TY - THES A1 - Ackermann, Matthias T1 - Studien zum Verhalten von Anthocyanen aus Heidelbeeren im Humanstoffwechsel - Stabilisierung und Bindung durch Proteine T1 - Studies on anthocyanins in human metabolism - the stabilization and binding by proteins N2 - Identifizierung und Strukturaufklärung von Anthocyanen und ihrer Metabolite erfolgten mit Hilfe der mittels Hochleistungsflüssigchromatographie-Diodenarray-Detektion-Elektro-spray-Tan¬dem¬massen¬spektrometrie (HPLC-DAD-ESI-MS/MS). Quantitative Analysen wurden via HPLC-DAD durchgeführt. Die hierzu erforderlichen Referenzverbindungen wurden mittels präparativer HPLC aus Heidelbeeren isoliert (Reinheit zwischen 85,8% und 99,4%). Der Gehalt an Anthocyanen in den untersuchten Heidelbeerfrüchten lag bei 6 g/kg. Bezüglich der mengen¬mäßigen Verteilung dominierten Delphinidin- und Cyanidin¬glykoside vor den Glykosiden von Malvidin, Petunidin und Peonidin. Als konjugierte Zucker¬reste kamen vor allem Glukose und Galaktose vor, der Gehalt an Arabinosiden war weit geringer. Bei oraler Aufnahme erfolgt ein erster Kontakt der Anthocyane mit Speichel. Daher wurde dessen Wirkung auf die Heidelbeeranthocyane in ex vivo-Studien über einen (unphysio-logisch langen) Zeitraum von bis zu 30 Minuten untersucht. Dabei konnte wurde ins-besondere der Einfluß des pH-Wertes auf die Stabilität der Anthocyane aufgezeigt werden. Zur Simulation des Verhaltens von Anthocyanen im Magen wurden die einzelnen Heidelbeeranthocyane mit künstlichem Magensaft (pH 1,81) über vier Stunden inkubiert. Hier erwiesen sich alle untersuchten Verbindungen als stabil. Die anschließend von uns mit simuliertem Duodenalsekret (pH 7,2) über einen Zeitraum von 24 Stunden durchgeführten Studien zeigten, dass die Anthocyane unterschiedlich starken Modifizierungen unterlagen. Unter den schwach alkalischen Bedingungen wurden vor allem die Glykoside des Delphinidins schnell abgebaut, aber auch die übrigen Anthocyane erwiesen sich unter diesen Bedingungen als nicht stabil; nach 24 h war kein Anthocyan mehr nachweisbar. Um die Metabolisierungsvorgänge der Anthocyane im Dünn- und Dickdarm zu untersuchen, wurden ex vivo-Inkubationen jeweils mit frischem Ileo- bzw. Kolo¬stoma-beutel¬inhalt durchgeführt. Während die Abbaugeschwindigkeit in der ilealen Flüssigkeit vor allem von der pH-Stabilität des Aglykons abhänig war, konnten im Dickdarm einzig die Arabinoside nach einer Stunde noch alle in geringen Konzentrationen identifiziert werden. Die meisten Glukoside und Galaktoside waren zu diesem Zeitpunkt schon vollständig abgebaut. Da im Darm von einer hydrolytischen Spaltung der Anthocyane in Anthocyanidin und Zucker ausgegangen wird, wurde die Metabolisierung von Anthocyanidinen unter physio-logischen pH-Bedingungen untersucht. Neben der jeweiligen Spaltung in das Benzoe¬säure-derivat des B-Ringes sowie Phloroglucinessigsäure traten verschiedene Poly¬merisierungs¬-produkte auf, deren Strukturen nicht aufgeklärt werden konnten. In einer weiteren Versuchsreihe wurde die renale Ausscheidung von Anthocyanen bei Ileostomieprobanden nach oraler Applikation von 300 g Heidelbeeren über einen Zeitraum von acht Stunden untersucht. Es zeigte sich, dass ein Stoma des terminalen Ileums keinen Einfluss auf die Absorption und Metabolisierung der Anthocyane hatte. Die Bilanzierung der Anthocyane im Urin erfolgte als Äquvalente von Malvidin-3-O-glukosid, da nicht alle Anthocyanmetabolite zur Verfügung standen. Der Zeitpunkt der maximalen renalen Anthocyanausscheidung sowie die Menge der ausgeschiedenen Anthocyane waren starken interindividuellen Schwankungen unterworfen. Das Aus¬sscheidungs¬maximum (tmax) lag zwischen 0,5 und zwei Stunden. Bei der ausge¬schiedenen Menge wurden Werte zwischen 0,007% und 0.019% der auf¬ge¬nommenen Anthocyane ermittelt. Aufgrund der literaturbekannten Unterschiede zwischen den in Serum und Urin gefunden Anthocyanmengen ist davon auszugehen, dass es nach Anthocyanverzehr zu Inter-aktionen mit Proteinen in Blut