TY - THES A1 - Yang, Tao T1 - Functional insights into the role of a bacterial virulence factor and a host factor in Neisseria gonorrhoeae infection T1 - Funktionelle Einblicke in die Rolle eines bakteriellen Virulenzfaktors und eines Wirtsfaktors bei der Infektion mit Neisseria gonorrhoeae N2 - Neisseria gonorrhoeae (GC) is a human specific pathogenic bacterium. Currently, N. gonorrhoeae developed resistance to virtually all the available antibiotics used for treatment. N. gonorrhoeae starts infection by colonizing the cell surface, followed by invasion of the host cell, intracellular persistence, transcytosis and exit into the subepithelial space. Subepithelial bacteria can reach the bloodstream and disseminate to other tissues causing systemic infections, which leads to serious conditions such as arthritis and pneumonia. A number of studies have well established the host-pathogen interactions during the initial adherence and invasion steps. However, the mechanism of intracellular survival and traversal is poorly understood so far. Hence, identification of novel bacterial virulence factors and host factors involved in the host-pathogen interaction is a crucial step in understanding disease development and uncovering novel therapeutic approaches. Besides, most of the previous studies about N. gonorrhoeae were performed in the conventional cell culture. Although they have provided insights into host-pathogen interactions, much information about the native infection microenvironment, such as cell polarization and barrier function, is still missing. This work focused on determining the function of novel bacterial virulence factor NGFG_01605 and host factor (FLCN) in gonococcal infection. NGFG_01605 was identified by Tn5 transposon library screening. It is a putative U32 protease. Unlike other proteins in this family, it is not secreted and has no ex vivo protease activity. NGFG_01605 knockout decreases gonococcal survival in the epithelial cell. 3D models based on T84 cell was developed for the bacterial transmigration assay. NGFG_01605 knockout does not affect gonococcal transmigration. The novel host factor FLCN was identified by shRNA library screening in search for factors that affected gonococcal adherence and/or internalization. We discovered that FLCN did not affect N. gonorrhoeae adherence and invasion but was essential for bacterial survival. Since programmed cell death is a host defence mechanism against intracellular pathogens, we further explored apoptosis and autophagy upon gonococcal infection and determined that FLCN did not affect apoptosis but inhibited autophagy. Moreover, we found that FLCN inhibited the expression of E-cadherin. Knockdown of E- cadherin decreased the autophagy flux and supported N. gonorrhoeae survival. Both non-polarized and polarized cells are present in the cervix, and additionally, E-cadherin represents different polarization properties on these different cells. Therefore, we established 3-D models to better understand the functions of FLCN. We discovered that FLCN was critical for N. gonorrhoeae survival in the 3-D environment as well, but not through inhibiting autophagy. Furthermore, FLCN inhibits the E-cadherin expression and disturbs its polarization in the 3-D models. Since N. gonorrhoeae can cross the epithelial cell barriers through both cell-cell junctions and transcellular migration, we further explored the roles FLCN and E-cadherin played in transmigration. FLCN delayed N. gonorrhoeae transmigration, whereas the knockdown of E-cadherin increased N. gonorrhoeae transmigration. In summary, we revealed roles of the NGFG_01605 and FLCN-E-cadherin axis play in N. gonorrhoeae infection, particularly in relation to intracellular survival and transmigration. This is also the first study that connects FLCN and human-specific pathogen infection. N2 - Neisseria gonorrhoeae (GC) ist ein humanpathogenes Bakterium. Gegen jedes kommerziell erhältliche Antibiotikum konnten bereits Resistenzen entdeckt werden. Die Infektion von Neisserien startet