TY - THES A1 - Silwedel, Christine T1 - Charakterisierung immortalisierter Maus-Hirnendothelzelllinien als in vitro-Modelle der Blut-Hirn-Schranke T1 - Characterization of immortalized murine brain capillary endothelial cells as an in vitro model of the blood brain barrier N2 - Die Blut-Hirn-Schranke reguliert den Transport von Molekülen aus dem Blut in das Gehirn und aus dem Hirngewebe in das Blut. Die Grundlage dieser für den Erhalt der Homöostase im Gehirn wichtigen Schranke bilden zwischen Endothelzellen der Gehirnkapillaren (BCECs) entwickelte, besonders dichte Zonulae Occludentes (Tight Junctions). Viele Krankheiten, zum Beispiel die Multiple Sklerose, gehen mit einer Dysfunktion der BBB einher, die molekularen Grundlagen verschiedener Störungen und damit die Therapiemöglichkeiten sind bisher jedoch oftmals noch unbekannt. Ein grundlegendes Problem der Forschung an der BBB war bislang das Fehlen eines geeigneten immortalisierten in vitro-Modelles zum Verständnis der Differenzierung und Regulierung der Schrankenfunktion. Es gelang nun erstmals, aus murinen BCECs ein solches in vitro-Modell der BBB zu entwickeln, welches wichtige Charakteristika der BBB in vivo aufweist. Zu den Eigenschaften der BBB in vivo zählen allgemein ein hoher transendothelialer elektrischer Widerstand (TER) von bis zu 2000  x cm², die Expression der TJ-Proteine Occludin, Claudin-1, Claudin-3 und Claudin-5 sowie eine geringe Rate transzellulärer Transportvorgänge. Die Entwicklung einer immortalisierten Zelllinie als in vitro-Modell der BBB beinhaltete das Bereitstellen einer möglichst natürlichen Umgebung für die Endothelzellen. Durch Zugabe von Wachstums- und Differenzierungsfaktoren sowie Serumreduktion im Differenzierungsmedium konnte eine dichte Schrankenfunktion induziert werden, welche sich anhand von TER-Messungen nachweisen ließ. Mittels immuncytochemischen und molekularbiologischen Methoden wurde außerdem die Expression verschiedener TJ-Proteine in den immortalisierten BCECs gezeigt. Die Permeabilität der BBB wird durch eine Reihe von Faktoren beeinflusst. So war zu erkennen, dass Glucocorticoide und Insulin die Barrierenfunktion der BBB induzieren und die Zugabe dieser Faktoren die in vitro-Kultivierung von BCECs ermöglicht, ohne dass diese dabei für die BBB in vivo wesentliche Charakteristika verlieren. Diese Ergebnisse stimmen überein mit anderen Studien, denenzufolge für die Induktion und Aufrechterhaltung komplexer Tight Junctions bei kultivierten Endothelzellen Glucocorticoide förderlich sind. Auch klinisch wird dieser Einfluss von Glucocorticoiden bereits genutzt: so konnten im Falle der Multiplen Sklerose Therapieerfolge durch die Gabe von Corticosteroiden erzielt werden. N2 - The blood brain barrier is responsible for regulation of transport between blood and brain, thus keeping up the brain's homeostasis. Tight Junctions in between brain capillary endothelial cells are the basis for barrier properties. Many diseases are going hand in hand with or are caused by a leakage within the blood brain barrier. Research was often limited by the lack of a proper in vitro model of the blood brain barrier. Aim of this study was to establish an in vitro model of the blood brain barrier and investigate regulation mechanisms. After cell isolation from murine brains certain growth- and differentiation supplements were added, cells were afterwards investigated regarding typical blood brain barrier properties. These are certain tight junction proteins (e.g. occludine, claudins), a high transendothelial electrical resistance as well as a low rate of transcellular transport. Our results showed the isolated brain capillary endothelial cells to be displaying those properties, thus building a valid in vitro model of the blood brain barrier. KW - Blut-Hirn-Schranke KW - Occludin KW - Hirnendothelzellen KW - zerebrale Mikrovaskulatur KW - blood brain barrier KW - cerebral microvasculature KW - brain capillary endothelial cells Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-34946 ER - TY - THES A1 - Koch, Angelina T1 - Expression von Transportern, Rezeptoren und Zell-Zell-Kontakt Proteinen an der Blut-Hirn-Schranke: Vergleich zwischen immortalisierten und primären Hirnendothelzellen T1 - Expression of transporters, receptors and cell-cell contact proteins at the blood-brain barrier: comparison between immortalized and primary brain endothelial cells N2 - Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) stellt eine wichtige Barriere zwischen dem Blutsystem und dem Gehirngewebe dar. An der Bildung dieser Barriere sind hauptsächlich die Endothelzellen der Blutkapillaren beteilig. Dabei verschließen die Tight Junction Proteine und die Adherens Junction Proteine den interzellulären Spalt zwischen zwei