TY  - JOUR
A1  - Alzheimer, Mona
A1  - Svensson, Sarah L.
A1  - König, Fabian
A1  - Schweinlin, Matthias
A1  - Metzger, Marco
A1  - Walles, Heike
A1  - Sharma, Cynthia M.
T1  - A three-dimensional intestinal tissue model reveals factors and small regulatory RNAs important for colonization with Campylobacter jejuni
JF  - PLoS Pathogens
N2  - The Gram-negative Epsilonproteobacterium Campylobacter jejuni is currently the most prevalent bacterial foodborne pathogen. Like for many other human pathogens, infection studies with C. jejuni mainly employ artificial animal or cell culture models that can be limited in their ability to reflect the in-vivo environment within the human host. Here, we report the development and application of a human three-dimensional (3D) infection model based on tissue engineering to study host-pathogen interactions. Our intestinal 3D tissue model is built on a decellularized extracellular matrix scaffold, which is reseeded with human Caco-2 cells. Dynamic culture conditions enable the formation of a polarized mucosal epithelial barrier reminiscent of the 3D microarchitecture of the human small intestine. Infection with C. jejuni demonstrates that the 3D tissue model can reveal isolate-dependent colonization and barrier disruption phenotypes accompanied by perturbed localization of cell-cell junctions. Pathogenesis-related phenotypes of C. jejuni mutant strains in the 3D model deviated from those obtained with 2D-monolayers, but recapitulated phenotypes previously observed in animal models. Moreover, we demonstrate the involvement of a small regulatory RNA pair, CJnc180/190, during infections and observe different phenotypes of CJnc180/190 mutant strains in 2D vs. 3D infection models. Hereby, the CJnc190 sRNA exerts its pathogenic influence, at least in part, via repression of PtmG, which is involved in flagellin modification. Our results suggest that the Caco-2 cell-based 3D tissue model is a valuable and biologically relevant tool between in-vitro and in-vivo infection models to study virulence of C. jejuni and other gastrointestinal pathogens.
KW  - in vitro
KW  - stem cells
KW  - invasion
KW  - host
KW  - adhesion
KW  - epithelial cells
KW  - translocation
KW  - virulence
KW  - responses
KW  - microenvironment
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-229454
VL  - 16
IS  - 2
ER  - 
TY  - THES
A1  - Bellwon, Patricia
T1  - Kinetic assessment by in vitro approaches - A contribution to reduce animals in toxicity testing
T1  - Evaluierung der Kinetik anhand von in vitro Systemen - Ein Beitrag um die Anzahl von Tierversuchen zur Toxizitätsprüfung zu reduzieren
N2  - The adoption of directives and regulations by the EU requires the development of alternative testing strategies as opposed to animal testing for risk assessment of xenobiotics. Additionally, high attrition rates of drugs late in the discovery phase demand improvement of current test batteries applied in the preclinical phase within the pharmaceutical area. These issues were taken up by the EU founded 7th Framework Program “Predict-IV”; with the overall goal to improve the predictability of safety of an investigational product, after repeated exposure, by integration of “omics” technologies applied on well established in vitro approaches. Three major target organs for drug-induced toxicity were in focus: liver, kidney and central nervous system. To relate obtained dynamic data with the in vivo situation, kinetics of the test compounds have to be evaluated and extrapolated by physiologically based pharmacokinetic modeling. 
This thesis assessed in vitro kinetics of the selected test compounds (cyclosporine A, adefovir dipivoxil and cisplatinum) regarding their reliability and relevance to respective in vivo pharmacokinetics. Cells were exposed daily or every other day to the test compounds at two concentration levels (toxic and non-toxic) for up to 14 days. Concentrations of the test compounds or their major biotransformation products were determined by LC-MS/MS or ICP-MS in vehicle, media, cells and plastic adsorption samples generated at five different time-points on the first and the last treatment day. 
Cyclosporine A bioaccumulation was evident in primary rat hepatocytes (PRH) at the high concentration, while efficient biotransformation mediated by CYP3A4 and CYP3A5 was determined in primary human hepatocytes (PHH) and HepaRG cells. The lower biotransformation in PRH is in accordance with observation made in vivo with the rat being a poor model for CYP3A biotransformation. Further, inter-assay variability was noticed in PHH caused by biological variability in CYP3A4 and CYP3A5 activity in human donors. The inter-assay variability observed for PRH and HepaRG cells was a result of differences between vehicles regarding their cyclosporine A content. Cyclosporine A biotransformation was more prominent in HepaRG cells due to stable and high CYP3A4 and CYP3A5 activity. In addition, in vitro clearances were calculated and scaled to in vivo. All scaled in vitro clearances were overestimated (PRH: 10-fold, PHH: 2-fold, HepaRG cells: 2-fold). These results should be proven by physiologically-based pharmacokinetic modeling and additional experiments, in order to verify that these overestimations are constant for each system and subsequently can be diminished by implementation of further scaling factors. 
Brain cell cultures, primary neuronal culture of mouse cortex cells and primary aggregating rat brain cells, revealed fast achieved steady state levels of cyclosporine A. This indicates a chemical distribution of cyclosporine A between the aqueous and organic phases and only minor involvement of biological processes such as active transport and biotransformation. Hence, cyclosporine A uptake into cells is presumably transport mediated, supported by findings of transporter experiments performed on a parallel artificial membrane and Caco-2 cells. Plastic adsorption of cyclosporine A was significant, but different for each model, and should be considered by physiologically based pharmacokinetic modeling. 
Kinetics of adefovir dipivoxil highlights the limits of in vitro approaches. Active transporters are required for adefovir uptake, but were not functional in RPTECT/TERT1. Therefore, adefovir uptake was limited to passive diffusion of adefovir dipivoxil, which itself degrades time-dependently under culture conditions. 
Cisplatinum kinetics, studied in RPTEC/TERT1 cells, indicated intracellular enrichment of platinum, while significant bioaccumulation was not noted. This could be due to cisplatinum not reaching steady state levels within 14 days repeated exposure. As shown in vivo, active transport occurred from the basolateral to apical side, but with lower velocity. Hence, obtained data need to be modeled to estimate cellular processes, which can be scaled and compared to in vivo.
