TY - THES A1 - Buttmann, Mathias T1 - Molekularbiologische Untersuchung intrazellulärer Signalwege, die in T-Lymphozyten zur Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-ATc führen T1 - Molecular studies of intracellular signalling pathways in T lymphocytes leading to the activation of the transcription factor NF-ATc N2 - Der Transkriptionsfaktor NF-ATc (Nuclear Factor of Activated T cells) kontrolliert die Genexpression in T-Lymphozyten. In dieser Arbeit, in der Jurkat-T-Zellen und embryonale 293-Zellen als Modellsysteme verwendet wurden, konnte gezeigt werden, daß die N-terminale transaktivierende Domäne TAD-A von NF-ATc in vivo induzierbar durch den Phorbolester TPA, in vitro durch die MAP-Kinase Erk2 phosphoryliert wird. In Transfektionsexperimenten mit einer TAD-A-Mutante, in der alle fünf Serinreste, die theoretisch durch MAP-Kinasen phosphoryliert werden können, durch Alaninreste ersetzt worden waren, konnte gezeigt werden, daß diese Phosphorylierung nicht notwendig für die Aktivierung von TAD-A ist. Vielmehr gelang der Nachweis, daß verschiedene MAP-Kinasen-Signalwege ihre Wirkung auf NF-ATc über die transkriptionellen Koaktivatoren CBP und p300 entfalten, die an die N-terminale transaktivierende Domäne TAD-A von NF-ATc binden und dessen Aktivität kontrollieren. Der Nachweis, daß konstitutiv aktive Mutanten von c-Raf und Rac synergistisch die CBP/p300-vermittelte TAD-A-Aktivierung verstärken, unterstreicht die wichtige Rolle, die CBP/p300 bei der Integration von T-Zell-Aktivierungssignalen spielt. N2 - NF-ATc (Nuclear Factor of Activated T cells), an inducibly expressed transcription factor, controls gene expression in T lymphocytes. We show here that the transcriptional co-activators CBP/p300 bind to and control the activity of the inducible N-terminal transactivation domain of NF-ATc, TAD-A. Similar to the N terminal transactivation domain of c-Jun, TAD-A is inducibly phosphorylated, but this phosphorylation is dispensable for the interaction with CBP/p300. Constitutive active versions of c-Raf and Rac synergistically enhance the CBP/p300-mediated increase of TAD-A activity, indicating the important role CBP/p300 plays in the integration of T cell activation signals. KW - NF-AT KW - NFAT KW - TAD-A KW - p300 KW - CBP KW - Rac KW - Raf KW - NF-AT KW - NFAT KW - TAD-A KW - p300 KW - CBP KW - Rac KW - Raf Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1181516 ER - TY - THES A1 - Cordes, Tatjana T1 - Bindungsverhalten der verschiedenen NFAT-Transkriptionsfaktoren an den nur77-Promotor und ihre Kooperationsfähigkeit mit MEF2D bei der Aktivierung des nur77-Promotors T1 - Binding of the different NFAT-transcription factors at the nur77-promotor and the cooperation with MEF2D in the activation of the nur77-promotor N2 - Sowohl NFAT- (Nukleäre Faktoren aktivierter T-Zellen) als auch MEF2- (’myosin-enhancer factor 2’) Transkriptionsfaktoren spielen eine wichtige Rolle bei der Differenzierung, Proliferation oder Apoptose vieler eukaryotischer Zellen. Sie sind in einer Vielzahl von Zellen aktiv und können dort die Transkription ihrer Zielgene nach Stimulation der Zellen mit anschließendem Calcium-Einstrom aktivieren. Dabei kooperieren sie oft mit anderen Transkriptionsfaktoren. Kurz vor Beginn dieser Arbeit erschienen zwei Veröffentlichungen, die eine Kooperation von MEF2D mit NFATc2 bei der Aktivierung des nur77-Promotors, der bei der negativen Selektion von T-Zellen aktiv ist, beschrieben. Im Rahmen dieser Arbeit sollte nun das Bindungsverhalten verschiedener NFAT-Proteine an den nur77-Promotor und ihre Kooperationsfähigkeit mit MEF2D bei der Aktivierung des nur77- und anderer Promotoren untersucht werden. Es konnte gezeigt werden, dass verschiedene NFAT-Faktoren direkt an ein Oligonukleotid des nur77-Promotors (von Position -274 bis -247 bp reichend) binden. Diese