benachbarten Endothelzellen. Dieser Verschluss sorgt dafür, dass keine Noxen aus dem Blut in das Zentralnervensystem gelangen können. Damit jedoch der Transport wichtiger Nährstoffe in das ZNS und der Abtransport von Abfallprodukten aus dem ZNS gewährleistet sind, sind spezielle Rezeptoren und Transporter notwendig. Diese sorgen auch dafür, dass in die Endothelzellen eingedrungene schädliche Substanzen wieder zurück in das Blutsystem befördert werden. Dafür sind Effluxpumpen, Proteine der Solute Carrier Familie und zelluläre Rezeptoren verantwortlich. Die immortalized mouse cerebral/cerebellar capillary endothelial cells (cEND/cerebEND) Modellsysteme sind in-vitro Modellsysteme der BHS und wurden in der AG: Förster in der Anästhesiologie im Universitätsklinikum Würzburg bereits erfolgreich isoliert und schon dazu benutzt verschiedene physiologische und pathophysiologische Prozesse in der BHS zu beschreiben und zu erklären. Die Zellen werden in diesem BHS-Modell mit Hilfe des Polynoma large T Antigens immortalisiert. Das Ziel der Doktorarbeit war der Vergleich der mRNA Expressions- und Proteinlevel verschiedener Tight Junction-Proteine, Adherens Junctions, Effluxpumpen, Proteine der SLC-Familie und zellulärer Rezeptoren der BHS zwischen cEND/cerebEND und primären Zellen, die aus dem Großhirn isoliert wurden, sowohl in 10% FCS als auch in 1% FCS Nährmedium. Es sollte ermittelt werden, ob durch die Immortalisierung der Hirnendothelzellen eine Veränderung in der Expression der Proteine herbeigeführt wird und ob es Unterschiede in der Expression bezüglich der Mediumkonzentration gibt. Untersucht wurden die mRNA Expressionslevel mit Hilfe der RT-PCR und die Proteinlevel mittels Western Blot. Es hat sich heraus gestellt, dass cEND und cerebEND in vielen Fällen ähnliche Mengen an ABC-Transportern, Proteinen der SLC-Familie, zellulärern Rezeptoren und Tight Junction Proteinen wie primäre Zellen, sowohl in 10% FCS als auch in 1% FCS Medium exprimieren. Dabei sind die mRNA- und Proteinexpressionslevel von Tight Junctions und der zellulären Rezeptoren, Insulin- und Transferrinrezeptor, im Vergleich zu primären Zellen am ähnlichsten. In diesen Fällen wird die Expression der untersuchten Proteine durch die Immortalisierung der Hirnendothelzellen nicht signifikant verändert. Somit lässt sich die Barrierefunktion der Hirnendothelzellen besonders gut mit den in-vitro Modellsystemen untersuchen. Die Modellsysteme cEND und cerebEND zeigen allerdings auch einige Schwachstellen. Bcrp, Mct1, Lrp1 und P-gp lassen sich nur bedingt mit diesen Modellsystemen untersuchen, da ihre mRNA- und Proteinexpression sehr stark hoch, im Fall von Bcrp, oder runter reguliert wird, im Fall von Mct1 und Lrp1 in cEND/cerebEND und P-gp in cerebEND. Im Hinblick auf Veränderungen in der Expression durch Mediumreduktion wird deutlich, dass sie zu höheren Expressionsraten in cEND, mehr noch in cerebEND, führt. Dies zeigt sich auf mRNA-Ebene noch deutlicher als auf Proteinebene. Diese Tatsache scheint sich allerdings nicht im Vergleich mit primären Zellen sichtbar zu machen. Es zeigt sich kein Unterschied im Vergleich zu primären Zellen zwischen 10% FCS und 1% FCS Nährmedium. Damit stellen cEND und cerebEND in vielen verschiedenen, jedoch nicht in allen Fragestellungen geeignete Modellsysteme dar. N2 - The blood-brain barrier (BBB) ​​represents an important barrier between the blood system and the brain tissue. The endothelial cells of the blood capillaries are mainly involved in the formation of this barrier. The tight junction proteins and the adherens junction proteins close the intercellular gap between two neighboring endothelial cells. This closure ensures that no noxious substances from the blood can get into the central nervous system. However, in order to ensure that important nutrients are transported to the CNS and that waste products are removed from the CNS, special receptors and transporters are necessary. These also ensure that harmful substances that have entered the endothelial cells are transported back into the blood system. Efflux pumps, proteins from the Solute Carrier family and cellular receptors are responsible for this. The immortalized mouse cerebral / cerebellar capillary endothelial cells (cEND / cerebEND) model systems are in-vitro model systems of the BBB and have already been successfully isolated in the AG: Förster in anaesthesiology at the University Hospital in Würzburg and already used to describe and explain various physiological and pathophysiological processes in the BBB. In this BBB models, the cells are immortalized using the Polynoma large T antigen. The aim of the doctoral thesis was to compare the mRNA expression and protein levels of various tight junction proteins, adherens