TY - THES A1 - Weiß, Esther T1 - Host-pathogen interactions of natural killer cells and Aspergillus fumigatus: Relevance of immune cell cross-talk and fungal recognition receptors T1 - Wirt-Pathogen Interaktionen von natürlichen Killerzellen und Aspergillus fumigatus: Relevanz von Immunzellinteraktionen und fungalen Erkennungsrezeptoren N2 - The human pathogen Aspergillus (A.) fumigatus is a fungal mold that can cause severe infections in immunocompromised hosts. Pathogen recognition and immune cell cross-talk are essential for clearing fungal infections efficiently. Immune cell interactions in particular may enhance individual cell activation and cytotoxicity towards invading pathogens. This study analyzed the reciprocal cell activation of natural killer (NK) cells and monocyte-derived dendritic cells (moDCs) after stimulation with A. fumigatus cell wall fractions and whole-cell lysates. Furthermore, the impact of the on moDCs expressed fungal receptors Dectin-1 and TLR-2 on NK cell activation was analyzed. Stimulation of moDCs with ligands for Dectin-1 and TLR-2 and transfer of soluble factors on autologous NK cells showed that moDCs could induce NK cell activation solely by secreting factors. In summary, both cell types could induce reciprocal cell activation if the stimulated cell type recognized fungal morphologies and ligands. However, moDCs displayed a broader set of A. fumigatus receptors and, therefore, could induce NK cell activation when those were not activated by the stimulus directly. Consequently, new fungal receptors should be identified on NK cells. The NK cell characterization marker CD56 was reduced detected in flow cytometry after fungal co-culture. Notably, this decreased detection was not associated with NK cell apoptosis, protein degradation, internalization, or secretion of CD56 molecules. CD56 was shown to tightly attach to hyphal structures, followed by its concentration at the NK-A. fumigatus interaction site. Actin polymerization was necessary for CD56 relocalization, as pre-treatment of NK cells with actin-inhibitory reagents abolished CD56 binding to the fungus. Blocking of CD56 suppressed fungal mediated NK cell activation and secretion of the immune-recruiting chemokines MIP-1α, MIP-1β, and RANTES, concluding that CD56 is functionally involved in fungal recognition by NK cells. CD56 binding to fungal hyphae was inhibited in NK cells obtained from patients during immune-suppressing therapy after allogeneic stem cell transplantation (alloSCT). Additionally, reduced binding of CD56 correlated with decreased actin polymerization of reconstituting NK cells challenged with the fungus. The immune-suppressing therapy with corticosteroids negatively influenced the secretion of MIP-1α, MIP-1β, and RANTES in NK cells after fungal stimulation ex vivo. Similar results were obtained when NK cells from healthy donors were treated with corticosteroids prior to fungal co-culture. Thus, corticosteroids were identified to have detrimental effects on NK cell function during infection with A. fumigatus. N2 - Der humanpathogene Pilz Aspergillus (A.) fumigatus kann lebensbedrohliche Infek-tionen in immunsupprimierten Patienten verursachen. Die Immunerkennung von Patho-genen sowie die Wechselwirkungen zwischen Immunzellen sind essentiell für die erfolg-reiche Bekämpfung von Pilzinfektionen. Zell-Zell-Interaktionen tragen zur gegenseitigen Aktivierung bei und können somit die Zytotoxizität gegenüber eindringenden Pathogenen steigern. In dieser Arbeit wurde die gegenseitige Zellaktivierung von natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) und die aus Monozyten generierten, dendritischen Zellen (DZ) nach Stimula-tion mit Zellwandfraktionen und Zelllysaten des Pilzes A. fumigatus analysiert. Des Weite-ren wurde der Einfluss dendritischer Rezeptoren auf die NK-Zellaktivierung untersucht. Die Stimulation mit Liganden für Dectin-1 und TLR-2 induzierte die Freisetzung löslicher Faktoren, welche ausreichend waren, um autologe NK-Zellen zu stimulieren. Zusammen-fassend ist zu sagen, dass DZ mehr Rezeptoren zur Pilzerkennung exprimieren und so-mit NK-Zellen auch dann aktivieren konnten, wenn diese, aufgrund fehlender