mit der Kolonisierung der Zelloberfläche, gefolgt von der Invasion in die Zelle, intrazellulärer Persistenz, Transzytose und Verlassen des subepithelen Raums. Subepithele Bakterien können den Blutfluss erreichen und sich somit auf andere Gewebe verbreiten und dadurch schwerwiegende Erkrankungen wie Arthritis und Lungenentzündungen verursachen. Zahlreiche Studien haben die Interaktion zwischen Wirtszelle und Pathogen zwischen Adhärenz und Invasion gut charakterisiert. Allerdings ist der Mechanismus des intrazellulären Überlebens und der Transmigration weitestgehend unbekannt. Um neue therapeutische Ansätze zu definieren ist es deshalb wichtig weitere bakterielle und zelluläre Faktoren verantwortlich für Interaktionen zwischen Wirt und Pathogen zu identifizieren. Außerdem wurden Studien über N. gonorrhoeae bisher in konventioneller Zellkultur durchgeführt. Auch wenn diese weitere Einsichten in Wirt-Pathogen Interaktionen geben, ist viel Information in der nativen Infektionsumgebung, wie Zellpolarisierung oder Barrierefunktionen, bisher nicht bekannt. Diese Arbeit fokussiert sich auf die Bestimmung eines neuen bakteriellen Virulenzfaktors, NGFG_01605, und Wirtsfaktoren (FLCN) in der Infektion von Gonokokken. NGFG_01605 wurde über Screening einer Transposonsammlung identifiziert und ist eine vermeintliche U32 Protease. Im Gegensatz zu anderen Proteinen dieser Familie, wird diese Protease nicht sekretiert und hat keine ex vivo Proteaseaktivität. Der Knockout von NGFG_01605 vermindert die Überlebensrate von Gonokokken in Epithelzellen. 3D-Modelle basierend auf T84-Zellen wurden für die Analyse der bakteriellen Transmigration entwickelt. Der Knockout von NGFG_01605 hat keinen Einfluss auf die Transmigration. Bei der Suche neuer Wirtsfaktoren, die für die Adhärenz und/oder Internalisierung wichtig sind, wurde FLCN durch ein Screening einer shRNA Sammlung entdeckt. Wir konnten zeigen, dass dieser Faktor zwar nicht für die Adhärenz oder Invasion von N. gonorrhoeae, aber für das Überleben der Bakterien in der Wirtszelle essenziell ist. Da der programmierte Zelltod ein typischer Abwehrmechanismus gegen intrazelluläre Bakterien ist, haben wir Apoptose und Autophagie weiter untersucht und konnten zeigen, dass FLCN zwar keinen Effekt auf Apoptose hat, aber Autophagie inhibiert. Außerdem konnten wir zeigen, dass FLCN die Expression von E-cadherin inhibiert. Auch der Knockdown von E-cadherin verringerte Autophagie und erhöhte das Überleben von N. gonorrhoeae. Im Gebärmutterhals sind sowohl polarisierte als auch nicht-polarisierte Zellen präsent. E-cadherin hat zudem unterschiedliche Einflüsse auf diese unterschiedlichen Zellen. Aus diesem Grund haben wir ein 3D-Modell entwickelt, um die Funktionen von FLCN besser zu verstehen. Wir entdeckten, dass FLCN zwar auch im 3D Modell wichtig für das Überleben ist, aber nicht durch Inhibition von Autophagie. Außerdem inhibiert FLCN die Expression und Verteilung von E-cadherin in 3D-Modellen. Da N. gonorrhoeae die Epithelzellbarierre durch sowohl Zell-Zell-Kontakte als auch transzelluläre Migration überwinden kann, untersuchten wir daraufhin die Rollen von FLCN und E-cadherin in der transzellulären Migration. Diese wird durch FLCN verspätet und durch Knockdown von E-cadherin erhöht. Zusammengefasst, haben wir die Rolle von NGFG_01605 und den Zusammenhang von FLCN und E-cadherin während der Infektion von N. gonorrhoeae untersucht. Unser Fokus war hierbei das intrazelluläre Überleben sowie zelluläre Transmigration. Diese Arbeit ist die Erste, die FLCN und humanpathogenspezifische Infektion miteinander in Verbindung bringt. KW - Folliculin KW - autophagy KW - polarized epithelium KW - protease KW - Gonococcal invasion KW - autophagocytose Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-208959 ER - TY - JOUR A1 - Volceanov, Larisa A1 - Herbst, Katharina A1 - Biniossek, Martin A1 - Schilling, Oliver A1 - Haller, Dirk A1 - Nölke, Thilo A1 - Subbarayal, Prema A1 - Rudel, Thomas A1 - Zieger, Barbara A1 - Häcker, Georg T1 - Septins Arrange F-Actin-Containing