junctions, efflux pumps, proteins of the SLC family and cellular receptors of the BBB between cEND / cerebEND in 10% FCS as well as in 1% FCS culture medium and primary cells, that were isolated from the cerebrum. It should be determined whether immortalization of the brain endothelial cells leads to a change in the expression of the proteins and whether there are differences in the expression with regard to the medium concentration. The mRNA expression levels were examined using RT-PCR and the protein levels using Western blot. It has been found that cEND and cerebEND in many cases have similar amounts of ABC transporters, proteins of the SLC family, cellular receptors and tight junction proteins like primary cells, both in 10% FCS and in 1% FCS culture medium. The mRNA expression and protein levels of tight junctions and the cellular receptors, insulin- and transferrin receptor, are the most similar compared to primary cells. In these cases, the expression of the examined proteins is not significantly changed by the immortalization of the brain endothelial cells. The barrier function of the brain endothelial cells can thus be investigated particularly well with the in vitro model systems. However, the model systems cEND and cerebEND also show some weak points. Bcrp, Mct1, Lrp1 and P-gp can only be investigated to a limited extent with these model systems, since their transcription and expression are regulated very high, in the case of Bcrp, or down-regulated, in the case of Mct1 and Lrp1 in cEND / cerebEND and P- gp in cerebEND. With regard to changes in expression through medium reduction, it becomes clear that it leads to higher expression rates in cEND, and even more so in cerebEND. This is shown even more clearly at the mRNA level than at the protein level. However, this fact does not appear to be visible in comparison with primary cells. There is no difference compared to primary cells between 10% FCS and 1% FCS culture medium. cEND and cerebEND seem to represent suitable model systems for many, but not for all questions. KW - Blut-Hirn-Schranke KW - Hirnendothelzellen KW - in-vitro Modellsystem Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-204505 ER - TY - THES A1 - Endres, Leo Maximilian T1 - Development of multicellular \(in\) \(vitro\) models of the meningeal blood-CSF barrier to study \(Neisseria\) \(meningitidis\) infection T1 - Entwicklung multizellulärer \(in\) \(vitro\) Modelle der meningealen Blut-Liquor Schranke zur Untersuchung der \(Neisseria\) \(meningitidis\) Infektion N2 - Neisseria meningitidis (the meningococcus) is one of the major causes of bacterial meningitis, a life-threatening inflammation of the meninges. Traversal of the meningeal blood-cerebrospinal fluid barrier (mBCSFB), which is composed of highly specialized brain endothelial cells (BECs), and subsequent interaction with leptomeningeal cells (LMCs) are critical for disease progression. Due to the human-exclusive tropism of N. meningitidis, research on this complex host-pathogen interaction is mostly limited to in vitro studies. Previous studies have primarily used peripheral or immortalized BECs alone, which do not retain relevant barrier phenotypes in culture. To study meningococcal interaction with the mBCSFB in a physiologically more accurate context, BEC-LMC co-culture models were developed in this project using BEC-like cells derived from induced pluripotent stem cells (iBECs) or hCMEC/D3 cells in combination with LMCs derived from tumor biopsies. Distinct BEC and LMC layers as well as characteristic expression of cellular markers were observed using transmission electron microscopy (TEM) and immunofluorescence staining. Clear junctional expression of brain endothelial tight and adherens junction proteins was detected in the iBEC layer. LMC co-culture increased iBEC barrier tightness and stability over a period of seven days, as determined by sodium fluorescein (NaF) permeability and transendothelial electrical resistance (TEER). Infection experiments demonstrated comparable meningococcal adhesion and invasion of the BEC layer in all models tested, consistent with previously published data. While only few bacteria crossed the iBEC-LMC barrier initially, transmigration rates increased substantially over 24 hours, despite constant high TEER. After 24 hours of infection, deterioration of the barrier properties was observed including loss of TEER and altered expression of tight and adherens junction components. Reduced mRNA levels of ZO-1, claudin-5, and VE-cadherin were detected in BECs from all models. qPCR and siRNA knockdown data suggested that transcriptional downregulation of these genes was potentially but not solely mediated by Snail1. Immunofluorescence staining showed reduced