TY  - THES
A1  - Gulder, Tobias Alexander Marius
T1  - Neue bioaktive Naturstoffe : Strukturaufklärung, Biosynthese und Synthese sowie stereochemische Analyse von Naturstoffen und synthetischen Verbindungen durch HPLC-CD
T1  - Novel Bioactive Natural Products : Structural Elucidation, Biosynthesis and Synthesis as well as Stereochemical Analysis of Natural Products and Synthetic Compounds Using HPLC-CD
N2  - Die Natur entwickelte im Laufe der Evolution eine unvorstellbare Vielfalt an unterschiedlichsten Lebewesen. Viele diese Organismen besitzen die Fähigkeit, biologisch aktive Sekundärstoffe zu produzieren, die ihnen im täglichen Überlebenskampf einen Vorteil gegenüber ihren Konkurrenten bieten. Die Effizienz, mit der solche Naturstoffe in lebenden Organismen biosynthetisch dargestellt werden, wurde von der organisch-chemischen Synthese bislang nicht annähernd erreicht. Die Untersuchung von Biosynthese-Routen verspricht daher nicht nur die Entdeckung wissenschaftlich interessanter Phänomene, sondern bietet zudem die Chance, von der Natur zu lernen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen dabei deutlich, dass sowohl die genaue Analyse des Aufbaus bereits lange bekannter Metabolite, wie z.B. des Furanonaphthochinons I (FNQ I) oder des Chrysophanols, als auch die Untersuchung der Biosynthese strukturell neuartiger Sekundärstoffe, wie etwa des Sorbicillactons A, von großem Interesse sein können. Die gewonnenen Informationen können dann zur optimierten biotechnologischen oder synthetischen Produktion viel versprechender bioaktiver Substanzen genutzt werden. Auch die Gewinnung neuer Substanzen aus der Natur, z.B. als Leitstrukturen für die Pharma-Forschung, ist ein lohnendes Ziel. Eine stete Verbesserung der Methoden zur Charakterisierung von Naturstoffen, z.B. unter Anwendung von Online-Analyse-Verfahren, hilft dabei, die gezielte Entdeckung noch unbekannter Metabolite schneller und einfacher zu gestalten. Für die Aufklärung der Konstitution von Substanzen nützlich ist hier vor allem die Kopplung von HPLC mit NMR und MS, wie beispielsweise im Rahmen der Identifizierung von Secohyperforin und neuer mariner Macrolactame gezeigt. Die Kombination von HPLC mit CD bietet zudem die Chance zur effizienten Aufklärung der absoluten Stereostruktur chiraler Verbindungen direkt am Peak im Chromatogramm. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Isolierung, die biosynthetische und strukturelle Charakterisierung sowie die Produktion bioaktiver Sekundärstoffe unter Anwendung und Weiterentwicklung unterschiedlichster Konzepte und Methoden der Naturstoffchemie. Die vielfältigen Ergebnisse sind das Resultat von interdisziplinären Kooperationen innerhalb des SPP 1152 (DFG Schwerpunktprojekts 'Evolution metabolischer Diversität') und des vom BMBF geförderten Exzellenzzentrums BIOTECmarin ('Nachhaltige Nutzung mariner Schwämme').
N2  - In the course of evolution nature has developed an unimaginable abundance of most diverse creatures. Most of these organisms produce biologically active secondary metabolites, which give them advantages over their competitors in their daily fight for survival. The efficiency of the biosynthesis of such natural products in living organisms has by far not been reached by organic-chemical synthesis. The investigation of biosynthetic routes therefore does not only promise to discover academically interesting phenomena, but additionally provides the chance to learn from nature. The results of the work presented here clearly show that both, the analysis of pathways to long-known metabolites, like, e.g., furanonaphthoquinone I (FNQ I) or chrysophanol, as well as investigations on the biosynthesis of structurally unprecedented, novel secondary metabolites, like, e.g., sorbicillactone A, can be of particular interest. The information thus obtained can then be utilized for an optimized biotechnological or synthetic production of promising biologically active compounds. The extraction of novel substances from natural sources, e.g., as lead structures for pharmaceutical research, is likewise a rewarding goal. The continuous improvement of methods for the characterization of natural products, e.g., by application of online analytical methods, helps to accelerate and to simplify the directed discovery of as yet unknown metabolites. To elucidate the constitutions of compounds, the hyphenation of HPLC with NMR and MS is of particular value, as it becomes obvious from the identification of secohyperforin and of new marine macrolactams. The combination of HPLC and CD additionally offers the possibility to elucidate full absolute stereostructures of chiral compounds directly from the peak in the chromatogram. The aim of the present work was the isolation, characterization, and production of secondary metabolites by applying und further developing diverse concepts and methods of natural products chemistry. The versatile findings are the result of interdisciplinary cooperations within the SPP 1152 (DFG priority programme 'Evolution of Metabolic Diversity') and the BMBF-funded center of excellence BIOTECmarin ('Sustainable Use of Marine Sponges').