Repeated daily exposure to two different drug concentrations makes it possible to account for bioaccumulation at toxic concentrations or biotransformation/extrusion at non-toxic concentrations. Potential errors leading to misinterpretation of data were reduced by analyses of the vehicles as the applied drug concentrations do not necessarily correspond to the nominal concentrations. Finally, analyses of separate compartments (medium, cells, plastic) give insights into a compound’s distribution, reduce misprediction of cellular processes, e.g. biotransformation, and help to interpret kinetic data. On the other hand, the limits of in vitro approaches have also been pointed out. For correct extrapolation to in vivo, it is essential that the studied in vitro system exhibits the functionality of proteins, which play a key role in the specific drug induced toxicity. Considering the benefits and limitations, it is worth to validate this long-term treatment experimental set-up and expand it on co-culture systems and on organs-on-chips with regard to alternative toxicity testing strategies for repeated dose toxicity studies.
N2  - Die Erlassung von Richtlinien und Verordnungen durch die EU führte zu der Entwicklung von alternativen Testmethoden als Ersatz von Tierversuchen zur Risikobewertung von Xenobiotika. Des Weiteren weisen hohe Ausfallraten von Arzneimitteln in der späten Entwicklungsphase auf die Notwendigkeit hin, die bisher verwendeten Testmethoden der präklinischen Phase zu verbessern. Diese Punkte wurden in dem im siebten Rahmenprogramm der EU finanzierten Projekt „Predict-IV“ aufgegriffen. Ziel des Projektes war es, die Vorhersage der Arzneimittelsicherheit durch integrierte „omics“-Technologien, angewendet an etablierten in vitro Ansätzen, zu verbessern. Dabei standen drei Zielorgane bzgl. Arzneimittel-induzierter Organtoxizität im Mittelpunkt: Leber, Niere und zentrales Nervensystem, die jeweils durch Zelllinien oder primäre Zellen vertreten waren. Um die in vitro generierten Dynamik-Daten mit der in vivo Situation in Korrelation zu bringen, muss die Kinetik der Testsubstanz berücksichtigt und die Ergebnisse mit Hilfe von physiologisch-basierter pharmakokinetischer Modellierung extrapoliert werden. 
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Kinetik-Daten der gewählten Testsubstanzen (Cyclosporin A, Adefovir dipivoxil und Cisplatin) in vitro zu erheben und bzgl. ihrer Zuverlässigkeit sowie ihrer Relevanz verglichen mit in vivo Daten zu beurteilen. Hierfür wurden kultivierte Zellen täglich bzw. jeden zweiten Tag für zwei Wochen mit zwei verschiedenen Konzentrationen (toxisch und nicht toxisch) des Arzneimittels behandelt. Der Gehalt des applizierten Arzneimittels oder die Hauptmetaboliten wurden mittels LC MS/MS oder ICP-MS in Vehikel, Medium und Zellen sowie die vom Plastik adsorbierte Menge in Proben bestimmt, die am ersten und letzten Behandlungstag zu fünf unterschiedlichen Zeitpunkten gewonnen wurden.
Eine eindeutige Bioakkumulation von Cyclosporin A wurde in primären Rattenhepatozyten nach Behandlung mit der hohen Konzentration festgestellt. Eine effiziente CYP3A4- und CYP3A5-vermittelte Biotransformation von Cyclosporin A wurde für primäre humane Hepatozyten sowie HepaRG Zellen beobachtet. Diese Ergebnisse stimmten mit der in vivo Situation überein. Ratten sind aufgrund ihrer geringen CYP3A Aktivität schlechte Tiermodelle für CYP3A-Biotransformationsstudien. Des Weiteren wurden Interassay-Schwankungen bei primären human Hepatozyten bemerkt, die auf die biologische Variabilität der CYP3A4- sowie CYP3A5-Aktivität zwischen den menschlichen Spendern zurückzuführen sind. Rattenhepatozyten und HepaRG Zellen hingegen wiesen Interassay-Schwankungen auf, die durch unterschiedliche Cyclosporin A Behandlungskonzentrationen zwischen den Replikaten verursacht wurden. Die Cyclosporin A Biotransformation war in HepaRG Zellen am stärksten ausgeprägt, was durch stabile und wesentlich höhere CYP3A4- und CYP3A5-Aktivität in HepaRG Zellen zu erklären ist. Zusätzlich wurden die in vitro Clearance-Werte bestimmt und auf in vivo Clearance-Werte extrapoliert. Alle extrapolierten Werte waren zu hoch geschätzt (primäre Rattenhepatozyten: 10fach, primäre human Hepatpzyten: 2fach, HepaRG Zellen: 2fach). Diese Ergebnisse sollten mittels physiologisch-basierter pharmakokinetischer Modellierung sowie durch weitere Experimente überprüft werden, um zu ermitteln, ob diese hohen Schätzungen für jedes System konstant sind und somit durch die Einführung von weiteren Skalierungsfaktoren verringert werden können.
Kultivierte Gehirnzellen, primäre Nervenzellkulturen der Kortex von Mäusen und primäre Hirnzellaggregate der Ratte, zeigten schnell erreichte Cyclosporin A Gleichgewichtskonzentrationen. Diese Ergebnisse deuteten auf eine Verteilung von Cyclosporin A zwischen der wässrigen und organischen Phase hin, wobei biologische Prozesse nur eine untergeordnete Rolle spielen. Daher scheint die intrazelluläre Cyclosporin A Aufnahme Transporter-vermittelt zu sein. Ergebnisse der Transporter Experimente, die an einer künstlichen Membran und Caco-2 Zellen durchgeführt wurden, unterstützten diese Hypothese. Messungen der Plastikbindung von Cyclosporin A zeigten signifikante, aber für jedes Zellsystem unterschiedliche, Adsorptionsraten, die mittels physiologisch-basierter pharmakokinetischer Modellierung berücksichtigt werden sollten. 