oder Geweben kommt. Mittels Blutfraktionierung wurde das humane Serumalbumin (HSA) als wichtigster Bindungspartner der Anthocyane im Blut identifiziert. Anhand spektroskopischer Methoden war es möglich, die Bindungs¬parameter zu berechnen. Als Bindungsort wurde der hydrophile Eingang der lipophilen Warfarin-Bindungstasche in der Subdomäne IIA des HSA-Moleküls mittels "molecular modelling" identifiziert. Nasschemische Untersuchungen ergaben, dass die Bindung der Anthocyane an HSA diese vor ihrem pH-abhängigen Abbau schützt. Eine signifikante Herab¬setzung der chemischen Abbaugeschwindig¬keit konnte auch für bovines Serumalbumin beobachtet werden. Diese Erkenntnis ließ sich auf andere, mit dem HSA-Molekül nicht strukurverwandte lebensmittelrelevante Albumine übertragen. So zeigten Anthocyane große Stabilität in Milch und Eiklar, wobei die Stabilisierung auf eine Wechselwirkung mit den Proteinen Laktalbumin und Ovalbumin zurückgeführt werden konnte. Die in dieser Arbeit erlangten Erkenntnisse hinsichtlich Absorption, Metabolisierung und systemischer Verfügbarkeit im menschlichen Organismus leisten einen Beitrag zum besseren Verständnis der Wirkungen von Anthocyanen. Die neuen Erkenntnisse der Protein¬bindung sind vor allem für die Bewertung der Verfügbarkeit der Anthocyane in humanem Gewebe relevant. N2 - Identification and structural analysis of anthocyanins and their metabolites was conducted by High-Performance-Liquid-Chromatography-Diode-Array-Detection-Electrospray-Tan-dem-Mass-Spectrometry (HPLC-DAD-ESI-MS/MS). Quantative analyses were realized via HPLC-DAD. The required reference compounds were isolated by preparative HPLC from blueberries (purity from 85.8% to 99.4%). The content of anthocyanines in the analysed blueberries was approximately 6 g/kg. Regarding the quantative distribution, delphinidin and cyaniding glycosides dominated, followed by malvidin, petunidin and peonidin glycosides. Regarding the conjugated sugar rests, glucose and galactose were most abundant with the content of arabinosides being much lower. When ingested orally the anthocyanins first come into contact with saliva. For this reason the effect of saliva on blueberry anthocyanins was analysed in ex vivo studies over a (unphysiologically long) period of up to 30 minutes. With this study, in particular, the influence of the pH-value on the stability of the anthocyanins was shown. For the simulation of the behaviour of anthocyanins in the stomach, the individual blueberry anthocyanins were incubated for four hours with artificial gastric juice (pH 1.81). Under these conditions all analysed components were found to be stable. The subsequent studies with simulated duodenal fluid (pH 7.2) over a period of 24 hours revealed, that the anthocyanins were modified differently. Under the weak alkaline conditions, especially the delphinidin glycosides were degraded quickly, but the other anthocyanins were also not stable under these conditions; no anthocyan was detectable after 24 hours. To analyse the metabolism processes of anthocyanins in the small and large intestines, ex vivo incubations of fresh ileostoma and colostoma bag contents were conducted. Whilst the degradation rates of the anthocyanins in the ileal liquid were dependent on the pH stability of the aglycons, only the arabinosides were detectable in small concentrations after one hour in the large intestine (colostoma incubations). Most of the glucosides and galactosides were degraded completely at this timepoint. As it is supposed that the anthocyanins are cleaved in the colon, the metabolism of anthocyanidins under physiological pH-values were analysed. Next to the respective cleavage into the benzoic acid derivative of the B-ring and phloroglucin acetic acid, different polymerisation products were found, whose structure could not be determined. In a further trial the renal excretion of anthocyanins in ileostoma patients after oral application of 300 g blueberries over a period of eight