Bindung wird zwar durch eine Bindung von MEF2-Faktoren an den Promotor unterstützt, ist jedoch nicht wesentlich beeinträchtigt, wenn MEF2-Faktoren aufgrund von einer Mutation in ihrer Bindungssequenz nicht binden können. Dagegen führt eine Mutation der NFAT-Bindungsstelle zu einer aufgehobenen Bindung von NFAT-Faktoren an den Promotor. Desweiteren zeigte sich, dass nicht nur endogenes NFATc2 sondern auch verschiedene NFATc1-Isoformen an den Promotor binden können. In ihrer Fähigkeit mit MEF2D zu kooperieren, zeigte sich kein Unterschied zwischen den getesteten NFAT-Isoformen NFATc1/αA, NFATc1/αC oder NFATc2. So aktivierten in Transfektionsversuchen in Jurkat T-Zellen und 293 T-Zellen alle NFAT-Proteine die Luciferase-Reporter-Gen-Konstrukte gemeinsam mit MEF2D in etwa additiver Weise. Dies konnte an verschiedenen Luciferase-Reporter-Genen (nur77-gesteuert, hFasL-gesteuert und desmin-gesteuert) nachgewiesen werden, was auf eine mögliche Kooperation der verschiedenen NFAT-Faktoren mit MEF2D (und evtl. auch anderen MEF2-Faktoren) nicht nur bei der Apoptose von T-Zellen sondern auch in anderen Zellen hinweist. N2 - NFAT- (nuclear factors of activated t cells) and MEF2- (myosin enhancer factor 2) transcription factors play an important role in the differentiation, proliferation or apoptosis of eucaryotic cells. They are activ in a variation of cells and they can activate the transcription of their target genes after stimulation of the cells with calcium influx. Both cooperate often with other transcription factors. Before the beginning of this work, there were two publications which discribed a cooperation of MEF2D with NFATc2 in the activation of the nur77 promotor, which is activ in t cells undergoing negative selection. In this work I studied the binding of different NFAT-proteins at the nur77-promotor and their ability to cooperate with MEF2D activating the nur77-promotor and other promotors. It could be shown that different NFAT-facors bind to an oligonucleotid of the nur77-promotor (reaching from position -274 to -247 bp). This binding is assisted by the binding of MEF2D to the promotor, but MEF2D binding is not essential for NFAT binding (when the MEF2-binding site is mutated). When the NFAT binding site is mutated, no binding of NFAT factors could be observed. It also could be shown, that not only NFATc2 but also different NFATc1-isoforms can bind to the promotor. There was no difference between the tested NFAT-isoforms NFATc1/αA, NFATc1/αC or NFATc2 in their ability to cooperate with MEF2D. All of them activated different luciferace-reporter-gene-contructs (nur77, hFasL, desmin) in transfection assays in Jurkat t-cells and 293 t-cells aproximately in addition, which might hint to a possible cooperation of different NFAT-factors with MEF2D not only in the apoptosis of t-cells but also in other cells. KW - Transkriptionsfaktor KW - Promotor KW - Apoptosis KW - Immunsystem KW - NFAT KW - MEF2D KW - Nur77 KW - Protein-Protein-Interaktion KW - Protein-DNA-Interaktion KW - NFAT KW - MEF2D KW - nur77 KW - interaction KW - apoptosis Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25964 ER - TY - THES A1 - Haßler, Markus Sebastian T1 - NFATc3 in der akuten GvHD T1 - NFATc3 in acute GvHD N2 - Bei Leukämien, Lymphomen und dem Multiplen Myelom stellt die allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation (allo-HCT) oft die letzte kurative Therapieoption dar. Spender-T-Zellen (v.a. CD8+-T-Zellen), die im Transplantat enthalten sind, erkennen nach Chemo-/Strahlentherapie verbliebene Reste des entarteten Empfängergewebes, eradizieren dieses und verhindern somit ein Tumorrezidiv (Graft-versus-Leukämie Reaktion/GvL). Häufig attackieren Spender-T-Zellen (v.a. CD4+-Th1-Zellen) aber auch nicht-malignes Gewebe (z.B. Haut, Leber und Darm), was bis zum Tod des