TY - THES A1 - Üceyler, Nurcan T1 - Charakterisierung genomischer Polymorphismen und somatischer Mutationen, sowie der Expression der gastrointestinalen Glutathionperoxidase im Rahmen der kolorektalen Karzinogenese T1 - Characterisation of genomic polymorphisms and somatic mutations and the expression of the gastrointestinal glutathionperoxidase during colorectal carcinogensis N2 - Das kolorektale Karzinom ist in der westlichen Welt die zweithäufigste Todesursache bei Männer und Frauen. Wichtige Pathomechanismen der kolorektalen Karzinome konnten in den letzten Jahren aufgedeckt werden. Die Anhäufung von genetischen Alterationen spielen sowohl bei sporadischen, als auch bei den hereditären Formen eine wichtige Rolle. Zwei molekulargenetische Hauptwege sind bei der kolorektalen Karzinogenese identifiziert worden: erstens der Tumorsuppressor-Pathway, bei dem es zu Alterationen in Tumorsuppresor- und Onkogenen kommt und zweitens der Mutatior-Pathway, der auf genetischen Alterationen in DNA-mismatch-Reparatur-Genen beruht, die zu einer genetischen Instabilität führen mit einer hohen Mutationsrate in repetitiven DNA-Sequenzen (sog. Mikrosatelliten). Es konnte gezeigt werden, dass oxidativer Stress, der durch die Bildung von H2O2 und anderen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) hervorgerufen wird, zur Entstehung von zellulären und DNA-Schäden wie z.B. oxidative Basenschäden, die ihrerseits u.a. die Entstehung von fixen Punktmutationen, Fragmentation der Desoxiribose und DNA-Strangbrüche initiieren, führen kann. Diese Veränderungen und auch die Mismatch-Reparatur-Defizienz begünstigen die Tumorprogression im Kolon. Es wird geschätzt, dass durch ROS täglich ca.20 000 hits pro Zelle verursacht werden. Es existieren sowohl extrazelluläre, als auch zelluläre antioxidative Abwhrsysteme, die Biomoleküle wie u.a. die DNA vor dem oxidativen Stress schützen. Unter diesen protektiven Enzymen gibt es neben der Superoxidismutase und der Katalase auch zahlreiche Selenoproteine, die Selenocystein in ihrem aktiven Zentrum tragen. Zu diesen Enzymen, die antioxidative Funktionen wahrnehmen gehören u.a. die Glutathionperoxidase, die Thioredoxinreduktase und das Selenoprotein P. Die Glutathionperoxidase-Familie besteht aus der cytosolischen Glutathioperoxidase (cGPx), der plasmatischen Glutathionperoxidase (pGPx), der gastrointestinalen Glutathionperoxidase (GI-GPx) und der Phospholipid-Hydroperoxid-Glutathionperoxidase (PH-GPx). Diese Enzymfamilie ist an der Reduktion von Hydroperoxiden beteiligt, wobei sie Glutathion als Cofaktor benutzt. Die Thioredoxinreduktase-Familie (TrxR-alpha und Trxr-beta) regeneriert oxidiertes Thioresoxin, das in die DNA-Synthese involviert ist und auch in zelluläre Redox-Regulationssysteme eingreift und Transkriptionsfaktoren beeinflusst. Das Selenoprotein P, das bis zu 10 Seleocysteinreste pro Molekül enthält, baut Peroxinitrit ab, das seinerseits ein starkes Agens bei der Nitrosylation von Biomolekülen ist. Zusätzlich reduziert Selenoprotein P auch Phospholipid-Hydroperoxide, wenn auch weniger effektiv als PH-GPx. Es konnte in Vorarbeiten gezeigt werden, dass Selenoproteine im Gastrointestinaltrakt eine differentielle Expression aufweisen. Kürzlich konnte in unserer Arbeitsgruppe die inverse mRNA-Expression selnocysteinhaltigen Proteine GI-GPx und Selenoprotein P in kolorektalen Adenomen im Vergleich zur Normalmukosa charakterisiert werden. Dabei zeigte sich eine dramatische Abnahme der Selenoprotein P-Expression, während die Expression der GI-GPx signifikant erhöht war. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit untersuchten wir die Expression der GI-GPx in kolorektalen Karzinomen und Kolonkarzinom-Zelllinien, um auf Ebene der Selenoprotein-kodierenden Gene nach Alterationen zu suchen, die die veränderte Expression mit verursachen könnten. N2 - Colorectal cancer is the seceond most cancer in both men and women in the western world. Important mechanisms of the pathogenesis of colorectal cancers have been identified during the last years. Accumulation of genetic alterations plays an imprtant role in the carcinogenesis of both sporadic and inherited colorectal cancers. Two major molecular pathways have been characterised in colorectal carcinogenesis, first, the tumor suppressor pathway, with the hallmark of alterations in tumor suppressor genes (p53, APC, DCC) and oncogenes (K-ras), and second, the mutator pathway, based on genetic alterations in DNA mismatch repair genes, which lead to genetic instability with high mutation rate in repetitive DNA sequences (microsatellites). Oxidative stress caused by formation of H2O2 and other reactive oxygen species (ROS) was shown to contribute to cellular and DNA damage e.g. oxidative base damage leading to fixed point mutations, fragmentation of deoxyribose as well as DNA strand breaks, thereby promoting tumor progression in the colon as well as mismatch repair deficiency. It has been estimated, that the number of ROS induced hits accounts for 20 000 hits per cell per day. Both extracellular and cellular antioxidative defense systems have evolved which protect biomolecules including DNA from oxidative stress events. Among these protecting enzymes such as superoxide dismutase and catalase, various selenocysteine containing proteins (selenoproteins) with antioxidative functions like the glutathione peroxidases, the thioredoxin reductases and selenoprotein P have been identified. The glutathione peroxidase family consists of the cytosolic glutathione peroxidase (cGPx), plasma glutathione peroxidase (pGPx), gastrointestinal glutathione peroxidase (giGPx) and the phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase (phGPx) and is involved in reduction of hydroperoxides using glutathione as a cofactor. The thioredoxin reductase family (TrxRalpha and TrxRbeta) regenerates oxidized thioredoxin, which is involved in DNA synthesis as well as cellular redox regulation of enzymes and transcription factors. Selenoprotein P (SePP), containing up to 10 seleocysteine residues per molecule is assumed to quench peoxnitrite, a powerful agent in nitrosylation of biomolecules. In addition, SePP was suggested to reduce phospholipid hydroperoxides although less efficiently than phGPx. Selenoproteins have been shown to be differentially expressed along the gastrointestinal tract. Recently, we identified an inverse mRNA expression of the selenocysteine-containing proteins giGPx and SePP in colorectal adenomatous polyps comparad to adjacent normal mucosa. In particular, SePP expression was dramatically reduced in colon adenomas, whereas giGPx expression was markedly increased. Here, we investigated the expression of the selenoprotein giGPx in colorectal cancers and colorectal cancer cell lines and examined whether alterations of genes encoding selenoproteins contributes to the altered expression of selenoproteins in colorectal cancer. KW - kolorektale Karzinogenese KW - Antioxidantien KW - Selenoproteine KW - Glutathionperoxidase KW - Mikrosatelliteninstabilität KW - colorectal carcinogensis KW - antioxidants KW - selenoproteins KW - glutathionperoxidase KW - microsatellit-instability Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5815 ER - TY - THES A1 - Özkent, Helena T1 - Untersuchung der Beteiligung der kleinen Nervenfasern bei Patient/-innen mit Antikörper-assoziierten Neuropathien T1 - Investigation of the involvement of small nerve fibers in patients with antibody-associated neuropathies N2 - In der vorliegenden Studie wurden QST, QSART, Hautbiopsien und Fragebögen genutzt, um die Beteiligung kleiner Nervenfasern bei verschiedenen Formen der Immunneuropathien zu untersuchen. Wir konnten hierbei eine signifikante Beeinträchtigung der thermischen Reizleitung bei CIDP- und MADSAM-Patient/-innen nachweisen sowie eine signifikant reduzierte Schweißproduktion am distalen Unterschenkel bei MADSAM-Patient/-innen. Diese Ergebnisse belegen in allen drei Untergruppen der immunvermittelten Neuropathien eine Beteiligung kleiner auch unmyelinisierter Nervenfasertypen. MADSAM- und CIDP-Patient/-innen wiesen in der QST ein ähnliches Schädigungsmuster auf. Dagegen unterschieden sie sich signifikant in der QSART. Diese Ergebnisse können als weiterer Hinweis auf unterschiedliche zugrundeliegende Pathomechanismen verstanden werden. MMN-Patient/-innen wiesen insgesamt die geringste Small-Fiber-Beteiligung in den quantitativen Testungen auf. Auch lagen bei MMN-Patient/-innen durchschnittlich die geringsten Schmerz-Scores und autonomen Symptome vor. Es zeigten sich wenig signifikante Unterschiede zwischen seropositiven und seronegativen