TY  - THES
A1  - Herb, Stefanie Maria
T1  - Regulation of MCMV immediate early gene expression by virally encoded miRNAs
T1  - Regulation der MCMV immediate early Genexpression durch viral kodierte miRNAs
N2  - Gene expression in eukaryotic cells is regulated by the combinatorial action of numerous gene-regulatory factors, among which microRNAs (miRNAs) play a fundamental role at the post-transcriptional level. miRNAs are single-stranded, small non-coding RNA molecules that emerge in a cascade-like fashion via the generation of primary and precursor miRNAs. Mature miRNAs become functional when incorporated into the RNA induced silencing complex (RISC). miRNAs guide RISCs to target mRNAs in a sequence-specific fashion. To this end, base-pairs are usually formed between the miRNA seed region, spanning nucleotide positions 2 to 8 (from the 5' end) and the 3'UTR of the target mRNA. Once miRNA-mRNA interaction is established, RISC represses translation and occasionally induces direct or indirect target mRNA degradation. Interestingly, miRNAs are expressed not only in every multicellular organism but are also encoded by several viruses, predominately by herpesviruses. By controlling both, cellular as well as viral mRNA transcripts, virus-encoded miRNAs confer many beneficial effects on viral growth and persistence. Murine cytomegalovirus (MCMV) is a ß-herpesvirus and so far, 29 mature MCMV-encoded miRNAs have been identified during lytic infection. Computational analysis of previously conducted photoactivated ribonucleotide-enhanced individual nucleotide resolution crosslinking immunoprecipitation (PAR-iCLIP) experiments identified a read cluster within the 3' untranslated region (3'UTR) of the immediate early 3 (IE3) transcript in MCMV. Based on miRNA target predictions, two highly abundant MCMV miRNAs, namely miR-m01-2-3p and miR-M23-2-3p were found to potentially bind to two closely positioned target sites within the IE3 PAR-iCLIP peak. To confirm this hypothesis, we performed luciferase assays and showed that activity values of a luciferase fused with the 3'UTR of IE3 were downregulated in the presence of miR-m01- 2 and miR-M23-2. In a second step, we investigated the effect of pre-expression of miR-m01-2 and miR-M23-2 on the induction of virus replication. After optimizing the transfection procedure by comparing different reagents and conditions, plaque formation was monitored. We could demonstrate that the replication cycle of the wild-type but not of our MCMV mutant that harbored point mutations in both miRNA binding sites within the IE3-3'UTR, was significantly delayed in the presence of miR-m01-2 and miR-M23-2. This confirmed that miR-m01-2 and miR-M23-2 functionally target the major transcription factor IE3 which acts as an indispensable regulator of viral gene expression during MCMV lytic infection. Repression of the major immediate early genes by viral miRNAs is a conserved feature of cytomegaloviruses. The functional role of this type of regulation can now be studied in the MCMV mouse model.
N2  - In eukaryotischen Zellen wird die Expression von Genen durch das Zusammenspiel vieler verschiedener biologischer Regulatoren, wie microRNAs (miRNAs), kontrolliert. MiRNAs sind einzelsträngige, kurze, nicht-kodierende RNA-Moleküle, die aus sogenannten primären miRNAs und Vorläufer-miRNAs entstehen und die Genexpression auf Ebene der Posttranskription beeinflussen. Um ihre Funktion ausüben zu können, werden reife miRNAs in RNA-induzierte Silencing-Komplexe (RISCs) eingebaut und zu ihren Ziel-mRNAs geführt. Durch Wechselwirkungen zwischen der miRNA "seed-Region , die die Nukleotide 2 bis 8 vom 5'-Ende überspannt und der 3'UTR (3' untranslatierte Region) der Ziel-mRNA, unterdrückt RISC die Translation der Ziel-mRNA und kann deren Abbau durch direkte sowie indirekte Mechanismen induzieren. Die Expression von miRNAs wurde nicht nur in multizellulären Organismen, sondern in bereits zahlreichen Viren, insbesondere in der Virusfamilie der Herpesviridae, nachgew- iesen. Viruskodierte miRNAs kontrollieren dabei zelluläre wie auch virale mRNA-Transkripte und verleihen dem Virus einen Selektionsvorteil