TY - THES A1 - Füller, Jochen T1 - Analysis of the binding properties of the kinase C-RAF to mitochondria and characterization of its effects on the cellular and molecular level T1 - Untersuchung der Bindungseigenschaften der Kinase C-RAF an Mitochondrien und Charakterisierung der Effekte auf zellulärer und molekulare Ebene N2 - The proteins of the RAF family (A-RAF, B-RAF, and C-RAF) are serine/threonine-kinases that play important roles in development, mature cell regulation and cancer. Although it is widely held that their localization on membranes is an important aspect of their function, there are few data addressing this aspect of their mode of action. Here, we report that each member of the RAF family exhibits a specific distribution at the level of cellular membranes, and that C-RAF is the only isoform that directly targets mitochondria. We find that the RAF kinases exhibit intrinsic differences in terms of mitochondrial affinity, and that C-RAF is the only isoform that binds this organelle efficiently. This affinity is conferred by the C-RAF amino-terminal domain, and does not depend on the presence of RAS GTPases on the surface of mitochondria. Furthermore, we analyze the consequences of C-RAF activation on the cellular and molecular level. C-RAF activation on mitochondria dramatically changes their morphology and their subcellular distribution. On the molecular level, we examine the role of C-RAF in the regulation of the pro-apoptotic Bcl-2 family member BAD. This protein exhibits the original mode of regulation by phosphorylation. Although several reports addressed the regulation of BAD by C-RAF, the exact mode of action as well as the consequences of C-RAF activation on BAD are still not completely understood. We show that the inducible activation of C-RAF promotes the rapid phosphorylation of BAD on Serine-112 (Ser-75 in the human protein), through a cascade involving the kinases MEK and RSK. Our findings reveal a new aspect of the regulation of BAD protein and its control by the RAF pathway: we find that C-RAF activation promotes BAD poly-ubiquitylation in a phosphorylation-dependent fashion, and increases the turn-over of this protein through proteasomal degradation. N2 - Die Proteine der RAF-Familie (A-RAF, B-RAF, C-RAF) sind Serin/Threonin-Kinasen, die eine wichtige Rolle in der Entwicklung, in der Zellregulation und in Krebs spielen. Obwohl es weitgehend anerkannt ist, dass die Lokalisation an Membranen ein wichtiger Aspekt ihrer Funktion ist, gibt es nur wenige Daten, die diesen Punkt ihrer Wirkungsweise beschreiben. Wir zeigen hier, dass jedes Mitglied der RAF-Familie eine spezifische Verteilung an zellulären Membranen besitzt, und dass C-RAF die einzige Isoform ist, die direkt an Mitochondrien bindet. Weiterhin zeigen wir, dass RAF-Kinasen intrinsische Unterschiede in ihrer mitochondrialen Affinität aufweisen, wobei C-RAF die einzige Isoform ist, die an dieses Organell effizient bindet. Diese Affinität wird von der amino-terminalen Domäne von C-RAF vermittelt und ist unabhängig vom Vorkommen der RAS-GTPasen auf der Oberfläche von Mitochondrien. Des Weiteren haben wir die Konsequenzen der Aktivierung von C-RAF auf zellulärer als auch auf molekularer Ebene untersucht. C-RAF Aktivierung an Mitochondrien hat drastische Änderungen in deren Morphologie und subzellulärer Verteilung zur Folge. Auf molekularer Ebene haben wir die Rolle von C-RAF in der Regulation des pro-apoptotischen Bcl-2 Familien Proteins BAD untersucht. Dieses Protein wird über Phosphorylierung reguliert. Obwohl eine Vielzahl von Arbeiten die Regulation von BAD durch C-RAF untersuchten, sind die exakte Wirkungsweise wie auch die Konsequenzen der C-RAF Aktivierung im Hinblick auf BAD immer noch unklar. Wir zeigen, dass die induzierbare Aktivierung von C-RAF die rapide Phosphorylierung von BAD an Serin 112 (Serin 75 im humanen Protein) zur