Neuropathie-Patient/-innen. Diese jedoch bestätigten unsere Hypothese einer etwas geringeren Small-Fiber-Beteiligung bei seropositiven Patient/-innen. Bei der Vielzahl an unterschiedlichen Pathomechanismen innerhalb der immunvermittelten Neuropathien erscheinen weitere Subklassifizierungen für eine optimale Diagnosestellung und Therapie unabdingbar. Diese Arbeit konnte mit den oben genannten Untersuchungen einen weiteren Beitrag zur Identifikation von klinischen und quantitativen Unterschieden innerhalb dieser großen Erkrankungsgruppe leisten. Künftige, größere Studien dieser Art können möglicherweise hier nur als Tendenzen gesehene Erkenntnisse belegen und sollten durch zusätzliche Informationen wie Korrelation zu Krankheitsdauer, Therapie, Laborchemie und elektrophysiologischen Untersuchen weitere interessante Erkenntnisse liefern. N2 - In the present study QST, QSART, skin biopsies and questionnaires were used to examine the involvement of small nerve fibers in different forms of immune-mediated neuropathies. Here, we demonstrated significant impairment of thermal conduction in CIDP and MADSAM patients and a significantly reduced sweat production at the distal lower leg in MADSAM patients. These results demonstrate an involvement of small unmyelinated nerve fibers in all three subgroups of immune-mediated neuropathies. MADSAM and CIDP patients showed a similar pattern of damage in QST. In contrast, they differed significantly in QSART. These results can be understood as further evidence of different underlying pathomechanisms. MMN patients had the lowest overall small-fiber involvement in our quantitative tests and suffered from less pain and autonomic symptoms compared to CIDP and MADSAM. There were few significant differences between seropositive and seronegative neuropathy patients. However, these confirmed our hypothesis of slightly lower small-fiber involvement in seropositive patients. Given the large number of different pathomechanisms within immune-mediated neuropathies, further subclassifications seem essential for optimal diagnosis and therapy. With these results this work could contribute further aspects to the identification of clinical and quantitative differences within immune-mediated neuropathies. Future larger studies of this type may be able to substantiate findings - seen here only as trends - and should provide further interesting insights through additional information such as correlation to disease duration, therapy, laboratory chemistry and electrophysiological studies. KW - Polyneuropathie KW - Nervenfaser KW - Neuropathie KW - Quantitativ Sensorische Testung KW - QSART KW - Hautbiopsie KW - small nerve fibers Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-269293 ER - TY - THES A1 - Östreicher, Sebastian T1 - Synthese und Eigenschaften neuartiger Di-, Tri- und Tetrametalloboridokomplexe T1 - Synthesis and Characterisation of Novel Di-, Tri-, and Tetrametalloborido Complexes N2 - Unter Ausnutzung der Reaktivität von Borylanionen wurden neuartige Übergangsmetallboridokomplexe synthetisiert, bei denen ein "nacktes" Boratom als Ligand für bis zu vier Übergangsmetalle vorliegt. Strukturelle und bindungstheoretische Eigenschaften der Boridokomplexe wurden mit gängigen metallorganischen Analysemethoden sowie mit DFT-Methoden untersucht. Dabei zeigte sich, dass die erhaltenen Tetrametalloboridokomplexe eine planare Koordinationsgeometrie um das Borzentrum aufweisen und damit ein Äquivalent zu anti van't Hoff/Le Bel-Verbindungen des Kohlenstoffs darstellen. N2 - Exploiting the reactivity of boryl anions, novel transition metal borido complexes were synthesised. Borido complexes feature a "naked" boron atom that serves as a ligand for up to four metals. Structucal characterisation of the boridokomplexes was carried out by means of common analytical methods as well as DFT-calculations. Tetrametalloborido complexes showed a remarkably planar geometry around the boron center and can therefore be considered as anti van't Hoff/Le Bel compounds. KW - Übergangsmetall KW - Mehrkernige Komplexe KW - Bor-Übergangsmetallverbindungen KW - Boridokomplexe KW - Borylanionen KW - anti-van't Hoff/Le Bel Verbinfungen KW - transition metal boron complexes KW - borido complexes KW - boryl anions KW - anti van't Hoff/Le Bel-compounds Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73943 ER - TY - THES A1 - Önel, Ayla T1 - Synthese und Relevanz von Oxylipinen in Blättern, Wurzeln und Samen von \(Arabidopsis\) \(thaliana\) T1 - Synthesis and relevance of oxylipins in leaves, roots and seeds of \(Arabidopsis\) \(thaliana\) N2 - Die Lipidoxidation kann sowohl enzymatisch als auch nicht enzymatisch erfolgen. Der erste Schritt der enzymatischen Oxidation wird durch Lipoxygenasen katalysiert, von welchen es in Arabidopsis thaliana sechs verschiedene Isoformen gibt. Dabei werden die Lipoxygenasen nach dem Kohlenstoffatom klassifiziert, welches sie oxidieren. Somit gehören die LOX1 und LOX5 zu den 9-Lipoxygenasen, während LOX2, LOX3, LOX4 und LOX6 zu den 13 Lipoxygenasen zählen. Während der Samenalterung findet vermehrt eine Lipidperoxidation statt, welche mit einem Verfall des Samens sowie einer verringerten Keimrate korreliert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zunächst erfolgreich ein System zur künstlichen Samenalterung von Arabidopsis thaliana etabliert. Bei der künstlichen Alterung stiegen ähnlich wie bei der natürlichen Samenalterung oxidierte Lipide an und die Keimrate fiel ab. Nach Alterung konnte ein Anstieg von sechs verschiedenen oxidierten Triacylglycerolen detektiert werden. Es konnte in dieser Arbeit mit Hilfe von Mutanten mit Defekten in mehreren der Lipoxygenase Gene gezeigt werden, dass die Oxidation dieser veresterten Fettsäuren zum größten Teil nicht enzymatisch erfolgt. Bei der Alterung stiegen zudem enzymatisch gebildete 9 Lipoxygenase Produkte wie freie Hydroxy- und Ketofettsäuren an. Bei einer Analyse der freien oxidierten Fettsäuren konnte ebenfalls mit Lipoxygenase Mutanten ermittelt werden, dass diese hauptsächlich via LOX1 oxidiert werden. Die Untersuchung der Keimraten der Lipoxygenase Mutanten nach Alterung zeigte in mehreren Versuchen eine leicht erhöhte Keimrate der lox1 im Vergleich zum Wildtyp. Eine exogene Behandlung von Wildtyp Samen mit verschiedenen 9-Lipoxygenase Produkten, welche bei der Alterung ansteigen, führte allerdings nicht zu einer Keimungshemmung. Somit scheinen Produkte wie Hydroxy- und Ketofettsäuren der 9-Lipoxygenase LOX1 nicht die Hauptursache für die Keimungshemmung nach Alterung zu sein. Darüber hinaus konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass eine Behandlung der Blüten des Wildtyps mit Methyljasmonat zu einer signifikant höheren Keimrate der Samen im Vergleich zu Samen von unbehandelten Pflanzen nach Alterung führt. Ein „Lipidprofiling“ der Samen von mit Methyljasmonat behandelten Pflanzen wies signifikant geringere Gehalte sowohl an freien als auch veresterten oxidierten Fettsäuren auf, was mit einer erhöhten Lebensfähigkeit korrelierte. Diese Erkenntnisse könnten von großer Relevanz für die Landwirtschaft sein, falls eine Übertragung auf Nutzpflanzen möglich ist. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war eine eingehende Untersuchung der Rolle und Funktion der LOX6. Mit Hilfe von GUS Färbungen konnte eine Lokalisation der LOX6 in Blättern und Wurzeln nachgewiesen werden. Zudem wurde ein 35SLOX6GFP Konstrukt erstellt und in Arabidopsis thaliana Pflanzen stabil transformiert. Mit den selektionierten Linien könnte in Zukunft auch die intrazelluläre Lokalisation der LOX6 untersucht werden. Außerdem wurden Konstrukte mit dem Reportergen GFP und AOS sowie LOX2 hinter dem 35S Promotor kloniert, welche ebenfalls für weitere Lokalisations- und Kolokalisationsstudien genutzt werden können. Zudem wurde mit der Klonierung eines Konstruktes begonnen, um in Zukunft einen spezifischen LOX6 Antikörper herstellen und auch die endogene LOX6 Lokalisation in dem Wildtyp analysieren zu können. Um die Produkte der LOX6 zu untersuchen, wurden 35SLOX6 Linien sowie die lox6 Mutante verwendet. Obwohl Hydroxyfettsäuren und Jasmonate Folgeprodukte der LOX6 sind, wiesen die 35SLOX6 Linien weder basal, noch nach Stress erhöhte Gehalte dieser im Vergleich zum Wildtyp auf. Somit geben die 35SLOX6 Linien einen Hinweis darauf, dass LOX6 im Wildtyp nicht limitierend für die Produktion von Hydroxyfettsäuren und Jasmonaten sein könnte. Um zu untersuchen, ob das Substrat der LOX6 der limitierende Faktor sein könnte, wurde eine Behandlung mit α Linolensäure durchgeführt. Dabei entstanden allerdings nicht mehr