Die Kinetik von Adefovir dipivoxil machte auf die Nachteile von in vitro Versuchen aufmerksam. Für die intrazelluläre Aufnahme von Adefovir sind aktive Transportproteine nötig, die jedoch in der Nierenzelllinie RPTEC/TERT1 nicht funktionell vorhanden sind. Daher war die Aufnahme von Adefovir auf die passive Diffusion von Adefovir dipivoxil beschränkt, das aber auch zeitabhängig unter den experimentellen Konditionen zerfiel. 
Die an RPTEC/TERT1 Zellen untersuchte Kinetik von Cisplatin deutete auf eine intrazelluläre Platin-Anreicherung hin, die jedoch nicht in einer signifikanten Bioakkumulation resultierte. Möglicherweise sind innerhalb von 14 Tagen die Gleichgewichtskonzentrationen von Cisplatin noch nicht erreicht. Die Kinetikprofile von Cisplatin in Medium ließen einen aktiven, von der basolateralen zur apikalen Seite gerichteten Cisplatin Transport erkennen, wie schon in vivo beschrieben, wobei die Geschwindigkeit dieser Transportprozesse in vitro langsamer zu sein scheint als in der intakte Niere. Daher müssen die generierten Daten zur Schätzung von zellulären Prozessen modelliert werden, um durch anschließende Extrapolation mit in vivo Daten verglichen werden zu können.
Abschließend bleibt zu sagen, dass das experimentelle Design vorteilhaft war. Wiederholte tägliche Administration von zwei unterschiedlichen Konzentrationen eines Medikaments ermöglichte die Erfassung von Bioakkumulation bei toxischen Konzentrationen sowie Biotransformation/Export bei nicht-toxischen Konzentrationen. Potenzielle Fehler, die zu einer Fehlinterpretation führen könnten, wurden durch die exakte Bestimmung der tatsächlich applizierten Arzneimittelmenge reduziert, da nicht immer die applizierte Konzentration mit der Nominalkonzentration übereinstimmt. Darüber hinaus erwies es sich als Vorteil, die Arzneimittelkonzentrationen in den einzelnen Kompartimenten (Medium, Zellen und Plastik) zu bestimmen. Somit konnten zum einen Erkenntnisse über die Verteilung der Substanz gewonnen werden und zum anderen Fehleinschätzungen von zellulären Prozessen, z.B. Biotransformation, verhindert werden, was letzten Endes bei die Interpretation von Kinetik-Daten behilflich ist. Jedoch, wurden auch die Grenzen von in vitro Ansätzen deutlich. Für eine korrekte Extrapolation ist es unverzichtbar, dass die untersuchten in vitro Systeme funktionierende Proteine aufweisen, die bei der untersuchten Arzneimittel-induzierten Toxizität eine Schlüsselrolle übernehmen. Abschließend kann festgehalten werden, dass es, unter Berücksichtigung der Vor- und Nachteile, von Nutzen sein kann diesen Versuchsansatz der Langzeitbehandlung zu validieren und darüber hinaus auf Co Kultursysteme sowie Organ-Chips anzuwenden hinsichtlich der Entwicklung von Alternativmethoden für Toxizitätsstudien bei wiederholter Gabe.
KW  - cell culture
KW  - pharmacokinetics
KW  - repeated dose
KW  - in vitro
KW  - toxicity testing
KW  - Zellkultur
KW  - In vitro
KW  - Pharmakokinetik
KW  - Toxizitätstest
Y1  - 2015
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-122693
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Benisch, Peggy
A1  - Schilling, Tatjana
A1  - Klein-Hitpass, Ludger
A1  - Frey, Sönke P.
A1  - Seefried, Lothar
A1  - Raaijmakers, Nadja
A1  - Krug, Melanie
A1  - Regensburger, Martina
A1  - Zeck, Sabine
A1  - Schinke, Thorsten
A1  - Amling, Michael
A1  - Ebert, Amling
A1  - Jakob, Franz
T1  - The Transcriptional Profile of Mesenchymal Stem Cell Populations in Primary Osteoporosis Is Distinct and Shows Overexpression of Osteogenic Inhibitors
JF  - PLoS One
N2  - Primary osteoporosis is an age-related disease characterized by an imbalance in bone homeostasis. While the resorptive aspect of the disease has been studied intensely, less is known about the anabolic part of the syndrome or presumptive deficiencies in bone regeneration. Multipotent mesenchymal stem cells (MSC) are the primary source of osteogenic regeneration. In the present study we aimed to unravel whether MSC biology is directly involved in the pathophysiology of the disease and therefore performed microarray analyses of hMSC of elderly patients (79-94 years old) suffering from osteoporosis (hMSC-OP). In comparison to age-matched controls we detected profound changes in the transcriptome in hMSC-OP, e.g. enhanced mRNA expression of known osteoporosis-associated genes (LRP5, RUNX2, COL1A1) and of genes involved in osteoclastogenesis (CSF1, PTH1R), but most notably of genes coding for inhibitors of WNT and BMP signaling, such as Sclerostin and MAB21L2. These candidate genes indicate intrinsic deficiencies in self-renewal and differentiation potential in osteoporotic stem cells. We also compared both hMSC-OP and non-osteoporotic hMSC-old of elderly donors to hMSC of similar to 30 years younger donors and found that the transcriptional changes acquired between the sixth and the ninth decade of life differed widely between osteoporotic and non-osteoporotic stem cells. In addition, we compared the osteoporotic transcriptome to long term-cultivated, senescent hMSC and detected some signs for pre-senescence in hMSC-OP. Our results suggest that in primary osteoporosis the transcriptomes of hMSC populations show distinct signatures and little overlap with non-osteoporotic aging, although we detected some hints for senescence-associated changes. While there are remarkable inter-individual variations as expected for polygenetic diseases, we could identify many susceptibility genes for osteoporosis known from genetic studies. We also found new candidates, e.g. MAB21L2, a novel repressor of BMP-induced transcription. Such transcriptional changes may reflect epigenetic changes, which are part of a specific osteoporosis-associated aging process.