Patienten führen kann (Graft-versus-Host Disease/GvHD). Calcineurin-Inhibitoren wie Cyclosporin A (CsA) und Tacrolimus, die oft schon prophylaktisch verabreicht werden, verhindern über eine unselektive Inhibition aller Mitglieder der NFAT-Transkriptionsfaktorfamilie (Nuclear factor of activated T-cells) die Aktivierung der Spender-T-Zellen. Es folgt eine klinische Besserung der GvHD-Symptomatik, während jedoch der GvL-Effekt ebenfalls supprimiert wird. Bisherige Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe am Mausmodell hatten gezeigt, dass die selektive Inhibition eines NFAT-Familienmitgliedes (NFATc1 oder NFATc2) in den Donor-T-Zellen zu einer signifikanten Besserung der aGvHD bei jedoch erhaltener GvL führt. Es wurde nun der Einfluss des dritten, in Lymphozyten exprimierten NFAT-Mitglieds NFATc3 im Kontext der aGvHD untersucht. Zur Basisanalyse der neu kreierten Nfatc3fl/fl.Cd4cre- und Nfatc1fl/fl.Nfatc3fl/fl.Cd4cre-Mauslinien erfolgten durchflusszytometrische und Western-Blot-Analysen. Anschließend wurden In-vivo-Untersuchungen unter Verwendung eines etablierten major-mismatch-aGvHD-Modells (H-2b→H-2d) durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass durch eine NFATc3- (+/- NFATc1-) Defizienz direkt ex vivo die CD4+/CD8+-Ratio durch Abnahme der CD4+- hin zu den CD8+-T-Zellen verschoben wird. Auch zeigte sich in den entsprechenden Genotypen eine Abnahme der naiven- und dafür vice versa eine Zunahme der Effektor-T-Zellen. In den wiederholt durchgeführten aGvHD-Versuchen zeigte sich in vivo als Korrelat der (ebenfalls erneut nachgewiesenen) Abnahme des CD4+/CD8+-Quotienten in den Zielorganen eine geringere Expansion der NFAT-defizienten als der wildtypischen T-Zellen. Leider spiegelte sich dies nicht in dem clinical score zur Quantifizierung der aGvHD-Symptomatik wider. Auch das Körpergewicht der Versuchsgruppe nahm rapide ab. Ursächlich hierfür ist – als Korrelat zur direkt ex vivo nachgewiesenen Aktivierungsneigung – ein vermehrter Th1-Shift der NFATc3 (+/-NFATc1-) defizienten T-Zellen. Eine Inhibierung von NFATc3 – im Gegensatz zu NFATc1 und NFATc2 – ist demzufolge kein sinnvoller Ansatzpunkt für eine mögliche, zielgerichtetere aGvHD-Therapie. Der positive Effekt der reduzierten Proliferationsneigung der NFATc3-defizienten Lymphozyten wird durch deren vermehrte Aktivierungsneigung mit erhöhter Sekretion von pro-inflammatorischen Zytokinen zunichte gemacht. N2 - In malignant diseases such as multiple myeloma, leukemia and lymphoma the allogenic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HCT) often represents the final curative treatment option. Donor T cells (esp. CD8+ T cells) within the graft recognize and eradicate tumor cells which have remained after chemo- and radiotherapy. This graft-versus-leukemia (GvL) effect can prevent tumor relapses. However, donor T cells (esp. CD4+ Th1 cells) often attack non-malignant tissue (e.g. skin, liver, colon) with potentially life-threatening consequences for the host. (Graft-versus-host disease = GvHD). To prevent the development of aGvHD, calcineurin-inhibitors (CNI) like cyclosporin A (CsA) and tacrolimus are often administered prophylactically. By means of an unselective suppression of the nuclear factor of activated T cells (NFAT) transcription factors, both drugs inhibit the activation of donor T cells. While leading to a clinical improvement of the GvHD-symptoms, coevally, the GvL effect is also suppressed. Previous research of our study group showed that a selective inhibition of one NFAT family member (NFATc1 oder NFATc2) in donor T cells leads to a significant decline of aGvHD symptoms while maintaining GvL. We have now analysed the iκluence of NFATc3, the third NFAT member expressed in lymphocytes, in context of aGvHD. Initially we analysed the new created Nfatc3fl/fl.Cd4cre- and