hours was determined. It was shown that the ileostoma handicap had no influence on the absorption and metabolism of anthocyanins. The quantification of anthocyanins in the urine samples were calculated as malvidin-3-O-glucoside equivalents, as not all anthocyan metabolites were available. The point of time of the maximum renal anthocyan excretion as well the amount of excreted anthocyanins underwent strong interindividual variations. The highest excretion (tmax) was between 0.5 and two hours. Values of 0.007% and 0.019% of the anthocyan uptake were recovered in the excreted material. Due to the differences known from literature between the amounts of anthocyanins found in serum and urine, it has to be assumed that there are interactions with proteins in the blood or tissue after anthocyan consumption. By fractionating blood, the human serum albumin (HSA) was identified as the most important binding partner for anthocyanins in blood. Using spectroscopic methods it was possible to calculate the binding parameters. With ‘molecular modelling’ the hydrophilic entrance of the lipophilic warfarin binding pocket in the subdomain IIA of the HSA molecule was identified as binding position. Chemical analyses showed that the binding of anthocyanins to HSA protected these from their pH-dependent degradation. A significant lowering of the chemical degradation velocity could also be observed for bovine serum albumin. This knowledge could be related to other, not structurally related food relevant albumins. Anthocyanins showed thus a large stability in milk and egg white, where the stabilising effect could be related to interactions with the proteins lactalbumin and ovalbumin. The novel information provided by this work regarding absorption, metabolism and systematic availability in the human organism leads to a better understanding of the effects of anthocyanins. The data of protein binding is particularly relevant for the assessment of the availability of anthocyanins in human tissues. KW - Heidelbeere KW - Anthocyane KW - Proteinbindung KW - Stoffwechsel KW - Anthocyane KW - Stabilität KW - Humanstoffwechsel KW - anthocyanins KW - binding KW - protein KW - stability KW - metabolism Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-53336 ER - TY - THES A1 - Kahle, Kathrin T1 - Polyphenole aus Apfelsaft : Studien zur Verfügbarkeit im Humanstoffwechsel T1 - Polyphenols from apple juice : Studies on availability in human metabolism N2 - Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Umfang der gastrointestinalen Absorption und Metabolisierung von mit der Nahrung aufgenommenen Polyphenolen in vivo zu ermitteln. Darüber hinaus sollte deren systemische Verfügbarkeit anhand von humanen Serum- und Urinproben bestimmt werden. Lebensmittel der Wahl war dabei Apfelsaft. Die Identifizierung und Strukturaufklärung der Polyphenole und ihrer Metabolite erfolgte mittels Hochleistungsflüssigchromatographie-Diodenarray-Detektion (HPLC-DAD), HPLC-Elektrospray-Tandemmassenspektrometrie (HPLC-ESI-MS/MS) sowie Kapillargaschromatographie-Massenspektrometrie (HRGC-MS). Quantitative Analysen wurden mittels HPLC-DAD durchgeführt; für die Bestimmung der Polyphenolgehalte in Urinproben sowie von D-(-)-Chinasäure wurde die HPLC-ESI-MS/MS im Single Reaction Monitoring (SRM) Modus eingesetzt. Zur Etablierung der Polyphenolanalytik und zur Auswahl eines für die Studien geeigneten Saftes wurden die Polyphenolprofile verschiedener Presssäfte aus Most- und Tafeläpfeln sowie kommerziell erhältlicher Apfelsäfte ausgewertet. Für die Säfte aus Tafeläpfeln wurden Polyphenolmengen zwischen 154 und 178 mg/L bestimmt, wohingegen die Säfte aus Mostäpfeln Gehalte zwischen 261 und 970 mg/L aufwiesen. Bei den Säften des Handels wiesen die naturtrüben Apfelsäfte mit 182 bis 459 mg/L höhere Polyphenolgehalte auf als die klaren Produkte (120 - 173 mg/L). Bei oraler Aufnahme kommen die Polyphenole zuerst mit Speichel in Kontakt. Umsetzungen mit zentrifugiertem Speichel