KW  - Naturstoff
KW  - Biosynthese
KW  - Chemische Synthese
KW  - HPLC-CD-NMR
KW  - Natural Products
KW  - Biosynthesis
KW  - Chemical Synthesis
KW  - HPLC-CD-NMR
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-26789
ER  - 
TY  - THES
A1  - Wein, Martina
T1  - Biosynthese und Metabolismus von 2,5-Dimethyl-4-hydroxy-3(2H)-furanon in Erdbeeren
T1  - Biosynthesis and Metabolism of 2,5-Dimethyl-4-hydroxy-3(2H)-furanone in Strawberries
N2  - Die vorliegende Arbeit präsentiert neue Erkenntnisse zur Biosynthese von 2,5-Dimethyl-4-hydroxy-3(2H)-furanon (DMHF) und 2,5-Dimethyl-4-methoxy-3(2H)-furanon (DMMF), zwei wichtigen Aromakomponenten in Erdbeeren. Potentielle, mit stabilen Isotopen markierte Vorläufersubstanzen wurden an Erdbeeren appliziert und drei Tage bei Raumtemperatur inkubiert. Der Nachweis über den erfolgreichen Einbau erfolgte mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie. Anhand der Massenspektren von DMHF und DMMF, die aus den behandelten Erdbeeren mittels Festphasenextraktion isoliert wurden, konnte der Markierungsgrad der Verbindungen ermittelt werden und somit Rückschlüsse über die Effizienz der Metabolisierung der applizierten Zucker zu den beiden Furanonen DMHF und DMMF gezogen werden. Als mögliche Ausgangsstoffe dienten unterschiedlich markierte D-Glucose und D-Fructose, sowie Desoxyzucker, da diese als direkte Vorläufersubstanzen von DMHF und DMMF diskutiert werden. Isotopenmarkierte Desoxy-D-glucose oder Desoxy-D-fructose sind kommerziell nicht erhältlich, weshalb die Verbindungen [1-13C]-1-Desoxy-D-fructose, [6-2H1]-6-Desoxy-D-glucose und [5,6,6,6-2H4]-6-Desoxyhexulose-1-phosphat zuerst synthetisiert werden mussten. Nach Applikation der Desoxyzucker wurde keine Erhöhung des Markierungsgrades an stabilen Isotopen gegenüber dem natürlichen Isotopenverhältnis festgestellt. Somit können 6-Desoxy-D-glucose, 1-Desoxy-D-fructose und 6-Desoxy-D-fructose-1-phosphat als Prekursoren von DMHF und DMMF ausgeschlossen werden. Als gute Vorläufersubstanzen erwiesen sich D-Glucose und D-Fructose. Markierungen (13C und 2H) an Position C-1 oder C-6 der beiden Verbindungen wurden sowohl in DMHF als auch in dessen Methoxyderivat DMMF detektiert, wobei die Applikation von D-Fructose im Gegensatz zur D-Glucose einen höheren Markierungsgrad der Zielverbindungen zur Folge hatte. Durch den Einsatz positionsspezifisch markierter D-Glucose (2H-Markierung an Position C-1, C-2 oder C-4) sollten Aufschlüsse über den Metabolisierungsmechanismus gewonnen werden. Die Markierung der D-[2-2H]Glucose befand sich wie die der D-[1-2H]Glucose in den Methylgruppen der Furanone, was nur durch eine intramolekulare Verschiebung von C-2 nach C-1 erklärbar ist. Diese wurde bei der Glucosephosphatisomerase-katalysierten Umwandlung von D-Glucose-6-phosphat zu D-Fructose-6-phosphat beobachtet. Somit muss D-Glucose bei der Biosynthese von DMHF und DMMF zuerst in diese Intermediate überführt werden. Im Gegensatz zu an Position C-2 markierter D-Glucose ging das Proton an Position C-4 im Laufe der Metabolisierung verloren. Demzufolge findet der in der Natur verbreitete Desoxygenierungsmechanismus von Monosacchariden nicht statt und schließt die Beteiligung