TY  - THES
A1  - Rouzière, Anne-Sophie
T1  - MODULATION OF THE B-CELL REPERTOIRE IN RHEUMATOID ARTHRITIS BY TRANSIENT B-CELL DEPLETION
T1  - Veränderung des B-Zell-Repertoirs nach B-Zelldepletion mit Anti-CD20-Antikörpen
N2  - Although the role of B-cells in autoimmunity is not completely understood, their importance in the pathogenesis of autoimmune diseases has been more appreciated in the past few years. It is now well known that they have roles in addition to (auto) antibody production and are involved by different mechanisms in the regulation of T-cell mediated autoimmune disorders. The evolution of an autoimmune disease is a dynamic process, which takes a course of years during which complex immunoregulatory mechanisms shape the immune repertoire until the development of clinical disease. During this course, the B-cell repertoire itself is influenced and a change in the distribution of immunoglobulin heavy and light chain genes can be observed. B-cell depletive therapies have beneficial effects in patients suffering from rheumatoid arthritis (RA), highlighting also the central role of B-cells in the pathogenesis of this disease. Nevertheless, the mechanism of action is unclear. It has been hypothesised that B-cell depletion is able to reset deviated humoral immunity. Therefore we wanted to investigate if transient B-cell depletion results in changes of the peripheral B-cell receptor repertoire. To address this issue, expressed immunoglobulin genes of two patients suffering from RA were analysed; one patient for the heavy chain repertoire (patient H), one patient for the light chain repertoire (patient L). Both patients were treated with rituximab, an anti-CD20 monoclonal antibody that selectively depletes peripheral CD20+ B-cells for several months. The B-cell repertoire was studied before therapy and at the earliest time point after B-cell regeneration in both patients. A longer follow-up (up to 27 months) was performed in patient H who was treated a second time with rituximab after 17 months. Heavy chain gene analysis was carried out by nested-PCR on bulk DNA from peripheral B-cells using family-specific primers, followed by subcloning and sequencing. During the study, patient H received two courses of antibody treatment. B-cell depletion lasted 7 and 10 months, respectively and each time was accompanied by a clinical improvement. Anti-CD20 therapy induced two types of changes in this patient. During the early phase of B-cell regeneration, we noticed the presence of an expanded and recirculating population of highly mutated B-cells. These cells expressed very different immunoglobulin VH genes compared before therapy. They were class-switched and could be detected for a short period only. The long-term changes were more subtle. Nevertheless, characteristic changes in the VH2 family, as well as in specific mini-genes like VH3-23, 4-34 or 1-69 were noticed. Some of these genes have already been reported to be biased in autoimmune diseases. Also in autoimmune diseases, in particular in RA, clonal B-cells have been frequently found in the repertoire. B-cell depletion with anti-CD20 antibody resulted in a long term loss of clonal B-cells in patient H. Thus, temporary B-cell depletion induced significant changes in the heavy chain repertoire. For the light chain gene analysis, the repertoire changes were analysed separately for naive (CD27-) and memory (CD27+) B-cells. Individual CD19+ B-cells were sorted into CD27- and CD27+ cells and single cell RT-PCR was performed, followed by direct sequencing. During the study, patient L received one course of antibody treatment. B-cell depletion lasted 10 months and the light chain repertoire was studied before and after therapy. Before therapy, some differences in the distribution of VL and JL genes were observed between naive and memory B-cells. In particular, the predominant usage of Jk-proximal Vk genes by the CD27- naive B-cells indicated that the receptor editing was less frequent in this population compared to memory cells. In VlJl rearrangements also, some evidence for decreased receptor editing was noticed, with the overrepresentation of the Jl2/3 gene segments. The CDR3 regions of naive and memory cells showed different characteristics: the activity of the terminal deoxynucleotidyl transferase and exonuclease in Vl(5’) side was greater in memory cells. Also in the light chain repertoire, we observed some changes induced by the B-cell depletive therapy. There was a tendency of a less frequent usage of Jk-proximal Vk genes in the naive population. Some Vl genes, previously described in autoimmune diseases and connected to rheumatoid factor activity, such as 3p, 3r, 1g, were not found after therapy. The different characteristics of the CDR3 regions of VlJl rearrangements were not observed anymore. Very significantly, the ratio Vk to Vl was shifted toward a greater usage of Vk genes in the naive population after therapy. Taken together, these results indicate that therapeutic transient B-cell depletion by anti-CD20 antibody therapy modulates the immunoglobulin gene repertoire in the two RA patients studied. Measurable changes were observed in the heavy chain as well as in the light chain repertoire, which may be relevant to the course of the disease. This also supports the notion that the composition of the B-cell repertoire is influenced by the disease and that B-cell depletion can reset biases that are typically found in autoimmune diseases.
