TY - THES A1 - Aminake, Makoah Nigel T1 - Towards malaria combination therapy: Characterization of hybrid molecules for HIV/malaria combination therapy and of thiostrepton as a proteasome-targeting antibiotic with a dual mode of action T1 - Die Entwicklung von Malaria-Kombinationstherapien: Die Charakterisierung von Hybridmolekülen für eine HIV/Malaria-Kombinationstherapie und von Thiostrepton als ein gegen das Proteasom-gerichtetes Antibiotikum mit dualem Wirkmodus N2 - Malaria and HIV are among the most important global health problems of our time and together are responsible for approximately 3 million deaths annually. These two diseases overlap in many regions of the world including sub-Saharan Africa, Southeast Asia and South America, leading to a higher risk of co-infection. In this study, we generated and characterized hybrid molecules to target P. falciparum and HIV simultaneously for a potential HIV/malaria combination therapy. Hybrid molecules were synthesized by covalent fusion between azidothymidine (AZT) and dihydroartemisinin (DHA), tetraoxane or chloroquine (CQ); and a small library was generated and tested for antiviral and antimalarial activity. Our data suggest that dihyate is the most potent molecule in vitro, with antiplasmodial activity comparable to that of DHA (IC50 = 26 nM, SI > 3000), a moderate activity against HIV (IC50 = 2.9 µM; SI > 35) and safe to HeLa cells at concentrations used in the assay (CC50 > 100 µM). Pharmacokinetic studies further revealed that dihyate is metabolically unstable and is cleaved following an O-dealkylation once in contact with cytochrome P450 enzymes. The later further explains the uneffectiveness of dihyate against the CQ-sensitive P. berghei N strain in mice when administered by oral route at 20 mg/kg. Here, we report on a first approach to develop antimalarial/anti-HIV hybrid molecules and future optimization efforts will aim at producing second generation hybrid molecules to improve activity against HIV as well as compound bioavailability. With the emergence of resistant parasites against all the counterpart drugs of artemisinin derivatives used in artemisinin based combination therapies (ACTs), the introduction of antibiotics in the treatment of malaria has renewed interest on the identification of antibiotics with potent antimalarial properties. In this study we also investigated the antiplasmodial potential of thiostrepton and derivatives, synthesized using combinations of tail truncation, oxidation, and addition of lipophilic thiols to the terminal dehydroamino acid. We showed that derivatives SS231 and SS234 exhibit a better antiplasmodial activity (IC50 = 1 µM SI > 59 and SI > 77 respectively) than thiostrepton (IC50 = 8.95 µM, SI = 1.7). The antiplasmodial activity of these derivatives was observed at concentrations which are not hemolytic and non-toxic to human cell lines. Thiostrepton and derivatives appeared to exhibit transmission blocking properties when administered at their IC50 or IC90 concentrations and our data also showed that they attenuate proteasome activity of Plasmodium, which resulted in an accumulation of ubiquitinated proteins after incubation with their IC80 concentrations. Our results indicate that the parasite’s proteasome could be an attractive target for therapeutic intervention. In this regard, thiostrepton derivatives are promising candidates by dually acting on two independent targets, the proteasome and the apicoplast, with the capacity to eliminate both intraerythrocytic asexual and transmission stages of the parasite. To further support our findings, we evaluated the activity of a new class of antimalarial and proteasome inhibitors namely peptidyl sulfonyl fluorides on gametocyte maturation and analogues AJ34 and AJ38 were able to completely suppress gametocytogenesis at IC50 concentrations (0.23 µM and 0.17 µM respectively) suggesting a strong transmission blocking potential. The proteasome, a major proteolytic complex, responsible for the degradation and re-cycling of non-functional proteins has been studied only indirectly in P. falciparum. In addition, an apparent proteasome-like protein with similarity to bacterial ClpQ/hslV threonine-peptidases was predicted in the parasite. Antibodies were generated against the proteasome subunits alpha type 5 (α5-SU), beta type 5 (β5-SU) and pfhslV in mice and we showed that the proteasome is expressed in both sexual and asexual blood stages of P. falciparum, where they localize in the nucleus and in the cytoplasm. However, expression of PfhslV was only observed in trophozoites and shizonts. The trafficking of the studied proteasome subunits was further investigated by generating parasites expressing GFP tagged proteins. The expression of α5-SU-GFP in transgenic parasite appeared to localize abundantly in the cytoplasm of all blood stages, and no additional information was obtained from this parasite line. In conclusion, our data highlight two new tools towards combination therapy. Hybrid molecules represent promising tools for the cure of co-infected individuals, while very potent antibiotics with a wide scope of activities could be useful in ACTs by eliminating resistant parasites and limiting transmission of both, resistances and disease. N2 - Malaria und HIV gehören zu den wichtigsten weltweiten Gesundheitsproblemen unserer Zeit und verursachen jährlich zusammen fast drei Millionen Todesfälle. Das Verbreitungsgebiet beider Krankheit überschneidet sich in vielen Weltregionen wie Afrika südlich der Sahara, Südostasien und Südamerika, was zu einem erhöhten Risiko für Koinfektionen führt. Während der vorliegenden Arbeit stellten wir Hybridmoleküle her und charakterisierten diese in Bezug auf ihre gleichzeitige Wirksamkeit gegen P. falciparum und HIV mit dem Ziel einer möglichen Kombinationstherapie gegen beide Krankheiten. Diese Hybridmoleküle wurden durch kovalente Verbindung von Azidothymidin (AZT) mit Dihydroartemisinin (DHA), Tetraoxan und Chloroquin (CQ) hergestellt. Die dabei hergestellte kleine Molekülsammlung wurde auf antivirale Wirkung und Wirkung gegen Malaria getestet. In vitro ist, gemäß unserer Daten, Dihyate das wirksamste Molekül, mit einer dem DHA vergleichbaren Wirksamkeit gegen Plasmodium (IC50 = 26 nM, SI > 3000), einer mittelmäßigen Wirksamkeit gegen HIV (IC50 = 2.9 µM; SI > 35) und keiner Wirkung auf HeLa-Zellen bei den im Versuch verwendeten Konzentrationen (CC50 > 100 µM). Weiterhin ergaben pharmakokinetische Studien, dass Dihyate metabolisch instabil ist und nach einer O-Dealkylierung gespalten wird, sobald es in Kontakt mit Cytochrom P450 Enzymen kommt. Dies erklärt auch die Unwirksamkeit von Dihyate gegen dem CQ-sensitiven P. berghei N Stamm im Mausversuch bei oraler Gabe von 20mg/kg. Wir berichten hier von einem ersten Ansatz Hybridmoleküle gegen Malaria/ HIV zu entwickeln. Zukünftige Verbesserungen werden darauf abzielen Hybridmoleküle der zweiten Generation herzustellen um sowohl die Wirksamkeit gegen HIV als auch die Bioverfügbarkeit zu verbessern. Auf Grund der Entwicklung von Resistenzen gegenüber sämtliche Substanzen, die zusammen mit Artemisinin in Kombinationstherapien genutzt werden, hat die Verwendung von Antibiotika bei der Behandlung der Malaria das Interesse daran neu geweckt, Antibiotika mit starker Wirksamkeit gegenüber Plasmodium aufzuspüren. Während der vorliegenden Studie untersuchten wir die Wirksamkeit von Thiostrepton und seinen Derivaten gegenüber Plasmodium. Diese Derivate wurden durch Kombinationen von Verkürzung der Seitenkette, Oxidation und der Anbringung von lipophilen Thiolen an die endständige Dehydroaminosäure hergestellt. Wir konnten zeigen, dass die Derivate SS231 und SS234 (IC50 = 1 µM SI > 59 und SI > 77) eine bessere Wirksamkeit gegen Plasmodium besitzen als Thiostrepton (IC50 = 8.95 µM, SI = 1.7). Diese Wirksamkeit konnte bei Konzentrationen beobachtet werden, die nicht hämolytisch sind und ungiftig gegenüber menschlichen Zelllinien. Thiostrepton und seine Derivate zeigten transmissionsblockierende Eigenschaften, wenn sie in Konzentrationen, die ihren IC50- oder IC90-Werten entsprachen, eingesetzt wurden. Unsere Daten zeigen auch, dass diese Substanzen die Aktivität des Proteasoms von Plasmodium abschwächen, was zu einer Anreicherung von ubiquitinierten Proteinen führte, wenn die Parasiten mit den Substanzen in IC80-Konzentrationen inkubiert wurden. Unsere Ergebnisse sprechen dafür, dass das Proteasom ein attraktives Ziel für therapeutische Maßnahmen sein kann. In diesem Zusammenhang sind die Derivate des Thiostreptons vielversprechende Kandidaten, da sie gleichzeitig an zwei unabhängigen Zielstrukturen angreifen, dem Proteasom und dem Apicoplasten und die Fähigkeit besitzen, sowohl die asexuellen Blutstadien als auch diejenigen Blutstadien, die für die Weitergabe des Parasiten verantwortlich sind, zu beseitigen. Um unsere Ergebnisse weiter zu untermauern, untersuchten wir die Wirkung von Peptidyl-Sulfonyl-Fluoriden, einer neuen Klasse von Substanzen mit Wirksamkeit gegen Malaria und hemmender Wirkung gegenüber dem Proteasom auf die Reifung von Gametozyten. Die Substanzen AJ34 und AJ38 unterdrückten die Bildung von Gametozyten vollständig, wenn sie in Konzentrationen, die ihren IC50-Werten (0.23 µM und 0.17 µM) entsprachen, eingesetzt wurden. Dies spricht für ein starkes transmissionsblockierendes Potential dieser Substanzen. Das Proteasom, ein bedeutender proteinabbauender Komplex, der für den Abbau und die Wiedergewinnung nicht funktioneller Proteine verantwortlich ist, wurde bisher nur indirekt in P. falciparum untersucht. Zusätzlich wurde die Existenz eines, dem Proteasom-ähnlichen, Proteins mit Ähnlichkeiten zu bakteriellen ClpQ/hslV Threonin-Peptidasen in Plasmodium vermutet. Gegen die Untereinheiten alpha 5 (α5-SU), beta 5 (β5-SU) und gegen pfhslV wurden in Mäusen Antikörper generiert. Mit diesen konnten wir zeigen, dass das Proteasom sowohl in den asexuellen als auch in den sexuellen Blutstadien von P. falciparum exprimiert wird und im Zellkern und im Zytoplasma lokalisiert sind. Die Expression von PfhslV konnte jedoch nur in Trophozoiten und Schizonten beobachtet werden. Der Transport der Proteasomuntereinheiten wurde weiterhin durch die Herstellung von transgenen Parasiten, die GFP-markierte Proteine bilden, untersucht. Die Expression von α5-SU-GFP in transgenen Parasiten schien im Zytoplasma aller Blutstadien lokalisiert zu sein, wobei durch diese Parasiten keine zusätzlichen Informationen gewonnen werden konnten. Zusammengefasst sprechen unsere Daten für zwei neue Werkzeuge für Kombinationstherapien. Hybridmoleküle sind vielversprechende Werkzeuge zur Heilung von gleichzeitig mit Malaria und HIV infizierten Patienten. Sehr wirksame Antibiotika mit einem breiten Wirkungsspektrum könnten in Artemisinin-Kombinationstherapien nützlich werden, wenn es darum geht, resistente Parasiten zu beseitigen und die Übertragung sowohl der Resistenz als auch der Krankheit zu verringern. KW - Malaria KW - HIV KW - Thiostrepton KW - Arzneimitteldesign KW - Malaria KW - HIV KW - co-infection KW - drug KW - screening KW - hybrid KW - proteasome KW - thiostrepton Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71841 ER - TY - THES A1 - Bothe, Sebastian Helmut T1 - Fragmentbasiertes Design von p97-Liganden: Identifizierung von Startstrukturen zur Entwicklung von Protein-Protein-Interaktionsinhibitoren für die SHP-Bindestelle der AAA+ ATPase p97 T1 - Fragment-based design of p97-ligands: Identification of starting points for the development of protein-protein-interaction inhibitors targeting the SHP-binding site of the AAA+ ATPase p97 N2 - Die AAA+ ATPase p97 ist ein essenzielles Protein, das an einer Vielzahl zellulärer Prozesse beteiligt ist und eine Schlüsselrolle in der Protein-Homöostase spielt. Die funktionale Diversität von p97 beruht auf der Interaktion zahlreicher unterschiedlicher Kofaktoren, die vorwiegend an die N-Domäne von p97 binden. Aufgrund seiner Bedeutung in der Regulierung diverser physiologischer und pathologischer Prozesse stellt p97 eine interessante Zielstruktur für die Entwicklung neuer Wirkstoffe dar, die insbesondere in der Krebstherapie von Bedeutung sein könnte. Bekannte p97-Inhibitoren greifen vor allem die ATPase-Funktion des Proteins an. Ein neuer pharmakologischer Ansatz stellt die Inhibierung der Kofaktorbindung an die N-Domäne dar. Ein solcher Protein-Protein-Interaktionsinhibitor wäre nicht nur von therapeutischem Interesse, sondern hätte auch einen besonderen Nutzen für die Entschlüsselung molekularer und zellulärer Funktionen von p97-Kofaktoren. In dieser Arbeit wurde ein fragmentbasierter Ansatz für die Identifizierung von chemischen Startstrukturen für die Entwicklung eines Protein-Protein- Interaktionsinhibitors verfolgt. Als Zielstruktur wurde die SHP-Bindestelle in der N-Domäne gewählt. Die Identifizierung von Liganden erfolgte sowohl durch computergestützte Methoden (insbesondere virtuelles Screening und Molekulardynamik-Simulationen) als auch experimentell durch biophysikalische Techniken (wie Biolayer-Interferometrie, Röntgenstrukturanalyse und ligandbasierte NMR-Techniken). Die Grundlage des computerbasierten Designs stellte eine Analyse der bekannten Kristallstrukturen der p97-Komplexe mit den SHP-Motiven der Kofaktoren UFD1 und Derlin-1 dar. Darüber hinaus dienten Molekulardynamik-Simulationen der Analyse der Wassereigenschaften innerhalb der SHP-Bindestelle. Darauf aufbauend wurden verschiedene Pharmakophormodelle entwickelt, die die Grundlage des im Anschluss durchgeführten virtuellen Screenings und Dockings bildeten. Anhand der Ergebnisse von Molekulardynamik-Simulationen wurden zehn Verbindungen für die experimentelle Validierung ausgewählt. Hiervon konnten zwei Fragmente in STD-NMR- und Biolayer-Interferometrie-Experimenten als Liganden bestätigt werden. In einem parallel durchgeführten biophysikalischen Fragmentscreening mittels Biolayer-Interferometrie wurden unter mehr als 650 Verbindungen 22 identifiziert, die an die N-Domäne binden. 