führten zu keiner Modifikation der Substanzen. In Gegenwart von nativem Speichel wurden für die ß-glycosidisch gebundenen Flavonoidglycoside hydrolytische Abbaureaktionen in Abhängigkeit der Struktur ihres Zuckerrestes beobachtet. Nach Antibiotikumzugabe wurden deutlich geringere Abbauraten ermittelt. Die Hydrolyse erfolgt demnach hauptsächlich durch Enzyme der bakteriellen Mundflora. Im Weiteren gelangen die Polyphenole über die Speiseröhre in den stark sauren Magen. Zur Überprüfung ihrer Stabilität wurden die Apfelpolyphenole mit künstlichem Magensaft (pH 1,81) über vier Stunden inkubiert. Einzig für Procyanidin B2 wurde ein nahezu vollständiger Abbau nachgewiesen. Nach Passage des Magens erreichen die Polyphenole das neutrale bis leicht alkalische Duodenum. Die Inkubation erfolgte mit simuliertem Duodenalsekret (pH 7,2) über einen Zeitraum von 24 Stunden. Für 5-Kaffeoylchinasäure wurde eine 37%ige Abnahme beobachtet. Dabei wurden 3- und 4-Kaffeolychinasäure, Kaffeesäure, D-(-)-Chinasäure sowie Kaffeesäuremethylester generiert. Vergleichbare Ergebnisse wurden bei der Inkubation von 4-p-Cumaroylchinasäure erhalten. Kaffeesäure unterlag einer 26,3%igen Umsetzung zu Ferulasäure, Dihydrokaffeesäure und Kaffeesäuremethylester. Bei den monomeren Flavan-3-olen wurden mittels HPLC-Analytik an chiraler Phase Epimerisierungen nachgewiesen. Procyanidin B2 war nach vier Stunden nur noch in Spuren erfassbar. Quercetin wurde vollständig in Phloroglucin, 3,4-Dihydroxybenzoesäure und 2,4,6-Trihydroxybenzoesäure gespalten. Um die Verfügbarkeit der Polyphenole im Dickdarm zu untersuchen, wurde eine Interventionsstudie mit naturtrübem Apfelsaft bei Probanden mit einem Stoma des terminalen Ileums durchgeführt. Nach oraler Aufnahme von einem Liter Saft wurde der Ileostomaausfluss über einen Zeitraum von acht Stunden gesammelt. In den Ileostomabeuteln wurden zwischen Null und 33,1% der einzelnen aus dem Apfelsaft aufgenommenen phenolischen Substanzen wiedergefunden. Der ausgeschiedene Anteil der Flavonoidglycoside war dabei abhängig von der Struktur des jeweiligen Zuckerrestes. Als Metabolite waren D-(-)-Chinasäure, 1- und 3-Kaffeoylchinasäure, Phloretin und dessen 2´-O-Glucuronid sowie die Methylester der Kaffee- und p-Cumarsäure nachweisbar. Für die höhermolekularen Procyanidine wurden Wiederfindungen von 90,3% sowie deren partieller Abbau ermittelt. Die systemische Verfügbarkeit der Polyphenole sowie ihre renale Ausscheidung wurden in zwei weiteren Humanstudien mit gesunden Probanden untersucht. Nach Konsum von einem Liter naturtrüben Apfelsaft erfolgten Blutabnahmen über einen Zeitraum von acht Stunden; Urin wurde über einen Zeitraum von 24 Stunden untersucht. Die Bilanzierung der Apfelpolyphenole erfolgte sowohl vor als auch nach enzymatischer Hydrolyse. Kaffeesäure, 5-Kaffeoylchinasäure, 4-p-Cumaroylchinasäure, (-)-Epicatechin, Phloretin und Quercetin waren sowohl im Serum als auch im Urin detektierbar. Insgesamt wurden 5,3% (Serum) bzw. 23% (Urin) der mit dem Saft aufgenommenen phenolischen Verbindungen wiedergefunden. Davon waren im Urin 19,5% in Form hydroxylierter phenolischer Säuren nachweisbar. N2 - The objective of the present work was to determine the amount of gastrointestinal absorption and metabolism of polyphenols after food consumption in vivo. Furthermore, their systemic availability should be determined by serum and urine samples.. The food under study was apple juice. Identification and structural elucidation of polyphenols and their metabolites were performed by high-performance liquid chromatography diode-array detection (HPLC-DAD), HPLC electrospray ionization tandem mass spectrometry (HPLC-ESI-MS/MS) as well as high-resolution gas chromatography mass spectrometry (HRGC-MS). Quantitative analyses were performed by HPLC-DAD; for the quantitation of polyphenol contents in the urine samples under study as well as the D-(-)-quinic acid, HPLC-ESI-MS/MS in the single reaction monitoring (SRM) mode was used. For