N2  - Obwohl die Rolle der B-Zellen für den Verlauf einer Autoimmunerkrankung noch nicht vollständig klar ist, so hat ihre Bedeutung für die Autoimmunpathogenese in den letzten Jahren zugenommen. Man weiß mittlerweile sehr wohl, dass ihre Rolle über die reine Produktion von (Auto-)antikörpern hinausgeht und sie z.B. an der Regulation T-Zellvermittelter Autoimmunstörungen beteiligt sind. Das B-Zellrepertoire selbst wird im Laufe einer autoimmunen Erkrankung durch solche immunregulatorische Prozesse beeinflusst. B-Zelldepletive Therapien zeigen vorteilhafte Effekte bei Patienten mit Rheumatoider Arthritis, was wiederum die zentrale Rolle von B-Zellen in der Pathogenese unterstreicht. Nichtsdestotrotz bleibt der genaue Mechanismus unklar. So wird z.B. spekuliert, dass mittels B-Zell-Depletion eine Neugenerierung der humoralen Immunität erreicht wird. Vor diesem Hintergrund untersuchten wir, ob eine vorübergehende B-Zell-Depletion zu Veränderungen im peripheren B-Zellrepertoire führt. Hierfür wurde das B-Zell-Rezeptorrepertoire von zwei Patienten mit Rheumatoider Arthritis im einen Fall bezüglich der schweren Kette (Patient H) und im anderen Fall bezüglich der leichten Kette (Patient L) analysiert. Beide Patienten wurden mit Rituximab, einem monoklonalen anti-CD20 Antikörper, der zu einer selektiven und über mehrere Monate anhaltenden Depletion peripherer CD20+-B-Zellen führt, behandelt. Das B-Zellrepertoire wurde für beide Patienten unmittelbar vor Therapie sowie in der frühen B-Zellregeneration untersucht. Bei Patient H erfolgte eine zweite Behandlung mit Rituximab nach 17 Monaten. Das Follow-up erfolgte in diesem Fall bis Monat 27. Die Analyse der Schwerketten erfolgte mittels nested-PCR mit DNA aus peripheren B-Zellen unter Verwendung familienspezifischer Primer und anschließendem Subklonieren und Sequenzieren. Während der Studie erhielt Patient H zwei Zyklen der Antikörperbehandlung. Die B-Zell-Depletion hielt 7 bzw. 10 Monate an und war zu jedem Zeitpunkt mit einer klinischen Besserung des Patienten verbunden. Die Anti-CD20 Therapie bewirkte zwei Arten von Veränderungen in diesem Patienten. Während der frühen Phase der B-Zellregeneration konnten wir eine ausgedehnte und rezirkulierende Population hochmutierter B-Zellen nachweisen. Diese Zellen exprimierten verglichen mit dem Zeitpunkt vor Therapie sehr unterschiedliche VH Gene. Es handelte sich hierbei um „class-switched“ Zellen, welche nur für kurze Zeit nachweisbar waren. Die Langzeit Veränderungen dagegen waren eher diskret. Nichtsdestotrotz konnten Veränderungen sowohl in der Familie VH2 als auch in spezifischen Mini-Genen wie VH3-23, 4-34 oder 1-69 festgestellt werden. Eine Häufung einiger dieser Gene wurde bereits