Fibers on the Chlamydia trachomatis Inclusion and Are Required for Normal Release of the Inclusion by Extrusion JF - MBIO N2 - Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular human pathogen that grows inside a membranous, cytosolic vacuole termed an inclusion. Septins are a group of 13 GTP-binding proteins that assemble into oligomeric complexes and that can form higher-order filaments. We report here that the septins SEPT2, -9, -11, and probably -7 form fibrillar structures around the chlamydial inclusion. Colocalization studies suggest that these septins combine with F actin into fibers that encase the inclusion. Targeting the expression of individual septins by RNA interference (RNAi) prevented the formation of septin fibers as well as the recruitment of actin to the inclusion. At the end of the developmental cycle of C. trachomatis, newly formed, infectious elementary bodies are released, and this release occurs at least in part through the organized extrusion of intact inclusions. RNAi against SEPT9 or against the combination of SEPT2/7/9 substantially reduced the number of extrusions from a culture of infected HeLa cells. The data suggest that a higher-order structure of four septins is involved in the recruitment or stabilization of the actin coat around the chlamydial inclusion and that this actin recruitment by septins is instrumental for the coordinated egress of C. trachomatis from human cells. The organization of F actin around parasite-containing vacuoles may be a broader response mechanism of mammalian cells to the infection by intracellular, vacuole-dwelling pathogens. IMPORTANCE Chlamydia trachomatis is a frequent bacterial pathogen throughout the world, causing mostly eye and genital infections. C. trachomatis can develop only inside host cells; it multiplies inside a membranous vacuole in the cytosol, termed an inclusion. The inclusion is covered by cytoskeletal "coats" or "cages," whose organization and function are poorly understood. We here report that a relatively little-characterized group of proteins, septins, is required to organize actin fibers on the inclusion and probably through actin the release of the inclusion. Septins are a group of GTP-binding proteins that can organize into heteromeric complexes and then into large filaments. Septins have previously been found to be involved in the interaction of the cell with bacteria in the cytosol. Our observation that they also organize a reaction to bacteria living in vacuoles suggests that they have a function in the recognition of foreign compartments by a parasitized human cell. KW - mammalian septins KW - host-cells KW - binding KW - proteins KW - organization KW - cytoskeleton KW - cytokinesis KW - mechanisms KW - expression KW - protease Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-115421 SN - 2150-7511 VL - 5 IS - 5 ER - TY - THES A1 - Paasche, Alexander T1 - Mechanistic Insights into SARS Coronavirus Main Protease by Computational Chemistry Methods T1 - Mechanistische Einblicke in die SARS Coronavirus Hauptprotease mit computerchemischen Methoden N2 - The SARS virus is the etiological agent of the severe acute respiratory syndrome, a deadly disease that caused more than 700 causalities in 2003. One of its viral proteins, the SARS coronavirus main protease, is considered as a potential drug target and represents an important model system for other coronaviruses. Despite extensive knowledge about this enzyme, it still lacks an effective anti-viral drug. Furthermore, it possesses some unusual features related to its active-site region. This work gives atomistic insights into the SARS coronavirus main protease and tries to reveal mechanistic aspects that control catalysis and inhibition. Thereby, it applies state-of-the-art computational methods to develop models for this enzyme that are capable to reproduce and interpreting the experimental observations. The theoretical investigations are elaborated over four main fields that assess the accuracy of the used methods, and employ them to understand the function of the active-site region, the inhibition mechanism, and the ligand binding. The testing of different quantum chemical methods reveals that their performance depends partly on the employed model. This can be a gas phase description, a continuum solvent model, or a hybrid QM/MM approach. The latter represents the preferred method for the atomistic modeling of biochemical reactions. A benchmarking uncovers some serious problems for semi-empirical methods when applied in proton transfer reactions. To understand substrate cleavage and inhibition of SARS coronavirus main protease, proton transfer reactions between the Cys/His catalytic dyad are calculated. Results show that the switching between neutral and zwitterionic state plays a central role for both mechanisms. It is demonstrated that this electrostatic trigger is remarkably influenced by substrate binding. Whereas the occupation of the active-site by the substrate leads to a fostered zwitterion formation, the inhibitor binding does not mimic this effect for the employed example. The underlying reason is related to the coverage of the active-site by the ligand, which gives new implications for rational improvements of inhibitors. More detailed insights into reversible and irreversible inhibition are derived from in silico screenings for the class of Michael acceptors that follow a conjugated addition reaction. From the comparison of several substitution patterns it becomes obvious that different inhibitor warheads follow different mechanisms. Nevertheless, the initial formation of a zwitterionic catalytic dyad is found as a common precondition for all inhibition reactions. Finally, non-covalent inhibitor binding is investigated for the case of SARS coranavirus main protease in complex with the inhibitor TS174. A novel workflow is developed that includes an interplay between theory and experiment in terms of molecular dynamic simulation, tabu search, and X-ray structure refinement. The results show that inhibitor binding is possible for multiple poses and stereoisomers of TS174. N2 - Das Schwere Akute Respiratorische Syndrom (SARS) wird durch eine Infektion mit dem SARS Virus ausgelöst, dessen weltweite Verbreitung 2003 zu über 700 Todesfällen führte. Die SARS Coronavirus Hauptprotease stellt ein mögliches Wirkstoffziel zur Behandlung dar und hat Modellcharakter für andere Coronaviren. Trotz intensiver Forschung sind bis heute keine effektiven Wirkstoffe gegen SARS verfügbar. Die vorliegende Arbeit gibt Einblicke in die mechanistischen Aspekte der Enzymkatalyse und Inhibierung der SARS Coronavirus Hauptprotease. Hierzu werden moderne computerchemische Methoden angewandt, die mittels atomistischer Modelle experimentelle Ergebnisse qualitativ reproduzieren und interpretieren können. Im Zuge der durchgeführten theoretischen Arbeiten wird zunächst eine Fehlereinschätzung der Methoden durchgeführt und diese nachfolgend auf Fragestellungen zur aktiven Tasche, dem Inhibierungsmechanismus und der Ligandenbindung angewandt. Die Einschätzung der quantenchemischen Methoden zeigt, dass deren Genauigkeit teilweise von der Umgebungsbeschreibung abhängt, welche als Gasphasen, Kontinuum, oder QM/MM Modell dargestellt werden kann. Letzteres gilt als Methode der Wahl für die atomistische Modellierung biochemischer Reaktionen. Die Vergleiche zeigen für semi-empirische Methoden gravierende Probleme bei der Beschreibung von Proton-Transfer Reaktionen auf. Diese wurden für die katalytische Cys/His Dyade betrachtet, um Einblicke in Substratspaltung und Inhibierung zu erhalten. Dem Wechsel zwischen neutralem und zwitterionischem Zustand konnte hierbei eine zentrale Bedeutung für beide Prozesse zugeordnet werden. Es zeigt sich, dass dieser „electrostatic trigger“ von der Substratbindung, nicht aber von der Inhibitorbindung beeinflusst wird. Folglich beschleunigt ausschließlich die Substratbindung die Zwitterionbildung, was im Zusammenhang mit der Abschirmung der aktiven Tasche durch den Liganden steht. Dies gibt Ansatzpunkte