Rezepto-ren, nicht stimuliert wurden. Basierend auf diesen Ergebnissen sollten neue Pathogen-Erkennungsrezeptoren auf NK-Zellen identifiziert werden. Der Charakterisierungsmarker CD56 zeigte nach fun-galer Kokultur eine reduzierte Detektion in durchflusszytometrischen Analysen. Die ver-minderte Proteindetektion von CD56 war nicht assoziiert mit Apoptose, Internalisation, Sekretion oder Proteindegradierung. Weitere Analysen bestätigten eine starke CD56-Bindung zu Pilzhyphen, gefolgt von einer Konzentration des Proteins an der NK-A. fumi-gatus Interaktionsstelle. Diese Relokalisation zeigte eine Abhängigkeit zu Aktin, da Zytos-kelett-Inhibitoren die CD56-Bindung am Pilz verhinderten. Eine spezifische Blockade von CD56 Rezeptoren reduzierte die Freisetzung der immun-rekrutierenden Chemokine MIP-1α, MIP-1β und RANTES, was folgern ließ, dass CD56 eine funktionelle Rolle in der Pil-zerkennung der NK-Zellen hat. NK-Zellen, die während einer Immunsuppressionstherapie aus Empfängern einer al-logenen Stammzelltransplantation (alloSZT) gewonnen wurden, zeigten eine inhibierte Bindung von CD56 an Pilzhyphen. Diese korrelierte mit einer reduzierten Aktinpolymeri-sation nach fungaler Stimulation. Weiterhin hemmte eine Immunsuppressionstherapie mit Corticosteroiden die Sekretion von MIP-1α, MIP-1β und RANTES in NK-Zellen, die mit Pilz ex vivo stimuliert wurden. Ähnliches war zu beobachten, wenn NK-Zellen von ge-sunden Spendern vor Pilzstimulation mit Corticosteroiden vorbehandelt wurden. Daraus folgend wurde den Corticosteroiden ein negativer Einfluss auf die NK-Zellfunktion bei Pilzinfektionen zugesprochen. KW - Natürliche Killerzelle KW - Aspergillus fumigatus KW - Dendritische Zelle KW - NK cell KW - host-pathogen interaction KW - allogeneic stem cell transplantation KW - NK-DC cross-talk KW - DC Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-206077 ER - TY - THES A1 - Steigerwald, Jutta T1 - Der NK-Zellrezeptor NKG2D als Zielstruktur für eine Antikörper-basierte therapeutische Immunmodulation T1 - The NK cell receptor NKG2D as target structure for antibody-based therapeutic immune modulation N2 - Das NKG2D (Natural Killer Group 2 Member D)-Protein, ist ein aktivierender Rezeptor, der es NK- und CD8+ T-Zellen ermöglicht, infizierte oder transformierte körpereigene Zellen zu erkennen und zu eliminieren. Eine Fehlregulation dieses Rezeptors auf Immunzellen scheint jedoch auch zur Ausbildung von Autoimmunerkrankungen wie Typ I Diabetes, Zöliakie und RA zu führen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein humaner Antikörper gegen hNKG2D für einen möglichen therapeutischen Einsatz bei Autoimmunerkrankungen generiert. Basierend auf den Sequenzen von schwerer (VH) und leichter Kette (VL) der murinen monoklonalen Antikörper 6H7 und 6E5A7, welche hNKG2D spezifisch binden und die Interaktion zwischen Ligand und Rezeptor blockieren, wurden scFv-Phagenbibliotheken hergestellt. Diese wurden anschließend zur Selektion im Phagen-Display eingesetzt. Der Humanisierungsprozess erfolgte hierbei mit Hilfe des Guided Selection-Verfahrens. Dazu wurde in einem ersten Phagen-Display-Durchgang die VH-Domäne des parentalen scFv mit einem humanen VL-Repertoire kombiniert. Die beiden daraus resultierenden humanen VL-Ketten wurden im darauf folgenden Schritt mit einem Repertoire an humanen VH-Domänen verknüpft. Da hierbei kein humaner rekombinanter scFv mit hNKG2D-Bindungsaktivität identifiziert werden konnte, musste eine schrittweise Humanisierung der Framework-Regionen (FR) der VH unter Beibehaltung der murinen CDR-Bereiche erfolgen. Diese führte zur Generierung des humanen scFv E1VLV71KVH, welcher neben den murinen CDR-Regionen lediglich noch drei Aminosäuren murinen Ursprungs im FR-Bereich besaß. Dessen biologische Aktivität wurde nach Konvertierung in das IgG1/lambda-Format in verschiedenen in vitro-Systemen analysiert. Anhand der Ergebnisse aus diesen Versuchen konnte ein deutlicher Verlust der Affinität und inhibitorischen Aktivität nach der Humanisierung festgestellt werden. Die dadurch erforderliche Affinitätsmaturierung des E1VLV71KVH Antikörpers mittels sequentieller Randomisierung des CDR3-Bereichs von E1VL und V71KVH resultierte in fünf