Nfatc1fl/fl.Nfatc3fl/fl.Cd4cre-mouse strains by western blot and flow cytometry. Subsequently, these were followed by in vivo studies, using an already established major-mismatch-aGvHD-model (H-2b→H-2d). It could be shown that directly ex vivo a NFATc3- (+/- NFATc1-) deficiency leads to a reduction in the CD4+/CD8+ ratio. This is mainly caused by a diminution of CD4+ T cell population, while the CD8+ population remains unaffected. Furthermore, a lower number of naive but an increased number of effector T cells has been observed. This effect (which was also present in the aGvHD-experiments) correlated in vivo with a decreased expansion of NFAT-deficient T cells – compared to wild type T cells – in target organs. Unfortunately, the expected clinical improvement could not be demonstrated. The clinical score which objectifies the aGvHD-symptoms, as well as the body weight of the mice in the experimental group declined rapidly, comparable with or even worse than in the control group due to an increased Th1-shift of the NFATc3- (+/- NFATc1) deficient T cells. This also correlates with the increased effector function which has been observed in the previous ex vivo experiments. In conclusion an inhibition of NFATc3 – in contrast to NFATc1 or NFATc2 – is not a useful target point for a more specific aGvHD-therapy. The positive effect of a reduced proliferation in NFATc3-deficient lymphocytes is over-compensated by their augmented activation. KW - Transplantat-Wirt-Reaktion KW - Gvhd KW - Transplantatabstoßung KW - NFAT KW - NFATc3 KW - GvL KW - Stammzelltransplantation KW - allogenic stem cell transplantation Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-323681 ER - TY - THES A1 - König, Thomas T1 - Die Rolle von NFAT-Transkriptionsfaktoren bei der Regulation der Apoptose peripherer T-Zellen T1 - The role of NFAT transcription factors in regulating apoptosis of peripheral T-cells N2 - In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle der NFAT-Transkriptionsfaktoren NFATc2 und NFATc3 beim AICD (Activation induced cell death) von peripheren T-Lymphozyten untersucht. Dazu wurde die Auslösbarkeit der Apoptose mittels Anti-CD3-Antikörper bei Wildtyp- bzw. Knock-out-Mäusen mit folgender NFAT-Ausstattung verglichen: NFAT c2+/+c3-/-, c2-/-c3+/+, c2-/-c3-/+, c2-/-c3-/-. Mittels FACS-Analyse von T-Helfer-Zellen aus den Lymphknoten dieser Mäuse zeigte sich, dass die CD3-vermittelte Apoptose - im Gegensatz zur Fas-vermittelten - mit dem Gesamtgehalt der Zellen an NFATc2 und NFAT c3 korreliert und diesbezüglich eine direkte Proportionalität angenommen werden kann. N2 - This thesis is abot the role of NFAT transkription faktors (NFATc2 and NFATc3) in the activation induced cell death of peripheral T-cells. Therfore we looked at the inducability of apoptosis by anti-CD3-antibodies in wildtype- or knock-out-mice with respect to specific NFAT-genes: NFAT c2+/+c3-/-, c2-/-c3+/+, c2-/-c3-/+, c2-/-c3-/-. With FACS-analysis of CD4-positive T-cells taken from lymphnodes of these mice we found, that CD3-mediated apoptosis - contraty to Fas-mediated - correlates with the amount of NFATc2 and NFAT c3 in the cell in a direct proportional manner. KW - NFAT KW - Knock-out-Mäuse KW - T-Zellen KW - AICD KW - Lymphozyten KW - NFAT KW - knock out mice KW - AICD KW - apoptosis KW - transcription factors Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-23594 ER - TY - THES A1 - Lauber, Paloma T1 - Die Rolle individueller NFAT-Faktoren in Lymphozyten und Keratinozyten T1 - The role of individual NFAT factors in lymphocytes and keratinocytes N2 - In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle der Transkriptionsfaktoren NFATc1/αA bzw. NFATc1/ßC und NFATc2 in NK-Zellen und die Rolle der Faktoren NFATc1-4 und NFAT5 in Keratinozyten analysiert. Die Familie der Nuclear Factor of Activated T-cell (NFAT) Transkriptionsfaktoren besteht aus fünf Mitgliedern, welche entscheidend die Gentranskription bei Immunantworten beeinflussen. Nach Antigenaktivierung wird in Lymphozyten die Expression des Nfatc1-Gens stark induziert. Die Akkumulation der dabei gebildeten kurzen Isoform NFATc1/αA ist für die Zytokinproduktion als Effektorfunktion sowie für die Proliferation und das Überleben aktivierter Zellen verantwortlich. Das kurze NFATc1-Protein unterscheidet sich nicht nur strukturell, sondern auch funktionell von fast allen anderen NFAT-Proteinen. Um neue Erkenntnisse über die Funktion der Isoform NFATc1/αA in Lymphozyten zu gewinnen, wurden KT12 NK-Zellen mit NFATc1/αA bzw. NFATc1/ßC und NFATc2- exprimierenden Vektoren transfiziert, geklont, stimuliert und anschließend auf ihre jeweilige Apoptoserate und die Zytokinsynthese bzw. -expression hin untersucht. Die gewählten KT12-Hybridoma-Zellen erwiesen sich allerdings in ihrer intendierten Funktion als Testzellen für die Über-Expression von NFATc-Proteinen in NK-Zellen als ungeeignet. Fehlregulationen von NFAT-Signalwegen werden mit einer fehlerhaften Entwicklung des Immunsystems, mit der Entstehung von Autoimmunerkrankungen und mit Krebs in Verbindung gebracht. Um die Rolle von NFAT-Faktoren in Keratinozyten besser zu verstehen, wurden HaCaT-Zellen und primäre humane Keratinozyten mit Differenzierungssignalen bzw. UVB-Licht stimuliert. Änderungen der Transkription von NFAT-Faktoren, Keratinozyten-spezifischen Proteinen und Chemokinen wurden mittels qRT-PCR-Assays detektiert und analysiert. Insgesamt konnte die Beteiligung von NFAT-Faktoren am Differenzierungsprozess und an der UV-Antwort von Keratinozyten gezeigt werden. Es zeigte sich tendenziell eine stärkere Induktion der kurzen NFATc1-Isoform im Vergleich zu langen NFATc1-Isoformen, was die Frage nach einer besonderen Funktion der kurzen NFATc1-Isoform in Keratinozyten aufwirft. Generell ließen sich besonders hohe Expressionslevel des Transkriptionsfaktors NFAT5 - verglichen mit anderen NFAT-Faktoren - messen. Für die Entwicklung von Therapien, welche die Ursachen und Folgen einer dysregulierten Hautbarrierenbildung behandeln, könnten sich weitere Studien zu einzelnen NFAT-Faktoren bzw. NFATc1-Isoformen als zielführend erweisen. N2 - In the present work the role of the transcription factors NFATc1/αA or NFATc1/ßC and NFATc2 in NK cells and the role of the factors NFATc1-4 and NFAT5 in keratinocytes were investigated. The nuclear factor of activated T-cell (NFAT) transcription factor family consists of five members that critically influence gene transcription in immune responses. Following antigen activation, expression of the Nfatc1 gene is strongly induced in lymphocytes. Accumulation of the short NFATc1/αA isoform - formed in this process - is responsible for cytokine production as an effector function and for proliferation along with the survival of activated cells. The short NFATc1 protein differs not only structurally but also functionally from almost all other NFAT proteins. To gain new insights into the function of the NFATc1/αA isoform in lymphocytes, KT12 NK cells were transfected with NFATc1/αA, NFATc1/ßC or NFATc2- expressing vectors. The KT12 cells were cloned, stimulated and subsequently analyzed for their respective apoptosis rates together with cytokine synthesis or expression. However, the selected KT12 hybridoma cells proved to be unsuitable in their function as test cells for the overexpression of NFATc proteins in NK cells. Misregulation of NFAT signaling pathways has been associated with defective development of the immune system and autoimmune diseases and cancer. To better understand the role of NFAT factors in keratinocytes, HaCaT cells and primary human keratinocytes were stimulated with differentiation signals and UVB light, respectively. Changes