für die Verbesserung von Inhibitoren. Aus in silico screenings werden genauere Einblicke in die reversible und irreversible Inhibierung durch Michael-Akzeptor Verbindungen gewonnen. Es wird gezeigt, dass unterschiedlichen Substitutionsmustern unterschiedliche Reaktionsmechanismen in der konjugierten Additionsreaktion zugrunde liegen. Die vorangehende Bildung eines Cys-/His+ Zwitterions ist allerdings für alle Inhibierungsmechanismen eine notwendige Voraussetzung. Letztendlich wurde die nicht-kovalente Bindung eines Inhibitors am Beispiel des TS174-SARS Coronavirus Hauptprotease Komplexes untersucht. Im Zusammenspiel von Theorie und Experiment wurde ein Prozess, bestehend aus Molekulardynamik Simulation, Tabu Search und Röntgenstruktur Verfeinerung ausgearbeitet, der eine Interpretation der Bindungssituation von TS174 ermöglicht. Im Ergebnis zeigt sich, dass der Inhibitor gleichzeitig in mehreren Orientierungen, als auch in beiden stereoisomeren Formen im Komplex vorliegt. KW - SARS KW - Inhibitor KW - Enzym KW - Computational chemistry KW - Coronaviren KW - SARS KW - Protease KW - Mechanismus KW - Inhibitor KW - Computerchemie KW - SARS KW - protease KW - mechanism KW - inhibitor KW - computational chemistry Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-79029 ER - TY - JOUR A1 - Klein, Philipp A1 - Barthels, Fabian A1 - Johe, Patrick A1 - Wagner, Annika A1 - Tenzer, Stefan A1 - Distler, Ute A1 - Le, Thien Anh A1 - Schmid, Paul A1 - Engel, Volker A1 - Engels, Bernd A1 - Hellmich, Ute A. A1 - Opatz, Till A1 - Schirmeister, Tanja T1 - Naphthoquinones as covalent reversible inhibitors of cysteine proteases — studies on inhibition mechanism and kinetics JF - Molecules N2 - The facile synthesis and detailed investigation of a class of highly potent protease inhibitors based on 1,4-naphthoquinones with a dipeptidic recognition motif (HN-l-Phe-l-Leu-OR) in the 2-position and an electron-withdrawing group (EWG) in the 3-position is presented. One of the compound representatives, namely the acid with EWG = CN and with R = H proved to be a highly potent rhodesain inhibitor with nanomolar affinity. The respective benzyl ester (R = Bn) was found to be hydrolyzed by the target enzyme itself yielding the free acid. Detailed kinetic and mass spectrometry studies revealed a reversible covalent binding mode. Theoretical calculations with different density functionals (DFT) as well as wavefunction-based approaches were performed to elucidate the mode of action. KW - protease KW - rhodesain KW - covalent reversible inhibition KW - 1,4-naphthoquinone KW - nucleophilic addition KW - prodrug Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-203791 SN - 1420-3049 VL - 25 IS - 9 ER - TY - THES A1 - Dunkel, Nico T1 - Regulation of virulence-associated traits of the human fungal pathogen Candida albicans by nitrogen availability T1 - Regulation Virulenz-assoziierter Faktoren im humanpathogenen Pilz Candida albicans durch Stickstoffverfügbarkeit N2 - Nitrogen-regulated pathogenesis describes the expression of virulence attributes as direct response to the quantity and quality of an available nitrogen source. As consequence of nitrogen availability, the opportunistic human fungal pathogen Candida albicans changes its morphology and secretes aspartic proteases [SAPs], both well characterized virulence attributes. C. albicans, contrarily to its normally non-pathogenic relative Saccharomyces cerevisiae, is able to utilize proteins, which are considered as abundant and important nitrogen source within the human host. To assimilate complex proteinaceous matter, extracellular proteolysis is followed by uptake of the degradation products through dedicated peptide transporters (di-/tripeptide transporters [PTRs] and oligopeptide transporters [OPTs]). The expression of both traits is transcriptionally controlled by Stp1 - the global regulator of protein utilization - in C. albicans. The aim of the present study was to elucidate the regulation of virulence attributes of the pathogenic fungus C. albicans