Folgeprodukte der LOX6, sondern es fand sowohl in den 35SLOX6 Linien als auch in dem Wildtyp eine massive nicht enzymatische radikalische Oxidation der Fettsäuren statt. Um festzustellen, ob sich durch eine LOX6 Überexpression das Metabolom ändert, wurde eine „untargeted Analyse“ mit 35SLOX6 Linien durchgeführt. Diese zeigte vier Metabolite, welche in den 35SLOX6 Linien im Vergleich zum Wildtyp unterschiedlich stark vorhanden waren. Zudem sollte untersucht werden, ob sich die Physiologie und Stressresistenz in den Überexpressionslinien im Vergleich zum Wildtyp unterscheiden. Dabei zeichneten sich die 35SLOX6 Linien durch kleinere, hellere und rundere Blätter aus. Zudem wurden die Wurzeln der 35SLOX6 Linien bei Fraßversuchen mit Pocellio scaber im Vergleich zum Wildtyp weniger bevorzugt gefressen. Diese Erkenntnisse sowie die generierten Konstrukte und Pflanzenlinien können in der Zukunft einen weiteren Einblick in die vielfältigen Funktionen und Produkte der LOX6 gewähren. N2 - Lipidoxidation can take place enzymatically and non-enzymatically. The first step of the enzymatic oxidation is catalysed via lipoxygenases. In Arabidopsis thaliana there are six lipoxygenase isoforms. The lipoxygenases are characterized by the carbon atom they oxidise. LOX1 and LOX5 are 9-lipoxygenases, while LOX2, LOX3, LOX4 and LOX6 are 13 lipoxygenases. During seed ageing lipid peroxidation takes place, which correlates with a deterioration of the seed and a lower germination rate. First, a method for artificial ageing of Arabidopsis thaliana seeds was successfully established as a part of this work. During artificial seed ageing, oxidised lipids increased and the germination rate decreased similar to natural ageing. During artificial ageing an accumulation of six oxidised triacylglycerols could be detected. In this work, it could be shown with the help of mutants with defects in the lipoxygenase genes, that the oxidation of esterified fatty acids mainly takes place non-enzymatically. Moreover, enzymatically formed free 9-lipoxygenase products such as hydroxy and keto fatty acids increase during the process of ageing. An analysis of the free fatty acids in lipoxygenase mutants lead to the conclusion that they are formed primarily by LOX1. The lox1 mutant showed a slightly higher germination rate than the wild type after seed ageing in the majority of the experiments. However, an exogenous treatment of wild type seeds with free 9-lipoxygenase products, which increase during ageing, did not inhibit the germination rate. Therefore, LOX1 (9-lipoxygenase) products like hydroxy and keto fatty acids do not seem to be the main cause for the inhibition of germination after ageing. In addition, this work shows that a methyl jasmonate treatment of wild type flowers leads to a significant higher germination rate of their seeds after ageing in comparison to the seeds of untreated wild type plants. A lipid profiling revealed significantly lower levels of oxidised esterified as well as free fatty acids after ageing in seeds of treated wild type plants compared to untreated ones, which correlates with a higher germination rate. These findings could be of great value for the agriculture if they are transferable to crop plants. Another focus of this work was set on investigating the function and relevance of LOX6. The localization of LOX6 in leaves and roots could be confirmed with the help of GUS stainings. Furthermore, a 35SLOX6GFP construct was generated and stably transformed in Arabidopsis thaliana plants. With the selected lines it will be possible to investigate the intracellular localization of LOX6 in the future. Moreover, constructs with the reporter gene GFP and AOS or LOX2 were cloned behind the 35S promoter which can also be used for additional localization and co-localization experiments. To analyse the endogenous localization of LOX6 in the wild type, the cloning of a construct was started to generate a specific antibody in the future. To investigate the different products of LOX6, 35SLOX6 lines and the lox6 mutant were used. Although hydroxy fatty acids and jasmonates are secondary products of LOX6, neither basal nor after different stress treatments elevated levels could be detected in the overexpression lines compared to the wild type. This finding indicates that LOX6 may not be limiting for the production of jasmonates and hydroxy fatty acids in the wild type. Moreover, to investigate if the substrate of LOX6 could be a limiting factor, a treatment with α linolenic acid was performed. However, this did not lead to more LOX6 secondary products but rather to a massive increase of non-enzymatic radical triggered oxidation of fatty acids in the 35SLOX6 lines as well as in the wild type. To examine whether an overexpression of LOX6 leads to changes in the metabolom, an untargeted analysis with 35SLOX6 lines was performed. This analysis revealed four metabolites, which were present in different amounts in 35SLOX6 lines and the wild type. Apart from that, the physiology and stress resistance of the 35SLOX6 lines should be investigated for differences compared to the wild type. The overexpression lines exhibited smaller, rounder and paler leaves. In feeding experiments, the roots of 35SLOX6 plants were less attractive to the rough woodlouse Porcellio scaber than the wild type. The insights of this work, together with the generated constructs and plant lines could help to gain a better understanding of the versatile functions and products of LOX6 in the future. KW - Jasmonate KW - Lipoxygenase KW - Oxylipine KW - Samen KW - Arabidopsis thaliana KW - Jasmonate KW - Künstliche Samenalterung KW - Lipoxygenase 6 KW - Oxylipine Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-141647 ER - TY - THES A1 - Öllinger, Rupert T1 - Polymerisationseigenschaften des Synaptonemalkomplexproteins SYCP1 und Charakterisierung von Bindungspartnern : Architektur meiotischer Chromosomen T1 - Polymerization Properties of the Synaptonemal Complex Protein SYCP1 and Characterization of Binding Partners N2 - Das Synaptonemalkomplexprotein SYCP1 ist eine Strukturkomponente des Synaptonemalkomplexes (SC) von Saeugern, einer meiosespezifischen Struktur, die wesentlich fuer die Synapse, Rekombination und Segregation homologer Chromosomen ist. Der SC besteht aus zwei lateralen Elementen (LEs) und einer zentralen Region (CR), in deren Mitte das zentrale Element (CE) liegt. Dabei sind die LEs den Achsen der homologen Chromosomen aufgelagert und werden in der CR durch Transversalfilamente (TFs) mit dem CE verbunden. Im Protein SYCP1 (125 kDa) flankieren zwei nicht-helikale terminale Domaenen eine ausgedehnte zentrale „Coiled-Coil“-Domaene. Fuer diese Domaene wird angenommen, dass sie die die Kluft zwischen LEs und CE ueberbrueckt, wobei die C-Termini in den LEs verankert sind und die N-Termini im CE lokalisiert wurden. Um die molekulare Architektur des SC besser zu verstehen und die Bedeutung von SYCP1 für die Zusammenlagerung des SC aufzudecken, wurden die Polymerisationseigenschaften von SYCP1 erforscht. Dazu wurde das Protein in somatischen Zellen exprimiert. In diesem experimentellem Ansatz polymerisierte SYCP1 autonom zu filamentoesen Strukturen, welche sich auf ultrastruktureller Ebene als alternierende elektronendichte Balken offenbarten, die ueber TFs verbunden waren. Dieser Aufbau glich parallel aneinander gereihten Stapeln von SCs, so genannten Polykomplexen (PCs). Die Analyse der Orientierung der SYCP1 Molekuele innerhalb der PCs erwies, dass diese hochorganisiert vorliegen und die Organisation von SYCP1 innerhalb von PCs und SCs identisch ist. Folglich kann sich SYCP1 sogar in Abwesenheit anderer SC-Proteine zu Strukturen zusammenlagern, die der CR entsprechen und muss dementsprechend beim Aufbau der CR des SC den grundlegenden Faktor darstellen. Für eine genauere Analyse wurden ausgewaehlte Mutanten von SYCP1 exprimiert. Moleküle mit modifizierter Laenge der zentralen alpha-helikalen Domaene resultierten in der Bildung von PCs mit veränderter Weite der CR. Dies beweist, dass die „Coiled-Coil“-Domaene den Abstand der CR eines PC bestimmt und impliziert dieselbe Funktion in der SC-Bildung. Darueber hinaus wurde gezeigt, dass SYCP1 Molekuele mit Deletion des nicht-helikalen N-Terminus immer noch in der Lage sind, PCs zu bilden, diese Eigenschaft aber stark eingeschraenkt ist. Das bezeugt die Bedeutung des N-Terminus sowohl in der PC-Bildung als auch im Aufbau des CE von SCs, weist aber dabei auch dem vorderen Teil der „Coiled-Coil“-Domaene eine wichtige Rolle zu. Im Gegensatz dazu war bei Mutanten mit Deletion des nicht-helikalen