bzgl. Wachstum und Persistenz. Das mur- ine Cytomegalievirus (MCMV) ist ein β-Herpesvirus, das nach aktuellem Wissensstand 29 reife miRNAs kodiert, die allesamt während der lytischen Infektion identifziert wurden. Bioinformatische Analysen eines vor dieser Arbeit durchgeführten PAR-iCLIP-Experiments (photoactivated ribonucleotide-enhanced individual nucleotide resolution crosslinking and immunoprecipitation), zeigten einen PAR-iCLIP Peak in der 3'UTR (3' untranslatierte Region) des immediate early 3-Transkripts (IE3) von MCMV. Unter Verwendung von RNAhbybrid, einem miRNA target prediction tool, fanden sich zwei virale miRNAs, näm- lich miR-m01-2-3p und miR-M23-2-3p mit potentiellen Bindestellen innerhalb der 3'UTR des MCMV IE3 Transkripts. Unsere konsekutiv durchgeführten Luciferase-Assays be- stätigten, dass sowohl miR-m01-2 als auch miR-M23-2 an die 3'UTR von IE3 binden. Beide viralen miRNAs führten zu einer verminderten Luciferaseaktivität unter Verwendung von Reportern, in denen die 3'UTR des IE3-Gens mit dem Luciferase-Transkript fusioniert war. xxiv Summary Das IE3 Protein gilt während des lytischen Zykluses als einer der wichtigsten Transkrip- tionsfaktoren von MCMV. Ebenfalls wurde der Einfluss der beiden viralen miRNAs auf die virale Reproduktion von uns untersucht. Hierfür wurden murine Zelllinien vor Infektion mit miR-m01-2 und miR- M23-2 transziert. Das Transfektionsverfahren optimierten wir zunächst durch Testung verschiedener Reagenzien und experimenteller Bedingungen. Schließlich zeigten wir mittels Plaqueassays, dass eine vor Infektion durchgeführte Transfektion mit miR-m01-2 und miR- M23-2 die Replikation von MCMV signifikant verzögerte. Unter Verwendung einer MCMV- Mutante, die durch Punktmutationen in beiden miRNA-Bindungsstellen innerhalb der IE3- 3'UTR charakterisiert war, ließ sich dieser Effekt aufheben. Unsere Experimente weisen somit stark darauf hin, dass miR-m01-2 und miR-M23-2 die Expression des IE3 Proteins regulieren und damit indirekt Einfluss auf die Genexpression während der lytischen Phase des Replikationszykluses von MCMV nehmen. Die miRNA-mediierte Repression der immediate early Genexpression stellt ein evolutionär konserviertes Merkmal von Zytomegalieviren dar. Für eine weitere Einordnung der Rolle dieser Genexpressionskontrolle bedarf es zukünftige Untersuchungen im MCMV-Tiermodell
KW  - miRNS
KW  - Cytomegalie-Virus
KW  - Herpes
KW  - Frühe Gene
KW  - PAR-CLIP
KW  - MCMV
KW  - miRNA
KW  - immediate early genes
KW  - lytic infection
KW  - IE3
KW  - miRNA target
KW  - luciferase assay
KW  - CMV
KW  - HCMV
KW  - viral miRNAs
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-323314
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TY  - THES
A1  - Jentzsch, Claudia
T1  - Identifizierung und Charakterisierung funktionell relevanter kardialer Faktoren
T1  - Identification and characterization of functionally relevant cardiac factors
N2  - Die chronische Herzinsuffizienz stellt nach wie vor eine der häufigsten Todesursachen weltweit dar. Trotz intensiver Forschung ist es bisher nicht möglich die pathophysiologischen Prozesse aufzuhalten. Es wird nach neuen Strategien gesucht, hier therapeutisch eingreifen zu können. Kleine nicht-kodierende RNAs, sogenannte microRNAs (miRNAs), wurden als wichtige Faktoren bei verschiedenen Herzkrankheiten beschrieben. Die Mehrzahl der bisherigen Studien fokussierte sich dabei auf die am stärksten deregulierten miRNAs im erkrankten Herz. In einer automatisierten Analyse im 96 Well-Format untersuchten wir 230 miRNAs auf ihr Potential, in das Größenwachstum von primären Kardiomyozyten einzugreifen. Aus den miRNAs mit den größten Effekten selektierten wir diejenigen, die eine hohe endogene Expression aufwiesen, und unterzogen sie einem Validierungsprozess. Hier konnten wir die Effekte aller pro- (miR-22, miR-30c, miR-30d, miR-212, miR-365) und anti-hypertrophen (miR-27a, miR-27b, miR-133a) miRNAs bestätigen. Die Mehrzahl dieser miRNAs wurde hiermit erstmalig beschrieben, dass sie eine wichtige Rolle beim Größenwachstum von Kardiomyozyten spielen. Sie wären daher interessante Kandidaten für detaillierte funktionelle Studien mit