von Desoxyzuckern an der Biosynthese von DMHF und DMMF gänzlich aus. Nach Einsatz von uniform markierter D-Fructose konnte sechsfach markiertes DMHF und DMMF identifiziert werden, was durch den Einbau der intakten Kohlenstoffkette zu erklären ist. Dieser Befund und weitere Untersuchungen mit verschiedenen Glykolyse-regulierenden Substanzen deuteten darauf hin, dass die Furanone dem zentralen Kohlenhydratstoffwechsel, der Glykolyse, entspringen. Vor der Aldolase-katalysierten Spaltung in zwei C3-Einheiten muss jedoch eine Abzweigung erfolgen, da sonst die Kohlenstoffkette nicht unverändert vorliegen könnte. Im zweiten Teil der Arbeit ist erstmals mit Hilfe von molekularbiologischen Techniken die vollständige cDNA einer O-Methyltransferase (OMT) aus Erdbeeren isoliert worden. Hierfür wurde mRNA aus reifenden Erdbeeren extrahiert und eine cDNA Bibliothek hergestellt. Diese wurde mit einer OMT-spezifschen Sonde durchmustert, welche durch PCR mit degenerierten Primern synthetisiert worden war. Nach mehreren Vereinzelungs-Zyklen konnte die vollständige cDNA einer O-Methyltransferase (STOMT, Strawberry OMT) erhalten werden. Northern-Analysen ergaben, dass die entsprechende RNA ausschließlich in den verschiedenen Reifestadien der Frucht akkumuliert, mit den höchsten Transkriptmengen in der rot-werdenden und reifen Frucht. In anderen Gewebeteilen wie Wurzel, Blätter, Stängel und Blüte konnte keine STOMT-RNA nachgewiesen werden. Das korrespondierende Protein zeigte hohe Homologien zu Kaffeesäure-OMTs aus Weidengewächsen der Gattung Populus. Nach erfolgreicher, heterologer Expression von STOMT in E. coli wurde die Substratspezifität des Enzyms untersucht, dessen Temperaturoptimum bei 30°C lag. Alle eingesetzten Substrate mit phenolischem Grundgerüst, wie Brenzcatechin, Kaffeesäure, Kaffeeoyl-CoA und 3,4-Dihydroxybenzaldehyd, aber auch das Furanonderivat DMHF wurden von der rekombinanten O-Methyltransferase umgesetzt. Als bestes Substrat erwies sich 3,4-Dihydroxybenzaldehyd, das, im Gegensatz zu dessen Methylierungsprodukt Vanillin, bisher in Erdbeeren nicht nachgewiesen werden konnte. Kaffeesäure wurde ebenfalls effektiv methyliert, worin vermutlich die Hauptaufgabe von STOMT in der Pflanze liegt. Die Methylierung von Kaffeesäure oder 5-Hydroxyferulasäure ist ein wichtiger Prozess in der Entstehung von Lignin. Die Tatsache, dass Erdbeeren teilweise in den Leitbündeln und verstärkt in den Achenen lignifiziert sind, erklärt das Vorhandensein eines solchen Enzyms. DMHF, das als Dienol-Tautomer eine aromatische Struktur mit Hydroxylgruppen aufweist und somit strukturelle Ähnlichkeiten zu phenolischen Verbindungen zeigt, wurde ebenfalls von STOMT als Substrat akzeptiert. Die Bildung von DMMF, dem Methoxyderivat von DMHF erfolgte vergleichsweise langsam, war aber eindeutig auf die Methyltransferase-Aktivität zurückzuführen. STOMT ist aufgrund des Expressionsmusters als fruchtspezifisch und reifeinduziert einzustufen. Primäre Funktion ist vermutlich zu Beginn der Fruchtreifung die Lignifizierung der Leitbündel und später die der Achenen. Gleichzeitig scheint STOMT wesentlich an der Bildung der Aromastoffe DMMF und Vanillin in Erdbeeren beteiligt zu sein.