in transcription of NFAT factors, keratinocyte-specific proteins and chemokines were detected and analyzed by qRT-PCR assays. Overall, the involvement of NFAT factors in the differentiation process and UV response of keratinocytes was demonstrated. The short NFATc1 isoform tended to be more strongly induced compared with long NFATc1 isoforms, raising the question of a special function of the short NFATc1 isoform in keratinocytes. Particularly high expression levels of the transcription factor NFAT5 - compared to other NFAT factors - could be measured. For the development of therapies that treat the causes and consequences of dysregulated skin barrier formation further studies on individual NFAT factors or NFATc1 isoforms will prove useful. KW - Keratinozyt KW - Natürliche Killerzelle KW - Transkriptionsfaktor KW - Chemokin CXCL10 KW - Chemokine KW - NFAT KW - Differenzierung KW - UV-Strahlung KW - Keratine Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-240119 ER - TY - THES A1 - Schulze-Lührmann, Jan T1 - Die Hämatopoetische Progenitor Kinase (HPK) 1 und NFAT-Transkriptionsfaktoren unterstützen die Apoptose von T-Lymphozyten T1 - Hematopoietic Progenitor Kinase (HPK) 1 and NFAT-Transcription Factors support Apoptosis of T Lymphocytes N2 - Die Expression der Hämatopoetischen Progenitor Kinase 1 (HPK1), einem Mitglied der Familie der „Germinal Centre“ Kinasen, ist im adulten Organismus auf die Zellen des hämatopoetischen Systems beschränkt. Die HPK1 wurde ursprünglich als ein Aktivator des JNK-Signalübertragungsweges beschrieben [Hu et al., 1996; Kiefer et al., 1996], und kürzlich wurde eine transiente Aktivierung der HPK1 nach TZR-Stimulation nachgewiesen. Auch wurde eine Assoziation der HPK1 mit dem Linker aktivierter T-Zellen (LAT) und den Adaptorproteinen Nck, Crk, Gads, Grb2, Grap, CrkL sowie SLP-76 gezeigt. Für die Aktivierung der nach TZR-Stimulation in den Lipid-Rafts lokalisierten HPK1 sind sowohl Lck als auch ZAP-70 notwendig [Liou et al., 2000; Liu et al., 2000a; Ling et al., 2001]. Diese Daten legen eine mögliche Funktion von HPK1 bei der TZR-vermittelten Signalübertragung nahe. Trotzdem konnte bisher eine physiologische Rolle der HPK1 im Rahmen der Immunrezeptor-Signalübertragung nicht nachgewiesen werden. In der vorliegenden Arbeit wird dargestellt, dass eine wichtige Funktion der HPK1 in T-Zellen nach TZR-Stimulation, die durch die Förderung des Aktivierungs-induzierten Zelltodes (AICD) vermittelt wird, in der Kontrolle der Termination der Immunantwort und damit Homöostase des Immunsystems besteht. Dies wurde durch retrovirale Überexpression der wildtypischen (wt) HPK1 in murinen CD4+ T-Zellen nachgewiesen, in denen die HPK1 zu einem Anstieg der spontanen und antiCD3-vermittelten Apoptose sowie zu einer gesteigerten Expression des Fas-Liganden (FasL oder auch CD95L) führte. Die Expression einer HPK1-„antisense“ (AS)-RNA in CD4+ T-Zellen bewirkte dagegen eine schwache, jedoch signifikant nachweisbare Hemmung der Apoptose und FasL-Expression. Die Apoptose-Hemmung durch die HPK1-AS-RNA war besonders stark in H2O2-stimulierten EL-4 T-Zellen ausgeprägt, in denen die Überexpression der wt HPK1 den durch reaktive Sauerstoffmetabolite (ROS) induzierten Zelltod verstärkte. Aus diesen Daten folgt, dass die HPK1 die T-Zell-Apoptose reguliert. In H2O2-stimulierten EL-4 T-Zellen führt die HPK1-Expression zu einer verstärkten und anhaltenden Aktivierung der c-Jun N-terminalen Kinase (JNK), die wahrscheinlich an der HPK1-vermittelten Apoptoseinduktion beteiligt ist. Unter den gleichen Bedingungen konnte eine schnelle Spaltung der HPK1 beobachtet werden. Die Überexpression der N- oder C-terminalen Spaltprodukte in CD4+ T-Zellen führte - wie die der Gesamt-HPK1 - zu einem Anstieg des AICD. In Übereinstimmung mit publizierten Daten konnten wir eine Hemmung der