KW  - alkaline-phosphatase
KW  - in vitro
KW  - bone-mineral density
KW  - age-related osteoporosis
KW  - WNT signaling pathway
KW  - replicative senescence
KW  - morphogenetic protein
KW  - parathyroid-hormone
KW  - growth factor
KW  - skeletal overexpression
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-133379
VL  - 7
IS  - 9
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Biermann, Daniel
A1  - Heilmann, Andreas
A1  - Didié, Michael
A1  - Schlossarek, Saskia
A1  - Wahab, Azadeh
A1  - Grimm, Michael
A1  - Römer, Maria
A1  - Reichenspurner, Hermann
A1  - Sultan, Karim R.
A1  - Steenpass, Anna
A1  - Ergün, Süleyman
A1  - Donzelli, Sonia
A1  - Carrier, Lucie
A1  - Ehmke, Heimo
A1  - Zimmermann, Wolfram H.
A1  - Hein, Lutz
A1  - Böger, Rainer H.
A1  - Benndorf, Ralf A.
T1  - Impact of AT2 Receptor Deficiency on Postnatal Cardiovascular Development
JF  - PLoS One
N2  - Background: The angiotensin II receptor subtype 2 (AT2 receptor) is ubiquitously and highly expressed in early postnatal life. However, its role in postnatal cardiac development remained unclear. 
Methodology/Principal Findings: Hearts from 1, 7, 14 and 56 days old wild-type (WT) and AT2 receptor-deficient (KO) mice were extracted for histomorphometrical analysis as well as analysis of cardiac signaling and gene expression. Furthermore, heart and body weights of examined animals were recorded and echocardiographic analysis of cardiac function as well as telemetric blood pressure measurements were performed. Moreover, gene expression, sarcomere shortening and calcium transients were examined in ventricular cardiomyocytes isolated from both genotypes. KO mice exhibited an accelerated body weight gain and a reduced heart to body weight ratio as compared to WT mice in the postnatal period. However, in adult KO mice the heart to body weight ratio was significantly increased most likely due to elevated systemic blood pressure. At postnatal day 7 ventricular capillarization index and the density of \(\alpha\)-smooth muscle cell actin-positive blood vessels were higher in KO mice as compared to WT mice but normalized during adolescence. Echocardiographic assessment of cardiac systolic function at postnatal day 7 revealed decreased contractility of KO hearts in response to beta-adrenergic stimulation. Moreover, cardiomyocytes from KO mice showed a decreased sarcomere shortening and an increased peak Ca\(^{2+}\) transient in response to isoprenaline when stimulated concomitantly with angiotensin II. 
Conclusion: The AT2 receptor affects postnatal cardiac growth possibly via reducing body weight gain and systemic blood pressure. Moreover, it moderately attenuates postnatal vascularization of the heart and modulates the beta adrenergic response of the neonatal heart. These AT2 receptor-mediated effects may be implicated in the physiological maturation process of the heart.
KW  - mice
KW  - II type-2 receptor
KW  - human endothelial cells
KW  - chronic kidney disease
KW  - angiotensin II
KW  - blood pressure
KW  - in vitro
KW  - cardiac hyperthrophy
KW  - tube formation
KW  - rat heart
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-134902
VL  - 7
IS  - 10
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Dembek, Marcin
A1  - Barquist, Lars
A1  - Boinett, Christine J.
A1  - Cain, Amy K.
A1  - Mayho, Matthew
A1  - Lawley, Trevor D.
A1  - Fairweather, Neil F.
A1  - Fagan, Robert P.
T1  - High-throughput analysis of gene essentiality and sporulation in Clostridium difficile
JF  - mBio
N2  - Clostridium difficile is the most common cause of antibiotic-associated intestinal infections and a significant cause of morbidity and mortality. Infection with C. difficile requires disruption of the intestinal microbiota, most commonly by antibiotic usage. Therapeutic intervention largely relies on a small number of broad-spectrum antibiotics, which further exacerbate intestinal dysbiosis and leave the patient acutely sensitive to reinfection. Development of novel targeted therapeutic interventions will require a detailed knowledge of essential cellular processes, which represent attractive targets, and species-specific processes, such as bacterial sporulation. Our knowledge of the genetic basis of C. difficile infection has been hampered by a lack of genetic tools, although recent developments have made some headway in addressing this limitation. Here we describe the development of a method for rapidly generating large numbers of transposon mutants in clinically important strains of C. difficile. We validated our transposon mutagenesis approach in a model strain of C. difficile and then generated a comprehensive transposon library in the highly virulent epidemic strain R20291 (027/BI/NAP1) containing more than 70,000 unique mutants. Using transposon-directed insertion site sequencing (TraDIS), we have identified a core set of 404 essential genes, required for growth in vitro. We then applied this technique to the process of sporulation, an absolute requirement for C. difficile transmission and pathogenesis, identifying 798 genes that are likely to impact spore production. The data generated in this study will form a valuable resource for the community and inform future research on this important human pathogen.
KW  - Bacillus subtilis
KW  - expression
KW  - spores
KW  - toxin
KW  - transcription
KW  - germination
KW  - transposition
KW  - metabolism
KW  - infection
KW  - in vitro
Y1  - 2015
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-143745
VL  - 6
IS  - 2
ER  - 
TY  - THES
A1  - Dirimanov, Stoyan Dinkov
T1  - Molecular Effects of Polyphenols in Experimental Type 2 Diabetes Mellitus and Metabolic Syndrome
T1  - Molekulare Effekte von Polyphenolen bei experimentellem Diabetes mellitus Typ 2 und metabolischem Syndrom
N2  - The growing prevalence of type 2 diabetes mellitus (T2DM) demands novel therapeutic and adjuvant strategies. Polyphenols (PPs) are plant secondary metabolites. Epidemiological studies demonstrate an inverse relationship between their increased intake and the risk of development of T2DM and cardiovascular complications. However, the PPs’ mechanism of action remains largely unknown. The present work aimed to expand knowledge regarding the effects of PPs on diabetes relevant molecular targets. 