Folge hat. Dieser Prozess wird durch eine Kaskade vermittelt, welche die Kinasen MEK und RSK einbezieht. Des Weiteren decken unsere Ergebnisse einen neuen Aspekt der Regulation des BAD Proteins auf und dessen Kontrolle durch den RAF-Signalweg: Wir zeigen, dass die Aktivierung von C-RAF die phosphorylierungs-abhängige Poly-ubiquitylierung von BAD zur Folge hat. Weiterhin beschleunigt die Aktivierung von C-RAF den Umsatz des BAD Proteins durch proteasomalen Abbau. KW - Apoptosis KW - Raf-Kinasen KW - Mitochondrium KW - BAD KW - BCL-2 Familie KW - BAD KW - BCL-2 family Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-35096 ER - TY - THES A1 - Nekhoroshkova, Elena T1 - A-RAF kinase functions in ARF6 regulated endocytic membrane traffic T1 - Die Rolle der A-RAF-Kinase in ARF6 reguliertem endocytotischem Membrantransport N2 - Extracellular signals are translated and amplified via cascades of serially switched protein kinases, MAP kinases (MAPKs). One of the MAP pathways, the classical RAS/RAF/MEK/ERK pathway, transduces signals from receptor tyrosine kinases and plays a central role in regulation of cell proliferation. RAF kinases (A-, B- and C-RAF) function atop of this cascade and convert signals emanating from conformational change of RAS GTPases into their kinase activity, which in turn phosphorylates their immediate substrate, MEK. Disregulated kinase activity of RAF can result in tumor formation, as documented for many types of cancer, predominantly melanomas and thyroid carcinomas (B-RAF). A-RAF is the least characterized RAF, possibly due to its low intrinsic kinase activity and comparatively mild phenotype of A-RAF knockout mice. Nevertheless, the unique phenotype of araf -/- mice, showed predominantly neurological abnormalities such as cerebellum disorders, suggesting that A-RAF participates in a specific process not complemented by activities of B- and CRAF. Here we describe the role of A-RAF in membrane trafficking and identify its function in a specific step of endocytosis. This work led to the discovery of a C-terminally truncated version of A-RAF, AR149 that strongly interfered with cell growth and polarization in yeast and with endocytosis and actin polymerization in mammalian cells. As this work was in progress two splicing isoforms of ARAF, termed DA-RAF1 and DA-RAF2 were described that act as natural inhibitors of RAS-ERK signaling during myogenic differentiation (Yokoyama et al., 2007). DA-RAF2 contains the first 153 aa of A-RAF and thus is nearly identical with AR149. AR149 localized specifically to the recycling endosomal compartments as confirmed by colocalization and coimmunoprecipitation with ARF6. Expression of AR149 interferes with recycling of endocytosed transferrin (Tfn) and with actin polymerization. The endocytic compartment, where internalized Tfn is trapped, was identified as ARF6- and RAB11- positive endocytic vesicles. We conclude that the inhibition of Tfn trafficking in the absence of A-RAF or under overexpression of AR149 occurs between tubular- and TGNassociated recycling endosomal compartments. siRNA-mediated depletion of endogenous A-RAF or inhibition of MEK by U0126 mimic the AR149 overexpression phenotype, supporting a role of ARAF regulated ERK signalling at endosomes that is controlled by AR149 and targets ARF6. Our data additionally suggest EFA6 as a partner of A-RAF during activation of ARF6. The novel findings on the A-RAF localization and the interaction with ARF6 have led to a new model of ARAF function were A-RAF via activation of ARF6 controls the recycling of endocytic vesicles.Endocytosis and rapid recycling of synaptic vesicles is critically important for the physiological function of neurons. The finding, that A-RAF regulates endocytic recycling open a new perspective for investigation of the role of A-RAF in the nervous system. N2 - Extrazelluläre Signale werden