15 dieser Fragmente wurden durch einen orthogonalen STD-NMR-Assay bestätigt. Fünf dieser Verbindungen zeigten Affinitäten mit KD-Werten kleiner 500μMund günstigen Ligandeffizienzen. Des Weiteren konnte die Bindungskinetik und Affinität des in der Literatur als p97-Inhibitor berichteten Naturstoffes Xanthohumol bestimmt und eine Bindung an die N-Domäne bestätigt werden. Zur Identifizierung möglicher Bindestellen dieser fünf Fragmente wurden mixed-solvent Molekulardynamik-Simulationen durchgeführt. Diese ergaben, dass alle Verbindungen die SHP-Bindestelle in der N-Domäne adressieren. Die Regionen fielen mit hot spots der Kofaktorwechselwirkungen zusammen und stellen somit mögliche Ankerpunkte für die Weiterentwicklung dar. Für zwei Fragmente konnten die postulierten Bindestellen mittels Röntgenstrukturanalyse bzw. STD-NMR-Messungen an p97-Alanin-Mutanten bestätigt werden. Die erhaltene Röntgenstruktur ist die erste p97-Struktur, die ein gebundenes Fragment an der N-Domäne zeigt. N2 - The AAA+ATPase p97 is an essential protein involved in numerous cellular pro-cesses and plays a key role in multiple aspects of protein homeostasis. Its functio-nal diversity is mediated through the interaction with a large number of distinctcofactors binding to the N-domain of p97. Due to its significant role in regulatinga variety of physiological responses, p97 has emerged as a potential therapeu-tic target. A small molecule inhibiting the cofactor binding would be importantto dissect the molecular and cellular functions of p97 cofactors, thus helping tounravel their specific role in controlling p97 activity. Such compounds may alsoopen routes to new cancer therapies.In this work, a fragment-based approach was pursued for the identification ofchemical starting points for the development of a protein-protein interaction in-hibitor addressing the SHP binding site. Therefore, computer-assisted methods,such as virtual screenings and molecular dynamics simulations, as well as bio-physical techniques including biolayer interferometry, X-ray crystallography, andligand-based NMR techniques, were applied.The computer-based design started with an analysis of the known p97 crystalstructures in complex with the SHP motifs of cofactors UFD1 and Derlin-1. In ad-dition, molecular dynamics simulations were used to analyze the water proper-ties within the SHP binding site. Based on these results, pharmacophore modelswere developed and utilized in the subsequent virtual screening and dockingprocess. With the help of molecular dynamics simulations, ten compounds wereselected for experimental validation. Two of these were confirmed as ligands inSTD-NMR and biolayer interferometry experiments.In parallel, a biophysical fragment screening of over 650 compounds was perfor-med using the biolayer interferometry method. This led to the identification of22 compounds binding to the N-domain. Fifteen of these fragments were con-firmed in an orthogonal STD-NMR assay. Five compounds showed affinities withKDvalues below 500 μM and favourable ligand efficiencies for further optimiza-tion. Furthermore, the binding kinetics and affinity of xanthohumol, a naturalproduct reported in the literature as a p97 inhibitor, were determined and bin-ding to the N-domain was confirmed. xToidentify possible binding sites of these five fragments, mixed solvent mole-cular dynamics simulations were performed. These revealed that all compoundsaddress the SHP binding site in the N-domain. The regions coincide with hotspots of the cofactor binding and, thus, represent potential anchor points for aprotein-protein interaction inhibitor. For two fragments, the postulated bindingsites were confirmed by X-ray crystallography and STD-NMR measurements onp97 alanine mutants, respectively. The X-ray structure obtained is the first p97structure showing a fragment bound to the N-domain. KW - Arzneimitteldesign KW - Fragmentscreening KW - p97 KW - Biolayerinterferometrie KW - Protein-Protein-Interaktion KW - Kofaktorbindung KW - fragment screening KW - p97 KW - biolayerinterferometry KW - protein-protein-interaction KW - cofactorbinding KW - Protein-Protein-Wechselwirkung KW - Wirkstoffdesign Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-239112 ER - TY - THES A1 - Busemann, Matthias T1 - Entwicklung chemometrischer Methoden für das in-silico-Wirkstoffdesign T1 - Development of chemometric techniques for the in-silico drug design N2 - Diese Dissertation beschreibt Methoden zur Lösung wichtiger anwendungsorientierter Aspekte des struktur- und ligandbasierten in-silico-Wirkstoffdesigns. Dabei liegt der Fokus auf der Entwicklung chemometrischer Verfahren und der Überprüfung ihrer Leistungsfähigkeit. Die vorgeschlagenen Algorithmen werden mit entsprechenden etablierten Techniken verglichen. Die folgenden Abschnitte fassen die Vorgehensweisen und Resultate in den einzelnen Projektbereichen zusammen. Identifizierung von Outliern. Die Untersuchung eines QSAR-Datensatzes mit dem Ziel der Outlier-Identifizierung wird in der Praxis häufig vernachlässigt. Dabei ist es offensichtlich, daß kein QSAR-Modell auf jede nur denkbare chemische Verbindung anwendbar sein kann. Vielmehr handelt es sich um empirische mathematische Modelle, die nur innerhalb jenes Datenraums Gültigkeit besitzen, der von den Trainingsobjekten aufgespannt wird. Daher ist jedes Modell auf gewisse Grenzen beschränkt, außerhalb derer eine verläßliche Vorhersage unmöglich ist. Die in dieser Arbeit entwickelte Methode ODD dient der Ermittlung dieser Grenzen und damit der Identifizierung von Outliern, also Objekten außerhalb des Anwendungsbereichs des Modells. Ziel der Entwicklung war ein nur auf den unabhängigen Variablen (X-Daten) basierendes Verfahren, das auch auf hochdimensionaleDatensätze anwendbar ist undweitestgehend auf den Eingriff des Benutzers (etwa die Definition von Grenzwerten) verzichtet. Ebenfalls wünschenswert war die Fähigkeit zur Identifikation von Inliern. Eine ausreichend hohe Geschwindigkeit sollte die Einsetzbarkeit im virtuellen Screening gewährleisten. Die Methode mußte der Überprüfung standhalten, den Vorhersagefehler eines Modells bei Vorhandensein extremer Outlier zu reduzieren, gleichzeitig aber unkritische Datensätze unbeeinflußt zu lassen. ODD basiert auf der Beurteilung der euklidischen Distanz eines Testobjekts zu seinem am nächsten benachbarten Trainingsobjekt. Der Schwellenwert für die Betrachtung eines Objekts als Outlier wird dabei aus der Verteilung der Nächster-Nachbar-Distanzen der Trainingsobjekte berechnet. Durch dieses intrinsische Maß ergibt sich die gewünschte Dimensionsunabhängigkeit und vor allem die automatische Anpassung des Grenzwerts an die Charakteristik des Kalibrierdatensatzes ohne Eingriff des Benutzers. Die Validierung zeigt, daß ODD extreme Outlier zuverlässig erkennt und sich gleichzeitig durch eine im Vergleich zu anderen gebräuchlichen Verfahren geringere Anzahl falsch positiver Identifizierungen auszeichnet. Ensemble-Techniken. In einer vergleichenden Studie wurde die Leistungsfähigkeit verschiedener Ensemble-Techniken hinsichtlich ihres Einflusses auf den Vorhersagefehler untersucht. Dazu wurden umfangreiche Simulationen anhand mehrerer realer QSAR-Datensätze durchgeführt. Die Verwendung von Ensembles (d. h. einer Sammlung vielerModelle, diemit geringfügigmanipulierten Varianten des Trainingsdatensatzes kalibriert wurden) wirkt sich im allgemeinen positiv auf den Vorhersagefehler (RMSEP) aus. Diese Reduzierung des RMSEP wurde hier ermittelt und für verschiedenen Ansätze zur Ensemble-Generierung verglichen. Insgesamt betrachtet erwiesen sich die Methoden der konvexen Pseudodaten und des Baggings als die effektivsten Verfahren zur Ensemble-Generierung, da sie den Vorhersagefehler am deutlichsten verbesserten. Die konvexen Pseudodaten wurden erstmalig zur Erzeugung von Ensembles in der QSAR-Analyse eingesetzt; sie werden als neuer Standard zur Reduzierung des RMSEP bei QSAR-Problemen vorgeschlagen, die Regressionsmodelle auf Basis von latenten Variablen verwenden. Darüber hinaus bieten die Studien eine Abschätzung dermit Hilfe von Ensembles zu erzielenden Reduktion des Vorhersagefehlers bei typischen QSAR-Datensätzen. Virtuelles Screening. Beim virtuellen Screening handelt es sich um eine Technik zum Durchsuchen großer (virtueller)Molekülbibliotheken—oftmehrere Millionen Verbindungen — nach den aussichtsreichsten Wirkstoffkandidaten. Dies kann sowohl durch strukturbasierte als auch mit Hilfe ligandbasierter Verfahren geschehen. Es wurden umfangreiche Simulationen anhand sechs verschiedener Targets und einer Bibliothek von mehr als 90 000 Molekülen durchgeführt, um das Potential strukturbasierter (Docking mit FLEXX) und ligandbasierter (Ähnlichkeitssuchemitmehreren Referenzen) Verfahren zu vergleichen. Darüber hinauswurde durch Berechnung von Interaktionsfingerprints eineMöglichkeit geschaffen, die Information der beiden sonst getrennten Herangehensweisen zu kombinieren. Um den Einfluß des Klassifizierungsalgorithmus zu untersuchen, wurden verschiedene statistische Methoden zur Datenauswertung herangezogen. Als Bewertungskriterium für die Leistungsfähigkeit eines Verfahrens diente jeweils die Anzahl der wiedergefundenen aktiven Moleküle in der simulierten Screeningdatenbank. Die Resultate führen zu dem Schluß, daß ligandbasierte Verfahren, die einfacher einzusetzen sind aber mehr a-priori -Information benötigen, dem strukturbasierten virtuellen Screening hinsichtlich der Datenbankanreicherung überlegen sind. Weiterhin konnte gezeigt werden, wie nutzbringend die Zusammenführung von strukturbasierter Information und solcher über das Interaktionsmuster bekanntermaßen aktiver Verbindungen für die Erhöhung der Wiederfindungsrate ist. Bei der Datenanalyse stellte sich heraus, daß im Mittel bestimmte statistische Methoden (minimale euklidische Distanz ED/Min bzw. Tanimoto-Ähnlichkeit der Integer-Fingerprints Int/Min) zu bevorzugen sind. Kovalentes Docking von Cathepsin-Inhibitoren. Die Cysteinproteasen Cathepsin B und L sind interessante pharmakologische Targets. Geeignete Inhibitoren stammen u. a. aus der Strukturklasse der Aziridine. Ein nukleophiler Angriff des Cysteinrests des Enzyms auf den elektrophilen Aziridinring führt hier zur Ausbildung einer kovalenten Ligand-Rezeptor-Bindung. Praktisch alle erhältlichen Dockingprogramme konzentrieren sich jedoch auf nicht-kovalente Ligand-Rezeptor-Interaktionen und lassen kein uneingeschränktes kovalentes Docking zu. Daher wurde für FLEXX ein Dockingprotokoll entworfen, das den entscheidenden nicht-kovalenten Zustand vor Ausbildung der kovalenten Bindung simulieren kann. Auf dieseWeise konnte untersucht werden, ob sich die Reaktionszentren von Ligand und Enzym ausreichend nahe für die Ausbildung einer kovalenten Bindung kommen. Der vorgestellte Ansatz läßt sich leicht auf andere kovalente Ligand-Rezeptor- Systeme übertragen und bietet somit eine breite Anwendbarkeit. Weiterhin wurde die Parametrisierung der in FLEXX vorgesehenen Interaktionsgeometrien an die strukturellen Eigenheiten der zu dockenden Aziridide angepaßt. Diese weisen nämlich formal eine Amidbindung auf, deren geometrische und elektronische Eigenschaften jedoch deutlich von den Werten eines typischen Amids abweichen. Die Ergebnisse der Dockingstudien liefern wertvolle Einblicke für das Verständnis der Selektivität der untersuchten Liganden bezüglich Cathepsin B beziehungsweise L. Umgekehrt erbringt die gute Übereinstimmung der FLEXX-Resultate mit den experimentell bestimmten Inhibitionskonstanten den Nachweis für die Validität des verwendeten Dockingprotokolls. N2 - This thesis describes methods for solving important application-oriented aspects of structure-based and ligand-based in silico drug design. The proposed algorithms are compared to well established techniques. The focus is particularly on the development and benchmarking of different chemometric techniques. In the following, the approaches and results within the different project areas are summarised. Outlier Identification. The inspection of QSAR datasets in order to identify prediction outliers is often omitted in practice. However, it is clear that no QSAR model is applicable to every conceivable chemical compound. Since QSAR models represent empirical mathematical models, these are only valid within the data space spanned by the training data. Hence, every model is restricted to certain borders beyond which a reliable prediction is impossible. The method ODD developed in this work can be used to determine these borders and thus to identify outliers. Those are objects outside the data space spanned by the training data (i.e. the applicability domain of the model). The aim of the method is to detect outliers solely based on the predictor variables (X data). Moreover, the method must be capable to handle high-dimensional datasetswithminimal user interference (e.g. setting of cut-offs). Furthermore, the ability to identify inliers would be preferable. The computational speed should be high enough to apply the method to virtual screening. The developed technique had to prove that it provides a reduction of the model’s error of prediction if extreme outliers are present. At the same time, it should leave non-critical datasets unaffected. ODD is based on the evaluation of the Euclidean distance of a test object towards its nearest neighbouring training object. The cut-off for deeming an object as outlier is calculated from the distribution of the nearest neighbour distances of the training set. This intrinsic value leads to the desired independence from data dimensionality and, above all, to an automatic adjustment of the cut-off to the characteristics of the calibration dataset without any user intervention. The validation shows that ODD reliably identifies extreme outliers. On the other hand, it offers a low rate of false positives compared to other common techniques for outlier identification. Ensemble Techniques. In a benchmark study, the impact of different ensemble techniques on the prediction error was investigated. For this purpose, comprehensive simulations on several real QSAR datasets were carried out. The application of ensembles (i.e. a collection of many models trained with sligthly perturbed versions of the training set) usually lowers the error of prediction (RMSEP). The RMSEP reduction was determined and compared for different approaches of ensemble generation. Overall, the methods of convex pseudo data and bagging proved to be the most efficient ways for ensemble generation (i.e. they resulted in the largest reduction of the prediction error). Convex pseudo data, which were applied toQSAR data sets for the first time as ensemble technique, are proposed as the new standard for lowering RMSEP in QSAR problems using latent variable regression models. Furthermore, the effect size of ensemble averaging was quantified for typical QSAR data sets. Virtual Screening. Virtual screening is a technique to screen large (virtual) molecular databases — often several million compounds — for the most promising drug candidates. This can be done by structure-based as well as by ligand-based approaches. Comprehensive computations on six different targets and a library of more than 90 000 compounds were carried out to compare the potential of structure-based techniques (docking with FLEXX) and ligand-based techniques (similarity searching with multiple queries). In addition to that, interaction fingerprints were computed in order to combine the information of the otherwise distinct approaches. Several statistical methods were applied for data analysis to investigate the impact of the machine learning algorithm. Figure of merit for each approach was the number of active compounds retrieved from the assembled screening database with known actives. The results lead to the following conclusions: Ligand-based approaches, which are simpler to use but require more a priori information, turned out to be superior to structure-based virtual screening techniques in terms of database enrichment. In addition, it could be shown that combination of structure-based information with information of the interaction pattern of known actives is beneficial for increasing retrieval rates. Data analysis revealed that certain statistical methods (minimum Euclidean distance ED/Min, and Tanimoto similarity of integer fingerprints Int/Min, respectively) are on average to be preferred. Covalent Docking of Cathepsin Inhibitors. Cysteine proteases Cathepsin B and L are interesting pharmacological targets. Suitable inhibitors, amongst others, come from the structural class of aziridines. A nucleophilic attack of the enzyme’s active site cysteine moiety on the electrophilic aziridine ring leads to formation of a covalent bond between ligand and receptor. However, virtually all available docking programs concentrate on noncovalent ligand-receptor interactions and do not provide sophisticated, unrestricted covalent docking. Thus, a docking protocol for FLEXX was designed which is able to represent the essential non-covalent state before formation of the covalent bond. That way, it could be studied whether or not the reaction centres of both ligand and receptor adopt a position close enough to each other to actually form the covalent bond. The approach presented here can easily be transferred to other covalent ligand-receptor systems and therefore provides a broad applicability. Furthermore, the parametrisation of the FLEXX interaction geometries was adapted to account for the special structural features of aziridides. Those show a formal amide bond, but its geometric and electronic properties differ noticeably from a typical amide. The results of the docking studies provide valuable insights for understanding the Cathepsin B/L selectivity of the ligands under scrutiny. Vice versa, the good correspondence of the FLEXX results and the inhibition constants obtained experimentally provide evidence for the validity of the applied docking protocol. KW - Arzneimitteldesign KW - Chemometrie KW - Chemometrie KW - Outlier-Identifizierung KW - virtuelles Screening KW - Docking KW - Chemometrics KW - Outlier Detection KW - virtual screening KW - docking Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18777 ER - TY - THES A1 - Diebold, Mathias T1 - Virtuelles Screening und Entwicklung selektiver Liganden des Aurora-A – MYCN Komplexes und computergestützte Methoden zur Analyse und Design von PROTACs T1 - Virtual screening and development of selective ligands for the Aurora-A - MYCN complex and computational methods for analysis and design of PROTACs N2 - Die Interaktion des onkogenen Transkriptionsfaktors MYCN mit der Ser/Thr Kinase Aurora-A verhindert dessen Abbau über das Ubiquitin Proteasomsystem indem die Rekrutierung des SCF FbxW7 Komplexes verhindert wird. Die Kinase nimmt mit der Bindung an MYCN eine aktive Konformation ein und erhält somit die Fähigkeit zur Kinaseaktivität ohne die sonst notwendige Phosphorylierung von Thr288 oder die Anwesenheit eines Aktivators wie TPX2. Da hohe MYCN Konzentrationen Tumore wie Neuroblastome antreiben, ist die Störung der Komplexbildung mit Aurora-A eine valide Strategie zur Entwicklung von Chemotherapeutika. Einige Inhibitoren von Aurora-A wie Alisertib (MLN8237) sind in der Lage, eine Konformationsänderung in der Kinase zu verursachen, die mit der Bindung von MYCN inkompatibel ist und auf diese Weise den Abbau des Transkriptionsfaktors induziert. Da Aurora-A wichtige Funktionen in der Mitose übernimmt, könnte eine direkte Adressierung des Komplexes anstelle einer systemischen Inhibition der Kinase vielversprechender sein. Ziel des Projektes war die Identifizierung von Molekülen, die selektiv an das Interface des Aurora-A – MYCN Komplexes binden und weiter optimiert werden können, um einen gezielten Abbau des Transkriptionsfaktors über einen PROTAC Ansatz zu ermöglichen. Virtuelle Screenings und molekulardynamische Simulationen wurden durchgeführt, um kommerziell erhältliche Verbindungen zu identifizieren, welche mit einer Bindetasche des Komplexes interagieren, die nur zustande kommt, wenn beide Proteine miteinander interagieren. Aus einem ersten Set von zehn potentiellen Liganden wurde für vier eine selektive Interaktion mit dem Protein – Protein Komplex gegenüber Aurora-A oder MYCN alleine in STD-NMR Experimenten bestätigt. Zwei der Hits besaßen ein identisches Grundgerüst und wurden als Ausganspunkt für die Optimierung zu potenteren Liganden genutzt. Das Gerüst wurde fragmentweise vergrößert und in Richtung besserer in-silico Ergebnisse und Funktionalisierung zur Anbringung von E3-Ligase-Liganden optimiert. Neun dieser Liganden der zweiten Generation wurden synthetisiert. Um quantitative Bindungsdaten zu erhalten, wurde ein kovalent verknüpftes Aurora-A – MYCN Konstrukt entworfen. Die strukturelle und funktionale Integrität wurde in STD-NMR und BLI Experimenten mit bekannten Aurora-A Inhibitoren bestätigt, sowie in NMR-basierten ATPase Assays. Zusätzlich konnte die Kristallstruktur des Konstrukts gelöst und damit die Validität des Designs bestätigt werden. Quantitative Messungen der synthetisierten Moleküle identifizierten HD19S als Hit mit einer zehnfach höheren Affinität für das Aurora-A – MYCN Konstrukt im Vergleich zu der Kinase allein. Zusätzlich wurden in-silico Untersuchungen zu PROTACs der Aurora-A Kinase durchgeführt. Interaktionen zwischen Aurora-A, der E3-Ligase Cereblon und den Liganden wurden modelliert und für die Erklärung unterschiedlicher Aktivitäten der eingesetzten PROTACs verwendet. Zudem zeigte das aktivste PROTAC eine hohe Selektivität für Aurora-A gegenüber Aurora-B, obwohl die verwendete Erkennungseinheit (Alisertib) an beide Aurora-Proteine bindet. Dieser Umstand konnte durch energetische Analysen von molekulardynamischen Simulationen der ternären Komplexe erklärt werden. Optimierungsmöglichkeiten für eine effizientere Degradation von Aurora-A durch die PROTACs wurden basierend auf modifizierten Erkennungseinheiten und verbesserten Linkern untersucht. N2 - The association of the oncogenic transcription factor MYCN with the Ser/Thr kinase Aurora-A prevents its degradation via the ubiquitin proteasome system by preventing the SCF FbxW7 complex from binding. The kinase adopts an active conformation when bound to MYCN, enabling kinase activity without prior phosphorylation on Thr288 or the presence of an activator like TPX2, and therefore at inappropriate times during the cell cycle. As high levels of MYCN have been shown to drive cancers like neuroblastoma, disrupting the complex formation is thought to be a viable development strategy for chemotherapeutics. Several small-molecule inhibitors of Aurora-A, like Alisertib (MLN8237), are able to induce a conformational change in the kinase, preventing the formation of the protein – protein complex and therefore promoting MYCN degradation. However, since Aurora-A has important roles during mitosis targeting only the complex could be a more promising approach than the systemic inhibition of the kinase. This project aimed to identify small molecules which selectively bind at the Aurora-A – MYCN interface and can be further optimized to induce targeted degradation via a PROTAC approach. Virtual screenings and molecular dynamics simulations were performed to identify commercially available compounds which should bind to a pocket formed only when the two proteins come together. Of a first set of ten potential binders, four showed binding to the Aurora-A – MYCN complex but not the individual proteins in STD-NMR experiments. Two of these hit molecules contained the same scaffold and were used as a starting point for optimization towards more potent ligands. In a fragment-based fashion, the scaffold was grown to achieve better affinity in-silico and provide linkage points for functionalization such as the attachment of E3 ligase ligands to create PROTACs. Nine of these second-generation compounds were then synthesized. In order to obtain quantitative binding data a covalently linked Aurora-A – MYCN construct was designed. Its structural and functional validity was shown in STD-NMR and BLI experiments with known Aurora-A inhibitors and in NMR-based ATPase assays. In addition, a crystal structure of the construct was solved, validating the designed structure. Quantitative measurements with the synthesized compounds revealed a positive hit (HD19S) with a ten-fold higher affinity to the covalently linked AuroraA – MYCN as compared to Aurora-A alone. Additionally, effects of PROTACs designed to degrade Aurora-A were studied in-silico. Interactions between Aurora-A, the E3-ligase Cereblon and small molecules were modelled and successfully used to explain the differences in activities observed with different PROTACs. The most active PROTAC also showed a high selectivity for Aurora-A over Aurora-B, even though the recognition unit (Alisertib) can bind both family members. Through energetic analysis of molecular dynamics simulations of the ternary complexes, these differences could be explained. Optimizations for a more efficient degradation of Aurora-A by the PROTACs were examined by changing the recognition unit and improving linkers. KW - Arzneimitteldesign KW - Protein-Protein-Wechselwirkung KW - Vernetzung KW - Wirkstoffdesign KW - PROTAC KW - Proteolysis-Targeting-Chimera KW - Aurora-A KW - MYCN KW - Aurora-A-MYCN-Komplex Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-317594 ER - TY - THES A1 - Eltschkner, Sandra T1 - Targeting the Bacterial Fatty-Acid Synthesis Pathway: Towards the Development of Slow-Onset Inhibitors and the Characterisation of Protein-Protein Interactions T1 - Die bakterielle Fettsäurebiosynthese als Zielobjekt zur Entwicklung langsam bindender Inhibitoren und zur Charakterisierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen N2 - A continuous arms race between the development of novel antibiotics and the evolution of corresponding resistance mechanisms in bacteria has been observed, since antibiotic agents like arsphenamines (e.g. Salvarsan, developed by Paul Ehrlich [1]), sulphonamides (e.g. Prontosil, Gerhard Domagk [2]) and penicillin (Alexander Fleming [3]) were first applied to effectively cure bacterial infections in the early 20th century. The rapid emergence of resistances in contrast to the currently lagging discovery of antibiotics displays a severe threat to human health. Some serious infectious diseases, such as tuberculosis or melioidosis, which were either thought to be an issue only in Third-World countries in case of tuberculosis, or regionally restricted with respect to melioidosis, are now on the rise to expand to other areas. In contrast, methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is already present in clinical setups all over the world and causes severe infections in immunocompromised patients. Thus, there is an urgent need for new and effective antimicrobial agents, which impair vital functions of the pathogen’s metabolism. One central metabolic pathway is represented by the bacterial fatty-acid synthesis pathway (FAS II), which is essential for the synthesis of long and branched-chain fatty acids, as well as mycolic acids. These substances play a major role as modulating components of the properties of the most important protective barrier – the cell envelope. The integrity of the bacterial cell wall and the associated membrane(s) is crucial for cell growth and for protection against physical strain, intrusion of antibiotic agents and regulation of uptake of ions and other small molecules. Thus, this central pathway represents a promising target for antibiotic action against pathogens to combat infectious diseases. The last and rate-limiting step is catalysed by the trans-2-enoyl-ACP reductase (ENR) FabI or InhA (in mycobacteria), which has been demonstrated to be a valuable target for drug design and can be addressed, amongst others, by diphenyl ether (DPE) compounds, derived from triclosan (TCL) – the first one of this class which was discovered to bind to ENR enzymes [4, 5]. Based on this scaffold, inhibitors containing different combinations of substituents at crucial positions, as well as a novel type of substituent at position five were investigated regarding their binding behaviour towards the Burkholderia pseudomallei and Mycobacterium tuberculosis ENR enzymes bpFabI and InhA, respectively, by structural, kinetic and in-vivo experiments. Generally, substitution patterns modulate the association and dissociation velocities of the different ENR inhibitors in the context of the two-step slow-onset binding mechanism, which is observed for both enzymes. These alterations in the rapidity of complex formation and decomposition have a crucial impact on the residence time of a compound and hence, on the pharmacokinetic properties of potential drug candidates. For example, the substituents at the 2’-position of the DPE scaffold influence the ground- and transition state stability during the binding process to bpFabI, whereas 4’-substituents primarily alter the transition state [6]. The novel triazole group attached to the 5-position of the scaffold, targeting the hydrophobic part of the substrate-binding pocket in InhA, significantly enhances the energy barrier of the transition state of inhibitor binding [7] and decelerates the association- as well as the dissociation processes. Combinations with different substituents at the 2’-position can enhance or diminish this effect, e.g. by