im Zusammenhang mit Autoimmunerkrankungen berichtet. Zusätzlich bewirkte die Rituximabtherapie ein Verschwinden klonaler B-Zellen für die gesamte Periode. Folglich bewirkte die vorübergehende B-Zell-Depletion signifikante Veränderungen im Schwerkettenrepertoire. Für die Genanalyse der leichten Kette wurden die Veränderungen getrennt für naive (CD27-) und Gedächtnis- (CD27+) B-Zellen untersucht. Einzelne CD19+ B-Zellen wurden in CD27- und CD27+-Zellen sortiert und anschließend eine Single-cell-RT-PCR mit direkter Sequenzierung der Produkte durchgeführt. Während der Studie erhielt Patient L eine Behandlung. Die B-Zell-Depletion dauerte 10 Monate und das Leichtkettenrepertoire wurde vor und nach Therapie analysiert. Gewisse Unterschiede bezüglich der Verteilung von VL und JL Genen zwischen den Populationen naiver und Gedächtnis-B-Zellen konnten vor Therapie nachgewiesen werden. Insbesondere die bevorzugte Nutzung von Vκ Genen Jκ-proximal in CD27- naive B-Zellen spricht für ein vermindertes „receptor editing“ in dieser Population. Ferner fanden sich in VλJλ-Rearrangements Hinweise für ein vermindertes „receptor editing“ mit einer Überrepräsentation der Jλ2/3 Gensegmente. Die CDR3-Regionen der naiven und Gedächtnis-B-Lymphozyten zeigten unterschiedliche Eigenschaften: die Aktivität der Terminalen-Deoxynucleotidyl-Transferase und Exonuklease im Vλ-Abschnitt (5´) war höher als in Gedächtniszellen. Die B-Zelldepletive Therapie führtete zu signifikanten Veränderungen. So fand sich die Tendenz einer weniger häufigen Nutzung von Jκ-proximal gelegenen Vκ Gensegmenten in der naiven B-Zellpopulation. Einige Vλ Gene, wie z.B. 3p, 3r oder 1g, welche kürzlich in Verbindung mit Rheumafaktor bei Autoimmunerkränkungen beschrieben wurden, waren nach der Therapie nicht mehr nachweisbar. Ebenso verschwanden die unterschiedlichen Eigenschaften der CDR3-Regionen von VλJλ-Rearrangements. Besonders auffällig war das Verhältnis Vκ zu Vλ zugunsten einer häufigeren Nutzung von Vκ Genen in der naiven Population nach Therapie verschoben. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass mittels therapeutischer und vorüber- gehender B-Zell-Depletion durch anti-CD20-Antikörper das Immunglobulingenrepertoire in den beiden untersuchten Patienten moduliert wurde. Messbare Unterschiede fanden sich sowohl im Schwerketten- als auch im Leichtkettenrepertoire. Es erscheint wahrscheinlich, dass diese Veränderungen mit dem beobachteten therapeutischen Ansprechen in Verbindung stehen. Die Ergebnisse stützen die Annahme, dass die Zusammensetzung des B-Zellrepertoires durch die Krankheit beeinflusst wird und für Autoimmunerkrankungen charakteristische Veränderungen mittels B-Zell-Depletion aufgehoben werden können.