unterschiedlichen, hoch-affinen Anti-hNKG2D scFv. Zwei dieser generierten Konstrukte, B1VLB6VH und E4VLG10VH, wurden nach ihrer Herstellung als vollständige IgG1/lambda-Antikörper in vitro hinsichtlich ihrer Aktivierungs- und Neutralisierungsaktivität, sowie ihrer Stabilität und Internalisierung durch NK-Zellen untersucht. Beide Antikörper wiesen nach der Affinitätsmaturierung mit einem IC50 von ca. 3,4x 10-2 µg/ml ein wesentlich höheres Inhibitionspotential als der murine Ursprungsantikörper (ca. 3,3 µg/ml) auf und zeigten gegenüber Hitzeeinwirkung und Serumproteasen eine hohe Stabilität. Mit Hilfe fluoreszenzmikroskopischer Untersuchungen konnten Internalisierungsvorgänge der Antikörper in die NK-Zelle beobachtet werden. Für ein besseres Verständnis NKG2D-abhängiger Regulationsvorgänge und die Identifizierung NKG2D-spezifischer Zielgene wurde das Genexpressionsprofil von humanen NK-Zellen nach Interaktion mit dem NKG2D-Liganden ULBP-1Fc mittels Microarray untersucht. Infolge einer anschließenden Validierung der Ergebnisse auf RNA- und Proteinebene konnten mittels RT-qPCR, FACS, ELISA und CBA NKG2D-spezifische Biomarker wie CRTAM, TNFalpha, IFNgamma und GM-CSF etabliert werden. Ergänzend zu 51Cr-Freisetzungs-Experimenten in zwei unterschiedlichen in vitro Zellkultursystemen ermöglichten diese Biomarker eine umfassende Charakterisierung neutralisierender und aktivierender Eigenschaften der beiden Antikörper B1VLB6VH und E4VLG10VH. Anhand dieser Experimente konnte festgestellt werden, dass die humanen Anti-hNKG2D Antikörper eine ambivalente Funktionalität aufweisen. In Lösung sind sie in der Lage, NKG2D-induzierte CRTAM-Expression, Zellyse und Zytokinfreisetzung zu inhibieren. Nach Kreuzvernetzung des NKG2D-Rezeptors über an Platten immobilisierte Anti-hNKG2D Antikörper hingegen lassen sich aktivierende Eigenschaften wie Zellyse und Zytokinsekretion durch NK Zellen beobachten. Aufgrund ihrer ambivalenten Aktivität scheint ein therapeutischer Einsatz der beiden Antikörper bei humanen Autoimmunerkrankungen zum jetzigen Zeitpunkt noch nicht möglich. In der vorliegenden Arbeit wurden somit die Voraussetzungen geschaffen, um einen humanen, hoch affinen hNKG2D neutralisierenden Antikörper in einem letzten Schritt in ein besser geeignetes Antikörper-Format (scFv, Fab oder F(ab)2) zu konvertieren. N2 - The natural killer group 2, member D protein (NKG2D) is an activating receptor on NK- and CD8+ T-cells, which enables them to identify and eliminate infected and transformed somatic cells. However, a dysfunction of this receptor on immune cells may lead to the development of autoimmune diseases like type I diabetes, celiac disease, and rheumatoid arthritis. In this doctoral thesis, a human antibody with anti-hNKG2D specificity was developed which could be of clinical relevance for the treatment of autoimmune diseases. Based on the sequences of heavy (VH) and light chain (VL) of the two murine monoclonal antibodies 6H7 and 6E5A7 which specifically bind to hNKG2D and block the interaction between NKG2D-ligand and receptor, scFv-phage-libraries were prepared. These libraries were used in the following selection process by phage-display and the humanization of the murine scFv was achieved by guided selection-technology. The VH domain of the parental scFv was first combined with a human VL-repertoire and the two resulting human light chains were then joined to a repertoire of human VH-domains. Because no recombinant human scFv with hNKG2D binding activity could be identified by this technique a stepwise humanization process of the VH framework-region (FR) had to be performed while retaining the murine CDR-domains. This procedure resulted in the human scFv E1VLV71KVH which in addition to the murine CDRs merely contained three amino acids of murine origin in the FR. The biological activity of the E1VLV71KVH was analyzed in different in vitro-systems after conversion of the scFv fragment into the completely human IgG1/lambda antibody format. The results of these experiments revealed a noticeable loss of affinity and neutralizing function of the antibody after humanization and thus demonstrated the need for affinity maturation. Therefore, a sequential