dem Ziel ihr therapeutisches Potential zu evaluieren. In einem früheren genetischen Screen zur Identifizierung von kardialen, sezernierten Faktoren wurde der Protease Inhibitor 16 (PI16) entdeckt, der sich im insuffizienten Herz durch eine starke Akkumulation auszeichnet. Gegenstand des zweiten Teils dieser Arbeit war es, eine Mauslinie zu generieren, in der PI16 global oder konditionell mit Hilfe des Cre/LoxP-Systems ausgeschaltet werden kann. Nach Elektroporation des Pi16floxneo Targeting Vektors in embryonale Stammzellen und Blastozysteninjektion erhielten wir eine Mauslinie, die Träger der zielgerichteten Modifikation des Pi16 Allels war. Mit der globalen genetischen Deletion des LoxP-flankierten Abschnitts von Exon 3 bis 4 konnten wir die Expression des Pi16 Gens komplett unterbinden. Die PI16 Defizienz führte weder im Herz noch in anderen Organen per se zu pathologischen Veränderungen. Zudem war unbekannt, dass PI16 in der gesunden Maus in der kardialen Fibroblastenfraktion enthalten sowie in den Zilien der Epididymis und der Trachea und im Lumen der Schilddrüse lokalisiert ist. Im insuffizienten Herz bestätigten wir eine Akkumulation von PI16, die sich vor allem auf die fibrotischen Bereiche beschränkte. Das lässt Grund zur Annahme, dass die kardiale Funktion von PI16 erst dann offensichtlich wird, wenn man die defizienten Mäuse zukünftig entsprechenden Stressmodellen aussetzt. Das wird zu einem umfassenden Verständnis der kardialen Funktion von PI16 und dessen Potential als therapeutisches Zielmolekül führen.
N2  - Chronic heart failure is one of the main causes of death worldwide. Although the pathophysiological processes have been intensely studied within the past they are still detrimental. New therapeutic interventions have to be identified to interfere with these processes. Small non-coding RNAs, so-called microRNAs (miRNAs), have been described to be important factors in several cardiac diseases. The majority of these studies focussed on miRNAs that are deregulated under disease conditions. In an unbiased screening approach we investigated 230 miRNAs for their potential to either promote or inhibit hypertrophy of primary cardiomyocytes. Using an automated system and a 96 well format we identified several miRNAs with strong effects on hypertrophic growth. From these we selected five pro- (miR-22, miR-30c, miR-30d, miR-212, miR-365) and three anti-hypertrophic (miR-27a, miR-27b, miR-133a) miRNAs for validation experiments, all of which displayed strong expression. All of these selected miRNAs could be confirmed in independent validation experiments with the majority not yet been described to be involved in cardiomyocyte hypertrophy. Detailed analysis of these candidate miRNAs will provide insights into the understanding of cardiac hypertrophy and their therapeutic potential for treatment of cardiac disease. In a previous study that used a genetic yeast screen to identify cardiac secreted factors we had identified Protease Inhibitor 16 (PI16) that is strongly accumulating in failing myocardium. In the second part of this work we generated a mouse line where PI16 expression can be deleted globally or conditionally using the Cre/LoxP recombination system. After electroporation of the Pi16floxneo targeting vector in embryonic stem cells and successful injection into murine blastocysts we gained a mouse line that carried the targeted modification of the Pi16 allele. Upon global deletion of the floxed region from Exon 3 to 4 we could completely delete PI16 expression. PI16 deficiency per se led to a phenoytpe neither in the heart nor in other organs of these mice. Furthermore it was unknown that PI16 localizes to cardiac fibroblasts, the cilia of the epididymis and trachea as well as to the lumen of the thyroid gland in healthy tissue. In the failing heart we could confirm accumulation of PI16 preferentially in fibrotic areas. Therefore we assume that PI16s function could only become obvious as soon as one applies respective cardiac stress models. Applying such models will contribute to a broader understanding of the function of PI16 and its potential as a therapeutic target molecule.