by nitrogen availability in more detail. Within a genome wide binding profile of Stp1, during growth with proteins, more than 600 Stp1 target genes were identified, thereby confirming its role in the usage of proteins, but also other nitrogenous compounds as nitrogen source. Moreover, the revealed targets suggest an involvement of Stp1 in the general adaption to nutrient availability as well as in the environmental stress response. With the focus on protein utilization and nitrogen-regulated pathogenesis, the regulation of the major secreted aspartic protease Sap2 - additionally one of the prime examples of allelic heterogeneity in C. albicans - was investigated in detail. Thereby, the heterogezygous SAP2 promoter helped to identify an unintended genomic alteration as the true cause of a growth defect of a C. albicans mutant. Additionally, the promoter region, which was responsible for the differential activation of the SAP2 alleles, was delimited. Furthermore, general Sap2 induction was demonstrated to be mediated by distinct cis-acting elements that are required for a high or a low activity of SAP2 expression. For the utilization of proteins as nitrogen source it is also crucial to take up the peptides that are produced by extracellular proteolysis. Therefore, the function and importance of specific peptide transporters was investigated in C. albicans mutants, unable to use peptides as nitrogen source (opt1Δ/Δ opt2Δ/Δ opt3Δ/Δ opt4Δ/Δ opt5Δ/Δ ptr2Δ/Δ ptr22Δ/Δ septuple null mutants). The overexpression of individual transporters in these mutants revealed differential substrate specificities and expanded the specificity of the OPTs to dipeptides, a completely new facet of these transporters. The peptide-uptake deficient mutants were further used to elucidate, whether indeed proteins and peptides are an important in vivo nitrogen source for C. albicans. It was found that during competitive colonization of the mouse intestine these mutants exhibited wild-type fitness, indicating that neither proteins nor peptides are primary nitrogen sources required to efficiently support growth of C. albicans in the mouse gut. Adequate availability of the preferred nitrogen source ammonium represses the utilization of proteins and other alternative nitrogen sources, but also the expression of virulence attributes, like Sap secretion and nitrogen-starvation induced filamentation. In order to discriminate, whether ammonium availability is externally sensed or determined inside the cell by C. albicans, the response to exterior ammonium concentrations of ammonium-uptake deficient mutants (mep1Δ/Δ mep2Δ/Δ null mutants) was investigated. This study showed that presence of an otherwise suppressing ammonium concentration did not inhibit Sap2 proteases secretion and arginine-induced filamentation in these mutants. Conclusively, ammonium availability is primarily determined inside the cell in order to control the expression of virulence traits. In sum, the present work contributes to the current understanding of how C. albicans regulates expression of virulence-associated traits in response to the presence of available nitrogen sources - especially proteins and peptides - in order to adapt its lifestyle within a human host. N2 - Stickstoffregulierte Pathogenität bezeichnet die Kontrolle von Virulenz-assoziierten Eigenschaften als direkte Folge der verfügbaren Quantität und Qualität einer Stickstoffquelle. Im Zusammenhang mit der Stickstoffverfügbarkeit verändert der opportunistisch krankheitserregende Pilz Candida albicans seine Morphologie und sekretiert Aspartat-Proteasen [SAPs], beides gut charakterisierte Virulenzattribute. Im Gegensatz zu seinem normalerweise apathogenen Verwandten Saccharomyces cerevisiae ist C. albicans in der Lage Proteine zu verwerten, welche als sehr häufige und wichtige Stickstoffquelle im menschlichen Wirt angesehen werden. Zur Nutzung von Proteinen sekretiert C. albicans Aspartat-Proteasen für den außerzellulären Verdau der Proteine und exprimiert Peptidtransporter (Di- /Tripeptidtransporter [PTRs] und Oligopeptidtransporter [OPTs]) um die Abbauprodukte aufzunehmen. Beide Eigenschaften werden transkriptionell von Stp1 - dem globalen Regulator zur Verwertung von Proteinen - kontrolliert. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Regulation von Virulenzattributen im pathogenen Pilz C. albicans durch die Verfügbarkeit von Stickstoff genauer zu untersuchen. Innerhalb einer genomweiten Bindestudie von Stp1 wurden mehr als 600 Stp1-Zielgene während des Wachstums mit Proteinen identifiziert. Dadurch bestätigte sich die Funktion von Stp1 in der Proteinverwertung und wurde zudem auch auf die allgemeine Verwertung von Stickstoffquellen erweitert. Des Weiteren deuten die aufgedeckten Zielgene an, dass Stp1 womöglich in der Adaption an die generelle Nährstoffverfügbarkeit sowie in der Antwort auf Stresssignale beteiligt ist. Mit dem Fokus auf die Proteinverwertung und stickstoffregulierter Pathogenität wurde die Regulation der wichtigsten sekretierten Protease Sap2 - welche außerdem ein Paradebeispiel für allelische Heterogenität ist - im Detail untersucht. Dabei half der heterogene SAP2-Promoter bei der Identifizierung einer unbeabsichtigten genomischen Veränderung als wahren Grund eines Wachstumsdefektes einer C. albicans Mutante. Zusätzlich wurde der Promotorbereich eingegrenzt, welcher für die unterschiedliche Aktivierung der beiden SAP2 Allele verantwortlich ist. Weiterhin wurden verschiedene cis-aktive Elemente identifiziert, die entweder für eine hohe oder eine niedrige SAP2 Expression benötigt werden. Die Aufnahme von Peptiden, die durch den außerzellulären Verdau entstehen, ist für die Verwertung von Proteinen ebenso wichtig. Deshalb wurde die Funktion und Bedeutung der spezifischen Peptidtransporter anhand von C. albicans Mutanten untersucht, welche Peptide nicht aufnehmen können (opt1Δ/Δ opt2Δ/Δ opt3Δ/Δ opt4Δ/Δ opt5Δ/Δ ptr2Δ/Δ ptr22Δ/Δ Septuplemutanten). Die Überexpression von individuellen Transportern in diesen Septuplemutanten offenbarte unterschiedliche Substratspezifitäten und erweiterte die Spezifität für die OPTs auf Dipeptide, eine komplett neue Facette dieser Transporter. Des Weiteren ermöglichten die Septuplemutanten eine Aufklärung, ob Proteine und Peptide tatsächlich eine wichtige In Vivo Stickstoffquelle für C. albicans sind. Dieses Arbeit zeigte, dass während der kompetitiven Kolonisierung des Mäusedarms die Septuplemutanten wildtypische Fitness aufwiesen. Dies deutet daraufhin, dass weder Proteine noch Peptide eine wichtige Stickstoffquelle für ein effizientes Wachstum in diesem In Vivo Model sind. Die ausreichende Verfügbarkeit der bevorzugten Stickstoffquelle Ammonium unterdrückt die Verwertung von Proteinen und anderen alternativen Stickstoffquellen. Aber auch die Expression von Virulenzattributen, wie die Proteasesekretion und die stickstoffmangel-induzierte Filamentierung, wird durch Ammonium inhibiert. Um zu unterscheiden, ob C. albicans die Ammoniumverfügbarkeit außerzellulär oder in der Zelle bestimmt, wurde das Verhalten auf außerzelluläre Ammoniumkonzentrationen in Mutanten untersucht, welche Ammonium nicht aufnehmen können (mep1Δ/Δ mep2Δ/Δ Mutanten). Diese Arbeit zeigte, dass in diesen Mutanten eine ansonsten inhibierende Ammoniumkonzentration nicht in der Lage war, die Sekretion der Sap2-Protease oder die Arginin-induzierte Hyphenbildung zu unterdrücken. Folglich wird, um die Expression von Virulenzattributen zu regulieren, die Ammoniumverfügbarkeit vorrangig in der Zelle bestimmt. Zusammenfassend erweitert die vorliegende Arbeit das Verständnis zur Regulation der Expression von Virulenzattributen durch die Verfügbarkeit von Stickstoffquellen - insbesondere Proteine und Peptide - die eine Anpassung von C. albicans an ein Leben im menschlichen Wirt ermöglichen. KW - Candida albicans KW - Regulation KW - Stickstoff KW - Virulenz KW - Proteasen KW - Nitrogen KW - SAP2 KW - STP1 KW - peptide KW - transport KW - ammonium KW - protease KW - Proteine Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-83076 ER -