TY - THES A1 - Danhof, Sophia T1 - Molekulare Untersuchung der Interaktion von Neutrophil Extracellular Traps mit dem humanen Pathogen Neisseria meningitidis T1 - Molecular investigation of the interaction of Neutrophil Extracellular Traps with the human pathogen Neisseria meningitidis N2 - Neisseria meningitidis ist ein wichtiger Erreger von Meningitis und Sepsis insbesondere bei jungen Menschen, gleichzeitig sind hohe Raten asymptomatischen Trägertums bekannt. Als die Virulenz begünstigende Faktoren wurden unter anderem die Kapsel, Pili, äußere Membranvesikel (OMV) und Lipopolysaccharid (LPS) identifiziert, die es dem Erreger erleichtern, das menschliche Immunsystem zu überwinden. Dabei war bisher die Rolle von Neutrophil Extracellular Traps (NETs) als neu beschriebene Komponente der angeborenen Immunantwort nicht untersucht worden. NETs stellen spinnennetzartige DNA-Strukturen mit globulären Proteindomänen dar, die aus neutrophilen Granulozyten entstehen und als antimikrobiell gelten. Ziel dieser Arbeit war es, die Wirkung von NETs auf Meningokokken zu charakterisieren und mögliche Resistenzmechanismen der Bakterien zu identifizieren. In den vorliegenden Versuchen konnte gezeigt werden, dass Meningokokken an NETs binden und durch diese in ihrer Proliferation gehemmt werden. Eine Lokalisation der Bakterien an die NETs konnte dargestellt werden, LPS und Pili wurden als wichtige Strukturen für die Vermittlung der NET-Bindung identifiziert. OMVs zeigten sich als protektiv gegenüber dem Einfluss der NETs, indem sie die Bindung der Erreger an die NETs blockierten. Wenig empfindlich zeigten sich die Bakterien gegenüber Histonen als den quantitativ bedeutsamsten NET-Proteinen. Meningokokken schützen sich gegenüber dem Einfluss der NETs durch Ausbildung von Kapsel und LPS mit intakter Phosphoethanolamin-Modifikation. Ebenso vermitteln zwei Cathelicidin-Resistenzgene den Bakterien einen Überlebensvorteil. Keine Rolle bei der NET-Resistenz spielten die untersuchten Effluxmechanismen. Neuere Untersuchungen von Lappann et al. indentifizierten Meningokokken und OMVs als potente NET-Induktoren. Damit könnten durch die relativ NET-resistenten Mikroorganismen andere Abwehrmechanismen der Neutrophilen konterkariert werden und eine Immunevasion begünstigt werden. Genauere Untersuchungen diesbezüglich stehen noch aus. N2 - Neisseria meningitidis is an important pathogenic agent of meningitis and sepsis especially in young adults, at the same time high rates of asymptomatic carriage are well-established. Known factors promoting virulence are, among others, the capsule, pili, outer membrane vesicles (OMV) and the lipopolysaccharide (LPS). In host defense against meningococcal disease, the role of Neutrophil Extracellular Traps (NETs), a recently described component of the innate immune response, had not yet been investigated. NETs are web like structures with globular protein domains that arise from neutrophil granulocytes and are considered being antimicrobial. The aim of the present study was to further investigate interactions between N. meningitidis and NETs and to identify possible resistance mechanisms of meningococci. In this thesis I could demonstrate that meningococci bind to NETs and are therewith being restricted in proliferation. A localization of bacteria to NETs was illustrated, and the mediating effect of LPS and pili on binding was identified. OMVs were shown to be protective against the properties of NETs by blocking the binding of pathogens to NETs. Bacteria were minor sensitive to histones which represent the quantitatively most significant group of proteins in NETs. Meningococci are protected against the effect of NETs by the formation of capsule and LPS when correctly modified with phosphoethanolamine. Two genes involved in cathelicidin resistance were shown to be beneficial on the survival of the bacteria. The investigated efflux mechanisms did not affect resistance to NETs though. Recent data by Lappann et al. identified the role of meningococci and OMVs as potent inducers of NET-formation. This might be a strategy of the NET-resilient microorganism to thwart neutrophil phagocytosis or degranulation and to facilitate immune escape, which is yet to be investigated. KW - Neisseria meningitidis KW - Meningokokken KW - Neutrophil Extracellular Traps KW - neutrophile Granulozyten KW - äußere Membranvesikel KW - antimikrobielle Peptide KW - meningococci KW - neutrophil granulocytes KW - outer membrane vesicles KW - antimicrobial peptides Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85231 ER - TY - THES A1 - Hornbach, Anke T1 - Aktivierungsmuster humaner neutrophiler Granulozyten nach Kontakt mit den pathogenen Pilzen Candida albicans und Aspergillus fumigatus T1 - Activation patterns of human neutrophils after contact with the pathogenic fungi Aspergillus fumigatus und Candida albicans N2 - Humane neutrophile Granulozyten spielen eine wichtige Rolle in der Immunabwehr invasiver Infektionen durch die humanpathogenen Pilze Candida albicans und Aspergillus fumigatus. Das Ziel der hier vorliegenden Arbeit bestand in einer Charakterisierung der Interaktion beider Pilzspezies mit neutrophilen Granulozyten, mit Fokussierung auf die unterschiedlichen Effektormechanismen dieser Zellen. C. albicans exprimiert eine Reihe von