KW  - miRNS
KW  - Herzhypertrophie
KW  - Sezernierte Faktoren
KW  - miRNA
KW  - cardiac hypertrophy
KW  - secreted factors
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-66699
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TY  - THES
A1  - Karl, Franziska
T1  - The role of miR-21 in the pathophysiology of neuropathic pain using the model of B7-H1 knockout mice
T1  - Die Rolle von miR-21 in der Pathophysiologie von neuropathischem Schmerz am Model der B7-H1 defizienten Maus
N2  - The impact of microRNA (miRNA) as key players in the regulation of immune and neuronal gene expression and their role as master switches in the pathophysiology of neuropathic pain is increasingly recognized. miR-21 is a promising candidate that could be linked to the immune and the nociceptive system. To further investigate the pathophysiological role of miR-21 in neuropathic pain, we assesed mice deficient of B7 homolog 1 (B7-H1 ko), a protein with suppressive effect on inflammatory responses.
B7-H1 ko mice and wildtype littermates (WT) of three different age-groups, young (8 weeks), middle-aged (6 months), and old (12 months) received a spared nerve injury (SNI). Thermal withdrawal latencies and mechanical withdrawal thresholds were determined. Further, we investigated anxiety-, depression-like and cognitive behavior. Quantitative real time PCR was used to determine miR-21 relative expression in peripheral nerves, dorsal root ganglia and white blood cells (WBC) at distinct time points after SNI. 
Naïve B7-H1 ko mice showed mechanical hyposensitivity with increasing age. Young and middle-aged B7-H1 ko mice displayed lower mechanical withdrawal thresholds compared to WT mice. From day three after SNI both genotypes developed mechanical and heat hypersensitivity, without intergroup differences. As supported by the results of three behavioral tests, no relevant differences were found for anxiety-like behavior after SNI in B7-H1 ko and WT mice. Also, there was no indication of depression-like behavior after SNI or any effect of SNI on cognition in both genotypes. The injured nerves of B7-H1 ko and WT mice showed higher miR-21 expression and invasion of macrophages and T cells 7 days after SNI without intergroup differences. Perineurial miR-21 inhibitor injection reversed SNI-induced mechanical and heat hypersensitivity in old B7-H1 ko and WT mice.
This study reveals that reduced mechanical thresholds and heat withdrawal latencies are associated with miR-21 induction in the tibial and common peroneal nerve after SNI, which can be reversed by perineurial injection of a miR-21 inhibitor. Contrary to expectations, miR-21 expression levels were not higher in B7-H1 ko compared to WT mice. Thus, the B7-H1 ko mouse may be of minor importance for the study of miR-21 related pain. However, these results spot the contribution of miR-21 in the pathophysiology of neuropathic pain and emphasize the crucial role of miRNA in the regulation of neuronal and immune circuits that contribute to neuropathic pain.
N2  - Die Beteiligung von microRNA (miRNA) an der Genregulation immunologischer und neuronaler Prozesse und deren Rolle als Schlüsselelement in der Pathophysiologie von neuropathischem Schmerz gewinnt zunehmend an Bedeutung. miR-21 ist ein vielversprechender Kandidat, der sowohl das Immunsystem, als auch das nozizeptive System beeinflusst. Um die pathophysiologische Rolle von miR-21 bei neuropathischem Schmerz besser zu verstehen wurden Mäuse mit B7 homolog 1 Defizienz (B7-H1 ko), einem immunsupprimierendem Protein, untersucht. Eine frühere Studie zeigte eine Hochregulierung von miR-21 in murinen Lymphozyten.
Junge (8 Wochen), mittelalte (6 Monate) und alte (12 Monate) B7-H1 ko Mäuse und Wildtypwurfgeschwister (WT) erhielten eine spared nerve injury (SNI) als neuropathischem Schmerzmodell. Es wurden thermische Rückzugslatenzen und mechanische Rückzugsschwellen bestimmt. Des weiteren wurde sowohl das Angstverhalten, das depressive Verhalten, als auch das kognitive Verhalten untersucht. Um die relative Expression von miR-21 in den peripheren Nerven, den Spinalganglien und in den weißen Blutzellen zu verschiedenen Zeitpunkten zu bestimmen, wurde die quantitative real time PCR angewandt. 