Pycnogenol® (PYC) is a standardized pine bark extract which consists of oligomeric and monomeric PPs. Its anti-diabetic effects have been demonstrated in clinical trials. As a part of a human study involving 20 healthy volunteers, the extract’s effects on dipeptidyl peptidase IV (DPP IV) were investigated. This protease terminates the insulin secretagogue action of incretins. Its inhibition is a promising strategy in T2DM treatment. This study uncovered that PYC-intake of 100 mg daily over 14 days statistically significantly reduced DPP IV serum concentrations by 8.2 % (n= 38, p= 0.032). Contrary to expectations, this decrease was not paralleled by a reduction in the serum DPP IV enzymatic activity. To the best of our knowledge, the present study was the first investigating the effects of PPs on DPP IV serum concentrations and activities in humans. The finding that PYC is capable of reducing DPP IV serum concentrations might be important with regard to diabetes, where DPP IV levels are increased.
Screenings for PPs’ in vitro effects on DPP IV activity were performed employing a purified enzyme. The effects of tested PPs (among which PYC ingredients) at a physiologically relevant concentration of 5 µM were weak (< 10 %) and too small compared to the reference compound sitagliptin, and thus not likely to be clinically relevant. This result is in discordance with some published data, but consistent with the outcome from the present human study. In addition, fluorescence interactions with the experimental setup were registered: under certain conditions urolithin B exhibited an autofluorescence which might mask eventual inhibitory activity. Quercetin quenched the fluorescence slightly which might contribute to false positive results. No statistically significant effects of selected constituents and metabolites of PYC on the total DPP IV protein expression were observed in 3T3-L1 adipocytes. Thus, the lower DPP IV in vivo concentrations after intake of PYC cannot be explained with down-regulation of the DPP IV expression in adipocytes.
Akt kinase is responsible for the transmission of insulin signals and its dysregulation is related to insulin resistance and plays an important role in development of cardiovascular complications in T2DM. Thus, the modulation of the phosphorylation status of endothelial Akt-kinase, respectively its activity, might be a promising strategy in the management of these pathologies. This work aimed to uncover the effects of PPs from different structural subclasses on Akt-phosphorylation (pAkt) in endothelial cells (Ea.hy926). Short-term effects (5 – 30 min) were investigated at a concentration of 10 µM. In a pilot study two model PPs induced a moderate, but reproducible inhibition of pAkt Ser473 of 52.37 ± 21.01 % (quercetin; p= 0.006, n= 3) and 37.79 ± 7.14 % (resveratrol; p= 0.021, n= 4) compared to the negative control. A primary screening with Western blot analysis investigated the effects of eight compounds from different subclasses on pAkt Ser473 and Thr308 to reveal whether the observed inhibition PPs a group effect or specific to certain compounds. In addition to resveratrol and quercetin, statistically significant inhibitions of pAkt Ser473 were induced by luteolin (29.96 ± 11.06 %, p< 0.01, n= 6) and apigenin (22.57 ± 10.30 %, p< 0.01, n= 6). In contrast, genistein, 3,4,5-trimethoxystilbene, taxifolin and (+)-catechin caused no inhibition. A strong positive and statistically significant correlation between the mean inhibitory effects of the tested PPs on both Akt-residues Ser473 and Thr308 (r= 0.9478, p= 0.0003) was determined. A comprehensive secondary screening via ELISA involving 44 compounds from nine structural groups quantified the effects of PPs on pAkt Ser473 to uncover potential structure-activity features. The most potent inhibitors were luteolin (44.31 ± 17.95 %), quercetin (35.71 ± 8.33 %), urolithin A (35.28 ± 11.80 %), apigenin (31.79 ± 6.16 %), fisetin (28.09 ± 9.09 %), and resveratrol (26.04 ± 5.58 %). These effects were statistically significant (p< 0.01, n= 3 to 6). Further lead structure optimization might be based on the fact that the effects of luteolin and resveratrol also differed statistically significantly from each other (p= 0.008). 
To the best of our knowledge, the present study is the first to compare quantitatively the short term effects of PPs from different subclasses on pAkt in endothelial cells. Basic structure-activity relationships revealed that for flavones and flavonols the presence of a C2=C3 double bond (ring C) was essential for inhibitory activity and hydroxylation on the m- and p- positions in the ring B contributed to it. For stilbenoids, three free OH-groups appeared to be optimal. The comparison of the inhibitory potentials of ellagic acid and its microbial metabolites showed that urolithin A was statistically significantly more effective than its progenitor compound. Despite their structural similarities, the only active compound among all urolithins tested was urolithin A, hydroxylated at the C3 and C8 positions. This suggested a specific effect for urolithin A. Based on the common structural determinants and molecular geometry of the most active PPs a pharmacophore model regarding Akt-inhibition was proposed.
In summary, the effects of a wide variety of PPs from diverse structural subclasses on the in vitro phosphorylation of endothelial Akt were quantitatively analyzed for the first time, the effects of previously undescribed compounds were determined and structure activity relationships were elucidated. The inhibitory potential of individual PPs might be beneficial in cases of sustained over-activation of Akt-kinase and its substrates such as S6 kinase as reported for certain T2DM-related pathological states, such as insulin resistance, endothelial dysfunction, excessive angiogenesis, vascular calcification, and insulin triggered DNA-damage. The results of the present work suggest potential molecular mechanisms of action of PP involving Akt-inhibition and DPP IV-down-regulation and thus contribute to the understanding of anti-diabetic effects of these compounds on the molecular level.
N2  - Diabetes mellitus Typ 2 (DMT2) und seine Spätkomplikationen sind ein maßgeblicher Grund für Morbidität und Mortalität. Die steigende Prävalenz der Krankheit erfordert die Entwicklung neuer therapeutischer und prophylaktischer Strategien. Publizierte Daten deuten darauf hin, dass diätetische Polyphenole (PP) sowohl zur Prävention des Diabetes beitragen als auch therapiebegleitend sinnvoll eingesetzt werden können. Allerdings sind ihre Wirkmechanismen nicht vollständig aufgeklärt. Das Ziel der Arbeit war die Charakterisierung zellulärer Wirkungen von PP, die eine Relevanz in der unterstützenden Behandlung von DMT2 und denen Spätkomplikationen haben könnten.