Aspartatproteasen, welche mit der Virulenz des Erregers assoziiert sind und zu Adhäsion, Gewebeinvasion und Immunevasion beitragen können. In dieser Arbeit wurde die Rolle der Aspartatproteasen Sap1-6, Sap9 und Sap10 in der Interaktion mit neutrophilen Granulozyten analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass, im Gegensatz zu anderen Aspartatproteasen, das zelloberflächenassoziierte GPI-verankerte Enzym Sap9 einen maßgeblichen Einfluss auf die Erkennung von C. albicans durch neutrophile Granulozyten hat. SAP9-Expression ist erforderlich, um die gerichtete Motilität (Chemotaxis) neutrophiler Granulozyten zu C. albicans-Keimschläuchen hin zu induzieren. Dieser Prozess stellt eine Grundvoraussetzung zur effektiven Aktivierung neutrophiler Granulozyten darstellt. Die Chemotaxis neutrophiler Granulozyten kann durch autologe Sekretion des Zytokins IL-8 verstärkt werden. Es konnte jedoch kein Einfluss von SAP9 auf die IL-8 Sekretion beobachtet werden. Allerdings führte die Deletion von SAP9 zu reduzierter Freisetzung von reaktiven Sauerstoffspezies (engl. reactive oxygen species, ROS) in neutrophilen Granulozyten. Die mit der ROS-Generierung in Verbindung stehende und durch C. albicans induzierte Apoptose neutrophiler Granulozyten war ebenfalls vermindert. In Konfrontationsassays war die Abtötung einer SAP9-Deletionsmutante verglichen mit dem Wildtyp reduziert. Die Degranulation stellt neben der Produktion von ROS einen weiteren wichtigen Effektormechanismus zur Abtötung von Mikroben dar, jedoch verlief die Freisetzung von Elastase ebenso unabhängig von SAP9 wie die durch neutrophile Granulozyten ausgelöste Wachstumsinhibition von Keimschläuchen. Die hier präsentierten Daten verbinden die Aktivität der Protease Sap9, der zuvor bereits eine Rolle in der Immunevasion von C. albicans zugeschrieben wurde, mit der Initiation der protektiven angeborenen Immunität. Wie C. albicans stimuliert auch A. fumigatus die Aktivität der neutrophilen Granulozyten. Microarray- Analysen mit Fokus auf dem Zytokinprofil neutrophiler Granulozyten während der Interaktion mit A. fumigatus-Hyphen offenbarten, dass nur wenige Zytokine im Lauf der Infektion hochreguliert wurden. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die Sap-Granulozyten-Interaktion neue molekulare Mechanismen zur Aktivierung dieser Zellen birgt. Zudem brachten die Microarray Analysen die Erkenntnis, dass die de novo-Zytokinsynthese durch A. fumigatus nur geringfügig beeinflusst wird und eine schnelle Abtötung des Pilzes offenbar im Vordergrund steht. N2 - Human polymorphonuclear neutrophils (PMNs) play a major role in the immune defence against invasive infections caused by the pathogenic fungi Candida albicans and Aspergillus fumigatus. The aim of this work was to further characterize the interaction of both fungi with PMNs with a focus on diverse PMN effector functions. C. albicans expresses a set of aspartic proteases which are associated with virulence and can contribute to adhesion, tissue invasion and immune evasion. Here, the role of the aspartic proteases Sap1-6, Sap9 and Sap10 in the interaction with human neutrophils was analysed. It could be demonstrated that, in contrast to other aspartic proteases, the cell surface associated GPI-anchored enzyme Sap9 has a major impact on recognition of C. albicans by PMNs. SAP9 expression is required for the effective induction of PMN chemotaxis towards C. albicans filaments, an essential prerequisite of effective PMN activation. Targeted motility can be enhanced by autologous secretion of IL-8, but no influence of SAP9 on the process of IL-8 secretion could be observed here. However, deletion of SAP9 led to a mitigated release of reactive oxygen intermediates (ROI) in human PMNs. Likewise, C. albicans induced apoptosis triggered by ROI formation was decreased. In confrontation assays, killing of a SAP9 deletion mutant was reduced in comparison to the wild-type. Beside ROI production, degranulation represents an additional important effector mechanism contributing to microbial killing, however, the release of elastase in response to C. albicans was found to be not dependent on SAP9, as well as the PMN-mediated growth inhibition of germ tubes. The data presented here clearly implicate Sap9 protease activity, which was already attributed to immune evasion before, with the initiation of protective innate immunity. Like C. albicans, A. fumigatus evokes PMN antifungal activity. Custom-made microarray analyses focusing on the cytokine profile of PMNs during interaction with A. fumigatus hyphae revealed that only few cytokines are upregulated during the course of infection. In summary it could be demonstrated that the interaction between Saps and PMNs is revealing novel molecular mechanisms which lead to an activation of these cells. Furthermore, microarray analyses lead to the awareness that de novo cytokine synthesis of PMNs is barely influenced by A. fumigatus, pointing out that instant killing of the fungus might be of higher importance. KW - Neutrophile Granulozyten KW - Aspergillus fumigatus KW - Candida albicans KW - Immunreaktion KW - neutrophile Granulozyten KW - Aspergillus fumigatus KW - Candida albicans KW - neutrophils KW - Aspergillus fumigatus KW - Candida albicans Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-53520 ER -