KW  - Rheumatoide Arthritis
KW  - B-Lymphozyt
KW  - Abreicherung
KW  - B-Zellrepertoire
KW  - Ig-Gene
KW  - Rituximab
KW  - B-Zelldepletive Therapie
KW  - B-cell repertoire
KW  - Ig genes
KW  - rituximab
KW  - anti-CD20 antibody therapy
Y1  - 2004
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9290
ER  - 
TY  - THES
A1  - Souto-Carneiro, Maria Margarida
T1  - Molecular and functional analyses of human synovial B-lymphocytes in rheumatoid arthritis
T1  - Molekularen und funktionellen Analysen humanen synovialen B-Lymphozyten in rheumatoiden Arthritis
N2  - B-cells of the rheumatoid synovial tissue are a constant part of and, in some histopathological subtypes, the dominant population of the inflammatory infiltrate, located in the region of tissue destruction. The pattern of B-cell distribution and the relationship to the corresponding antigen-presenting cells (follicular dendritic reticulum cells: FDCs) show a great variety. B-cells may exhibit (i) a follicular organization forming secondary follicles; (ii) follicle-like patterns with irregularly formed FDC networks, and (iii) a diffuse pattern of isolated FDCs. Molecular analysis of immunoglobulin VH and VL genes from human synovial B-cell hybridomas and synovial tissue demonstrates somatic mutations due to antigen activation. The FDC formations in the synovial tissue may therefore serve as an environment for B-cell maturation, which is involved in the generation of autoantibodies. An autoantibody is defined as "pathogenic" if it fulfills the Witebsky-Rose-Koch criteria for classical autoimmune diseases: definition of the autoantibody; induction of the disease by transfer of the autoantibody; and isolation of the autoantibody from the disease-specific lesion. B-cells from rheumatoid synovial tissue show specificity for FcIgG, type II collagen, COMP, sDNA, tetanus toxoid, mitochondrial antigens (M2), filaggrin and bacterial HSPs. The contributions of these antigens to the pathogenesis of RA are still hypothetical. A possible contribution could derive from crossreactivity and epitope mimicry: due to crossreaction, an antibody directed originally against a foreign infectious agent could react with epitopes from articular tissues, perpetuating the local inflammatory process. The characteristic distribution pattern, the localisation within the area of tissue destruction, the hypermutated IgVH and IgVL genes, and their exclusive function to recognize conformation-dependent antigens suggest a central role for B-cells in the inflammatory process of rheumatoid arthritis. Therefore, the analysis of synovial B-cell hybridomas and experimental expression of synovial IgVH and IgVL genes will help to characterise the antigens responsible for the pathogenesis of rheumatoid arthritis. In the present study 55 IgVH genes amplified from 3 different anatomical regions of a RA patient were analysed adding further information on synovial B-cell maturation and recirculation in RA. This analysis demonstrated somatically mutated IgVh genes in all different regions with amino acid deletions and mixed IgVh molecules, suggesting the existence of a novel pathway to generate (auto)antibody specificities. The comparison of amino acid sequences of amplified genes belonging to the VH1 family (with predominantly the same germline counterpart) exhibited a strong homology, indicating an apparently conserved mutational pattern. This suggests that the number of antigens activating B-cells in the different locations is restricted. The most striking result was the finding of clonally related sequences in different anatomical regions indicating a recirculation of activated B-cells between the different affected joints. Also in the present study a synovial B-cell hybridoma was analyzed for its specific recognition of cartilage antigens. A heptameric peptide of cartilage oligomeric protein (COMP) could be defined as the target structure. The IgVH-gene (IgHV4-59*01) of the IgG2l hybridoma has somatically mutated genes with high R/S values in the CDR regions (9:2). Thus, indicating that this hybridoma originates from a synovial B-cell which has been antigen activated/selected for its affinity. To analyse the presence of the clonotypic IgHV4-59*01 sequences in other cases of RA and osteoarthritis (OA) synovitis, primers specific for the CDR3 rearrangement of this hybridoma were used. The clonotypic and clone related sequences (98 per cent ± 1 per cent homology) could only be detected in synovitis of RA cases but not in OA cases indicating that this B-cell is specific to RA synovitis. The identified heptameric peptide of COMP was used in a peptide ELISA to analyse whether there is a specific binding in RA serum samples. Serum samples (IgG) from RA patients (n=22) showed a significant higher efficiency to the COMP heptamer than the OA sera (n=24) and the age matched healthy controls (n=20) (for both p<1x10-4, Students t-test). The specificity of this B-cell hybridoma may therefore be defined as RA specific. Since COMP is restricted to cartilage and tendons which are organs specifically affected in RA this COMP specific autoantibody represents the first organ specific autoantibody in RA. The IgG2 COMP specific autoantibody with somatically mutated IgVH genes is different from germline encoded, antigen clearing IgM autoantibodies and may therefore be directly involved as an "arthritogenic autoantibody" in cartilage and tendons destruction by complement activation.