Pycnogenol® (PYC) ist ein standardisierter Kiefernrindenextrakt, der oligomere und monomere PP enthält. PYC hat in klinischen Studien mit Diabetikern viele vorteilhafte anti-diabetische und protektive Effekte gezeigt. Die Wirkungen des Extraktes auf die Serumkonzentration und die enzymatische Aktivität der Dipeptidylpeptidase IV (DPP IV) wurden im Rahmen einer klinischen Studie mit 20 gesunden Probanden untersucht. DPP IV ist eine Serin-Exopeptidase, die Inkretinhormone spaltet und damit deren Wirkung auf die Insulin-Freisetzung beendet. Nach PYC-Einnahme zeigte sich im Vergleich zu dem Kontrollzustand eine statistisch signifikante (p= 0,032, n= 38) Abnahme der DPP-IV-Konzentration von 8.2 %. Allerdings wurden keine deutlichen Änderungen der mittleren DPP-IV-Aktivität durch die PYC-Behandlung hervorgerufen. Nach unserem Wissensstand war die klinische Studie die erste ihrer Art, welche die Effekte von PP auf die Serumkonzentration und die enzymatischen Aktivität von DPP IV im Menschen untersuchte. Da die Serumspiegel von DPP IV bei diabetischen Patienten im Vergleich zu gesunden Menschen erhöht sind, könnte der beobachtete Effekt vorteilhaft sein. 
Als Nächstes sollten die Effekte von einzelnen PP und ihren Metaboliten auf die enzymatische Aktivität der DPP IV in vitro untersucht werden. Die Ergebnisse zeigten nur eine geringe Hemmung (< 10 %) der DPP IV Aktivität durch die PP (auch Inhaltsstoffe von PYC und deren Metaboliten) in einer Konzentration von 5 µM, verglichen zur initialen 100 %-igen Enzymaktivität. Die Positivkontrolle (50 nM Sitagliptin) verursachte hingegen eine starke Senkung der Aktivität von DPP IV. Es ist daher unwahrscheinlich, dass die Effekte der PP eine klinische Relevanz haben. Die Ergebnisse stehen im Widerspruch zu bisher veröffentlichten Daten, unterstützen aber die Resultate aus der vorliegenden Humanstudie. Zusätzlich durchgeführte Fluoreszenzmessungen deuten darauf hin, dass Quercetin und Urolithin B unter definierten Bedingungen in der Lage sind, die Ergebnisse des DPP IV-Inhibitoren-Screening-Assays unspezifisch zu beeinflussen. In-vitro-Experimente in 3T3-L1 differenzierten Adipozyten zeigten zudem keine statistisch signifikanten Effekte auf die Proteinexpression von DPP IV – weder für einzelne Bestandteile noch für Metabolite von PYC. Somit konnte die beobachtete Abnahme der DPP-IV-Konzentrationen in vivo nach der Einnahme von PYC nicht durch eine Herunterregulierung der DPP-IV-Expression in Adipozyten erklärt werden. 
Die Akt-Kinase/PKB (Protein Kinase B) spielt eine wesentliche Rolle bei der Vermittlung der Effekte des Insulins auf intrazellulärer Ebene bzw. bei der Pathophysiologie von DMT2 sowie dessen vaskulären Spätfolgen. Die Modulation von Akt in Endothelzellen ist ein vielversprechender Ansatz, um pathophysiologische Veränderungen zu beeinflussen, die für diabetische kardiovaskuläre Spätkomplikationen verantwortlich sind. Daher sollte in der vorliegenden Arbeit der Einfluss von PP aus verschiedenen strukturellen Subklassen auf die Akt-Phosphorylierung (pAkt) an Ser 473 und Thr 308 in Endothelzellen (EA.hy926) in vitro untersucht werden (10 µM, 5 – 30 min). In der Pilotstudie hemmten beide Modellverbindungen die Akt-Phosphorylierung (pAkt Ser473) statistisch signifikant mit 52,37 ± 21,01 % (Quercetin; p= 0,006, n= 3) und 37,79 ± 7,14 % (Resveratrol; p= 0,021, n= 4). Im Primärscreening wurden acht Verbindungen verschiedener Subklassen einbezogen. Die Substanzen, welche neben Quercetin und Resveratrol die stärksten Hemmungsaktivitäten auf pAkt Ser473 (Mittelwert ± Standardabweichung) hatten, waren Luteolin (29,96 ± 11,06 %, p< 0,01, n= 6) und Apigenin (22,57 ± 10,30 %, p< 0,01, n= 6). Im Gegensatz dazu zeigten Genistein, 3,4,5-Trimethoxy-trans-stilben, Taxifolin und (+)-Catechin keine Hemmung. Die inhibierenden Effekte der PP auf pAkt Thr308 und pAkt Ser473 korrelierten positiv und statistisch signifikant miteinander (r= 0,9478, p= 0,0003). In einem sekundären Screening sollten die Effekte diverser PP auf die Phosphorylierung von Akt an Ser 473 in Endothelzellen mittels quantitativen ELISA detailliert untersucht werden. Die Verbindungen mit den größten Hemmungseffekte waren Luteolin (44,31 ± 17,95 %), Quercetin (35,71 ± 8,33 %), Urolithin A (35,28 ± 11,80 %), Apigenin (31,79 ± 6,16 %), Fisetin (28,09 ± 9,09 %), und Resveratrol (26,04 ± 5,58 %). Diese Hemmungen waren statistisch signifikant (p< 0,01, n= 3 - 6). Zusätzlich war die Wirkung von Luteolin und Resveratrol statistisch signifikant verschieden (p= 0,008), was einer weiteren Leitstrukturoptimierung dienen kann.
Der quantitative Vergleich der Substanzaktivitäten war die Grundlage für nachfolgende Struktur-Wirkungsuntersuchungen (SAR). Die Doppelbindung C2=C3 (Ring C) war für die Inhibitionseffekte bei Flavonen und Flavon-3-olen von wesentlicher Bedeutung. Die Anwesenheit einer meta- und einer para- OH-Gruppe (Ring B) trug sehr wahrscheinlich zu den Hemmeffekten bei. Bei den Stilbenoiden hingegen waren drei freie OH-Gruppen (bei Resveratrol) optimal für die Aktivität. Der mikrobielle Metabolit der Ellagsäure, Urolithin A, hemmte im Vergleich zur Muttersubstanz die Akt-Phosphorylierung statistisch signifikant. Im Gegensatz dazu zeigten die anderen Urolithine trotz der strukturellen Ähnlichkeit nur geringe Effekte. Dies deutet auf einen spezifischen Effekt von Urolithin A hin. Basierend auf den gemeinsamen Merkmalen, die für die Aktivität wichtig sein können und der molekularen Geometrie der aktivsten PP, wurde ein Pharmakophormodell für die Akt-Hemmung vorgeschlagen.