Naive B7-H1 ko Mäuse zeigten mit zunehmendem Alter eine mechanische Hyposensitivität. Bereits 3 Tage nach SNI entwickelten beide Genotypen eine Überempfindlichkeit gegenüber Hitze und mechanischer Stimulation. In drei durchgeführten Verhaltenstests konnten keine relevanten Unterschiede im Angstverhalten nach SNI von B7-H1 ko und WT Mäusen festgestellt werden. Bei beiden Genotypen gab es weder Hinweise auf depressives Verhalten nach SNI, noch wurde das kognitive Verhalten durch SNI beeinträchtigt. Die verletzen Nerven der B7-H1 ko und WT Mäuse zeigten 7 Tage nach SNI eine höhere miR-21 Expression und eine Invasion durch Makrophagen und T-Zellen ohne Gruppenunterschiede. Die perineurale Injektion eines miR-21 Inhibitors konnte die durch SNI induzierte mechanische und thermische Hypersensitivität lindern. 
Diese Studie zeigt, dass der Anstieg von miR-21 im N. tibialis und N. peroneus communis mit reduzierten Rückzugsschwellen gegen mechanische Reize und verkürzten Wegzugslatenzen bei Hitzestimulation einhergeht, welche durch perineurale Injektion eines miR-21 Inhibitors verringert werden können. Entgegen der Erwartungen zeigten B7-H1 ko Mäuse im Vergleich zu WT Mäusen keine erhöhte miR-21 Expression und sind daher möglicherweise von geringer Bedeutung für die Untersuchung von miR-21 assoziiertem Schmerz. Jedoch bekräftigen diese Ergebnisse eine Beteiligung von miR-21 an der Pathophysiologie von neuropathischem Schmerz und bestätigen die wichtige Rolle von miRNA bei der Regulation von neuronalen und immunologischen Prozessen, die zu neuropathischem Schmerz beitragen.
KW  - neuropathic pain
KW  - inflammation
KW  - B7-H1
KW  - immune system
KW  - neuropathic pain
KW  - miRNA
KW  - miR-21
Y1  - 2017
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-156004
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TY  - THES
A1  - Vardapour, Romina
T1  - Mutations in the DROSHA/DGCR8 microprocessor complex in high-risk blastemal Wilms tumor
T1  - Mutationen des DROSHA/DGCR8 Mikroprozessor-Komplexes in blastemreichen Hochrisiko-Wilms Tumoren
N2  - Wilms tumor (WT) or nephroblastoma is the most common kidney tumor in childhood. Several genetic alterations have been identified in WT over the past years. However, a clear-cut underlying genetic defect has remained elusive. Growing evidence suggests that miRNA processing genes play a major role in the formation of pediatric tumors, including WT.
We and others have identified the microprocessor genes DROSHA and DGCR8 as key players in Wilms tumorigenesis. Exome sequence analysis of a cohort of blastemal-type WTs revealed the recurrent hotspot mutations DROSHA E1147K and DGCR8 E518K mapping to regions important for catalyic activity and RNA-binding. These alterations were expected to affect processing of miRNA precursors, ultimately leading to altered miRNA expression. Indeed, mutated tumor samples were characterized by distinct miRNA patterns. Notably, these mutations have been observed almost exclusively in WT, suggesting that they play a specific role in WT formation.
The aim of the present work was to first examine the mutation frequency of DROSHA E1147K and DGCR8 E518K in a larger cohort of WTs, and to further characterize these microprocessor gene mutations as potential oncogenic drivers for WT formation. 
Screening of additional 700 WT samples by allele-specific PCR revealed a high frequency of DROSHA E1147K and DGCR8 E518K mutations, with the highest incidence found in tumors of high-risk histology. DROSHA E1147K was heterozygously expressed in all cases, which strongly implies a dominant negative effect. In contrast, DGCR8 E518K exclusively exhibited homozygous expression, suggestive for the mutation to act recessive. 
To functionally assess the mutations of the microprocessor complex in vitro, I generated stable HEK293T cell lines with inducible overexpression of DROSHA E1147K, and stable mouse embryonic stem cell (mESC) lines with inducible overexpression of DGCR8 E518K. To mimic the homozygous expression observed in WT, DGCR8 mESC lines were generated on a DGCR8 knockout background. Inducible overexpression of wild-type or mutant DROSHA in HEK293T cells showed that DROSHA E1147K leads to a global downregulation of miRNA expression. It has previously been shown that the knockout of DGCR8 in mESCs also results in a significant downregulation of canonical miRNAs. Inducible overexpression of wild type DGCR8 rescued this processing defect. DGCR8 E518K on the other hand, only led to a partial rescue. Differentially expressed miRNAs comprised members of the ESC cell cycle (ESCC) and let-7 miRNA families whose antagonism is known to play a pivotal role in the regulation of stem cell properties. Along with altered miRNA expression, DGCR8-E518K mESCs exhibited alterations in target gene expression potentially affecting various biological processes.