C-Terminus die PC-Bildung vollstaendig blockiert, was auf eine große Bedeutung dieser Domaene fuer die Polymerisation hinweist. Ein weiterer Hauptgegenstand der Arbeit war die Charakterisierung von Bindungspartnern von SYCP1. Über Immungoldlokalisation auf Maushoden konnten die Proteine Syce1 und Cesc1 als erste ausschliessliche Komponenten des CE des SC bestimmt werden. Zusaetzlich wurde die Interaktion dieser Proteine mit dem N-Terminus von SYCP1 verifiziert. SYCP1 bildet also die Grundstruktur des CE aus und rekrutiert Syce1 und Cesc1. N2 - The synaptonemal complex protein 1 (SYCP1) is a structural component of the mammalian synaptonemal complex (SC), a meiosis-specific nuclear structure essential for synapsis, recombination and segregation of homologous chromosomes. The SC is a tripartite structure consisting of two lateral elements (LEs) and the central region (CR) with a central element (CE) in its middle. The LEs are attached to the axes of homologous chromosomes and are connected with the CE by transversal filaments (TFs). The protein SYCP1 (125 kDa) contains a long central á-helical domain, which is predicted to mediate dimerization in a parallel coiled-coil structure, flanked by two non-helical ends. The coiled-coil is thought to cross the gap between the LEs and the CE, the C-termini are anchored in the LEs and the N-termini have been localized to the CE. In order to better understand the molecular architecture of the SC and the role of SYCP1 in SC-assembly the polymerization properties of SYCP1 were investigated. To this end the protein was expressed in somatic cells. In this approach SYCP1 is able to form stable filamentous structures autonomously, which on the ultrastructural level represent alternating lines connected by TFs. This composition resembles multimeric SC-like complexes arranged in parallel, so called polycomplexes (PCs). By determining the orientation of SYCP1 molecules it was proven that PCs are highly ordered structures with the same arrangement of SYCP1 molecules as in SCs. These results demonstrate that SYCP1 is able to assemble into structures closely resembling the CR of SCs even in the absence of other SC-proteins, which signifies that SYCP1 is the primary determinant of SC assembly which in turn plays a key role in synapsis of homologous chromosomes. For a more detailed analysis, selected mutated constructs of SYCP1 were expressed. Mutations that modified the length of the central alpha-helical domain resulted in the formation of PCs consisting of repeat units of altered width, verifying that the coiled-coil domain determines the distance between the lines of the PC. This result implies the same function of this domain in SC assembly. Moreover, it was observed that SYCP1 molecules lacking the non-helical N-terminus are still able to form PCs, albeit at a strongly reduced level. This shows the importance of the N-terminus both in SYCP1 autoassembly and in the formation of the CE of SCs, but also implies a significant role of the N-terminal part of the coiled-coil domain. In contrast, when the non-helical C-terminus was deleted, filament formation was eliminated indicating a major role of the C-terminus in SYCP1 autoassembly. Another major topic of this work was the characterization of SYCP1 binding partners. By immunogold localization on mouse testis the proteins Syce1 and Cesc1 could be identified as the first exclusive components of the CE of SCs. Furthermore, the interaction of these proteins with the N-terminal region of SYCP1 was validated. Hence, SYCP1 forms the basic structure of the CE and recruits Syce1 and Cesc1. KW - Synaptinemal-Komplex KW - Coiled coil KW - Skleroproteine KW - Synaptonemalkomplex KW - Meiose KW - Keimzellentwicklung KW - Sturkturprotein KW - Coiled-Coile KW - synaptonemal complex KW - meiosis KW - germ cell development KW - structural protein KW - coiled-coil Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15456 ER - TY - THES A1 - Öchsner, Andreas T1 - Synthese, Struktur und Reaktivität von [2]Borametallocenophanen der Gruppe 4 Metalle : Ihr katalytisches Verhalten und die Eigenschaften der erhaltenen Polymere T1 - Synthesis, structure and reactivity of [2]borametallocenophanes of group 4 metals : Their catalytic behaviour and properties of the obtained polymers N2 - In der vorliegenden Arbeit wird die Darstellung einer Reihe monoarylsubstituierter Bisdimethylamino-1-bromo-2-arlydiborane(4) beschrieben. Sowohl die Umsetzung der monoarylsubstituierten Ligandenvorstufen mit einem weiteren Äquivalent Lithium- oder Natriumaryl in einem Ether/Toluol-Gemisch als auch die Umsetzung von 1,2-Dibrom-bis(dimethylamino)diboran(4) mit einem mehrfachen Überschuss Lithium- oder Natriumaryl führte zur Bildung von diarylsubstituierten Diboranen(4). Umsetzung der Ligandenvorstufen mit Lithiumorganylen, wie beispielsweise Li[CH3] oder Li[C4H9] führt zu doppelt deprotonierten Verbindungen. Werden die dilithiierten Verbindungen mit Metallhalogeniden der Gruppe 4 in einem Toluol/Ether-Gemisch umgesetzt, können [2]Borametallocenophane erhalten werden. Von einigen der Verbindungen konnte die Struktur im Festkörper mittels Einkristallstrukturanalyse bestimmt werden. Die Verbindungen zeigen in Lösung ein dynamisches Gleichgewicht, welches durch die Flexibilität der B-B-Brücke ermöglicht wird. Dieses konnte mittels NMR Spektroskopie untersucht werden. Auch die Reaktivität der Verbindungen wurde erforscht. Versuche zur oxidativen Addition von Platin(0) in die B-B-Bindung, wie sie bereits für ähnliche Systeme beschrieben waren, scheiterten. Ebenfalls nicht erfolgreich war der versuchte Austausch der Dimethylaminogruppen an den Bor-Atomen. Di(fluorenyl)substituierte [2]Borametallocenophane zeigen in der Reihe der dargestellten Verbindungen ein einzigartiges Verhalten. Wird die dilithiierte Liganden-Vorstufe bei der Umsetzung mit den Metallhalogeniden der Gruppe 4 Licht ausgesetzt, so lagert sie zum 1,3-Diboretan um. Auch oxidativ kann diese Umlagerung ausgelöst werden. Das Umlagerungsprodukt war von anderen Reaktionen bereits bekannt, konnte im Rahmen dieser Arbeit aber erstmals strukturell charakterisiert werden. Die Dichloroverbindungen der [2]Borametallocenophane können mittels Li[CH3] in die entsprechenden Dimethylkomplexe überführt werden. Damit besteht die Möglichkeit, die Verbindungen nicht nur mit MAO, sondern auch mit alternativen Co-Katalysatoren, wie beispielsweise Tris-(pentafluorphenyl)boran für die Olefinpolymerisation zu aktivieren. Die Aktivierung mittels MAO wurde sowohl mittels NMR- als auch mittels UV/Vis-Spektroskopie bei verschiedenen [Al]/[Zr] Verhältnissen untersucht. Neben den [2]Borametallocenonphanen konnte mit Verbindung [(n5-C29H37)2ZrCl2] das erste Metallocen mit dem neuen OctafluH-Liganden und zwei koordinierenden Arylgruppen dargestellt werden. Um die Polymerisationseigenschaften der Verbindungen zu untersuchen, wurde ein neuer Versuchsaufbau entworfen. Zur Überwachung der Polymerisationen wurde ein Programm entwickelt, was in der Lage war, verbrauchte Gasmenge und Temperatur im Reaktoraufzuzeichnen. Hier wurden die katalytischen Eigenschaften einer Serie von [2]Borametallocenophanen und des dargestellten Metallocens [(n5-C29H37)2ZrCl2] in der Ethen-Homopolymerisation untersucht. Diese Polymere wurden mittels DSC auf ihre thermischen Eigenschaften hin geprüft. Ausgewählte Polymere wurden in Zusammenarbeit mit der LyondellBasell Industries, Basell Polyolefine GmbH, Frankfurt mittels GPC auf ihr mittleres Molekulargewicht und dessen Verteilung hin untersucht. Alle Daten wurden mit denen von industriell verwendeten Katalysatoren und den von Kraft bekannten [1]Borametallocenophanen verglichen. In weiteren Untersuchungen wurde überprüft, in wie weit die Polymerisationsbedingungen, wie beispielsweise das [Al]/[Zr]-Verhältnis, die Temperatur oder der Druck Auswirkungen auf die Eigenschaften des Polymers haben. Eine Reihe von Komplexen wurde überdies in der Ethen/[1]Hexen-Copolymerisation untersucht. Die erhaltenen Copolymere wurden mittels DSC-, GPC-, IR- und NMR- Spektroskopie analysiert. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass eine Reihe neuer Verbindungen dargestellt und charakterisiert werden konnte, wobei insbesondere der neuartige Ligand OctafluH (C29H38) eingesetzt wurde. Die dargestellten [2]Borametallocenophane sind aktive Katalysatoren in der Ziegler-Natta ähnlichen Olefinpolymerisation. Die dargestellten Polymere wurden mittels verschiedener Methoden untersucht. Es zeigte sich, dass [2]Borametallocenophane langkettige Polyolefine und Ethen/1-Hexen Copolymere liefern können. N2 - Based on Krafts work on [1]borametallocenophanes, a various number of monoarylsubstituted bisdimethylamino-1-bromo-2-aryldiboranes(4) were synthesized in the present work. Either the reaction of these monoarylsubstituted compounds with one equivalent of a lithiumaryl in toluene/ether or direct reaction of 1,2-dibromo-bis(dimethylamino)diborane(4) with a large excess of the lithiumaryl leads to the formation of diaryl substituted diboranes(4). Reaction of the ligand precursors with lithium organyls, e.g. Li[CH3] or Li[C4H9] leads to double deprotonation. [2]Borametallocenophanes are accessible via reaction of the dilithiated species with metal halides of Group 4 in toluene/ether. Due to the flexibility of the B-B-bridge, these complexes show dynamic behaviour in solution, which can be monitored by NMR spectroscopy. The solid state structure of some of these complexes could be examined by X-Ray diffraction. The reactivity of the new [2]borametallocenophanes also was reviewed. An oxidative addition reaction of platinum(0) was published for similar systems, but failed in this case. Neither was it possible to substitute the bisdimethylamino-groups bound to the boron-atoms. The prepared di(fluorenyl)substituted [2]borametallocenophanes show a unique feature. If the dilithiated precursor is exposed to visible or UV light during reaction with metal halides of group 4, these complexes rearrange to the 1,3-diboretane. This rearrangement also can be performed oxidatively. The Compound has been previously characterized in solution by multinuclear NMR spectroscopy; its structure in the solid state is now reported for the first time. The [2]borametallocenophanedichlorides can be reacted with Li[CH3], resulting in the corresponding dimethyl complexes. This allows for an alternative activation of the complexes with co-catalysts like tris(pentafluorophenyl)borane, in addition to the common activation with MAO. A model reaction for this alternative activation was performed using K[B(C6F5)4] to obtain a ion pair via chlorine abstraction. The common activation of the metal complexes using MAO was monitored either by NMR- or by UV/Vis-spectroscopy at various [Al]/[Zr] ratios. In addition to the [2]borametallocenophanes, [(n5-C29H37)2ZrCl2] could be prepared. It is the first metallocene with two aryl groups of the new octafluH-ligand (C29H38). To analyse the activity of the compounds in olefin polymerization processes, a new experimental set-up was designed. To control the polymerisation reactions, a Software program was developed, which allowed us to record gas-consumption and temperature in the reactor simultaneously. The catalytic behaviour of a whole series of [2]borametallocenophanes and of compound [(η5-C29H37)2ZrCl2] was studied in ethene homopolymerization. The thermal properties of all produced polymers where analyzed by DSC. The molecular weight distribution of selected examples was studied in cooperation with LyondellBasell Industries, Basell Polyolefine GmbH with GPC analyses. All data where directly compared to reference catalysts and to the [1]borametallocenophanes made by Kraft. The data show, that [2]borametallocenophanes have lower activities than [1]borametallocenophanes, but produce polymers of significantly higher average molecular weight. One can see clear differences throughout the data of the DSC measurements, for instance in the melting point and metling range, or crystallinity of the polymer. The melting points of the polymers obtained from [2]borametallocenophanes and compound [(n5-C29H37)2ZrCl2] are significantly higher than those of the reference catalysts. Additional experiments gave some insight into the relationship between polymerization conditions, e.g. the [Al]/[Zr] ratio, temperature or pressure and the key features of the polymers. It was shown that all these parameters influence the melting point and other specific values of the polymer. Additionally, selected examples were tested in the ethene/1-hexene copolymerization. The copolymers have been analyzed using DSC, GPC, IR and NMR spectroscopy. In conclusion, some new products were prepared and analyzed, in many cases with OctafluH (C29H38) as a substituent. All [2]borametallocenophanes are active catalysts in Ziegler-Natta type olefin polymerization processes. Analyses of the produced polymers revealed that [2]borametallocenophanes can produce long-chain polyethylene and ethene/1-hexene copolymers. KW - Anorganische Chemie KW - Homogene Katalyse KW - Ziegler-Natta-Katalysator KW - Metallocene KW - Bor KW - Polyolefine KW - Metallocenophane KW - metallocenophanes Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-44444 ER - TY - THES A1 - Zürn, Christina Anika T1 - Charakterisierung des Mitochondrialen Tumorsuppressor-Gens 1 (MTUS1) anhand von In-vitro-Untersuchungen und Etablierung eines Knockout-Maus-Modells T1 - Characterisation of the Mitochondrial Tumor Suppressor Gene 1 (MTUS1) using in vitro investigations and generation of a knock out mouse N2 - Das kürzlich publizierte MTUS1-Gen zeigt Eigenschaften eines Tumorsuppressor-Gens. So liegt die MTUS1-Expression in verschiedenen Tumorzelllinien vermindert vor und bei rekombinanter Expression in der schnell wachsenden Pankreaskarzinomzelllinie MiaPaCa-2 konnte die Proliferation signifikant reduziert werden. Darüber hinaus interagiert MTUS1 mit dem AT2-Rezeptor und scheint durch die Inhibierung des RTK-Signalwegs die Zellproliferation zu regulieren. Nach den Untersuchungen der MiaPaCa-2-Zelllinie konnte eine Mutation in der Exonsequenz und der vorhergesagten Promotorregion als Ursache der niedrigen MTUS1-Expression ausgeschlossen werden. Die Analyse des Promotorbereichs hinsichtlich des Methylierungsmusters der CpG- und CpNpG-Inseln brachte deutliche Methylierungsunterschiede in den CpNpG-Inseln der MiaPaCa-2-Zellen gegenüber HUVEC-Zellen zu Tage. Die anschließende Untersuchung der vorhergesagten Promotorregion mit Hilfe eines Promotor-Assays brachte die Gewissheit, dass es sich bei der untersuchten Sequenz um einen Transkription regulierenden Genabschnitt handelt. Durch die Transfektion von HUVEC-Zellen mit MTUS1-siRNA konnten nachweislich Zellen mit einem funktionellen MTUS1-Knockout hergestellt werden. Diese Zellen zeigten mit der verminderten MTUS1-Expression ein signifikant erhöhtes Wachstum. Die Ergebnisse der Zellversuche legen die Vermutung nahe, dass MTUS1 deshalb als Tumorsuppressor-Gen agieren kann, weil es die Zellproliferation reguliert und so der funktionelle MTUS1-Knockout mit einem erhöhten Zellwachstum einhergeht. Als Mechanismus der Geninaktivierung kommt die Hypomethylierung der vorhergesagten Promotorsequenz in Frage. Die Untersuchung der Colontumorgewebe und Normalgewebe von zehn Patienten mit Colonkarzinom zeigte eine deutliche Reduktion der MTUS1-Protein-Expression in 50% der Tumorgewebe. Bei diesen Patienten konnte ebenfalls eine signifikant reduzierte mRNA-Expression nachgewiesen werden. Wie bereits bei den MiaPaCa-2-Zellen nachgewiesen, zeigte sich eine Hypomethylierung der CpNpG-Inseln in den Geweben mit geringer MTUS1-Expression. Diese veränderte Methylierung könnte die Erklärung für die verminderte Transkription des MTUS1-Gens sein. Mit dem MTUS1-Knockout-Maus-Modell wurde die Grundlage für das bessere Verständnis der Funktion von MTUS1 in vivo geschaffen. Nach erfolgreicher Blastozysteninjektion und Zucht der homozygoten Knockout-Mäuse, konnte auf DNA-, mRNA- und Protein-Ebene die geglückte Ausschaltung des MTUS1-Gens bestätigt werden. Bei der Langzeituntersuchung der Tiere zeigten sich vor allem Abweichungen im Blutbild, wonach die homozygoten und heterozygoten Tiere auffallend hohe Werte an Leukozyten und Lymphozyten aufwiesen. Durch die pathologische Untersuchung konnte eine extramedulläre Hämatopoese und lymphatische Infiltrate in verschiedenen Organen nachgewiesen werden und gaben Hinweise auf eine Bluterkrankung. Nach diesen pathologischen Ergebnissen zeigten 23% der homozygoten und 17% der heterozygoten Tiere Symptome eines B-Zell-Lymphoms. Bei den Wildtyp-Tieren konnten keine pathologischen Auffälligkeiten gezeigt werden. Fast ein Viertel der homozygoten Mäuse wiesen eine Herzhypertrophie auf, oft einhergehend mit einer chronischen Glomerulonephritis und einer Atelektase der Lunge. Eine denkbare Erklärung für die blutdruckunabhängige Entstehung der Herzhypertrophie wäre eine Beeinflussung von Wachstumsfaktoren, da bereits nachgewiesen wurde, dass eine durch MTUS1 vermittelte Inhibierung von Insulin-, bFGF- und EGF-gesteuerten Signalkaskaden eine Inaktivierung von ERK2 zur Folge hatte. Mit Hilfe einer X-Gal-Färbung von verschiedenen