Zusammengefasst ist die vorliegende Studie nach unserem Wissensstand die erste, welche die Auswirkungen einer Vielzahl von PP verschiedener struktureller Subklassen auf die Akt-Phosphorylierung in Endothelzellen quantitativ verglich. Es wurden Effekte von zuvor nicht beschriebenen Verbindungen und Struktur-Aktivitäts-Beziehungen ermittelt. Die hemmenden Eigenschaften einzelner PP auf die Akt-Kinase könnten im Fall einer anhaltenden Überaktivierung der Akt-Kinase und ihren Substraten wie die S6-Kinase vorteilhaft sein. Dieser Zustand wurde bei bestimmten DMT2-verwandten pathologischen Prozessen, wie Insulinresistenz, endotheliale Dysfunktion, übermäßige Angiogenese, vaskuläre Kalzifizierung und Insulin-induzierte-DNA-Schäden beobachtet. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit deuten darauf hin, dass die Wirkmechanismen von PP die Akt-Inhibierung und DPP IV-Herunterregulierung umfassen könnten, was zum Verständnis der anti-diabetischen und protektiven Wirkungen dieser Verbindungen auf molekularer Ebene beitragen kann.
KW  - Polyphenole
KW  - Endothel
KW  - Struktur-Aktivitäts-Beziehung
KW  - Diabetes mellitus
KW  - in vitro
KW  - endothelium
KW  - screening
KW  - structure-activity relationship
KW  - DPP IV
KW  - Akt
KW  - Diabetes mellitus
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-185701
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Dirimanov, Stoyan
A1  - Högger, Petra
T1  - Screening of inhibitory effects of polyphenols on Akt-phosphorylation in endothelial cells and determination of structure-activity features
JF  - Biomolecules
N2  - Polyphenols exert beneficial effects in type 2 diabetes mellitus (T2DM). However, their mechanism of action remains largely unknown. Endothelial Akt-kinase plays a key role in the pathogenesis of cardiovascular complications in T2DM and therefore the modulation of its activity is of interest. This work aimed to characterize effects of structurally different polyphenols on Akt-phosphorylation (pAkt) in endothelial cells (Ea.hy926) and to describe structure-activity features. A comprehensive screening via ELISA quantified the effects of 44 polyphenols (10 µM) on pAkt Ser473. The most pronounced inhibitors were luteolin (44 ± 18%), quercetin (36 ± 8%), urolithin A (35 ± 12%), apigenin, fisetin, and resveratrol; (p < 0.01). The results were confirmed by Western blotting and complemented with corresponding experiments in HUVEC cells. A strong positive and statistically significant correlation between the mean inhibitory effects of the tested polyphenols on both Akt-residues Ser473 and Thr308 (r = 0.9478, p = 0.0003) was determined by immunoblotting. Interestingly, the structural characteristics favoring pAkt inhibition partially differed from structural features enhancing the compounds’ antioxidant activity. The present study is the first to quantitatively compare the influence of polyphenols from nine different structural subclasses on pAkt in endothelial cells. These effects might be advantageous in certain T2DM-complications involving over-activation of the Akt-pathway. The suggested molecular mode of action of polyphenols involving Akt-inhibition contributes to understanding their effects on the cellular level.
KW  - Akt/PKB
KW  - endothelium
KW  - diabetes
KW  - polyphenols
KW  - in vitro
KW  - structure-activity relationships
KW  - screening
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-197333
SN  - 2218-273X
VL  - 9
IS  - 6
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Drechsler, Johannes
A1  - Groetzinger, Joachim
A1  - Hermanns, Heike M.
T1  - Characterization of the Rat Oncostatin M Receptor Complex Which Resembles the Human, but Differs from the Murine Cytokine Receptor
JF  - PLoS One
N2  - Evaluation of a pathophysiological role of the interleukin-6-type cytokine oncostatin M (OSM) for human diseases has been complicated by the fact that mouse models of diseases targeting either OSM or the OSM receptor (OSMR) complex cannot fully reflect the human situation. This is due to earlier findings that human OSM utilizes two receptor complexes, glycoprotein 130 (gp130)/leukemia inhibitory factor receptor (LIFR) (type I) and gp130/OSMR (type II), both with wide expression profiles. Murine OSM on the other hand only binds to the gp130/OSMR (type II) receptor complex with high affinity. Here, we characterize the receptor usage for rat OSM. Using different experimental approaches (knock-down of the OSMR expression by RNA interference, blocking of the LIFR by LIF-05, an antagonistic LIF variant and stably transfected Ba/F3 cells) we can clearly show that rat OSM surprisingly utilizes both, the type I and type II receptor complex, therefore mimicking the human situation. Furthermore, it displays cross-species activities and stimulates cells of human as well as murine origin. Its signaling capacities closely mimic those of human OSM in cell types of different origin in the way that strong activation of the Jak/STAT, the MAP kinase as well as the PI3K/Akt pathways can be observed. Therefore, rat disease models would allow evaluation of the relevance of OSM for human biology.
KW  - in vitro
KW  - leukemia-inhibitory factor
KW  - ciliary neurotrophic factor
KW  - T cell development
KW  - swiss model
KW  - fetal liver
KW  - interleukin-6-type cytokines
KW  - rheumatoid arthritis
KW  - signal transduction
KW  - growth regulator
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-133879
VL  - 7
IS  - 8
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Dühring, Sybille
A1  - Germerodt, Sebastian
A1  - Skerka, Christine
A1  - Zipfel, Peter F.