NFkB-Aktivität durch das C-terminale HPK1-Peptid nachweisen, das die IkBalpha-Degradation inhibiert. Die erzielten Ergebnisse führten uns in ihrer Gesamtheit zu folgendem Modell: während der Initiationsphase der T-Zell-Stimulierung werden nach schneller, transienter HPK1-Aktivierung pro- und anti-apoptotische Signale durch den JNK- und NFkB-Signalübertragungsweg vermittelt. Durch die Akkumulation der C-terminalen HPK1-Spaltprodukte kommt es später zur Inhibierung der NFkB-Aktivität und damit zu einer Verschiebung des Gleichgewichts zwischen den Überlebens- und Apoptose-stimulierenden Signalen zugunsten des AICD. Allerdings gibt es sicherlich weitere Faktoren und Signalwege, die an der HPK1-vermittelten Kontrolle der T-Zell-Apoptose beteiligt sind und von deren Untersuchung ein detaillierteres Verständnis der HPK1-Physiologie erwartet wird. Die Nukleären Faktoren aktivierter T-Zellen (NFAT´s) gehören zu einer Familie von Transkriptionsfaktoren, denen eine konservierte, ca. 300 Aminosäuren (aa) große DNA-Bindedomäne und eine Calcineurin-Bindedomäne gemeinsam ist. NFATc (auch NFATc1 oder NFAT2 genannt) und NFATp (NFATc2 oder NFAT1) werden in peripheren T-Zellen stark exprimiert und kontrollieren deren Effektorfunktionen u.a. über die Expression von IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IFNgamma und weiterer Lymphokine. Weitere von den NFAT´s kontrollierte Gene sind p21WAF1, der CD40L und der CD95L. Somit scheinen die NFAT´s bei der Zellzyklus-Kontrolle und beim AICD von T-Lymphozyten eine wichtige Rolle zu spielen. Daten unseres Labors zeigten, dass die T-Zell-Aktivierung zu einer massiven Induktion der kurzen Isoform A von NFATc innerhalb von 3-4 h führt [Chuvpilo et al., 1999b], noch vor dem Start des AICD. Dies ließ vermuten, dass sich die biologische Funktion von NFATc/A durch das Fehlen des C-terminalen Peptids von ca. 245 aa, das in allen anderen NFAT-Proteinen einschließlich der längeren Isoform NFATc/C vorhanden ist, unterscheidet. Deshalb sollte in der vorliegenden Arbeit die Induktion und Funktion von NFATc/A in murinen T-Lymphozyten untersucht werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Infektion primärer CD4+ T-Lymphozyten mit NFATc/A-exprimierenden rekombinanten Retroviren, im Gegensatz zu der mit NFATc/C- oder NFATp-exprimierenden Retroviren, den AICD unbeeinflusst lässt. Dies deutet darauf hin, dass es durch die massive NFATc/A-Synthese nach Effektor-T-Zell-Aktivierung zur Induktion von Effektor-Funktionen kommt, ohne dass dabei die T-Zell-Apoptose beschleunigt wird. Im Gegensatz dazu üben die langen NFAT-Faktoren wie NFATc/C und NFATp eine pro-apoptotische Wirkung aus. N2 - Hematopoietic progenitor kinase 1 (HPK1) is a member of germinal center kinases that is predominantly expressed in hematopoietic cells. The HPK1 has originally been described as an upstream Ser/Thr protein kinase of the JNK signaling cascade [Hu et al., 1996; Kiefer et al., 1996]. Recently, it was shown that T cell receptor (TCR) stimulation leads to a rapid but transient activation of HPK1 and its binding to the linker of activated T cells (LAT) and the adaptor proteins Nck, Crk and Gads. HPK1 which also binds to the signaling molecules SLP-76, Grb2, Grap and CrkL is localized in lipid rafts and needs lck and ZAP70 for its activation [Liou et al., 2000; Liu et al., 2000a; Ling et al., 2001]. These data suggested an involvement of HPK1 in the signaling transfer from the TCR to downstream signaling cascades. However, a role for HPK1 in T cell physiology remained to be shown. We show here that one of the functions of HPK1 activation upon T cell stimulation is to control the termination of immune response and, therefore, homeostasis of the immune system by supporting the ´Activation Induced Cell Death´ (AICD) of T cells. This is demonstrated by overexpressing