We could observe decreased proliferation rates, most likely due to reduced cell viability. DGCR8-E518K seemed to be able to overcome the block of G1-S transition and to rescue the cell cycle defect in DGCR8-KO mESCs, albeit not to the full extent like DGCR8-wild-type. Moreover, DGCR8-E518K appeared to be unable to completely block epithelial-to-mesenchymal transition (EMT). Embryoid bodies (EBs) with the E518K mutation, however, were still able to silence the self-renewal program rescuing the differentiation defect in DGCR8-KO mESCs.
Taken together, I could show that DROSHA E1147K and DGCR8 E518K are frequent events in WT with the highest incidence in high-risk tumor entities. Either mutation led to altered miRNA expression in vitro confirming our previous findings in tumor samples. While the DROSHA E1147K mutation resulted in a global downregulation of canonical miRNAs, DGCR8 E518K was able to retain significant activity of the microprocessor complex, suggesting that partial reduction of activity or altered specificity may be critical in Wilms tumorigenesis.
Despite the significant differences found in the miRNA and mRNA profiles of DGCR8 E518K and DGCR8-wild-type mESCs, functional analysis showed that DGCR8 E518K could mostly restore important cellular functions in the knockout and only slightly differed from the wild-type situation. Further studies in a rather physiological environment, such as in a WT blastemal model system, may additionally help to better assess the subtle differences between DGCR8 E518K and DGCR8 wild-type observed in our mESC lines. Together with our findings, these model systems may thus contribute to better understand the role of these microprocessor mutations in the formation of WT.
N2  - Der Wilms Tumor (WT), auch Nephroblastom genannt, ist der häufigste Nierentumor im Kindesalter. In den letzten Jahren wurden bereits mehrere genetische Veränderungen in Wilms Tumoren festgestellt. Bisher konnte jedoch keine eindeutige genetische Ursache gefunden werden. Immer mehr Erkenntnisse deuten darauf hin, dass miRNA Prozessierungsgene eine wichtige Rolle bei der Entstehung von pädiatrischen Tumoren, einschließlich von WT, spielen.
Uns ist es gelungen die Mikroprozessor-Gene DROSHA und DGCR8 als entscheidende Faktoren in der WT-Entstehung zu identifizieren. Mit Hilfe der Exom-Sequenzierung einer Kohorte blastemreicher Wilms Tumoren konnten die wiederkehrenden Hotspot-Mutationen DROSHA E1147K and DGCR8 E518K gefunden werden. Diese Mutationen betreffen Regionen, die für die katalytische Aktivität und die Bindung von RNA wichtig sind. Diese Veränderungen beeinflussen vermutlich die Prozessierung von Vorläufer-miRNAs und führen letztendlich zu einer veränderten miRNA Expression. In der Tat waren mutierte Tumorproben durch auffällige Expressionsmuster gekennzeichnet.
Bemerkenswerterweise wurden diese Mutationen fast ausschließlich in WT beobachtet, was darauf hindeutet, dass sie eine spezifische Rolle bei der Entstehung von WT spielen.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, zunächst die Mutationshäufigkeit von DROSHA E1147K und DGCR8 E518K in einer größeren Kohorte von Wilms Tumoren zu untersuchen und anschließend diese Mikroprozessor-Genmutationen als mögliche onkogene Treiber für die WT-Entstehung näher zu charakterisieren. 
Das Screening von zusätzlichen 700 WT-Proben mittels allelspezifischer PCR ergab eine hohe Häufigkeit von DROSHA E1147K und DGCR8 E518K Mutationen. Dabei traten sie vermehrt bei Tumoren mit einer Hochrisikohistologie auf. Die DROSHA E1147K Mutation wurde in allen Fällen heterozygot exprimiert, was einen dominant-negativen Effekt impliziert. Im Gegensatz dazu zeigte die DGCR8 E518K Mutation ausschließlich eine homozygote Expression, was darauf hindeutet, dass die Mutation rezessiv wirkt.