A1  - Dandekar, Thomas
A1  - Schuster, Stefan
T1  - Host-pathogen interactions between the human innate immune system and Candida albicans - understanding and modeling defense and evasion strategies
JF  - Frontiers in Microbiology
N2  - The diploid, polymorphic yeast Candida albicans is one of the most important human pathogenic fungi. C. albicans can grow, proliferate and coexist as a commensal on or within the human host for a long time. However, alterations in the host environment can render C. albicans virulent. In this review, we describe the immunological cross-talk between C. albicans and the human innate immune system. We give an overview in form of pairs of human defense strategies including immunological mechanisms as well as general stressors such as nutrient limitation, pH, fever etc. and the corresponding fungal response and evasion mechanisms. Furthermore, Computational Systems Biology approaches to model and investigate these complex interactions are highlighted with a special focus on game-theoretical methods and agent-based models. An outlook on interesting questions to be tackled by Systems Biology regarding entangled defense and evasion mechanisms is given.
KW  - agent-based model
KW  - antimicrobial peptides
KW  - fungal pathogens
KW  - Candida albicans
KW  - immunological cross-talk
KW  - beta-lactamase inhibition
KW  - in vitro
KW  - biomaterial surfaces
KW  - biofilm formation
KW  - dendritic cells
KW  - infection
KW  - resistance
KW  - human immune system
KW  - host-pathogen interaction
KW  - computational systems biology
KW  - defense and evasion strategies
Y1  - 2015
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-151621
VL  - 6
IS  - 625
ER  - 
TY  - THES
A1  - Eiter [verh. Seidl], Rafael
T1  - Untersuchungen zum Einfluss von Wundsekret auf Zellvermehrung, Chemoresistenzentwicklung, Zellzyklus und die Induktion einer Epithelial-mesenchymalen Transition in Tumorzellen von Kopf und Hals
T1  - Studies on the influence of wound fluid on cell proliferation, development of chemoresistance, cell cycle and the induction of an epithelial-mesenchymal transition in head and neck tumor cells
N2  - Tumore von Kopf und Hals gehen weiterhin mit einer schlechten Prognose einher. Im Rahmen einer operativen Therapie tritt Wundsekret (WS) aus, welches der Wundheilung dient.  Dieses kann in Kontakt mit Tumorzellen bzw. Resttumor in der Wunde kommen.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Frage nach dem Einfluss von Wundsekret auf Zellvermehrung, Chemoresistenzentwicklung, den Zellzyklus und die Induktion einer Epithelial-mesenchymalen Transition (EMT) in Tumorzellen von Kopf und Hals gestellt.
Hierfür wurde das WS von Tag1 und das WS von Tag 2 im Dotblot auf seine Zytokinzusammensetzung analysiert. Zwei Tumorzelllinien von Kopf und Hals, FaDu und HlaC78, wurden mit WSTag1 und WSTag2 behandelt und untersucht, welche Effekte das WS auf die Zellen hat. 
Verwendet wurden ein Proliferationsassay, eine Zellzyklusuntersuchung und Apoptosetestung mittels FACS, eine PCR, ein Spheroidmodell und die Lichtmikroskopie.
Im WS wurden erhöhte Konzentrationen verschiedener Zytokine, insbesondere von IL-6, nachgewiesen. Gezeigt werden konnte eine gesteigerte Proliferationsrate der Tumorzellen unter WS-Behandlung, jedoch keine veränderte Verteilung der Zellzyklusphasen. In HlaC78-Zellen konnte eine vermehrte Vitalität nach Cisplatinbehandlung nachgewiesen werden. In beiden Tumorzelllinien fand sich eine vermehrte Exprimierung von Snail 1, Snail 2 und Vimentin. E-Cadherin wurde vermindert exprimiert. Twist und N-Cadherin wiesen keine Veränderungen auf. Es zeigte sich eine vermehrte Migration der Tumorzellen in die Umgebung. Die Zellen wiesen nach Behandlung mit WS vermehrt mesenchymale Zeichen auf. Es konnte kein Unterschied der Auswirkungen einer Behandlung mit WSTag1 im Vergleich zu einer Behandlung mit WSTag2 festgestellt werden.
Insgesamt scheint WS in Tumorzellen von Kopf und Hals einen EMT-artigen Prozess in Gang zu setzen, also eine partial EMT (pEMT).
Als mögliche Auslöser dieser Veränderungen kommen die im WS nachgewiesenen Zytokine und v. a. IL-6 in Frage.
N2  - Tumors of the head and neck continue to be associated with a poor prognosis. In the course of surgical therapy, wound fluid (WF) may come into contact with tumor cells or residual tumor in the wound.
In this study, the influence of wound fluid on cell proliferation, development of chemoresistance, the cell cycle and the induction of an epithelial-mesenchymal transition (EMT) in tumor cells of the head and neck was investigated.
Therefore, WF from day 1 and WF from day 2 were analyzed for their cytokine composition by Dotblot. The effects of WF from day 1 and WF from day 2 on two tumor cell lines of the head and neck, FaDu and HlaC78, were investigated using a proliferation assay, a cell cycle assay and an apoptosis assay via FACS, PCR, a spheroid model and light microscopy.
Increased concentrations of various cytokines, especially IL-6, were detected in the WF. An increased proliferation rate of tumor cells under WF treatment could be shown. There was no alteration in the distribution of cell cycle phases, however. In HlaC78 cells an increased vitality after cisplatin treatment could be proven. Increased expression of Snail 1, Snail 2, and Vimentin was found in both tumor cell lines. The expression of E-cadherin was decreased. Twist and N-cadherin showed no changes. Increased migration of tumor cells to the surrounding area could be seen. Cells showed more mesenchymal signs after treatment with WF. No difference in the effects of treatment with WF from day 1 compared to treatment with WF from day 2 was observed.
Overall, WF appears to initiate an EMT-like process in tumor cells of the head and neck, this is called partial EMT (pEMT). Possible inducers of these changes are the cytokines and in particular IL-6 that have been found in WF.
KW  - Wundheilung
KW  - Hals-Nasen-Ohren-Tumor
KW  - Cytokine
KW  - Zellzyklus
KW  - Cisplatin
KW  - Epithelial-mesenchymale Transition
KW  - Wundsekret
KW  - IL-6
KW  - Zellvermehrung
KW  - in vitro
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-326782
ER  -