wild type (wt) HPK1 which led to a substantial increase in spontaneous and antiCD3-mediated apoptosis as well as in Fas ligand (FasL or also CD95L) expression on murine CD4+ T cells. In contrast, expression of HPK1 antisense (AS)-RNA exerted a slight, albeit measurable suppressive effect on both apoptosis and FasL expression. Apoptosis suppression by overexpressing HPK1 AS-RNA was much more pronounced in H2O2-treated EL-4 T cells in which HPK1 overexpression stimulated cell death induced by reactive oxygen species (ROS) indicating that HPK1 indeed controls apoptosis in T cells. HPK1 expression also led to a sustained increase in c-Jun N-terminal kinase (JNK) activity suggesting that JNK activation contributes to the HPK1-mediated apoptosis in H202-treated EL-4 cells. Under the same conditions a rapid cleavage of HPK1 was observed, and overexpression of N- and C-terminal cleavage products in CD4+ T cells resulted, similar to full-length HPK1, in an increase in AICD. In agreement with published data we show that the C-terminal portion of HPK1 suppresses IkBalpha degradation thereby inhibiting NFkB activation. Taken together, these results led to a model in which, during the initial phase of T cell activation, the rapid and transient HPK1 induction provides both pro- and anti-apoptotic signals by activating JNK and NFkB signaling pathways, respectively. At a later stage, due to the accumulation of the C-terminal HPK1 cleavage product, NFkB activation is suppressed and the balance between survival and apototic signals is shifted favoring apoptosis. However, signalling events in addition to the stimulation of JNK and inhibition of NFkB signalling cascades might also be involved in the HPK1-mediated control of T cell apoptosis. The nature of these events remains to be elucidated. Nuclear Factor of activated T cells (NFAT) proteins belong to a family of transcription factors which share a common DNA binding domain of approximately 300 amino acids (aa) and a calcineurin binding domain. NFATc (also designated as NFATc1 or NFAT2) and NFATp (also designated as NFATc2 or NFAT1) are highly expressed in peripheral T cells and control their effector function, in particular the expression of lymphokines, such as IL-2, IL-3, IL-4, IL-5 and IFNgamma. Further target promoters for NFATs are the p21Waf1, the CD40 ligand and CD95 ligand promoters indicating that in addition to effector function NFATs are also involved in the control of the cell cycle and, in particular, AICD of T lymphocytes. We have shown previously that T cell activation leads to the massive induction of the short isoform A of NFATc within 3-4 h [Chuvpilo et al., 1999b], i.e. before the onset of AICD. This observation suggested that due to the lack of the C-terminal extension of approximately 245 aa which is present in all other NFAT proteins, NFATc/A might differ in biological function from other NFAT proteins, including its longer isoform NFATc/C. This view prompted us to investigate the induction and function of NFATc/A in murine T lymphocytes. Here we show that infection of primary CD4+ T lymphocytes with recombinant retroviruses expressing NFATc/A, in contrast to retroviruses expressing NFATc/C or NFATp, does not enhance AICD. These data suggest that the massive synthesis of NFATc/A upon activation of effector T cells ensures these cells to exert effector functions without inducing rapid apoptosis. KW - T-Lymphozyt KW - Apoptosis KW - HPK1 KW - NFAT KW - JNK KW - MAPK KW - NFkappaB KW - CD4+ KW - T-Lymphozyten KW - EL-4 KW - AICD KW - Apoptose KW - ROS KW - H2O2 KW - Retroviraler Gentransfer KW - HPK1 KW - NFAT KW - JNK KW - MAPK KW - NFkappaB KW - CD4+ KW - T Lymphocytes KW - EL-4 KW - AICD KW - Apoptosis KW - ROS KW - H2O2 KW - retroviral gene transfer Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-3074 ER -