Organen einer Wildtyp-, heterozygoten und homozygoten Maus konnten Erkenntnisse über die Genaktivität von MTUS1 in den verschiedenen Organen gewonnen werden. Zusammenfassend lässt sich von einer hohen MTUS1-Expression in den meisten Epithelzellen und Endothelzellen sprechen, außerdem weisen die Kardiomyozyten im Herz und die Purkinjefasern im Gehirn eine hohe Expression auf. Bei der Untersuchung von homozygoten und Wildtyp-Bauchhautfibroblasten wurde schließlich eine geringere Zellgröße der homozygoten Fibroblasten festgestellt. Mit der X-Gal-Färbung konnte nachgewiesen werden, dass das MTUS1-Protein vorwiegend in der Nähe des Zellkerns lokalisiert ist. Eine der untersuchten homozygoten Fibroblastenlinien zeigte gegenüber den anderen Fibroblasten eine deutlich erhöhte Proliferation. Das könnte ein Hinweis auf eine antiproliferative Wirkung von MTUS1 und eine Erklärung für die kleinere Zellgröße der homozygoten Fibroblasten sein. Als Zusammenfassung aller hier gezeigten Ergebnisse konnte die Hypothese untermauert werden, dass es sich bei MTUS1 um ein Tumorsuppressor-Gen handelt, das seine antiproliferativen Eigenschaften wahrscheinlich in Kooperation mit dem AT2-Rezeptor durch die Inhibierung des RTK-Signalwegs vermittelt. N2 - The recently published MTUS1 gene exhibits characteristics of a tumor suppressor gene. Thus the MTUS1 expression is decreased in different tumor cell lines and the recombinant expression of MTUS1 could reduce the proliferation in the fast growing pancreatic tumor cell line MiaPaCa-2. Beyond that, MTUS1 interacts with the AT2 receptor and seems to regulate the cell proliferation by the inhibition of the RTK signaling pathway. After the investigations of the MiaPaCa-2 cell line, a mutation in the exon sequence or the predicted promoter region could be excluded as a cause of the low MTUS1 expression. The analysis of the promoter range regarding the methylation pattern of the CpG and CpNpG islands did not reveal differences in the methylation of the CpG islands, but clear discrepancies in the CpNpG islands of the MiaPaCa-2 cells in contrast to the HUVEC cells. The subsequent investigation of the predicted promoter sequence with a promoter assay approved the hypothesis that the examined sequence has properties for the regulation of gene transcription. HUVEC cells with a functional MTUS1 knockout could be obtained by the transfection with MTUS1 siRNA. The experiment with these cells exhibited that cells without MTUS1 expression can proliferate significantly faster. The assumption that MTUS1 could act like a tumor suppressor gene by affecting the regulation of the cell proliferation is thereby confirmed. The investigation of the tumor tissue and normal tissue of ten patients with colorectal carcinoma revealed a clear reduction of the MTUS1 protein expression in 50% of the tumor tissues. In these tissues a significantly reduced MTUS1 mRNA expression could also be proven. The methylation pattern of the CpG islands showed no differences between tumor and normal tissue, but there was a hypomethylation of the CpNpG islands in the tissue with less MTUS1 Expression. This methylation pattern could be the explanation for the decreased transcription of the MTUS1 gene. With the MTUS1 knockout mouse model the basis for a better understanding of the MTUS1 function in vivo has been created. After successful injection of stem cells into blastocysts and breeding of the homozygote knockout mice, the elimination of the MTUS1 gene could be proven on DNA, mRNA and protein level. The long-term investigation showed discrepancies in the haemogram of the wildtype, heterozygote and homozygote mice. The homozygote and heterozygote animals had remarkably high values of leukocytes and lymphocytes, while the values of the erythrocytes and the thrombocytes decreased. The pathological investigation could detect extramedullary haematopoiesis in spleen, lymph node and kidneys of the heterozygote and homozygote mice, in addition lymphocytic infiltrates in spleen, kidneys, lung, liver, lymph node and salivary gland were discovered, probably referring to a blood illness. To these pathological results 23% of the homozygote and 17% of the heterozygote animals showed symptoms of a B-cell-lymphoma. The wildtype animals showed no abnormality regarding the extramedullary haematopoiesis or the lymphocytic infiltration in organs. Nearly a quarter of the homozygote mice exhibited a hypertrophy of the heart, often accompanied with a chronic glomerulonephritis and an atelectasis of the lung. The interaction with growth factors could be an explanation for the blood pressure independent hypertrophy because MTUS1 can inhibit the insulin, bFGF and EGF signaling cascades. With the help of the X-gal staining of different organs from wildtype, heterozygote and homozygote mice, informations about the MTUS1 activity could be gathered. In summary MTUS1 showed a high expression in epithelial and endothelial cells, in the cardiomyocytes in the heart and the pukinje cells in the brain. During the analysis of the homozygote and wildtype fibroblasts a smaller height of the homozygote fibroblasts was determined. With the X-gal staining it could be proven that the MTUS1 protein is located predominantly in the perinuclear region. One of the examined homozygote fibroblast lines showed a significant higher proliferation rate in comparison to the wildtype and two other homozygote fibroblast lines. This could be again a reference of the antiproliferative effect of MTUS1 and an explanation for the smaller cell height of the homozygote fibroblasts. The summary of all results supports the hypothesis that MTUS1 has characteristics of a tumor suppressor gene. For the antiproliferative effect MTUS1 seems to cooperate with the AT2 receptor to inhibit the RTK signaling pathway. KW - Tumorsuppressor-Gen KW - Mitochondrium KW - Knockout KW - MTUS1 KW - Tumorsuppressor-Gen KW - MTUS1 KW - tumor suppressor gene Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18951 ER - TY - THES A1 - Zürn, Alexander T1 - Spezifische Markierungsverfahren von Rezeptoren mit kleinen Fluorophoren zur Analyse der Rezeptoraktivierung mittels FRET T1 - Specific labelling techniques with small fluorophores for visualzing ligandselective conformations on receptors with FRET N2 - Es gibt viele Hinweise, dass G-Protein-gekoppelte Rezeptoren bei ihrer Aktivierung durch einen Agonisten ligandenselektive Konformationen eingehen. Ein tatsächlichen Beleg hierfür konnte bisher in lebenden Zellen noch nicht erbracht werden. Zu diesem Zweck wurde in dieser Arbeit ein Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)-basierter Ansatz gewählt, um ligandenselektive Konformationen in der dritten intrazellulären Schleife des α2a-adrenergen Rezeptors (α2a-AR) in lebenden Zellen darzustellen. Dazu wurden Rezeptorsensoren erstellt, welche jeweils ein CFP am Ende des C-Terminus trugen und in der dritten intrazellulären Schleife an verschiedenen Stellen mit einem Tetracysteinmotiv versehen wurden. Drei Konstrukte wurden verglichen, die das Tetracysteinmotiv N-terminal in der Nähe der Transmembrandomäne V (I3-N), in der Mitte der dritten intrazellulären Schleife (I3-M) beziehungsweise C-terminal in der Nähe der Transmembrandomäne VI (I3-C) trugen. Die drei Rezeptorsensoren unterschieden sich hinsichtlich ihrer Ligandenbindung sowie ihrer G-Proteinaktivierung nicht vom Wildtyp α2a-AR. Durch das Tetracysteinmotiv ist es möglich, den Rezeptor spezifisch mit dem niedermolekularen Fluorophor FlAsH (fluorescein arsenical hairpin binder) zu markieren, welcher als Akzeptor für den Donor CFP in FRET-Experimenten dient. Die Änderung des FRET-Signals zwischen den beiden Fluorophoren, das durch den vollen Agonist Norepinephrin ausgelöst wurde, war bei allen drei Rezeptorsensoren vergleichbar. Der starke partielle Agonist Clonidin war ebenfalls in der Lage, in allen drei Konstrukten ein ähnliches FRET-Signal hervorzurufen. Dagegen zeigte der partielle Agonist Dopamin an dem Konstrukt I3-N ein signifikant schwächeres Signal, als an I3-C. Die schwachen partiellen Agonisten Octopamin und Norphenephrin konnten an den Konstrukten I3-N und I3-M keine Änderung des FRET-Signals bewirken, wobei an I3-C eine deutliche Signaländerung detektiert wurde. Dies legt nahe, dass die Transmembrandomäne V bei der Aktivierung des Rezeptors eine kleinere Bewegung eingeht als die Transmembrandomäne VI, und bestätigt damit ein auf Röntgenstrukturanlysen basierendes Modell der Rezeptorbewegung. Außerdem wurden die Aktivierungskinetiken für die Agonisten Norepinephrin und Dopamin verglichen. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die durch Norepinephrin ausgelöste Bewegung an allen beobachteten Punkten gleich schnell war. Im Gegensatz dazu aktivierte Dopamin I3-C und I3-M ca. 1,5-mal langsamer, als Norepinephrin. Für das I3-N Konstrukt wurde sogar eine 3-mal langsamere Aktivierung gemessen. Diese Daten zeigen, dass unterschiedliche Agonisten in der dritten intrazellulären Schleife spezifische Konformationen auslösen können. Die Untersuchungen zur Rezeptorbewegung im ersten Teil dieser Arbeit wurde mit dem kleinen Fluorophor FlAsH in Kombination mit einer großen GFP-Variante durchgeführt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, bei der es möglich ist Proteine spezifisch mit beiden kleinen Fluorophoren FlAsH und ReAsH in einer lebenden Zelle zu markieren. Hierfür wurden zwei Tetracysteinmotive, CCPGCC und FLNCCPGCCMEP, gewählt, an die beide kleine Fluorophore kovalent binden. Durch Verdrängungsexperimente mit BAL konnte gezeigt werden, dass FlAsH für beide Motive eine dreifach höhere Affinität besitzt, als ReAsH. Dabei besitzt das FLNCCPGCCMEP-Motiv jedoch eine dreifach höhere Affinität zu dem jeweiligen Fluorophor besitzt als CCPGCC. Durch Ausnutzung dieser Affinitätsunterschiede konnte ein Protokoll entwickelt werden, mit dem es möglich ist, beide Motive in einer Zelle zu markieren. Dabei werden zunächst beide Motive mit ReAsH markiert. Durch anschließendes Waschen mit einer geeigneten Konzentration von BAL wird das ReAsH ausschließlich von der CCPGCC-Sequenz verdrängt, wohingegen die FLNCCPGCCMEP-Sequenz mit ReAsH markiert bleibt. Die nun unbesetzte CCPGCC-Sequenz kann dann anschließend mit FlAsH markiert werden, ohne dabei die Bindung des ReAsH an die FLNCCPGCCMEP-Sequenz zu beeinflussen. Um die Funktionalität dieses Protokolls zu überprüfen, sollten zwei verschiedene Proteine mit unterschiedlicher subzellulärer Lokalisation in einer lebenden Zelle spezifisch mit jeweils einem kleinen Fluorophor markiert werden. Hierzu wurden ein PTH-Rezeptor, in dem im C-Terminus die FLNCCPGCCMEP-Sequenz eingebracht wurde, mit ReAsH und ein β-Arrestin-2, dem die CCPGCC-Sequenz eingebracht wurde, in Zellen co-exprimiert und gemäß dem Protokoll mit FlAsH und ReAsH markiert. Beide Proteine konnten spezifisch markiert werden, wobei der mit ReAsH markierte PTH-Rezeptor eine deutliche Lokalisation in der Zellmembran zeigte. Durch sequentielle Exzitation konnte in der gleichen Zelle das zytosolisch lokalisierte, mit FlAsH markierte β-Arrestin-2 detektiert werden. Wurden die so markierten Zellen mir 1 µM PTH stimuliert, wurde das FlAsH-markierte β-Arrestin-2 an die Zellmembran rekrutiert. Somit konnte durch die Entwicklung dieses Protokolls eine duale spezifische Markierung von Proteinen mit zwei kleinen Fluorophoren zu innerhalb einer Zelle erreicht werden. N2 - Several lines of evidence suggest that G-protein-coupled receptors can adopt different active conformations, but their direct demonstration in intact cells is still missing. Using a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based approach we studied conformational changes in 2A-adrenergic receptors (2A-AR) in intact cells. The receptors were C-terminally labeled with cyan fluorescent protein (CFP) and with fluorescein arsenical hairpin binder (FlAsH) bound at a tetracysteine-motif at different sites in the third intracellular loop: N-terminally close to transmembrane domain V (I3-N), in the middle of the loop (I3-M), or C-terminally close to transmembrane domain VI (I3-C). All constructs retained normal ligand binding and signaling properties compared to the wildtype-2A-AR. Changes in FRET between the labels were determined in intact cells in response to different agonists. The full agonist norepinephrine evoked similar FRET-changes for all three constructs. The strong partial agonist clonidine induced partial FRET-changes for all constructs. The partial agonist dopamine envoked a significantly weaker FRET-signal in I3-N than in I3-C. However, the weak partial agonists octopamine and norphenephrine only induced detectable changes in the construct I3-C, but no change in I3-M and I3-N. This agrees with X-ray receptor structures indicating larger agonist-induced movements at the cytoplasmic ends of transmembrane domain VI than V and suggests that partial agonism is linked to distinct conformational changes within a G-protein-coupled receptor. The kinetics of the receptor activation was compared between dopamine and norepinephrine. The kinetics for norepinephrine were similar for all three constructs. Dopamine-induced FRET-signals were ≈1.5-fold slower than those for norepinephrine in I3-C and I3-M, but >3-fold slower in I3-N. Our data indicate that the different ligands induced conformational changes in the receptor that were sensed differently in different positions of the third intracellular loop. Specific labeling of proteins in living cells with two different molecular probes would be an important further development for multiparameter imaging of cellular functions. Here we report a strategy to selectively label two different proteins in living cells with two different fluorophores, FlAsH and ReAsH. Recently improved tetracysteine binding motifs have been described to selectively bind FlAsH or ReAsH. We compared the six amino acid motif CCPGCC and the twelve amino acid motif FLNCCPGCCMEP with respect to their affinity for FlAsH and ReAsH. For both fluorophores, we observed a 3-fold higher affinity for the FLNCCPGCCMEP motif compared to CCPGCC, when washed off with BAL (british anit lewisite; 2,3-Dimercaptopropanol). For both target sequences, FlAsH showed more stable interactions than ReAsH. Based on these observations, we developed a protocol to demonstrate selective labeling of different proteins in the same cell. We used two target proteins that are localized in different cellular compartments. As model proteins we chose a plasmamembrane localized G protein-coupled receptor for PTH (PTH-receptor) which was C-terminally modified with the FLNCCPGCCMEP motif for labeling with ReAsH, and the cytosolic -arrestin-2 protein which was C-terminally modified with the CCPGCC motif for labeling with FlAsH. Both proteins were specifically labelled with the respective Fluorophores and -arrestin-2 will translocate to the plasmamembrane upon agonist stimulation of the PTH receptor. Taken together our data demonstrate that FlAsH and ReAsH can be used for orthogonal labeling to different binding motifs fused to different target proteins in living cells. KW - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer KW - Fluoreszenz KW - Fluoreszenz KW - Wirkstoff-Rezeptor-Bindung KW - GPCR KW - Konformationsänderung KW - ligandenselektive Konformationen KW - Mikroskopie KW - FlAsH KW - ReAsH KW - Tetracystein-Motivee KW - GPCR KW - lignaselective conformations KW - FlAsH KW - ReAsH KW - Tetracystein-Motive Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-35961 ER - TY - THES A1 - Zürl, Julian Klaus T1 - Die Rolle der Calcium-Calmodulinkinase II\(_δ\) bei der Desfluran-induzierten Kardioprotektion gegen den Ischämie/Reperfusionsschaden T1 - Role of Calcium-Calmodulinkinase II\(_δ\) in cardioprotection against the ischemia/reperfusion injury N2 - Anästhetika-induzierte Präkonditionierung (APC) mit Desfluran vermittelt einen endogenen Schutzmechanismus gegen den Ischämie/Reperfusionsschaden im Tiermodell mit männlichen C57BL/6 Mäusen. Die Calcium-Calmodulinkinase IIδ (CamKIIδ) spielt eine zentrale Rolle im intrazellulären Calciumhaushalt und beim Ischämie/Reperfusionsschaden. Ein Ergebnis dieser Studie zeigt, dass eine Desfluran-vermittelte Reduktion der Herzinfarktgröße in Wildtyptieren, nicht aber in Mäusen mit homozygotem genetischen Knock-Out (KO) der CaMKIIδ stattfindet. Weiterhin wird gezeigt, dass der CaMKIIδ KO die Expression von Phospholamban (PLB) und die Phosphorylierung von PLB an der Aminosäurestelle Serin 16 im Vergleich zum Wildtyp mehr als verdoppelt, ermittelt via Western-Immunoblotting. Darüber hinaus wird gezeigt, dass die Expression des β1 –Adrenorezeptors (AR) in Tieren mit homo- und heterozygotem CaMKIIδ KO im Vergleich zum Wildtyp signifikant erhöht ist. APC mit Desfluran hebt diese erhöhte β1 –AR Konzentrationen im homozygoten, aber nicht im heterozygoten KO auf. Dies zeigt, dass sich die β1 –AR Expression entsprechend der CaMKIIδ Verfügbarkeit adaptiert, dieser Effekt aber durch APC unterbunden werden kann. N2 - Anesthetic-induced preconditioning (APC) with desfluran mediates an endogenous protection against the ischemia/reperfusion injury in the animal model with male C57BL/6 mice. The Calcium-Calmodulinkinase