N2  - The present work reveals new insight in the biosynthesis of 2,5-dimethyl-4-hydroxy-3(2H)-furanone (DMHF) and 2,5-dimethyl-4-methoxy-3(2H)-furanone (DMMF), two important flavor compounds in strawberries. Isotopically labeled precursors were applied to detached strawberries and incubated for three days at room temperature. The successful incorporation of the isotopes was determined by gas chromatography-mass spectroscopy. On the basis of the mass spectra of DMHF and DMMF, isolated from treated strawberries by solid phase extraction, the ratio of labeled and unlabeled compounds was determined. Thus, the conversion of sugars to the furanones DMHF and DMMF could be analyzed in regard to efficiency of metabolism. Differently labeled D-glucose, D-fructose and deoxysugars were used as they are considered to be good precursors of DMHF and DMMF. [1-13C]-1-Deoxy-D-fructose, [6-2H1]-6-deoxy-D-glucose and [5,6,6,6-2H4]-6-deoxyhexulose-1-phosphate had to be synthesized first since these isotopically labeled deoxysugars are not commercially available. After application of the labeled deoxysugars, the ratio of stable isotopes did not change in comparison with the natural isotopic ratio. As a consequence 6-deoxy-D-glucose, 1-deoxy-D-fructose and 6-deoxyhexulose-1-phosphate can be ruled out as precursors of DMHF and DMMF. D-Glucose and D-fructose were converted efficiently to the furanones. The isotopic label (13C and 2H) from position C-1 and C-6 of both carbohydrates was detected in DMHF and its derivative DMMF. In contrast to D-glucose, D-fructose was metabolized more efficiently to the target molecules as the furanones showed a higher degree of labeling. The use of D-glucose labeled at different positions should provide information about the mechanism of the biosynthesis. The label of D-[2-2H]glucose as well as that of D-[1-2H]glucose was recovered in the methyl group of the furanones. This observation was explained by an intra molecular isotope shift from position C-2 to C-1 which was observed in the course of the conversion of D-glucose-6-phosphate to D-fructose-6-phosphate mediated by phosphohexose isomerase. Consequently, D-glucose has to be transformed into these intermediates prior to the formation of DMHF and DMMF. In contrast to D-glucose, which was labeled at position C-2, the label at position C-4 was lost during the transformation. Therefore, the natural mechanism of deoxygenation might not occur during the biosynthesis of DMHF and DMMF. After application of D-[U-13C6]fructose the incorporation of six 13C atoms into DMHF and DMMF was detected. This implies that the complete carbon skeleton is incorporated. These findings and additional studies with different regulatory substances of the glycolysis indicated that the central metabolism of carbohydrates (glycolysis) is involved in the biosynthesis of furanones. Prior to the final cleavage into two C3-fragments by aldolase, another pathway has to branch off, as otherwise the skeleton can not remain unchanged. In the second part of the thesis the complete cDNA of a O-methyltransferase from strawberry was isolated by the means of molecular techniques. First, mRNA was extracted from turning strawberries to construct a cDNA library. An OMT specific fragment, synthesized by PCR with degenerated primers, was used as probe in order to screen the cDNA library. After few cycles of separation a complete cDNA coding for a putative O-methyltransferase (STOMT, strawberry OMT) was obtained. Northern analysis revealed high abundance in the different stages of fruit ripening while highest RNA levels were found in turning and ripe fruit. On the contrary, there were no STOMT-RNA transcripts in other tissue such as root, leaf, petiole and flower. The corresponding protein showed high homology to caffeic acid OMTs from Salicacea (Populus). STOMT was successfully expressed in E. coli in order to determine the substrate specificity. The enzyme showed highest activity at 30°C. All tested phenolic compounds such as catechol, caffeic acid, caffeoyl CoA and protocatechuic aldehyde as well as the furanone derivative DMHF were accepted by the recombinant O-methyltransferase. STOMT converted most rapidly protocatechuic aldehyde, which has not been detected in strawberry yet, to its methylated counterpart vanillin. Caffeic acid was also accepted to a high degree, which is probably the main function in strawberry. The methylation of caffeic acid and 5-hydroxyferulic acid is an important process in the formation of lignin. The fact that the vascular bundles contain lignin and the achenes are strongly lignified explains the presence of such an enzyme in strawberry. The dienolic tautomer of DMHF exhibiting an aromatic structure with two hydroxy groups shows structural homology to phenolic compounds. Therefore, DMHF was accepted as substrate by STOMT. Although the conversion proceeds quite slowly, unequivocally the methoxy derivative descends from DMHF by OMT activity. In accordance with its expression pattern in strawberry, STOMT is fruit specific and induced during ripening. In the course of the maturation, the primary function of STOMT is probably the lignification of the vascular bundles in the beginning and later that of the achenes. On the other hand, STOMT seems to be substantially involved in the biosynthesis of the flavor compounds DMMF and vanillin, too.
KW  - Erdbeere
KW  - Naturidentischer Aromastoff
KW  - Furaneol
KW  - Biosynthese
KW  - Stoffwechsel
KW  - 2
KW  - 5-Dimethyl-4-hydroxy-3(2H)-furanon
KW  - 2
KW  - 5-Dimethyl-4-methoxy-3(2H)-furanon
KW  - Furaneol
KW  - Erdbeeren
KW  - Methylierung
KW  - Biosynthese
KW  - Aroma
KW  - 2
KW  - 5-Dimethyl-4-hydroxy-3(2H)-furanone
KW  - 2
KW  - 5-Dimethyl-4-methoxy-3(2H)-furanone
KW  - Furaneol
KW  - Strawberry
KW  - Methylation
KW  - Biosynthesis
KW  - Flavor
Y1  - 2001
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1182059
ER  -