junctional coverage of occludin, indicating N. meningitidis-induced post-transcriptional modulation of this protein, as previous studies have suggested. Together, these results suggest a potential combination of transcellular and paracellular meningococcal traversal of the mBCSFB, with the more accessible paracellular route becoming available upon barrier disruption after prolonged N. meningitidis infection. Finally, N. meningitidis induced cellular expression of pro-inflammatory cytokines and chemokines such as IL-8 in all mBCSFB models. Overall, the work described in this thesis highlights the usefulness of advanced in vitro models of the mBCSFB that mimic native physiology and exhibit relevant barrier properties to study infection with meningeal pathogens such as N. meningitidis. N2 - Neisseria meningitidis (der Meningokokkus) ist einer der Hauptursachen bakterieller Meningitis, einer lebensbedrohlichen Entzündung der Hirnhäute. Entscheidend für das für das Voranschreiten der Krankheit ist die Fähigkeit des Erregers, die meningeale Blut-Liquor-Schranke (mBCSFB), bestehend aus spezialisierten Hirnendothelzellen (BECs) und leptomeningealen Zellen (LMCs), zu überwinden und in den submeningealen Raum einzudringen. Da es sich bei N. meningitidis um ein rein humanes Pathogen handelt, beschränkt sich die Erforschung dieser speziellen Interaktion primär auf die Verwendung von in vitro Modellen. Bisher wurden hierfür hauptsächlich periphere oder immortalisierte BECs verwendet, welchen jedoch wichtige Barriere-Eigenschaften fehlen. Um die Interaktion von N. meningitidis mit der mBCSFB in einem physiologisch relevanteren Umfeld zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit neuartige BEC-LMC Kokulturmodelle entwickelt. Dabei wurden sowohl BEC-ähnliche Zellen, die aus induzierten pluripotenten Stammzellen generiert wurden (iBECs), als auch hCMEC/D3 Zellen verwendet und zusammen mit LMCs aus Tumorbiopsien kultiviert. Mittels Transmissions-Elektronenmikroskopie und Immunfluoreszenzfärbung konnten die unterschiedlichen Zellschichten und deren Expression charakteristischer zellulärer Marker dargestellt werden. Durchgängige Expression von wichtigen Bestandteilen Barriere-formender Zellverbindungen, sogenannter Tight und Adherens Junctions, wurde in der iBEC-Schicht beobachtet. Die Integrität der zellulären Barriere wurde mittels transendothelialer elektrischer Resistenz (TEER) und Permeabilität gegenüber Natrium-Fluorescein (NaF) bestimmt. Erhöhte TEER-Werte und verringerte NaF-Permeabilität, gemessen über einen Zeitraum von sieben Tagen, zeigten eine durch die Kokultur mit LMCs ausgelöste Steigerung der Dichtigkeit und Stabilität der iBEC-Barriere. Infektionsexperimente mit N. meningitidis zeigten in allen Modellen vergleichbare bakterielle Adhäsion und Invasion der BEC-Schicht. Bakterielle Transmigration durch die gesamten Zellbarriere war im iBEC-LMC Modell kurz nach Infektion nur in geringem Maße detektierbar, nahm jedoch innerhalb von 24 Stunden deutlich zu. Interessanterweise wurde bis zu 24 Stunden nach Infektion noch eine hohe Integrität der Barriere gemessen, welche allerdings im weiteren Verlauf verloren ging. Neben signifikantem TEER-Verlust wurde eine verringerte Expression der Tight und Adherens Junction Proteine ZO-1, claudin-5, und VE-cadherin mittels qPCR festgestellt. qPCR und siRNA Knockdown Experimente deuteten darauf hin, dass dies möglicherweise, aber nicht ausschließlich, auf den Transkriptionsfaktor Snail1 zurückzuführen war. Zusätzlich zu den beobachteten Effekten auf die zelluläre Transkription von Tight Junction Genen, zeigten Immunfluoreszenzfärbungen eine verringerte Expression von Occludin an den Zell-Zell-Verbindungen, was auf eine post-translationale Modulation schließen lässt. Zusammen deuten die Ergebnisse dieser Infektionsstudien auf eine mögliche Kombination aus trans- und parazellulärer bakterieller Transmigration der mBCSFB hin. Zuletzt wurden in dieser Arbeit noch die Immunaktivierung von BECs nach N. meningitidis Infektion in den neuen BEC-LMC Kokulturmodellen untersucht. Hierbei wurde eine erhöhte Expression von Zytokinen, insbesondere Interleukin-8, beobachtet. Insgesamt konnten in dieser Arbeit neue, fortschrittlicher in vitro Modelle der mBCSFB entwickelt werden, welche die humane Physiologie besser widerspiegeln und daher für Infektionsstudien mit Meningitis-verursachenden Erregern wie N. meningitidis von besonderem Nutzen sind. KW - Bakterielle Hirnhautentzündung KW - Blut-Liquor-Schranke KW - Induzierte pluripotente Stammzelle KW - Neisseria meningitidis KW - In-vitro-Kultur KW - Brain endothelial cells KW - Leptomeningeal cells KW - Hirnendothelzellen KW - Leptomeningealzellen Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-346216 ER -