IIδ (CamKIIδ) plays a key role in intracellular calcium metabolism and in ischemia/reperfusion injury. A result of the study shows that a reduction of myocardial infarction by desfluran-induced preconditioning is achieved in wildtyp mice, but not in mice with homocygous CaMKIIδ genetic knock-out (KO). Furthermore the expression of phospholamban (PLB) and phosphorylation of PLB at amino acid serine 16 in mice with CaMKIIδ KO is twice the level of wildtype mice measured by western-immunoblotting. Moreover the expression of β1 –adrenoreceptor (AR) is significantly higher in homo- and heterozygous mice than in wildtype mice. APC with desfluran eliminates the higher β1 –AR concentration in homocygous but not in heterocygous KO mice. This means that the β1 –AR expression depends on the CaMKIIδ availibility, this effect is cancelled by APC with desfluran. KW - Myokardprotektion KW - Präkonditionierung KW - Anästhesie KW - Ischämie KW - Ischämie/Reperfusionsschaden KW - Volatile Anästhetika KW - Kardioprotektion KW - Calcium-Calmodulinkinase II Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-185298 ER - TY - THES A1 - Zügner, Sascha T1 - Untersuchungen zum elastisch-plastischen Verhalten von Kristalloberflächen mittels Kraft-Eindringtiefen-Verfahren T1 - Determination of elastic-plastic properties of individual particles using nanoindentation technique N2 - Untersuchungen zum elastisch-plastischen Verhalten von Kristalloberflächen mittels Kraft-Eindringtiefen-Verfahren Die ‘registrierende Härteprüfung‘ nach dem Kraft-Eindringtiefen-Verfahren hat in den letzten Jahren mehr und mehr an Bedeutung gewonnen, um mechanische Materialparameter vor allem dünner Filme und beschichteter Oberflächen im Nanometermaßstab zu messen. Das kontrollierte Eindringen einer Meßspitze in eine Oberfläche mit definierter Kraft bei gleichzeitiger Registrierung der zurückgelegten Wegstrecke ermöglicht die Aufzeichnung sogenannter Kraft-Weg-Kurven. Deren Auswertung liefert quantitative Daten der mechanischen Materialeigenschaften wie Härte (H), Elastizitätsmodul (E), Bruchfestigkeit oder Kriechanteil. Im Laufe eines pharmazeutischen Herstellungsprozesses müssen fast alle eingesetzten Wirk- und Hilfsstoffe zerkleinert werden. Die dabei geforderten Feinheitsgrade lassen sich oft nur durch den Einsatz effizienter Maschinen, wie zum Beispiel der Luftstrahlmühlen erreichen. Dieser energie- und kostenaufwendige Zerkleinerungsprozeß ist bis heute noch nicht vollständig kontrollierbar. Das makroskopische Verhalten von partikulären Schüttgütern, wie etwa deren Bruchfestigkeit, benötigte Bruchkraft oder -energie, wird weitgehend von den elastisch-plastischen Materialeigenschaften mitbestimmt. Demnach sollten Härte und Elastizität einen entscheidenden Einfluß darauf haben, ob und in welchem Ausmaß ein Partikelkollektiv zerkleinert wird. Die Eindruckexperimente wurden an vier verschiedenen, handelsüblichen, kristallinen Schüttgütern durchgeführt (CaCO3, Natriumascorbat, NaCl, Saccharose). Dabei konnte gezeigt werden, daß sich die einzelnen Proben z.T. erheblich in ihren mechanischen Eigenschaften unterscheiden. Alle untersuchten Materialien sind durch ausgeprägtes elastoplastisches Verhalten charakterisiert. Während der elastische Anteil an der Gesamtverformung für Calcit, Natriumascorbat und Saccharose etwa 30% beträgt, zeigt Natriumchlorid nahezu vollständig plastische Deformation. Die elastische Rückfederung in der Entlastungsphase liegt für Kochsalz jeweils unter 10%. Ebenso schwanken die gemessenen Härtewerte der pharmazeutischen Schüttgüter in einem Bereich von 0,4GPa und 3,0GPa. Dabei erweist sich das Calciumcarbonat als härtestes und sehr sprödes Material (H»3,0GPa und E»85GPa). Im Gegensatz dazu ist das Natriumchlorid sehr weich und leicht plastisch verformbar (H»0,5GPa und E»42GPa). Weiterhin kann der bei einer Vielzahl von kristallinen Materialien nachgewiesene ‘indentation size effect’, also die Abhängigkeit der Härte von der Eindruckgröße, bestätigt werden. Bei geringen Eindringtiefen ist die Härte signifikant erhöht, wogegen sie mit zunehmender Indenttiefe auf konstante Werte absinkt. Die Energiezufuhr in Form einer äußeren mechanischen Beanspruchung beeinflußt ebenfalls die Härte. Art und Ausmaß der Beanspruchung spielen dabei die entscheidende Rolle. Partikel, welche in einer Luftstrahlmühle zerkleinert wurden, zeigen im Vergleich zu unbeanspruchten Teilchen signifikant höhere Werte. Der Grund für diesen Härtezuwachs liegt in der Kaltverfestigung des Materials. Die hohe Prallenergie und in deren Folge die Veränderung der partikulären Mikrostruktur führen vor allem bei kleinen, stark beanspruchten Partikeln zu einer gesteigerten Härte. Die elastisch-plastischen Parameter sind eng mit der Kristallstruktur und der Orientierung der Atome im Kristallgitter verknüpft. Jedoch kann eine Anisotropie bezüglich der mechanischen Kennwerte für die kristallinen Materialien nicht bestätigt werden. Eindruckexperimente unter wechselnden Rotationswinkeln ergaben keine statistisch unterscheidbaren Meßwerte. N2 - Determination of elastic-plastic properties of individual particles using nanoindentation technique In the last decade the nanoindentation technique has faced more and more importance to characterise mechanical properties of solid surfaces and surface thin films. By continuously recording the movement of a stylus impressed into the surface under increasing load force-displacement curves can be derived. They provide quantitative data such as hardness (H), young’s modulus of elasticity (E), fracture toughness or creep, important parameters that determine the mechanical behaviour of the material. On the basis of the common theory of comminution it is assumed that the elastic-plastic properties of single crystals may affect the size reduction process of bulk materials during jet milling. Breaking resistance, work of fraction and maximum strain for example are strongly dependent of near-surface parameters like hardness and young’s modulus. Determining these crystal characteristics and comparing them with derived jet mill parameters allows to gain new insight into the size reduction process. Our experiments were performed on naturally grown, crystalline solids, namely calcite, sodium ascorbate, sucrose and sodium chloride. Load-displacement-data as well as the AFM images indicate that all tested pharmaceutical bulk products exhibit distinct elastic-plastic deformation of their stressed areas. While with calcite, ascorbate and sucrose a large amount of elastic recovery (30%) can be observed during final unloading, sodium chloride shows a predominantly plastic and almost no elastic response. Hardness values of the four tested materials cover a wide range from 0.4GPa to 3.0GPa. Calcite proves to be the hardest and most brittle substance with H»3.0GPa and E»85GPa. As a marked contrast the very plastic, ductile sodium chloride shows a much lower plastic hardness of about 0.4-0.6 GPa and elastic moduli of 40-45GPa. Nanohardness varies with indentation depths. At shallow penetration depths of about 30nm single crystals seem to be substantially harder than at larger depths where hardness approximates to constant values. This so called indentation size effect (ISE), previously observed for both metals and ceramics, could also be affirmed for soft, strain-hardenable crystalline solids. External stresses brought into the material e.g. by jet-milling seem to strain harden the surface. The type and extend of an external constraint are supposed to have major influence on the elastic-plastic properties. Particles which had to be ground during the production process exhibit significantly enhanced hardness values afterwards. We dedicate this rise in hardness to work hardening following high impact loads during comminution. Especially small particles have faced higher levels of stress during grinding and therefore they are extensively strain hardened. Calcite crystals are intrinsically anisotropic. Hence one would expect that the hardness varies with respect to indenter rotation. Despite of its rhombohedral structure hardness and modulus anisotropy for CaCO3 could not be observed. In fact the values for H and E measured at indenter rotation angles of 0°, 30°and 45° are identical within the relatively wide limits of experimental uncertainty. KW - Nanostrukturiertes Material KW - Registrierende Härteprüfung KW - Registrierende Härteprüfung KW - Nanohärte KW - elastischer Eindringmodul KW - Nanoindentation KW - elastic-plastic properties KW - hardness KW - young’s modulus Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-3447 ER -