the establishment of polyphenol analysis and for the selection of a suitable juice for the studies, the polyphenol profiles of different pressed juices of cider and dessert apples as well as commercially available apple juices were analysed first of all. For the juices from dessert apples polyphenol amounts ranged between 154 and 178 mg/l, whereas the juices from cider apples showed contents between 261 and 970 mg/l. Among commercially available juices, with 182 to 459 mg/l cloudy apple juices showed higher contents than the clear products (120 - 173 mg/l). By oral consumption, polyphenols come first into contact with saliva. Conversions with centrifuged saliva led to no modification of the substances. In the presence of whole saliva in ß-glycosidic bound flavonoid glycosides hydrolytic decomposition reactions in dependence of their sugar moiety were observed. After the addition of antibiotic, smaller degradation rates were clearly determined. Thus, hydrolysis resulted mainly from the enzymes of the oral bacterial flora. Afterwards, the polyphenols reach the highly acid stomach via the oesophagus. For examination of their stability the apple polyphenols were incubated with artificial gastric juice (pH 1.81) for four hours. Only for procyanidin B2 an almost complete decomposition was demonstrated. Following the passage of the stomach the polyphenols reach the neutral to slightly alkaline duodenum. Incubations were performed with simulated duodenal secretion (pH 7.2) over a period of 24 hours. For 5-caffeoylquinic acid, a decomposition of 37% was observed. Thereby,3- and 4-caffeoylquinic acid, caffeic acid, D-(-)-quinic acid as well as caffeic acid methyl ester were generated. Comparable results were received with the incubation of 4-p-coumaroylquinic acid. 26.3% of the caffeic acid underwent a conversion to ferulic acid, dihydrocaffeic acid and caffeic acid methyl ester. For monomeric flavan-3-ols epimerisation was demonstrated by HPLC analytics using a chiral phase. Only traces of procyanidin B2 were detectable after four hours. Quercetin was split completely into phloroglucinol, 3,4-dihydroxybenzoic acid and 2,4,6-trihydroxybenzoic acid. In order to investigate the availability of polyphenols in the large intestine, an intervention study with cloudy apple juice was accomplished by volunteers with a terminal ileostomy. After oral intake of one litre of juice the ileostomy discharge was collected over a period of eight hours. Between zero and 33.1% of the particular phenolic substances absorbed from the apple juice were recovered in the ileostomy bags. The excreted amount of the flavonoid glycosides depended thereby on the structure of the respective sugar moiety. As metabolites, D-(-)-quinic acid, 1- and 3-caffeoylquinic acid, phloretin and its 2´-O-glucuronide as well as the methyl ester of the caffeic and p-coumaric acid were detectable. For the high-molecular procyanidins recoveries of 90.3% as well as their partial decomposition were detected. The systemic availability of polyphenols as well as their renal elimination was investigated in two further human studies with healthy volunteers, respectively. After consumption of one litre of cloudy apple juice blood samples were taken over a period of eight hours; urine was analysed over a period of 24 hours. The measurement of the apple polyphenols was carried out both before and after enzymatic hydrolysis. Caffeic acid, 5-caffeoylquinic acid, 4-p-coumaroylquinic acid, (-)-epicatechin, phloretin and quercetin were detectable both in serum and urine. Alltogether 5.3% (serum) and 23.0% (urine) of the phenolic compounds consumed with the juice were recovered. In the urine, 19.5% of that was determined in form of hydroxylated phenolic acids. KW - Apfelsaft KW - HPLC KW - Verfügbarkeit KW - Polyphenole KW - Humanstoffwechsel KW - apple juice KW - HPLC KW - availability KW - polyphenols KW - human metabolism Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-32514 ER -