ground-state stabilisation, which will result in an increased residence time of the respective inhibitor on InhA. Further structural investigations carried out in this work, confirm the proposed binding mode of a customised saFabI inhibitor [8], carrying a pyridone moiety on the DPE scaffold to expand interactions with the protein environment. Structural and preliminary kinetic data confirm the binding of the same inhibitor to InhA in a related fashion. Comparisons with structures of the ENR inhibitor AFN-1252 [9] bound to ENR enzymes from other organisms, addressing a similar region as the pyridone-moiety of the DPE inhibitor, suggest that also the DPE inhibitor bears the potential to display binding to homologues of saFabI and InhA and may be optimised accordingly. Both of the newly investigated substituents, the pyridone moiety at the 4’-position as well as the 5-triazole substituent, provide a good starting point to modify the DPE scaffold also towards improved kinetic properties against ENR enzymes other than the herein studied and combining both groups on the DPE scaffold may have beneficial effects. The understanding of the underlying binding mechanism is a crucial factor to promote the dedicated design of inhibitors with superior pharmacokinetic characteristics. A second target for a structure-based drug-design approach is the interaction surface between ENR enzymes and the acyl-carrier protein (ACP), which delivers the growing acyl chain to each distinct enzyme of the dissociated FAS-II system and presumably recognises its respective interaction partner via electrostatic contacts. The interface between saACP and saFabI was investigated using different approaches including crosslinking experiments and the design of fusion constructs connecting the ACP and the FabI subunits via a flexible linker region of varying lengths and compositions. The crosslinking studies confirmed a set of residues to be part of the contact interface of a previously proposed complex model [10] and displayed high crosslinking efficiency of saACP to saFabI when mutated to cysteine residues. However, crystals of the complex obtained from either the single components, or of the fusion constructs usually displayed weak diffraction, which supports the assumption that complex formation is highly transient. To obtain ordered crystals for structural characterisation of the complex it is necessary to trap the complex in a fixed state, e.g. by a high-affinity substrate attached to ACP [11], which abolishes rapid complex dissociation. For this purpose, acyl-coupled long-residence time inhibitors might be a valuable tool to elucidate the detailed architecture of the ACP-FabI interface. This may provide a novel basis for the development of inhibitors that specifically target the FAS-II biosynthesis pathway. N2 - Seit Beginn der Anwendung antibiotischer Substanzen wie Arsphenaminen, z.B. Salvarsan, entwickelt von Paul Ehrlich [1], Sulfonamiden, z.B. Prontosil, dessen antibakterielle Wirksamkeit durch Gerhard Domagk nachgewiesen wurde [2], oder des von Alexander Fleming entdeckten Penicillins [3] zur effektiven Bekämpfung von Infektionskrankheiten Anfang des 20. Jahrhunderts findet ein kontinuierliches Wettrüsten zwischen der Entstehung von Antibiotikaresistenzen in Bakterien und der Entwicklung neuer Antibiotika statt. Vor allem die zügige Entstehung von Resistenzen im Gegensatz zum eher stockenden Fortschritt der Entdeckung neuer Antibiotika stellt ein ernstzunehmendes Risiko für die menschliche Gesundheit dar. Einige stark lebensbedrohliche Infektionskrankheiten, darunter Tuberkulose und Melioidose, erfahren dadurch eine erhöhte Verbreitung. Ein Anstieg der Zahl der Tuberkuloseerkrankungen in Gebieten, in denen die Krankheit bereits als ausgerottet galt, beispielsweise in Europa; oder im Falle der Melioidose, eine Verbreitung in Gebiete, in denen die Krankheitserreger natürlicherweise nicht vorkommen; sind u.a. die Folgen fehlender Wirkstoffe zur Bekämpfung resistenter Stämme. Methicillinresistente Staphylococcus-aureus- (MRSA-) Stämme sind hingegen bereits fast weltweit in Krankenhäusern verbreitet und gelten dort als Quelle schwerer Infektionen, die vor allem für Patienten mit geschwächtem Immunsystem eine ernsthafte Bedrohung darstellen. Die mannigfaltigen Vorkommen resistenter Erreger und die eingeschränkten Behandlungsmöglichkeiten dadurch verursachter Infektionen machen die Entwicklung neuer, wirksamer Antibiotika dringend notwendig. Ein zentraler Stoffwechselweg der Bakterien ist die Fettsäurebiosynthese II, die im Hinblick auf die Herstellung lang- und verzweigtkettiger Fettsäuren sowie von Mykolsäuren essentiell ist. Die Zusammensetzung der Fettsäuren trägt maßgeblich zur Funktionsfähigkeit der unentbehrlichen Schutzbarriere der Zelle – nämlich der Zellhülle – bei. Eine intakte Zellwand und deren assoziierte Membranen schützen die Zelle vor physikalischem Stress, vor dem Eindringen antibiotischer Substanzen und regulieren die Aufnahme anderer Kleinmoleküle und Ionen. Genau aus diesem Grunde stellt die Fettsäurebiosynthese ein attraktives Ziel für die Entwicklung von Antibiotika dar. Die Enoyl-ACP-Reduktase (ENR), welche den letzten und geschwindigkeitsbestimmenden Schritt des Synthesezyklus katalysiert, wurde als hervorragendes Zielmolekül identifiziert und wird unter anderem von Diphenylethern gehemmt. Diese Verbindungen sind von Triclosan abgeleitet, dessen Bindung an ENR-Enzyme als erstem Vertreter dieser Stoffklasse nachgewiesen werden konnte [4, 5]. Basierend auf dem Diphenylethergrundgerüst von Triclosan wurden Inhibitoren mit unterschiedlichen Substitutionsmustern bezüglich ihrer Bindungseigenschaften an die ENR-Enzyme von Burkholderia pseudomallei (bpFabI) und Mycobacterium tuberculosis (InhA) untersucht. Kritische Positionen dieses Grundgerüstes wurden mit verschiedenen, chemischen Gruppen versehen und die Bindung an diese beiden Enzyme anschließend strukturell, kinetisch und am lebenden Organismus charakterisiert. In beiden Fällen üben die Substitutionsmuster einen beträchtlichen Einfluss auf die Assoziations- und Dissoziationsgeschwindigkeiten der verschiedenen Inhibitoren im Rahmen des verlangsamten Zweischrittassoziationsmechanismus aus, welche wiederum die Verweildauer des Inhibitors am Enzym und dessen pharmakokinetische Eigenschaften bestimmen. Die Beschaffenheit der 2‘-Substituenten beeinflusst beispielsweise die Stabilität des Grund- sowie des Übergangszustandes im Bindungsgeschehen an bpFabI, wohingegen 4‘-Substituenten hauptsächlich zu Stabilitätsänderungen im Übergangszustand beitragen [6]. Die Einführung des Triazolsubstituenten an der 5-Position des Diphenylethergerüsts führt zu einer signifikanten Erhöhung der Energiebarriere des Übergangszustandes im Bindungsprozess an InhA [7], was im Rückschluss zu einer ebenfalls verlangsamten Dissoziation des Enzym-Inhibitor-Komplexes führt. Zusätzlich wird dieser Effekt durch die Beschaffenheit des entsprechenden Substituenten an der 2‘-Position noch verstärkt oder abgeschwächt. Dies erfolgt beispielsweise durch eine Stabilisierung des Grundzustandes und eine daraus resultierende, verlängerte Verweildauer des Inhibitors am Enzym. Weitere, strukturelle Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit konnten den vorgeschlagenen Bindungsmodus [8] des neuartigen, speziell auf das ENR-Enzym von Staphylococcus aureus (saFabI) zugeschnittenen Inhibitors „55JS“ (auch „SKTS1“) bestätigen. Dieser Diphenyletherinhibitor besitzt an der 4‘-Position einen Pyridonring, welcher die Wechselwirkungen mit dem Enzym verstärken soll. Aus den strukturellen und vorläufigen, kinetischen Daten geht hervor, dass dieser Inhibitor ebenfalls und in ähnlicher Weise an InhA bindet. Außerdem legt ein Vergleich mit Komplexstrukturen verschiedener ENRs in Verbindung mit AFN-1252 [9] die Vermutung nahe, dass auch 55JS an weitere ENR-Homologe binden könnte; denn jener Teil des AFN-1252-Inhibitors, der sich räumlich mit dem Pyridonring von 55JS überlagert, geht mit derselben Region im Protein ähnliche Wechselwirkungen ein. Es ist daher möglich, dass dieser Inhibitor das Potential birgt, durch entsprechende Optimierung als Wirkstoff gegen andere Pathogene zum Einsatz zu gelangen. Beide dieser neuartigen, funktionellen Gruppen, die Triazol- und die Pyridongruppe, stellen einen guten Ansatzpunkt für die Weiterentwicklung von Diphenylethern bezüglich verbesserter kinetischer Eigenschaften gegenüber ENR-Enzymen dar. Ein weiterer, interessanter Ansatz für die strukturbasierte Wirkstoffentwicklung ist durch die Interaktionsfläche zwischen ENR-Enzymen und dem Acyl-Carrier-Protein (ACP) gegeben. ACP transportiert die naszierende Acylkette von einem zum nächsten Enzym des dissoziierten Fettsäurebiosynthesezyklus, welche es wahrscheinlich anhand elektrostatischer Interaktionen erkennt. Die Kontaktfläche zwischen saACP und saFabI wurde hier mittels verschiedener Ansätze untersucht, die sowohl Crosslinking-Experimente als auch die Generierung von Fusionsproteinen umfassten. In den verschiedenen Fusionskonstrukten wurden das ACP- und das ENR-Protein durch eine flexible Aminosäurekette unterschiedlicher Längen und Zusammensetzungen miteinander verbunden. Durch die Crosslinking-Experimente konnten Aminosäuren identifiziert werden, welche einen Teil einer vorgeschlagenen Interaktionsfläche [10] ausmachen und tatsächlich eine hohe Vernetzungseffizienz aufwiesen. Proteinkristalle des Komplexes, die entweder beide Einzelkomponenten oder das Fusionsprotein enthielten, zeigten jedoch nur schwache Beugungsmuster. Diese Beobachtung deckt sich mit der Annahme, dass die Komplexbildung äußerst kurzlebig ist. Die intrinsische Flexibilität beider Proteine erhöht zusätzlich die Schwierigkeit, wohlgeordnete Kristalle zu erhalten. Es wird deshalb notwendig sein, den Komplex in einem fixierten Zustand einzufangen. Die Verwendung eines hochaffinen Substrates, welches die Dissoziation des Komplexes unterbindet, beispielsweise ein acylgekoppelter Inhibitor [11] mit langer Verweildauer am Enzym, könnte hier von großem Nutzen sein und es damit erlauben eine detaillierte Kenntnis der ACP-FabI-Interaktionsfläche zu erhalten, die neue Perspektiven für eine gezielte Entwicklung von Inhibitoren der Fettsäurebiosynthese II eröffnen könnten. KW - Fettsäurestoffwechsel KW - Diphenylether KW - Arzneimitteldesign KW - Verweildauer KW - bacterial fatty-acid biosynthesis KW - enoyl-ACP reductase KW - structure-based drug design KW - inhibitor residence time Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-156643 ER - TY - THES A1 - Hein, Michael T1 - Entwicklung computergestützter Methoden zur Bewertung von Docking-Lösungen und Entwurf niedermolekularer MIP-Inhibitoren T1 - Development of computer-aided methods for the evaluation of docking poses and design of small-molecule MIP inhibitors N2 - Dockingbasierte Ansätze zählen zu den wichtigsten Komponenten im virtuellen Screening. Sie dienen der Vorhersage der Ligandposition und -konformation in der Bindetasche sowie der Abschätzung der Bindungsaffinität zum Protein. Bis heute stellt die korrekte Identifizierung proteingebundener Ligandkonformationen ein noch nicht vollständig gelöstes Problem für Scoringfunktionen dar. Der erste Teil der vorliegenden Arbeit ist daher der Entwicklung computergestützter Methoden zur Bewertung von Docking-Lösungen gewidmet. Der Fokus eines ersten Teilprojektes lag auf der Berücksichtigung der Absättigung vergrabener Wasserstoffbrückenakzeptoren (HBA) und -donoren (HBD) bei der Bewertung von Docking-Lösungen. Nicht-abgesättigte vergrabene HBA und HBD stellen einen der Bindungsaffinität abträglichen Beitrag dar, der bis dato aufgrund fehlender Struktur- bzw. Affinitätsdaten in Scoringfunktionen vernachlässigt wird. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde auf der Basis einer detaillierten Untersuchung zur Häufigkeit vergrabener nicht-abgesättigter HBA und HBD in hochaufgelösten Protein-Ligand-Komplexen des Hartshorn-Datensatzes eine empirische Filterfunktion („vnaHB“-Filterfunktion) entwickelt, die unerwünschte Ligandbindeposen erkennt und von der Bewertung mittels Scoringfunktionen ausschließt. Der praktische Nutzen der empirischen Filterfunktion wurde für die Scoringfunktionen SFCscore und DSX anhand vorgenerierter Docking-Lösungen des Cheng-Datensatzes untersucht. Die Häufigkeitsuntersuchung zeigt, dass eine Absättigung vergrabener polarer Gruppen in Protein-Ligand-Komplexen für eine hochaffine Protein-Ligand-Bindung notwendig ist, da vergrabene nicht-abgesättigte HBA und HBD nur selten auftreten. Eine vollständige Absättigung durch entsprechende Proteinpartner wird für ca. 48 % der untersuchten Komplexe beobachtet, ca. 92 % weisen weniger als drei hauptsächlich schwache, nicht-abgesättigte HBA bzw. HBD (z. B. Etherfunktionen) auf. Unter Einbeziehung von Wassermolekülen in die Häufigkeitsanalyse sind sogar für ca. 61 % aller Komplexe alle wasserstoffbrückenbindenden Gruppen abgesättigt. Im Gegensatz zu DSX werden für SFCscore nach Anwendung der empirischen Filterfunktion erhöhte Erfolgsraten für das Auffinden einer kristallnahen Pose (≤ 2.0 Å Abweichung) unter den am besten bewerteten Docking-Posen erzielt. Für die beste SFCscore-Funktion (SFCscore::229m) werden Steigerungen dieses als „Docking Power“ bezeichneten Kriteriums für die Top-3-Posen (Erfolgsrate für die Identifizierung einer kristallnahen 2.0 Å Pose unter den besten drei Docking-Lösungen) von 63.1 % auf 64.2 % beobachtet. In einem weiteren Teilprojekt wurden repulsive Protein-Ligand-Kontakte infolge sterischer Überlappungen der Bindungspartner bei der Bewertung von Docking-Lösungen berücksichtigt. Die adäquate Einbeziehung solcher repulsiver Kontakte im Scoring ist für die Identifizierung proteingebundener Ligandkonformationen entscheidend, jedoch aufgrund fehlender Affinitäts- bzw. Strukturdaten problematisch. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde auf der Basis des Lennard-Jones-Potentiales des AMBER-Kraftfeldes zunächst ein neuer Deskriptor zur Beschreibung repulsiver Kontakte („Clash“-Deskriptor) entwickelt und zur Untersuchung der Häufigkeit ungünstiger Protein-Ligand-Kontakte in hochaufgelösten Protein-Ligand-Komplexen des Hartshorn-Datensatzes herangezogen. Eine aus der Häufigkeitsverteilung abgeleitete empirische Filterfunktion („Clash“-Filterfunktion) wurde anschließend der Bewertung von Docking-Lösungen des Cheng-Datensatzes mittels der Scoringfunktionen SFCscore und DSX vorgeschaltet, um unerwünschte Ligandbindeposen auszuschließen. Die Häufigkeitsuntersuchung zeigt, dass vorwiegend schwache repulsive Kontakte in Protein-Ligand-Komplexen auftreten. So werden in 75 % der Komplexe des Hartshorn-Datensatzes abstoßende Potentiale unter 0.462 kcal/mol beobachtet. Zwar betragen die ungünstigen Beiträge pro Komplex für 50 % aller Strukturen ca. 0.8 kcal/mol bis 2.5 kcal/mol, jedoch können diese auf Ungenauigkeiten der Kristallstrukturen zurückzuführen sein bzw. durch günstige Protein-Ligand-Wechselwirkungen kompensiert werden. Die Anwendung der „Clash“-Filterfunktion zeigt signifikante Verbesserungen der Docking Power für SFCscore. Für die beste SFCscore-Funktion (SFCscore::frag) werden Steigerungen der Erfolgsraten für das Auffinden einer kristallnahen Pose unter den drei am besten bewerteten Docking-Lösungen von 61.4 % auf 86.9 % erzielt, was an die Docking Power der bis dato besten Scoringfunktionen aus der Literatur (z. B. DSX, GlideScore::SP) heranreicht (Docking Power (DSX): 92.6 %; Docking Power (GlideScore::SP): 86.9 %). Die „Clash“-Filterfunktion allein ist auch der Kombination der „Clash“- und der „vnaHB“-Filterfunktion überlegen. Ein weiterer Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit wurde auf die Einbeziehung von Decoy-Daten (Struktur- und Affinitätsdaten schwach affiner und inaktiver Liganden) im Zuge der Entwicklung computergestützter Methoden zur Bewertung von Docking-Lösungen gelegt. Dadurch soll eine adäquate Berücksichtigung ungünstiger Beiträge zur Bindungsaffinität ermöglicht werden, die für die Richtigkeit und Zuverlässigkeit ermittelter Vorhersagen essentiell ist. In der vorliegenden Arbeit wurden binäre Klassifizierungsmodelle zur Bewertung von Docking-Lösungen entwickelt, die die Einbeziehung von Decoy-Daten ohne die Verfügbarkeit von Affinitätsdaten erlauben. Der Random-Forest-Algorithmus (RF), SFCscore-Deskriptoren, der neu entwickelte „Clash“-Deskriptor, und die Decoy-Datensätze von Cheng und Huang (Trainingsdaten) bilden die Grundlage des leistungsfähigsten Klassifizierungsmodells. Der praktische Nutzen des „besten“ RF-Modells wurde nach Kombination mit der Scoringfunktion DSX anhand der Docking Power für das Auffinden einer kristallnahen Pose auf Rang 1 am unabhängigen Cheng-/Huang- (Komplexe, die nicht in den Trainingsdaten enthalten sind) und CSAR-2012-Testdatensatz untersucht. Gegenüber einer alleinigen Anwendung von DSX werden an beiden Testdatensätzen weitere Verbesserungen der Docking Power erzielt (Cheng-/Huang-Testdatensatz: DSX 84.24 %, RF 87.27 %; CSAR-2012-Testdatensatz: DSX 87.93 %, RF 91.38 %). Das „beste“ Modell zeichnet sich durch die zuverlässige Vorhersage richtig-positiver Docking-Lösungen für einige wenige Komplexe aus, für die DSX keine kristallnahe Ligandkonformation identifizieren kann. Ein visueller Vergleich der jeweils am besten bewerteten RF- und DSX-Pose für diese Komplexe zeigt Vorteile des RF-Modells hinsichtlich der Erkennung für die Protein-Ligand-Bindung essentieller Wechselwirkungen. Die Untersuchung der Bedeutung einzelner SFCscore-Deskriptoren für die Klassifizierung von Docking-Lösungen sowie die Analyse der Misserfolge nach Anwendung des Modells geben wertvolle Hinweise zur weiteren Optimierung der bestehenden Methode. Hinsichtlich der zu bewertenden Eigenschaften ausgeglichenere Trainingsdaten, Weiterentwicklungen bestehender SFCscore-Deskriptoren sowie die Implementierung neuer Deskriptoren zur Beschreibung bis dato nicht-berücksichtigter Beiträge zur Bindungsaffinität stellen Ansatzpunkte zur Verbesserung dar. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit umfasst die Anwendung dockingbasierter Methoden im Rahmen der Entwicklung neuer Inhibitoren des „Macrophage Infectivity Potentiator“-(MIP)-Proteins von Legionella pneumophila und Burkholderia pseudomallei. Das MIP-Protein von Legionella pneumophila stellt einen wichtigen Virulenzfaktor und daher ein attraktives Zielprotein für die Therapie der Legionellose dar. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit erfolgten systematische Optimierungen des Pipecolinsäure-Sulfonamides 1, des bis dato besten niedermolekularen MIP-Inhibitors (IC50 (1): 9 ± 0.7 µM). Nach Hot-Spot-Analysen der Bindetasche wurden Docking-Studien zur Auswahl aussichtsreicher Kandidaten für die Synthese und Testung auf MIP-Inhibition durchgeführt. Die Ergebnisse der Hot-Spot-Analysen zeigen günstige Wechselwirkungsbereiche für Donorgruppen und hydrophobe Substituenten in meta-Position sowie Akzeptorgruppen in para-Position des Benzylringes von 1 auf. Die Einführung einer Nitrofunktion in para-Position des Benzylringes von 1 (2h) resultiert in einer erhöhten MIP-Inhibition (IC50 (2h): 5 ± 1.5 µM), was wahrscheinlich auf die Ausbildung einer zusätzlichen Wasserstoffbrücke zu Gly116 zurückzuführen ist. Selektivitätsverbesserungen gegenüber dem strukturverwandten humanen FKBP12-Protein werden insbesondere für das para-Aminoderivat von 1 (2n) erzielt (Selektivitätsindex (1): 45, Selektivitätsindex (2n): 4.2; mit Selektivitätsindex = IC50 (MIP)/IC50 (FKBP12)). Der Ersatz des hydrophoben Trimethoxyphenylrestes von 1 durch einen Pyridinring (2s) führt zu einer verbesserten Löslichkeit bei vergleichbarer MIP-Inhibition. Das MIP-Protein von Burkholderia pseudomallei spielt eine wichtige Rolle in der Pathogenese der Melioidose und stellt daher ein attraktives Zielprotein für die Entwicklung neuer Arzneistoffe dar. In der vorliegenden Arbeit erfolgten Optimierungen des bis dato besten niedermolekularen MIP-Inhibitors 1. Ausgehend von einem Strukturvergleich von Burkholderia pseudomallei MIP mit Legionella pneumophila MIP und einer Hot-Spot-Analyse der Burkholderia pseudomallei MIP-Bindetasche wurden Docking-Studien zur Auswahl aussichtsreicher Kandidaten für die Synthese und Testung auf MIP-Inhibition durchgeführt. Der Strukturvergleich zeigt eine hohe Homologie beider Bindetaschen. Größere konformelle Änderungen werden lediglich für den von Ala94, Gly95, Val97 und Ile98 geformten Bindetaschenbereich beobachtet, was unterschiedliche Optimierungsstrategien für 1 erforderlich macht. Günstige Wechselwirkungsbereiche der Burkholderia pseudomallei MIP-Bindetasche finden sich einerseits für Donorgruppen oder hydrophobe Substituenten in para-Position des Benzylringes (Region A) von 1, andererseits für Akzeptor- bzw. Donorgruppen in para- bzw. meta-/para-Position des Trimethoxyphenylringes (Region B). Anhand von Docking-Studien konnten sowohl für Variationen in Region A als auch in Region B aussichtsreiche Kandidaten identifiziert werden. Initiale MIP-Inhibitionsmessungen der bis dato synthetisierten Derivate deuten auf erhöhte Hemmungen im Vergleich zu 1 hin. Der Ersatz des hydrophoben Trimethoxyphenylrestes von 1 durch einen Pyridinring führt auch hier zu vergleichbarer MIP-Inhibition bei verbesserter Löslichkeit. Derzeit sind weitere Synthesen und Testungen aussichtsreicher Liganden durch die Kooperationspartner geplant. Die Ergebnisse der Inhibitionsmessungen sollen deren Nutzen als MIP-Inhibitoren aufzeigen und wertvolle Informationen für weitere Zyklen des strukturbasierten Wirkstoffdesigns liefern. N2 - Docking-based approaches belong to important virtual screening components and aim at predicting both the ligand position and conformation within the protein binding site as well as the binding affinity. To date scoring functions are still not fully reliable in correctly identifying near-native ligand conformations generated by docking. Thus, the first part of the current work is dedicated to the development of computer-aided methods for the evaluation of docking poses. A first project focused on considering the saturation of hydrogen bond acceptors (HBA) and donors (HBD) for the evaluation of docking poses. Since structural and affinity data are missing, current scoring functions neglect unpaired buried HBA and HBD, which strongly disfavour high-affinity binding. Based on a detailed frequency analysis of unpaired buried HBA and HBD within high-quality protein-ligand complexes of the Hartshorn dataset, an empirical filter function (“vnaHB” filter function) was developed to remove unfavourable ligand binding poses prior to the ranking with scoring functions. The practical benefit of the filter function was investigated for the scoring functions SFCscore and DSX using pre-generated docking poses of the Cheng dataset. As shown in the frequency analysis, the saturation of buried polar groups is of utmost importance for high-affinity binding, as unpaired buried HBA and HBD are extremely rare. A complete saturation by proper protein counterparts is observed for about 48 % of all complexes under study, whereas approximately 92 % have less than three, mostly weak unpaired buried HBA or HBD (e.g. ether functions). Including also the saturation by water molecules reveals that actually for about 61 % of all complexes every hydrogen bonding group is saturated. Unlike DSX, the application of the filter function with SFCscore results in higher success rates for identifying a near-native 2.0 Å pose under the top scored poses, a criterion termed “Docking Power”. For the best SFCscore function (SFCscore::229m) the Docking Power with respect to the top three poses increases from 63.1 % to 64.2 %. A further project focused on considering repulsive intermolecular contacts due to sterical overlap of the protein-ligand binding partners for the evaluation of docking poses. Although an inclusion of such repulsive contacts in scoring is of utmost importance for the identification of protein-bound ligand conformations, it remains challenging because of missing structural and affinity data. Based on the Lennard-Jones potential of the AMBER force field a new descriptor accounting for repulsive protein-ligand contacts (“clash” descriptor) was developed and used for analysing the frequency of unfavourable protein-ligand contacts among high-quality structures of the Hartshorn dataset. An empirical filter function (“clash” filter function) derived from the frequency distribution was applied to pre-generated docking poses of the Cheng dataset to remove unfavourable ligand binding poses prior to the ranking with SFCscore and DSX. As shown in the frequency analysis, mostly weakly repulsive contacts occur within protein-ligand complexes. For 75 % of the complexes of the Hartshorn dataset repulsive potentials of less than 0.462 kcal/mol are observed. Indeed, unfavourable contributions add up to not more than 0.8 kcal/mol to 2.5 kcal/mol per complex for 50 % of all structures; values in this range may be attributed to inaccuracies of crystal structures or could be counterbalanced by favourable protein-ligand interactions. The application of the “clash” filter function shows significant improvements of the Docking Power of SFCscore. For the best SFCscore function (SFCscore::frag) the success rates for identifying a near-native 2.0 Å pose under the three top scored poses increases from 61.4 % to 86.9 %, which is comparable to the Docking Power of the best scoring functions (e.g. DSX, GlideScore::SP) currently available in literature (Docking Power (DSX): 92.6 %; Docking Power (GlideScore::SP): 86.9 %). The “clash” filter function alone is also superior to the combination of the “clash” and the “vnaHB” filter function. Another focus of the work was the inclusion of decoy data (structure and affinity data of weakly active and inactive ligands) in scoring function development. Thus, unfavourable contributions to the binding affinity should be adequately considered, which appears essential for improving accuracy and reliability of the predictions. Within the scope of this work a binary classification model was developed for the evaluation of docking poses, allowing the inclusion of decoy poses without affinity data. The random forest algorithm (RF), SFCscore descriptors, the new “clash” descriptor, and the decoy datasets of Cheng and Huang (training data) provide the basis of the best-performing model. The practical benefit of the “best” RF model was investigated after combination with the scoring function DSX based on the Docking Power for identifying a near-native pose on rank 1 using the independent Cheng/Huang (only complexes not used for training) and the CSAR-2012 dataset. With respect to the standalone application of DSX, improvements of the Docking Power regarding both test sets are achieved (Cheng/Huang test set: DSX 84.24 %, RF 87.27 %; CSAR-2012 test set: DSX 87.93 %, RF 91.38 %). A key feature of the “best” model are reliable predictions of true positive docking poses for those complexes for which DSX fails to identify a near-native ligand conformation. A visual comparison of the best RF and DSX pose highlights advantages of the RF model regarding the recognition of interactions crucial for protein-ligand binding. The importance analysis of SFCscore descriptors for the classification of docking poses as well as the investigation of failures after model application provide useful hints for further improvements. Thus, more property-balanced training data, the further development of established SFCscore descriptors, and the implementation of new descriptors accounting for neglected contributions to the binding affinity constitute possible starting points for future improvements. The second part of this work is dedicated to the application of docking-based methods for the development of new inhibitors of the "`Macrophage Infectivity Potentiator"'-(MIP) proteins of Legionella pneumophila and Burkholderia pseudomallei. The MIP protein of Legionella pneumophila constitutes an important virulence factor and thus an attractive target for the treatment of legionellosis. Within the scope of this work the pipecolic acid sulfonamide 1, one of the best small-molecule MIP inhibitors to date (IC50 (1): 9 ± 0.7 µM), was systematically optimised. After hot spot analysis of the binding pocket, docking studies were conducted to select promising candidates for synthesis and testing MIP inhibition. The results of the hot spot analysis show favourable interaction fields for donor groups and hydrophobic substituents in meta position as well as acceptor groups in para position of the benzyl ring of 1. Introducing a nitro function in para position of the benzyl ring of 1 (2h) results in an increased MIP inhibition (IC50 (2h): 5 ± 1.5 µM), which is likely due to the formation of an additional hydrogen bond to Gly116. An improvement in the selectivity compared to the structurally related human FKBP12 protein is achieved particularly with