randomization of the CDR3 domains of E1VL and V71KVH was performed which resulted in five different anti-hNKG2D scFv fragments with high affinity. Two of these human constructs, B1VLB6VH and E4VLG10VH, were produced as fully human IgG1/ antibodies and examined in vitro with regard to their activating and neutralizing activity as well as their stability and internalization effects by NK cells. After affinity maturation, both antibodies exhibited more potent inhibitory activity at IC50 values of 3,4x 10-2 µg/ml compared to the original murine antibody (3,3 µg/ml) and showed a high rigidity to impact of heat and serum proteases. Internalization events of the antibodies by NK cells could be observed by fluorescence microscopic analysis. For a better understanding of NKG2D-dependent regulation processes and the identification of NKG2D-specific target genes, the expression profile of ULBP-1Fc stimulated human NK cells was determined using microarray technology. The microarray data were validated on both RNA- and protein-level using RT-qPCR, FACS, ELISA and CBA, and the following biological NKG2D-specific markers could be established: CRTAM, TNFalpha, IFNgamma and GM-CSF. In addition to the execution of 51Cr-release studies in two different in vitro cell culture systems these markers provided the basis for the characterization of the neutralizing and activating capacity of the human antibodies B1VLB6VH and E4VLG10VH. The findings of all these experiments indicated that the human anti-hNKG2D antibodies exhibit an ambivalent functionality: In solution the antibodies have the ability to inhibit NKG2D-specific CRTAM-Expression, cytolytic activity and cytokine release. However, cross-linking of NKG2D-receptor via plate-bound human anti-hNKG2D antibodies results in the induction of a cytolytic response and cytokine secretion by human NK cells. Due to the bifunctional activity of these two antibodies a therapeutic use in human autoimmune diseases does not seem to be feasible yet. Taken together, this thesis has provided the basis for the conversion of a human hNKG2D neutralizing antibody with high affinity into a more suitable antibody format (scFv, Fab or F(ab)2). KW - Antikörper KW - Autoimmunität KW - Immunmodulation KW - Natürliche Killerzelle KW - NKG2D KW - Phagen-Display KW - Humanisierung KW - NKG2D KW - NK cell KW - human IgG1 KW - phage display KW - autoimmune disease Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-33446 ER - TY - JOUR A1 - Peters, Annika E. A1 - Knöpper, Konrad A1 - Grafen, Anika A1 - Kastenmüller, Wolfgang T1 - A multifunctional mouse model to study the role of Samd3 JF - European Journal of Immunology N2 - The capacity to develop immunological memory is a hallmark of the adaptive immune system. To investigate the role of Samd3 for cellular immune responses and memory development, we generated a conditional knock-out mouse including a fluorescent reporter and a huDTR cassette for conditional depletion of Samd3-expressing cells. Samd3 expression was observed in NK cells and CD8 T cells, which are known for their specific function against intracellular pathogens like viruses. After acute viral infections, Samd3 expression was enriched within memory precursor cells and the frequency of Samd3-expressing cells increased during the progression into the memory phase. Similarly, during chronic viral infections, Samd3 expression was predominantly detected within precursors of exhausted CD8 T cells that are critical for viral control. At the functional level however, Samd3-deficient CD8 T cells were not compromised in the context of acute infection with Vaccinia virus or chronic infection with Lymphocytic choriomeningitis virus. Taken together, we describe a novel multifunctional mouse model to study the role of Samd3 and Samd3-expressing cells. We found that Samd3 is specifically expressed in NK cells, memory CD8 T cells, and precursor exhausted T cells during viral infections, while the molecular function of this enigmatic gene remains further unresolved. KW - viral infection KW - CD8 T cell KW - mouse model KW - NK cell KW - SAMD3 Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-257362 VL - 52 IS - 2 ER -