N2  - B-Zellen des rheumatoiden Synovialgewebes sind einerseits ein konstanter Bestandteil und andererseits in einigen histopathologischen Subtypen sogar die dominante Bevölkerung des entzündlichen Infiltrates, welches sich in direkter Nähe des zerstörten Gewebes befindet. Das Strickmuster der B-Zellen-Verbreitung und die Verbindung zu den korrespondierenden antigenerzeugenden Zellen (follikuläre dendritische Zellen, sprich: FDC) zeigen eine große Vielfalt. B-Zellen können a) in der Form eines follikulären Verbandes sich bildender Sekundärfollikel; b) als follikelähnliche Muster mit unregelmäßig geformten FDC-Netzwerken und c) als ein diffuses Muster isolierter FDCs auftreten. Molekularanalysen der immunglobulinen VH- und VL-Gene von menschlichen synovialen B-Zell-Hybridomen und Synovialgewebe zeigen somatische Mutationen aufgrund von Antigenaktivierung auf. Die FDC-Schichten im Synovialgewebe dürften daher als ein Nährboden für B-Zell-Reifung dienen, welche wiederum in den Prozeß der Autoantikörperbildung eingreift. Ein Autoantikörper wird als "pathogenisch" bezeichnet, wenn er das Witebsky-Rose-Koch-Kriterium für klassische Autoimmunkrankheiten erfüllt: Bildung des Autoantikörpers; Einleitung der Krankheit durch Übertragung des Autoantikörpers und Isolation des Autoantikörpers vom krankheitsspezifischen Entzündungskomplex. B-Zellen aus rheumatoidem Synovialgewebe zeigen Spezifität für die Fc-Region von lgG; Typ II Kollagen; COMP; sDNA; Tetanustoxin; mitochondrische Antigene (M2); Fillaggrin und bakterielle HSPs. Der Beitrag dieser Antigene zur Pathogenese in der RA ist weiterhin hypothetisch. Ein möglicher Beitrag könnte aus der Kreuzreaktion und Epitopähnlichkeit aufgrund dieser Kreuzreaktion herrühren. Ein Antikörper, der ursprünglich gegen einen fremden Infektionsherd gerichtet war, könnte mit Epitopen aus Gelenkgewebe reagieren und somit den lokalen Entzündungsprozeß aufrechterhalten. Das charakteristische Verteilungsmuster, die Lokalisierung inmitten des zerstörten Gewebes, die hypermutierten IgVH- und IgVL-Gene und ihre ausschließliche Funktion, strukturabhängige Antigene zu erkennen, läßt auf eine zentrale Bedeutung der B-Zellen im Bezug auf den Entzündungsverlauf in der rheumatoiden Arthritis schließen. Deswegen wird die Analyse synovialer B-Zellen-Hybridome und die experimentelle Erkundung synovialer IgVH- und IgVL-Gene eine große Hilfe zur Charakterisierung der Antigene sein, welche verantwortlich für die Pathogenese in der RA sind. In dieser Studie wurden 55 IgVH-Gene analysiert, die von 3 verschiedenen anatomischen Regionen eines RA-Patienten amplifiziert wurden, wodurch man zusätzliche Informationen über synoviale B-Zellen-Reifung und -Rezirkulation in der RA erhielt. Diese Analyse zeigte somatisch mutierte IgVH-Gene in allen verschiedenen Regionen auf, mit Aminosäuredeletionen und gemischten IgVH-Molekülen, die Grund zur Annahme geben, daß eine neue Möglichkeit