the para amino derivative of 1 (2n) (selectivity index (1): 45, selectivity index (2n): 4.2, where the selectivity index = IC50 (MIP)/IC50 (FKBP12)). Replacing the hydrophobic trimethoxyphenyl residue of 1 with a pyridine ring (2s) leads to improved solubility and comparable MIP inhibition. The MIP protein of Burkholderia pseudomallei plays an important role in the pathogenesis of melioidosis and thus constitutes an attractive target for the development of new drugs against this disease. Within the scope of this work the currently best small-molecule MIP inhibitor 1 was optimised. Starting with a structural comparison of Burkholderia pseudomallei MIP and Legionella pneumophila MIP, as well as a hot spot analysis of the Burkholderia pseudomallei MIP binding pocket, docking studies were conducted to select promising candidates for synthesis and testing for MIP inhibition. The structural comparison reveals a high homology of the two binding pockets. Major conformational changes are observed for the binding pocket region formed by Ala94, Gly95, Val97 and Ile98, which necessitates different optimisation strategies for 1. Favourable interaction fields for the Burkholderia pseudomallei MIP binding pocket are found for donor groups or hydrophobic substituents in para position of the benzyl ring (region A) of 1 as well as for acceptor or donor groups in para or meta/para position of the trimethoxyphenyl ring (region B). On the basis of the docking studies promising candidates could be identified for variations in both regions. Initial MIP inhibition measurements of synthesised derivatives indicate increased inhibition compared to 1. Replacing the hydrophobic trimethoxyphenyl residue of 1 with a pyridine ring (yielding a more soluble derivative) leads again to comparable MIP inhibition. Further syntheses and tests of promising ligands are currently being planned by the collaboration partners. The results of the inhibition measurements should demonstrate their suitability as MIP inhibitors and provide useful information for future structure-based drug design cycles. KW - Arzneimitteldesign KW - Computational chemistry KW - Legionella pneumophila KW - Burkholderia KW - Strukturbasiertes Wirkstoffdesign KW - Docking KW - Scoringfunktionen KW - Legionella pneumophila KW - Burkholderia pseudomallei KW - Structure-based drug design KW - Docking KW - Scoring functions KW - Legionella pneumophila KW - Burkholderia pseudomallei KW - Maschinelles Lernen Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-101585 ER - TY - THES A1 - Hirschbeck, Maria Wenefriede T1 - Structure-based drug design on the enoyl-ACP reductases of Yersinia pestis and Burkholderia pseudomallei T1 - Struktur-basiertes Wirkstoffdesign an Enoyl-ACP Reductase von Yersinia pestis und Burkholderia pseudomallei N2 - Spreading drug resistances among Gram-negative pathogens and the paucity of new agents on the antibacterial drug market against these tenacious bacteria create a pressing need for the development of new antibiotics. The bacterial fatty acid biosynthesis pathway FAS-II, especially the enoyl-ACP reductase catalyzing the last step of the elongation cycle, is an established drug target against tuberculosis but has not been extensively exploited for drug design against other bacterial pathogens. In this thesis the enoyl-ACP reductases of the Gram-negative biothreat organisms Burkholderia pseudomallei and Yersinia pestis were targeted in a structure-based drug design approach. The structure of the most recently identified enoyl-ACP isoenzyme FabV was characterized by X-ray crystallography and could be determined in three different states. FabV from B. pseudomallei was obtained in the apo-form of the enzyme, whereas FabV from Y. pestis was characterized in a binary complex with the cofactor NADH as well as in a ternary complex with NADH and the triclosan-based 2-pyridone inhibitors PT172 and PT173. Analysis of the FabV structure revealed the typical fold of the short chain dehydrogenase/reductase superfamily with the NADH-binding Rossmann fold and a substrate-binding pocket with a conserved active site geometry compared to the related isoenzyme FabI. Additional structural elements of FabV are located around the active site. The monomeric form of the enzyme is thereby stabilized and the substrate-binding loop is kept in a closed, helical conformation. The ternary complexes of FabV exhibited a similar inhibitor-binding mode as observed for triclosan inhibition in FabI and point to a potential substrate-binding mechanism. B. pseudomallei possesses FabI as an additional enoyl-ACP reductase isoenzyme, which was structurally characterized in the apo form and in ternary complexes with NAD+ and the diphenyl ether inhibitors triclosan, PT02, PT12 or PT404 as well as the 4-pyridone inhibitor PT155. The structural data of the ternary enoyl-ACP reductases complexes of B. pseudomallei and Y. pestis hold the promise for the possibility to develop antibacterials targeting FabV or even both isoenzymes, FabI and FabV, based on the triclosan scaffold. N2 - Die Ausbreitung von Antibiotikaresistenzen in Gram-negativen Pathogenen sowie der Mangel neuer Medikamente auf dem Arzneimittelmarkt gegen diese hartnäckigen Bakterien weist einen dringenden Bedarf an neuen Antibiotika auf. Die bakterielle Fettsäurebiosynthese (FAS-II), speziell die Enoyl-ACP-Reduktase, welche den finalen Schritt des Elongationszyklus katalysiert, ist ein etablierter Angriffspunkt in der Tuberkulosetherapie. Sie wurde jedoch bisher noch nicht für die gezielte Wirkstoffentwicklung gegen andere bakterielle Krankheitserreger genutzt. In dieser Dissertation waren die Enoyl-ACP Reduktasen aus Burkholderia pseudomallei und Yersinia pestis Gegenstand des strukturbasierten Wirkstoffdesigns. Die Struktur des zuletzt gefundenen Isoenzyms der Enoyl-ACP-Reduktase, FabV, wurde röntgenstrukturanalytisch charakterisiert und konnte in drei verschiedenen Zuständen bestimmt werden. Die Struktur des FabV Proteins aus B. pseudomallei wurde in der Apo-Form gelöst, während FabV aus Y. pestis in binären und ternären Komplexen mit NADH bzw. NADH und einem Triclosan-basierten 2-Pyridon-Inhibitor, PT172 bzw. PT173 charakterisiert wurde. FabV weist die typische Struktur eines Mitglieds der Short-Chain-Dehydrogenase/Reduktase Superfamilie mit einer NADH-bindenden Rossmann-Faltung und einer Substratbindetasche auf mit einer, im Vergleich zu dem verwandten Isoenzym FabI, konservierte Geometrie des aktiven Zentrums. Zusätzliche strukturelle Elemente sind um das aktive Zentrum gefaltet und stabilisieren damit das Enzym in seiner monomeren Form. Darüber hinaus halten sie den Substratbindeloop in einer geschlossenen helikalen Gestalt. Die ternären FabV Komplexe zeigen Übereinstimmungen mit dem bekannten Bindungsmechanismus des Inhibitors Triclosan in FabI und deuten auf einen möglichen Substratbindungsmechanismus hin. B. pseudomallei besitzt FabI als zusätzliches Isoenzym der Enoyl-ACP-Reduktasen. Dieses Isoenzym wurde in der Apo-Form und in ternären Komplexen mit NAD+ und den Diphenylether-Inhibitoren Triclosan, PT02, PT12 und PT404 sowie dem 4-Pyridon-Inhibitor PT155 strukturell charakterisiert. Die strukturellen Daten der ternären Enoyl-ACP-Reduktase Komplexe von B. pseudomallei und Y. pestis stellen die Möglichkeit in Aussicht Antibiotika zu entwickeln, welche FabV oder auch beide Isoenzyme, FabI und FabV, inhibieren. KW - Yersinia KW - Burkholderia KW - Arzneimitteldesign KW - Fettsäurestoffwechsel KW - Struktur-basiertes Wirkstoff Design KW - Fettsäurebiosynthese KW - Triclosan KW - FabI KW - FabV KW - Yersinia pestis KW - Burkholderia pseudomallei KW - FAS-II Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70869 ER - TY - THES A1 - Kesetovic, Diana T1 - Synthesis and biological testing of potential anti-tuberculosis drugs targeting the β-ketoacyl ACP synthase T1 - Synthese und biologische Untersuchung von β-ketoacyl-ACP-Synthase-Inhibitoren als potentielle Antituberkulotika N2 - With 9.6 million new cases and 1.5 million deaths in 2014, tuberculosis (TB) is alongside with AIDS the most deadly infection.‎ Foremost, the increased prevalence of resistant strains of M. tuberculosis among the TB-infected population represents a serious thread. Hence, in the last decades, novel drug targets have been investigated worldwide. So far a relatively unexplored target is the cell wall enzyme β-ketoacyl-ACP-synthase “KasA”, which plays a crucial role in maintaining the membrane impermeability and hence the cell ability to resist to the immune response and drug therapy. KasA is a key enzyme in the fatty acid synthase “FAS-II” elongation cycle, responsible for the extension of the growing acyl chain within the biosynthesis of precursors for the most hydrophobic constituents of the cell wall – mycolic acids. Design of the novel KasA inhibitors, performed in the research group of Prof. Sotriffer by C. Topf and B. Schaefer, was based on the recently published crystal structure of KasA‎ in complex with its known inhibitor thiolactomycin (TLM). Considering the essential ligand-enzyme interactions, a pharmacophore model was built and applied in the virtual screening of a modified ZINC database. Selected hits with the best in silico affinity data have been reported by Topf‎ and Schaefer‎. In this work, two of the obtained hits were synthesized and their structure was systematically varied. First, a virtual screening hit, chromone-2-carboxamide derivative GS-71, was modified in the amide part. Since the most of the products possessed a very low solubility in the aqueous buffer medium used in biological assays, polar groups (nitro, succinamidyl and trimethyl-amino substituent in position 6 of the chromone ring or hydroxyl group on the benzene ring in the amide part have been inserted to the molecule. Further variations yielded diaryl ketones, diaryl ketone bearing a succinamidyl substituent, carboxamide bearing a methylpiperazinyl-4-oxobutanamido group and methyl-malonyl ester amides. Basically, the essential structural features necessary for the ligand-enzyme interactions have been maintained. The latter virtual screening hit, a pyrimidinone derivative VS-8‎ was synthesized and the structure was modified by substitution in positions 2, 4, 5 and 6 of the pyrimidine ring. Due to autofluorescence, detected in most of the products, this model structure was not further varied. Simultaneously, experiments on solubilization of the first chromone-2-carboxamides with cyclodextrins, cyclic oligosacharides known to form water-soluble inclusion complexes, were performed. Although the assessed solubility of the chromone 3b/DIMEB (1:3) mixture exceeded 14-fold the intrinsic one, the achieved 100 µM solubility was still not sufficient to be used as a stock solution in the binding assay. The experiments with cyclodextrin in combination with DMSO were ineffective. Owing to high material costs necessary for the appropriate cyclodextrin amounts, the aim focused on structural modification of the hydrophobic products. Precise structural data have been obtained from the solved crystal structures of three chromone derivatives: the screening hit GS-71 (3b), its trimethylammonium salt (18) and 6-nitro-substituted N-benzyl-N-methyl-chromone-2-carboxamide (9i). The first two compounds are nearly planar with an anti-/trans-rotamer configuration. In the latter structure, the carboxamide bridge is bent out of the chromone plane, showing an anti-rotamer, too. Considering the relatively low partition coefficient of compound 3b (cLogP = 2.32), the compound planarity and correlating tight molecular packing might be the factors significantly affecting its poor solubility. Regarding the biological results of the chromone-based compounds, similar structure-activity correlations could be drawn from the binding assay and the whole cell activity testing on M. tuberculosis. In both cases, the introduction of a nitro group to position 6 of the chromone ring and the presence of a flexible substituent in the amide part showed a positive effect. In the binding study, the nitro group at position 4 on the N-benzyl residue was of advantage, too. The highest enzyme affinity was observed for N-(4-nitrobenzyl)-chromone-2-carboxamide 4c (KD = 34 µM), 6-nitro substituted N-benzyl-chromone-2-carboxamide 9g (KD = 40 µM) and 6‑nitro-substituted N-(4-nitrobenzyl)-chromone-2-carboxamide 9j (KD = 31 µM), which could not be attributed to the fluorescence quenching potential of the nitro group. The assay interference potential of chromones, due to a covalent binding on the enzyme sulfhydryl groups, was found to be negligible at the assay conditions. Moderate in vivo activity was detected for 6‑nitro-substituted N-benzyl-chromone-2-carboxamide 9g and its N-benzyl-N-methyl-, N‑furylmethyl-, N-cyclohexyl- and N-cyclohexylmethyl derivatives 9i, 9d, 9e, 9f, for which MIC values 20 – 40 µM were assessed. Cytotoxicity was increased in the N‑cyclohexylmethyl derivative only. None of the pyrimidine-based compounds showed activity in vivo. The affinity of the model structure, VS-8, surpassed with KD = 97 µM the assessed affinity of TLM (KD = 142 µM). Since for the model chromone compound GS-71 no reliable KasA binding data could be obtained, a newly synthesized chromone derivative 9i was docked into the KasA binding site, in order to derive correlation between the in silico and in vitro assessed affinity. For the 6‑nitro-derivative 9i a moderate in vivo activity on M. tuberculosis was obtained. The in silico predicted pKi values for TLM and 9i were higher than the corresponding in vitro results, maintaining though a similar tendency, i.e., the both affinity values for compound 9i (pKi predicted = 6.64, pKD experimental = 4.02) surpassed those obtained for TLM (pKi predicted = 5.27, pKD experimental = 3.84). Nevertheless, the experimental pKD values are considered preliminary results. The binding assay method has been improved in order to acquire more accurate data. Owing to the method development, limited enzyme batches and solubility issues, only selected compounds could be evaluated. The best hits, together with the compounds active on the whole cells of M. tuberculosis, will be submitted to the kinetic enzyme assay, in order to confirm the TLM-like binding mechanism. Regarding the in vivo testing results, no correlations could be drawn between the predicted membrane permeability values and the experimental data, as for the most active compounds 9e and 9f, a very low permeability was anticipated (0.4 and 0.7 %, respectively). Further biological tests would be required to investigate the action- or transport mode. N2 - Mit 9.6 Millionen Neuerkrankungen und 1.5 Millionen Todesfällen im Jahr 2014 ist Tuberkulose (TB) neben AIDS die häufigste Todesursache unter Infektionskrankheiten.