Um die Mutationen des Mikroprozessorkomplexes in vitro funktionell zu untersuchen, generierte ich stabile HEK293T-Zelllinien mit induzierbarer Überexpression von DROSHA E1147K, und stabile embryonale Mausstammzelllinien mit induzierbarer Überexpression von DGCR8 E518K. Um die in WT beobachtete homozygote Expression nachzustellen, wurden für die Erzeugung der DGCR8-Zelllinien Mausstammzellen mit einem DGCR8-Knockout verwendet. 
Die induzierbare Überexpression von Wildtyp oder mutiertem DROSHA in HEK293T-Zellen zeigte, dass DROSHA E1147K zu einer globalen Herunterregulierung der miRNA-Expression führt. Es wurde zuvor gezeigt, dass der Knockout von DGCR8 in Mausstammzellen ebenfalls zu einer signifikanten Herunterregulierung kanonischer miRNAs führt. Die induzierbare Überexpression von Wildtyp DGCR8 konnte diesen Prozessierungsdefekt aufheben. DGCR8 E518K führte dagegen nur zu einer partiellen Behebung des Prozessierungsdefekts. Differenziell exprimierte miRNAs umfassten hierbei Mitglieder aus der stammzellspezifischen ESCC-Familie und der let-7-miRNA-Familie, deren Antagonismus bekanntermaßen eine bedeutende Rolle bei der Regulation von Stammzelleigenschaften spielt. Zusammen mit einer veränderten miRNA-Expression zeigten DGCR8-E518K-Zellen Veränderungen in der Zielgenexpression, welche möglicherweise verschiedene biologische Prozesse beeinflussen können. 
Wir konnten verringerte Proliferationsraten beobachten, höchstwahrscheinlich aufgrund einer verringerten Lebensfähigkeit der Zellen. DGCR8-E518K schien in der Lage zu sein, den Block des G1-S Übergangs zu überwinden und den Zellzyklusdefekt in DGCR8-KO-Zellen zu beheben, wenn auch nicht in vollem Umfang wie Wildtyp DGCR8. Darüber hinaus schien DGCR8-E518K nicht in der Lage zu sein, die epithelial-mesenchymale Transition (EMT) vollständig blockieren zu können. Embryoid-Körper (EBs) mit der E518K Mutation konnten das Selbsterneuerungsprogramm jedoch noch unterdrücken und somit den Differenzierungsdefekt in DGCR8-KO-Zellen beheben.
Zusammenfassend konnte ich zeigen, dass DROSHA E1147K und DGCR8 E518K häufige Mutationen in WT sind und dabei am häufigsten in Hochrisiko-Tumoren vorkommen. Jede dieser Mutationen führte in vitro zu einer veränderten miRNA-Expression, was unsere vorherigen Befunde in Tumorproben bestätigte. Während die DROSHA E1147K Mutation zu einer globalen Herunterregulierung kanonischer miRNAs führte, konnte die DGCR8 E518K Mutation die Aktivität des Mikroprozessorkomplexes größtenteils wiederherstellen, was darauf hindeutet, dass eine teilweise Verringerung der Aktivität oder eine veränderte Spezifität bei der WT-Entstehung kritisch sein könnte. 
Trotz der signifikanten Unterschiede in den miRNA- und mRNA-Profilen von DGCR8-E518K- und DGCR8 Wildtyp-Zellen, ergab die Funktionsanalyse, dass DGCR8 E518K viele wichtige Zellfunktionen im Knockout wiederherstellen konnte und sich nur geringfügig von der Wildtyp-Situation unterschied. Weitere Studien unter physiologischeren Bedingungen, wie beispielsweise in einem WT-Blastem-Modellsystem, könnten zusätzlich helfen, die in unseren Mausstammzelllinien beobachteten feinen Unterschiede zwischen DGCR8 E518K und DGCR8 Wildtyp besser bewerten zu können. Zusammen mit unseren Erkenntnissen könnten diese Modellsysteme somit dazu beitragen, die Rolle dieser Mikroprozessormutationen bei der WT-Entstehung besser zu verstehen.
KW  - Nephroblastom
KW  - Genmutation
KW  - miRNS
KW  - Wilms tumor
KW  - miRNA
KW  - microprocessor complex
KW  - DROSHA
KW  - DGCR8
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-231404
ER  -