existiert, (Auto-) Antikörperspezifizierungen zu generieren. Der Vergleich von Aminosäuresequenzen amplifizierter Gene, die zur VH1-Familie gehören (mit überwiegend denselben Keimbahngenen) zeigten eine starke Homologie auf und wiesen auf ein scheinbar erhaltenes Mutationsmuster hin. Dieses läßt annehmen, daß die Anzahl der Antigene begrenzt ist, die B-Zellen in den verschiedenen Regionen aktivieren. Das markanteste Ergebnis war das Auffinden klonal verwandter Sequenzen in verschiedenen anatomischen Regionen, die darauf hinweisen, daß aktivierte B-Zellen zwischen den verschiedenen befallenen Gelenken rezirkulieren. Desweiteren wurde in dieser Studie ein synoviales B-Zellen-Hybridom analysiert bezüglich seiner spezifischen Erkennung von Knorpelantigenen. Ein heptameres Peptid des COMP könnte als eine mögliche Zielstruktur definiert werden. Die IgVH-Gene (IgHV4-59*01) des IgG2?-Hybridomes besitzt somatisch mutierte Gene mit hohen R/S-Werten in den CDR-Regionen (9.2). Somit weist dies darauf hin, daß dieses Hybridom aus einer synovialen B-Zelle stammt, welche aufgrund ihrer Affinität antigen-aktiviert wurde. Um das Vorkommen der klonotypischen IgHV4-59*01-Sequenzen in anderen Fällen der RA und Osteoarthritis (OA)-Synovitis zu analysieren, wurden Primer benutzt, die spezifisch für die CDR3 dieses Hybridomes sind. Die klonotypischen und klonal verwandten Sequenzen (98 Prozent ± 1 Prozent Homologie) konnte nur in Fällen der RA-Synovitis erkannt werden, jedoch nicht bei OA-Fällen, was darauf hinweist, daß diese B-Zelle spezifisch für die RA-Synovitis ist. Das identifizierte heptamere COMP-Peptid wurde in einer Peptid-ELISA verwendet, um festzustellen, ob es eine spezifische Bindung in RA-Seren gibt. Seren (IgG) von RA-Patienten (n=22) zeigten eine bedeutend höhere Wirksamkeit des COMP-Heptamers an als in OA-Seren (n=24) und den altersabhängigen gesunden Kontrollen (n=20); (für beide p<1x10-4; Students t-Test). Die Spezifizierung dieses B-Zellen-Hybridomes könnte daher als RA-spezifisch angesehen werden. Da COMP sich auf Knorpel und Sehnen beschränkt - welches hauptsächlich in der RA betroffene Organe sind - repräsentiert dieser COMP-spezifische Autoantikörper den ersten organspezifischen Autoantikörper in der RA. Der IgG2-COMP-spezifische Autoantikörper mit somatisch mutierten IgVH-Genen unterscheidet sich von dem der antigenvernichtenden IgM Autoantikörper und könnte daher direkt in die Knorpel- und Sehnenzerstörung durch Komplementaktivierung miteinbezogen sein, als ein "arthritogener Autoantikörper".
KW  - Rheumatoide Arthritis
KW  - B-Lymphozyt
KW  - Synovialmembran
KW  - Molekularbiologie
KW  - rheumatoiden Arthritis
KW  - B-Lymphozyten
KW  - Autoantikörper
KW  - Antigen
KW  - Cartilage Oligomeric Matrix Protein
KW  - rheumatoid arthritis
KW  - B-lymphocytes
KW  - autoantibody
KW  - antigen
KW  - cartilage oligomeric matrix protein
Y1  - 2000
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-2308
ER  -