‎ Insbesondere die zunehmende Verbreitung resistenter Stämme von M. tuberculosis stellt eine ernste Gefahr dar. In den letzten Jahrzehnten wurde daher weltweit nach neuen möglichen Wirkstoff-Zielen gesucht. Bisher noch relativ unerforschtes Ziel ist das Zellwand-Enzym β Ketoacyl-ACP-Synthase "KasA", das eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Membran-Dichtigkeit spielt, und somit den Zellen ermöglicht, gegen den Immunabwehr und Arzneimitteltherapie Resistenz zu zeigen. KasA ist ein Schlüsselenzym in der Fettsäure-Synthase-(FAS-II)-Elongationsrunde, die für die Erweiterung der wachsenden Acylkette während der Biosynthese der Vorstufen der hydrophobesten Zellwand-Bestandteilen – der Mykolsäuren, verantwortlich ist. Das Design der neuen KasA-Hemmer, das im Arbeitskreis von Prof. Sotriffer von C. Topf und B. Schäfer durchgeführt wurde, basiert auf der kürzlich veröffentlichten Kristallstruktur von KasA im Komplex mit seinem bekannten Inhibitor Thiolactomycin (TLM)‎. In Anbetracht der essentiellen Ligand-Enzym-Wechselwirkungen wurde ein Pharmakophor-Modell erstellt und im virtuellen Screening einer modifizierten ZINC-Datenbank angewendet. Die ausgewählten “Hits“ mit den besten In-silico-Affinitätsdaten wurden in den Doktorarbeiten von Topf‎ und Schaefer‎ veröffentlicht. In Rahmen dieser Arbeit wurden zwei der erhaltenen “Hits“ synthetisiert und ihre Struktur systematisch variiert. Erste Modellstruktur, das Chromon-2-Carboxamid-Derivat GS-71‎. wurde zunächst in dem Amid-Rest modifiziert. Da die meisten Produkte (3a-p, 4a-k) eine sehr geringe Löslichkeit im wässrigen Puffermedium aufwiesen, wurden polare Gruppen in das Molekül eingefügt (Nitro, Succinamidyl- und Trimethyl-Amino-Substituenten in der 6 Stellung des Chromon-Rings, oder eine Hydroxyl-Gruppe am Benzolring im Amid-Teil. Weitere Variationen ergaben Diarylketone, ein Diarylketon mit der Succinamidyl Kette, ein Carboxamid mit dem Methylpiperazinyl-4-oxobutanamido-Substituenten und Methyl-Malonyl-Ester-Amide. Grundsätzlich wurden alle Strukturmerkmale notwendig für die Ligand-Enzym-Wechselwirkungen beibehalten. Die letztere Modellstruktur aus dem virtuellen Screening, das Pyrimidinon Derivat VS-8‎ wurde synthetisiert, und die Struktur wurde durch Substitution in den Positionen 2, 4, 5 und 6 des Pyrimidin-Rings modifiziert. Wegen Eigenfluoreszenz, detektiert in den meisten Produkten, wurde diese Modellstruktur nicht weiter variiert. Gleichzeitig wurden Experimente zur Solubilisierung der ersten Chromon-2-Carbonsäureamide mit Cyclodextrinen, cyclischen Oligosacchariden, die bekanntlich wasserlösliche Einschlusskomplexe bilden, durchgeführt. Obwohl die gemessene Löslichkeit des 3b/DIMEB (1:3)-Gemisches die intrinsische Löslichkeit um das 14-fache überschritt, war die erzielte Löslichkeit von 100 µM noch nicht ausreichend, um diese Lösung als Stammlösung im Assay zu verwenden. Die Experimente mit Cyclodextrin in Kombination mit DMSO waren unproduktiv. Aufgrund der hohen Materialkosten für die benötigten Cyclodextrinmengen wurden die Löslichkeit-Tests an dieser Stelle abgebrochen und eine strukturelle Modifizierung der hydrophoben Produkte stand in Vordergrund des Interesses. Genaue Strukturdaten wurden aus den aufgeklärten Kristallstrukturen von drei Chromon-Derivaten, der Modellstruktur GS-71 (3b), seiner Trimethylammoniumsalz (18) und dem 6‑Nitro-substituierten N-Benzyl-N-methyl-Chromon-2-Carboxamid (9i), erhalten. Die ersten beiden Verbindungen sind mit einer anti-/trans-Rotamer Konfiguration fast planar. Die Carbonsäureamid-Brücke der letzteren Struktur, die ebenso ein anti-Rotamer darstellt, wird aus der Chromon Ebene gebogen. Angesichts des relativ geringen Verteilungskoeffizientes der Verbindung 3b (clogP = 2.32), die Ebenheit des Moleküls und das damit verbundene enge Molekülpackung könnten die wesentlich schlechtere Löslichkeit begründen. In Bezug auf die biologischen Ergebnisse der Chromon-basierten Verbindungen, ähnliche Struktur-Aktivitäts-Beziehungen können aus dem Bindungs-Assay, sowie aus dem Ganzzellaktivitätstests auf M. tuberculosis gezogen werden. In beiden Fällen zeigte die Einführung einer Nitrogruppe in die Position 6 des Chromon-Rings und das Vorhandensein eines flexiblen Substituents im Amidrest einen positiven Effekt. In dem Bindungs-Assay war die Nitrogruppe in Position 4 des N-Benzyl-Rests ebenso vorteilhaft. Die höchste Enzymaffinität wurde im Falle des N-(4-Nitrobenzyl)-Chromon-2-Carboxamid 4c (KD = 34 µM), des substituierten 6-nitro-N-Benzyl-Chromon-2-Carboxamid 9g (KD = 40 µM) und des 6-Nitro-substituierten N-(4-Nitrobenzyl)-Chromon-2-Carboxamid 9j (KD = 31 µM), beobachtet, allerdings konnte sie nicht dem Fluoreszenzlöschungspotenzial der Nitrogruppe zugeschrieben werden. Das Assay-Störpotential der Chromonverbindungen aufgrund einer kovalenten Bindung an die Sulfhydryl-Gruppen des Enzyms zeigte sich in den Assay-Bedingungen als vernachlässigbar. Moderate in vivo-Aktivitäten wurden für den 6-nitro substituierten N‑Benzyl-Chromon-2-Carboxamid 9g und dessen N-Benzyl-N-Methyl- (9i), N‑Furfurylmethyl-(9d), N-Cyclohexyl- (9e) und N-Cyclohexylmethyl- (9f) Derivate, für denen die MIC-Werte zwischen 20 und 40 µM erhalten wurden (siehe Tab. 17). Die Zytotoxizität wurde erhöht nur im Falle des N-Cyclohexylmethyl Derivates. Keine der Pyrimidin-basierten Verbindungen wies eine Aktivität in vivo auf. Die KasA-Affinität der Modellstruktur VS-8 übertraf mit KD = 97 µM die gemessene Affinität von TLM (KD = 142 µM). Da für die Modell Chromon-Verbindung GS-71 keine zuverlässigen KasA Bindungsdaten erhalten werden konnten, ein neu-synthetisierte Chromon-Derivat 9i wurde in die KasA Bindungsstelle gedockt, um die Korrelation zwischen den In-silico- und In-vitro-Affinitätswerten abzuleiten. Für den 6-Nitroderivat 9i wurde eine mäßige Aktivität in vivo auf M. tuberculosis bestimmt. Die in silico-vorhergesagten pKi-Werte für TLM und 9i waren allgemein höher als die entsprechenden experimentellen Ergebnisse. Sie bewiesen allerdings eine ähnliche Tendenz, d.h. die beiden Affinitätswerte für die Verbindung 9i (pKi vorhergesagt = 6.64, pKD experimentell = 4.02) übertrafen die Werte von TLM (pKi vorhergesagt = 5.27, pKD experimentell = 3.84). Dennoch sind die experimentellen Affinitätsdaten nur als vorläufige Resultate zu betrachten, solange die Bindungsweise mittels des kinetischen Enzymassays verifiziert wird. Die Assay-Methode wurde verbessert, um zuverlässigere Daten zu erhalten. Aufgrund der Verfahrensentwicklung, den limitierten Enzymchargen und Löslichkeitsprobleme konnten nur ausgewählte Verbindungen bewertet werden. Die besten “Hits“, zusammen mit den Verbindungen, die auf den ganzen Zellen von M. tuberculosis aktiv waren, werden dem kinetischen Enzymtest vorgelegt. In Bezug auf die In-vivo-Testergebnisse, es konnten keine Korrelationen zwischen den vorhergesagten Membranpermeabilität-Werten und den experimentellen Daten gezogen werden, da bei den wirksamsten Verbindungen 9e und 9f nur eine sehr geringe Permeabilität erwartet wurde (zu 0.4 und 0.7 %). Weitere biologische Tests wären erforderlich, um das Wirkungsmechanismus oder die Transportweise zu untersuchen. KW - Tuberkelbakterium KW - Inhibitor KW - Ketoacyl-ACP-Synthase KW - Arzneimitteldesign KW - Tuberculosis KW - Enzyme inhibitor KW - Synthesis KW - Ketoacyl-ACP-synthase KW - Chromone KW - Pyrimidinone KW - Tuberkulose KW - Synthese KW - Zellwand KW - Enzym Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-131301 ER - TY - THES A1 - Kuhn, Maximilian T1 - Strukturbasiertes Design von MIP-Inhibitoren und computergestützte Selektivitätsuntersuchung gegenüber MIP- und humanen FKB-Proteinen T1 - Structure-based design of MIP-Inhibitors and computer-aided selectivity studies towards MIP and human FKB proteins N2 - Bakterielle und parasitäre MIP-Proteine stellen wichtige Virulenzfaktoren dar, deren Inhibition das Überleben der Erreger sowie deren Penetration in menschliche Zellen stark einschränken kann. In dieser Arbeit standen die MIP-Proteine von Burkholderia pseudomallei (Auslöser der Melioidose) und Legionella pneumophila (Legionärskrankheit) im Fokus. Außerdem wurde das MIP-Protein von Trypanosoma cruzi (Chagas-Krankheit) untersucht. Die strukturverwandten humanen FKB-Proteine FKBP12 und FKBP52 sind relevante „off-targets“, wie Experimente mit Knockout-Mäusen gezeigt haben. Ziel dieser Arbeit war die Verbesserung von bekannten MIP-Inhibitoren im Hinblick auf ihre Affinität und Selektivität für MIP-Proteine gegenüber den beiden genannten FKB-Proteinen bei gleichzeitig verbesserter Löslichkeit, mit Hilfe von in silico Methoden. Ausgangspunkt waren hierbei zwei von Dr. Christina Juli und Dr. Florian Seufert entwickelte Leitstrukturen, welche ein Pipecolinsäuregrundgerüst aufweisen. Diese Referenzliganden beinhalten einen 3,4,5-Trimethoxyphenylring (TMPR, vgl. Ref_t) bzw. einen Pyridinylring (Ref_p). Beim Vergleich von insgesamt 32 MIP- und FKB-Proteinen konnten in zwei Loop-Bereichen, welche 50er bzw. 80er Loop genannt werden, relevante Unterschiede in der Aminosäuresequenz identifiziert werden. Die Nummerierung bezieht sich stets auf FKBP12. Diese Unterschiede ließen sich zum Design von vergleichsweise selektiv an MIP-Proteine bindenden Molekülen nutzen. Der 50er Loop ist in nahezu allen MIP-Proteinen (jedoch nicht in BpsMIP) im Vergleich zu den FKB-Proteinen um zwei Aminosäuren verkürzt. Dadurch befindet sich das Proteinrückgrat von LpnMIP (Gln49) und TcrMIP (Arg49) näher am Zentrum der Bindetasche (definiert als Ile56, welches durch die Pipecolinsäureesterfunktion der Liganden adressiert wird). MD-Simulationen der beiden Apoproteine belegten, dass die geringere Distanz nicht durch Artefakte beim Modellieren der Strukturen bedingt ist. Aufbauend auf dieser Erkenntnis wurde gezeigt, dass der Pyridinylring von Ref_p eine Wasserstoffbrücke zu Gln49 ausbildet. Experimentell wurde dieser Befund durch eine entsprechende chemische Verschiebung der Aminosäure im NMR-Experiment von Dr. Kristian Schweimer bestätigt. Durch Überbrückung des Pipecolinsäurerings (Ligand 6bp) konnte die Wasserstoffbrücke in MD-Simulationen weiter stabilisiert werden. Durch Rechnungen zur Abschätzung der freien Bindungsenthalpien (mittels LIE und MM/GBSA) wurde eine erhöhte Affinität von 6bp im Vergleich zu Ref_p in LpnMIP ermittelt. Im Laufe der Arbeit wurde anhand von pIC50-Werten, welche von Dr. Mathias Weiwad bestimmt wurden, erkannt, dass Liganden mit Pyridinylring oftmals eine bessere Affinität in LpnMIP aufweisen als die entsprechenden Liganden mit TMPR. Durch MD Simulationen wurde nachgewiesen, dass der TMPR in LpnMIP nur schwer an der in den anderen Proteinen bevorzugten Position binden kann. Grund hierfür ist die Mutation einer Aminosäure (zu Pro57) in diesem Bereich von LpnMIP: Diese verfügt über eine wenig flexible Seiten-kette, an welche sich der TMPR auf Grund seiner Rigidität nicht anpassen kann, was die Interaktion zwischen Protein und Ligand stört. Der Pyridinylring von Ref_p ist hiervon nicht betroffen, da er bevorzugt an einer anderen Stelle (Gln49, s. o.) bindet. Der 80er Loop weist in vielen MIP-Proteinen deutlich hydrophobere Aminosäuren auf als in FKB-Proteinen. Von besonderem Interesse ist die Position 90, da hier in BpsMIP und LpnMIP sterisch weniger anspruchsvolle Aminosäuren (Val, Pro) vorliegen als in den bei-den FKB-Proteinen (Ile, Lys). Dieser Unterschied wurde mit kleinen hydrophoben Substituenten am Phenylring der Liganden adressiert. Bereits im Docking zeigten sich die positiven Effekte der para-Substitution durch Halogenatome oder eine Methylgruppe. Die von Dr. Mathias Weiwad und Dr. Mirella Vivoli ermittelten pIC50- bzw. pKi-Werte bestätigten diesen Trend. Zugleich nahm die Affinität zu FKBP12 deutlich ab. Bei der Untersuchung der Referenzliganden sowie deren Chlor- und Bromderivate in MD-Simulationen zeigte sich, dass der Phenylring der Liganden in den MIP-Proteinen bevorzugt in Richtung des 80er Loops orientiert ist; in den FKB-Proteinen liegt er hingegen um etwa 110° gedreht vor und kann somit schlechter mit der Bindetasche interagieren. Besonders ausgeprägt ist dieser Effekt in FKBP12. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde der Phenylring durch einen 4-Bromo-1H-imidazol-2-ylsubstituenten ersetzt (Ligand 8ap). Dieser ist in der Lage, in der erwarteten Orientierung im Bereich des 80er Loops von BpsMIP zu binden und gleichzeitig eine stabile Wasserstoffbrücke zu Asp37 auszubilden. Hieraus resultiert für den Liganden eine deutlich höhere Affinität in LIE- und MM/GBSA-Rechnungen; in FKBP12 blieb sie auf Grund der dort instabilen Interaktion unverändert. Die berechneten Energien können unmittelbar für einen relativen Vergleich verschiedener Liganden in einer Bindetasche verwendet werden. Für die Vorhersage von pKi- bzw. pIC50-Werten in den verschiedenen Proteinen ist eine Kalibrierung gegen die gemessenen Affinitäten erforderlich. Dies wurde für BpsMIP durchgeführt, indem eine lineare Korrelation zwischen den pKi- bzw. pIC50-Werten und den mit MM/GBSA ermittelten Energien aufgestellt wurde. Für LIE wurde auf publizierte Werte von Lamb et al. zurückgegriffen. Die berechneten Affinitäten stimmen für die bereits getesteten Inhibitoren gut mit den experimentellen pKi- und pIC50-Werten überein. Anhand der Modelle werden für 8ap Werte vorhergesagt, die besser als die experimentellen Affinitäten bekannter Liganden sind. Idealerweise können auch aus den Scores, die durch Docking erhalten werden, bereits Rückschlüsse auf die Affinitäten der Liganden gezogen werden. Für die untersuchten Proteine war dies, auf Grund des engen Bereichs der experimentell ermittelten pKi- und pIC50-Werte, nicht mit hinreichender Richtigkeit möglich. Um die Scores dennoch für die Beurteilung neuer Liganden verwenden zu können, wurden logistische Regressionsmodelle erstellt. Anhand dieser kann abgeschätzt werden, ob ein Molekül in BpsMIP submikromolare Affinität aufweist. Die Richtigkeit dieser Vorhersagemodelle konnte durch die Berücksichtigung dreier weiterer Deskriptoren (Konfiguration am Stereozentrum der Pipecolinsäure, Molekulargewicht und logD-Wert) deutlich verbessert werden, wobei die AUC der entsprechenden ROC-Kurven Werte bis zu 0.9 erreichte. Diese Modelle können für die Postprozessierung eines Dockings angewendet werden, um die vielversprechendsten Kandidaten zu identifizieren und anschließend in rechnerisch anspruchsvolleren MD-Simulationen genauer zu untersuchen. Mit dieser Arbeit wurde zur Weiterentwicklung der Leitstrukturen Ref_t und Ref_p beigetragen. Viele der getesteten Derivate wiesen deutlich verbesserte Löslichkeit bei gleichbleibender Affinität auf. Ferner wurden erstmalig detailliert die Unterschiede in den Bindetaschen zwischen 32 MIP- und FKB-Proteinen evaluiert. Hiervon wurden fünf in MD-Simulationen als Apoprotein und im Komplex mit verschiedenen Inhibitoren verglichen. Anhand dieser Simulationen wurde nachgewiesen, dass jeweils eine Aminosäure in BpsMIP und LpnMIP im Vergleich zum wichtigsten „off-target“ FKBP12 selektiv durch eine Wasserstoffbrücke adressiert werden kann. Durch LIE- und MM/GBSA-Rechnungen konnte gezeigt werden, dass in diesen hochkonservierten Bindetaschen eine bedeutende Modulation der Affinität zugunsten von BpsMIP möglich ist. N2 - Bacterial and parasitic MIP proteins constitute important virulence factors. Inhibiting these proteins can considerably reduce the survival of the pathogens as well as their penetration into human host cells. The work presented in this thesis focused on the MIP proteins of Burkholderia pseudomallei (the causative agent of melioidosis) and Legionella pneumophila (Legionnaires’ disease). Furthermore, the MIP protein of Trypanosoma cruzi (Chagas disease) was also investigated. The structurally homologous human FKB proteins FKBP12 and FKBP52 were taken into account as relevant off-targets. The aim of this thesis was to improve MIP inhibitors by means of in silico methods with respect to affinity and selectivity (for MIP proteins over FKBP12 and FKBP52) as well as solubility. The starting point for this task were two lead structures with a pipecolic acid scaffold from the work of Dr. Christina Juli and Dr. Florian Seufert. These reference ligands contain a 3,4,5-trimethoxyphenyl ring (TMPR, cf. Ref_t) or a pyridinyl ring (Ref_p). By comparison of 32 MIP and FKB proteins major differences with regard to the amino acid sequence could be identified in two loop regions, the so called 50s and 80s loop (numbering always with respect to FKBP12). It was possible to utilise these differences for the design of molecules with preferential binding to MIP proteins. The 50s loop is truncated by two amino acids in nearly all MIP proteins compared to the FKB proteins, except for BpsMIP. Thus, the protein backbone of LpnMIP (Gln49) and TcrMIP (Arg49) is located closer to the centre of the binding pocket. The centre is defined as Ile56, which is binding to the pipecolic ester function of the ligands. MD simulations of both apoproteins proved that the smaller distance is not caused by artefacts introduced during modelling of the structures. Expanding on this knowledge, it could be shown that the pyridinyl ring of Ref_p forms a hydrogen bond to Gln49. This finding was proven ex-perimentally by a corresponding chemical shift of the amino acid in an NMR experiment conducted by Dr. Kristian Schweimer. The hydrogen bond was stabilised further in MD simulations via bridging of the pipecolic acid ring (ligand 6bp). Calculations by MM/GBSA and LIE, estimating the binding free energies of the ligands, yielded im-proved affinity for 6bp compared to Ref_p in LpnMIP. It was noted in the course of this work, based on pIC50 measurements conducted by Dr. Mathias Weiwad, that ligands containing a pyridinyl ring often exhibit better affinity in LpnMIP than their corresponding counterparts with a TMPR. It could be shown with MD simulations that the TMPR is barely able to bind to LpnMIP at the position preferred in the other proteins. This is caused by mutation of an amino acid (to Pro57) in this region of LpnMIP. Due to its rigidity, the TMPR is not able to adjust to the hardly flexible side chain of proline. Consequently, the interaction between protein and ligand is disrupted. The pyridinyl ring of Ref_p is not affected by this mutation since it binds at another position (Gln49, see above). The 80s loop contains more hydrophobic amino acids in MIP proteins than in FKB proteins. Position 90 is of particular interest, as there are sterically less demanding amino acids in BpsMIP and LpnMIP (Val, Pro) than in both FKB proteins (Ile, Lys). This difference was addressed with small hydrophobic substituents at the ligands’ phenyl ring. The favourable effects of the substitution in para-position by halogen atoms or a methyl group could be observed in initial docking experiments. pIC50 and pKi values measured by Dr. Mathias Weiwad und Dr. Mirella Vivoli confirmed this trend. Furthermore, the affinity for FKBP12 clearly decreased. MD simulations of both reference ligands as well as their derivatives substituted with chlorine or bromine showed that the phenyl ring preferentially adopts a conformation pointing towards the 80s loop in MIP proteins. In contrast, the phenyl ring is rotated by approximately 110° in FKB proteins, leading to decreased interactions with the binding pocket. This effect is especially pronounced in FKBP12. Based on these results, the phenyl ring was substituted by 4-Bromo-1H-imidazol-2-yl (ligand 8ap). A ligand containing this substituent can bind next to the 80s loop of BpsMIP maintaining the previously described orientation and simultaneously form a stable hydrogen bond to Asp37. Hence, a considerably higher binding affinity of this ligand to BpsMIP was predicted via LIE and MM/GBSA calculations. There were no changes in affinity for FKBP12 due to the instable interaction in this protein. The calculated energies can directly be used to rank different ligands in a binding pocket. In order to predict pIC50 and pKi values in different proteins, these energies require calibration versus experimentally measured affinities. Such a calibration was carried out for BpsMIP by linearly correlating pIC50 and pKi values with energies gained from MM/GBSA calculations. For the LIE method, parameters published by Lamb et al. were used. Both computational approaches yielded affinities in good agreement with experimentally measured pIC50 and pKi values of known ligands. The affinities predicted by these models for 8ap are better than the inhibition constants of all currently known inhibitors. Ideally, scores obtained by docking can directly be used to gain insights into the ligands’ affinities. However, sufficient accuracy for the proteins investigated could not be gained, due to the narrow range of the experimental pIC50 and pKi values. Consequently, logistic regression models were created to allow for assessment of the ligands based on their score. These models predict whether a ligand is likely to show submicromolar affinity in BpsMIP. The accuracy of these models was considerably increased by implementing three other descriptors (configuration at the stereo centre of the pipecolic acid, molecular weight and logD value). Thus, AUCs up to 0.9 could be achieved in the corresponding ROC curves. The models can be used for postprocessing a docking calculation in order to identify the most promising ligands and subsequently investigating them with computationally more demanding MD simulations. This work contributed to the improvement of the lead structures Ref_t and Ref_p. Many of the tested derivatives exhibited increased solubility while affinity was maintained. Furthermore, differences in the binding pockets of 32 MIP and FKB proteins were evaluated in detail for the first time. Five of these proteins were compared in MD simulations, both as apoproteins as well as complexed with different inhibitors. It was proven by these simulations that one amino acid in BpsMIP as well as in LpnMIP can selectively be addressed with a hydrogen bond. These interactions cannot be formed in the most prominent off-target FKBP12. LIE and MM/GBSA calculations proved that considerable modulation of the binding affinity towards BpsMIP is possible in these highly conserved binding pockets. KW - Computational chemistry KW - Macrophage Infectivity Potentiator Protein KW - Arzneimitteldesign KW - MIP protein KW - FKBP KW - docking KW - MD simulation KW - Burkholderia pseudomallei KW - Legionella pneumophila KW - Trypanosoma cruzi KW - Drug design KW - molecular dynamics Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-165757 ER - TY - THES A1 - Luckner, Sylvia T1 - Towards the development of high affinity InhA and KasA inhibitors with activity against drug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis T1 - Entwicklung von hoch-affinen InhA und KasA Inhibitoren gegen resistente Stämme von Mycobacterium tuberculosis N2 - Mycobacterium tuberculosis is the causative agent of tuberculosis and responsible for more than eight million new infections and about two million deaths each year. Novel chemotherapeutics are urgently needed to treat the emerging threat of multi drug resistant and extensively drug resistant strains. Cell wall biosynthesis is a widely used target for chemotherapeutic intervention in bacterial infections. In mycobacteria, the cell wall is comprised of mycolic acids, very long chain fatty acids that provide protection and allow the bacteria to persist in the human macrophage. The type II fatty acid biosynthesis pathway in Mycobacterium tuberculosis synthesizes fatty acids with a length of up to 56 carbon atoms that are the precursors of the critical mycobacterial cell wall components mycolic acids. KasA, the mycobacterial ß-ketoacyl synthase and InhA, the mycobacterial enoyl reductase, are essential enzymes in the fatty acid biosynthesis pathway and validated drug targets. In this work, KasA was expressed in Mycobacterium smegmatis, purified and co-crystallized in complex with the natural thiolactone antibiotic thiolactomycin (TLM). High-resolution crystal structures of KasA and the C171Q KasA variant, which mimics the acyl enzyme intermediate of the enzyme, were solved in absence and presence of bound TLM. The crystal structures reveal how the inhibitor is coordinated by the enzyme and thus specifically pinpoint towards possible modifications to increase the affinity of the compound and develop potent new drugs against tuberculosis. Comparisons between the TLM bound crystal structures explain the preferential binding of TLM to the acylated form of KasA. Furthermore, long polyethylene glycol molecules are bound to KasA that mimic a fatty acid substrate of approximately 40 carbon atoms length. These structures thus provide the first insights into the molecular mechanism of substrate recognition and reveal how a wax-like substance can be accommodated in a cytosolic environment. InhA was purified and co-crystallized in complex with the slow, tight binding inhibitor 2-(o-tolyloxy)-5-hexylphenol (PT70). Two crystal structures of the ternary InhA-NAD+-PT70 were solved and reveal how the inhibitor is bound to the substrate binding pocket. Both structures display an ordered substrate binding loop and corroborate the hypothesis that slow onset inhibition is coupled to loop ordering. Upon loop ordering, the active site entrance is more restricted and the inhibitor is kept inside more tightly. These studies provide additional information on the mechanistic imperatives for slow onset inhibition of enoyl ACP reductases. N2 - Mycobacterium tuberculosis, der Erreger der Tuberkulose ist für mehr als acht Millionen Neu-Infektionen und ungefähr zwei Millionen Todesfälle jedes Jahr verantwortlich. Besonders die Entwicklung von multiresistenten und extrem resistenten Stämmen macht die Entwicklung neuer Medikamente gegen Tuberkulose dringend erforderlich. Die Zellwandbiosynthese ist ein validiertes Ziel für die Chemotherapie bei bakteriellen Infektionen. Bei Mycobakterien besteht die Zellwand zum Großteil aus Mykolsäuren, sehr langkettigen Fettsäuren, die den Bakterien Schutz bieten und ihnen ermöglichen, in Makrophagen zu überleben. Mycobakterien synthetisieren in der Fettsäurebiosynthese II (FAS-II) Fettsäuren bis zu einer Länge von 56 Kohlenstoffatomen, die Bestandteile der Mykolsäuren sind. KasA, die mycobakterielle ß-ketoacyl Synthase und InhA, die mycobakterielle enoyl Reductase, sind essentielle Enzyme der FAS-II und geeignete Ziele für die Entwicklung neuer Antibiotika. In dieser Arbeit wurde KasA in Mycobacterium smegmatis exprimiert und aufgereinigt. Das Protein wurde im Komplex mit dem natürlich vorkommenden Thiolacton-Antibiotikum Thiolactomycin (TLM) co-kristallisiert. Kristallstrukturen von KasA und der C171Q KasA Variante, die das acylierte Enzym-Intermediat darstellt, wurden als apo-Strukturen und im Komplex mit gebundenem TLM aufgeklärt. Die Kristallstrukturen zeigen, wie der Inhibitor an das Enzym gebunden ist und deuten darauf hin, wie das TLM Molekül verändert werden könnte, um seine Affinität für das Protein zu erhöhen und damit ein wirksames Medikament gegen Tuberkulose zu entwickeln. Vergleiche zwischen den TLM gebundenen Kristallstrukturen erklären, warum TLM bevorzugt an die acylierte Form des Enzyms bindet. Des Weiteren sind lange Polyethylenglykol-Moleküle an KasA gebunden, die ein Fettsäuresubstrat einer Länge von etwa 40 Kohlenstoff-Atomen nachahmen. Die Strukturen geben damit zum ersten Mal einen Einblick in den molekularen Mechanismus der Substrat-Erkennung und zeigen, wie eine wachsartige Substanz in einem cytosolischen Umfeld aufgenommen werden kann. InhA wurde aufgereinigt und im Komplex mit dem „slow binding“ Inhibitor 2-(o-tolyloxy)-5-hexylphenol (PT70) co-kristallisiert. Zwei Kristallstrukturen des ternären InhA-NAD+-PT70 Komplexes wurden gelöst und zeigen wie der Inhibitor in der Substratbindetasche gebunden ist. Beide Strukturen, weisen geordnete Substrat-Binde-Loops auf, die den Eingang zur „Active Site“ schließen und damit den gebundenen Inhibitor in der Tasche festhalten. Die Strukturen bestätigen damit die Hypothese, dass „Slow Binding Inhibition“ mit der Ordnung des Loops zusammenhängt. Diese Studien können als Basis für die Entwicklung weiterer „Slow Binding“ Inhibitoren verwendet werden. KW - Tuberkelbakterium KW - Multidrug-Resistenz KW - Arzneimitteldesign KW - Fettsäure-Synthase KW - Zellwand KW - Kristallstruktur KW - tuberculosis KW - multi-drug-resistance KW - drug development KW - fatty acid synthesis KW - cell wall KW - crystal structure KW - structure based drug design Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-43621 ER -