über eine Serie von nacheinander geschalteten Proteinkinasen, den MAP-Kinasen (MAPK) weitergeleitet und multipliziert. Einer der MAPK-Signalwege, der RAS/RAF/MEK/ERK-Signaltransduktionsweg, leitet Signale von Tyrosinkinaserezeptoren weiter und spielt eine zentralle Role in der Regulation der Zellproliferation. RAF Kinasen (A-, B-, und CRAF) stehen am Anfang der Kaskade. Sie wandeln die signalbedingte strukturellen Änderungen der RAS-GTPase in ihre Kinaseaktivität um und phosphorylieren ihr direktes Substrat, MEK. Eine Störung in der Regulation der Kinaseaktivität des RAF-Proteins kann zur Tumorbildung führen, wie es bei vielen Krebsarten, vor allem Melanom und Schilddrüsenkarzinom (B-RAF), dokumentiert ist. A-RAF ist die bislang am wenigsten charakterisierte RAF-Kinase, möglicherweise aufgrund sihrer nidrigen intrinsischen Kinaseaktivität. Weiterhin weist die A-RAF defficiente Maus einen relativ milden hauptsächlich neuronalen Phänotyp auf, der sich unter anderem auch in einer Fehlfunktion des Cerebellums manifestiert. Dieser einzigartige Phänotyp weist darauf hin, dass eine Reihe zellulärer Prozesse spezifisch durch A-RAF und nicht durch aktiveren B- und C-RAF vermittellt wird. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde die Rolle des A-RAF-Proteins im intrazellulären Membrantransport analysiert und eine spezifische A-RAF Funktion by endozytotischen Prozessen identifiziert. Diese Arbeit führte zur Entdeckung einer C-terminal verkürtzten Form von A-RAF, AR149, welche das Wachstum und die Polarisation von Hefezellen beeinträchtigt. In Säugetierzellen wirkt AR149 störend auf die Endozytose und die Aktinpolymerisation. Während des Entstehungsprozesses dieser Studie, wurden parallel zwei Spleißisoformen des A-RAF-Proteins, DARAF1 und 2, publiziert, die als natürliche Inhibitoren des RAS-RAF-MEK-ERK-Signalwegs in der myogenen Differenzierung agieren (Yokoyama et al., 2007). DA-RAF2 beinhaltet die ersten 153 Aminosäuren des A-RAF Proteines und ist damit fast identisch mit AR149. Eigene Kolokalisierungund Koimmunopräzipitationsexperimente mit ARF6 weisen darauf hin, dass AR149 spezifisch in ARF6-positiven Recycling-Endosomen lokalisiert ist. Expression des AR149 Proteins bechindert das Recycling von endozytiertem Transferrin und die Aktin Polimerisation. Die endosomalen Kompartimente in denen internalisiertes Transferrin gefangen vor liegt, konntenals ARF6- und RAB11-positive endozytotische Vesikeln characterisiert werden. Diese Ergebnisse lassen auf eine durch A-RAF Überexpression bzw. durch die Abwesenheit an A-RAF vermittelte Blokade des intrazellulären Transferrintransportes zwischen den tubulären- und Trans-Golgi-Netzwerk-assoziirten endosomalen Recycling-Kompartimenten schließen. Inhibierung der endogenen A-RAF-Expression durch siRNA oder Hemmung der MEK-Aktivität durch U0126 haben den selben Effekt wie AR149. Auf der Basis dieser Ergebnisse wird ein neues Modell für die Rolle der A-RAF regulierten ERK Signallwirkung auf Endosomen vorgestellt, bei dem das Zielprotein die ARF6 GTPase durch 3 AR149/DA-RAF2 negativ reguliert wird. Daruber hinaus deuten unsere Daten darauf hin, dass EFA6, ein GEF-Faktor von ARF6, als Kooperationspartner von A-RAF bei der ARF6-Aktivierung fungiert. Endocytose und das schnelle Recycling von synaptischen Vesikeln ist von besonderer Bedeutung für die Funktion von Neuronen. Aus dem Befund, dass A-RAF ein Regulator des endocytotischen Recyclings ist ergibt sich dacher eine neue Perspektieve für die Untersuchung der A-RAF Funktion im Nervensystem. KW - Raf-Kinasen KW - Endocytose KW - Onkologie KW - Signaltransduktion KW - Carcinogenese KW - ARF6 GTPase KW - Recycling- Endosomen KW - ERK KW - A-RAF KW - Signal-Übertragung KW - A-RAF KW - signal transduction KW - mitogen cascade KW - membrane trafficking KW - endocytic recycling Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-44566 ER -