TY - THES A1 - Hötten, Stefanie Brigitte T1 - Atheroprotektive Effekte der neuronalen Stickstoffmonoxid-Synthase in Apolipoprotein-E-Knockout-Mäusen T1 - Atheroprotective effects of neuronal nitric oxide synthase in apolipoprotein-E knockout mice N2 - In dieser Arbeit wurde die Rolle der neuronalen Stickstoffmonoxid-Synthase in der spontanen Atheroskleroseentwicklung untersucht. Die Untersuchungen wurden an Apolipoprotein E-Knockout /neuronale Stickstoffmonoxid-Synthase-Knockout-Mäusen und Apolipoprotein E-Knockout-Mäusen durchgeführt, die zuvor 14 bzw. 24 Wochen mit einer ‚western-type’-Diät gefüttert worden sind. Durch eine immunhistochemische Analyse konnte zunächst gezeigt werden, dass neuronale Stickstoffmonoxid-Synthase in Plaques von Apolipoprotein E-Knockout Mäusen exprimiert wird. Nach 14 Wochen ‚western-type’- Diät zeigten männliche Apolipoprotein E-Knockout/neuronale Stickstoffmonoxid-Synthase-Knockout Tiere eine signifikante Zunahme der %-Läsionsfläche um 66%. Im Gegensatz dazu war die %-Läsionsfläche der weiblichen Apolipoprotein E-Knockout/neuronale Stickstoffmonoxid-Synthase-Knockout Tiere nach 14 Wochen unverändert, zeigte aber nach 24 Wochen eine signifikante Zunahme um 32 %. Aortengesamtfläche, Körpergewicht und Plasmacholesterinspiegel waren zwischen gleichgeschlechtlichen Tieren der verschiedenen Genotypen unverändert. Der mittlere arterielle Blutdruck der weiblichen Apolipoprotein E-Knockout/neuronale Stickstoffmonoxid-Synthase-Knockout Tiere war signifikant reduziert, bei den männlichen Tieren fand sich kein Blutdruckunterschied. Dieser Befund könnte eine mögliche Erklärung für die verzögerte Plaqueentwicklung bei weiblichen Apolipoprotein E-Knockout/neuronale Stickstoffmonoxid-Synthase-Knockout Tieren darstellen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass ein Mangel an neuronaler Stickstoffmonoxid-Synthase zu einer deutlichen Zunahme der Atherosklerose führt, so dass ein atheroprotektiver Effekt der neuronalen Stickstoffmonoxid-Synthase angenommen werden kann. N2 - To test whether nNOS deficiency affects atherosclerosis, we studied “western-type” diet fed apolipoprotein E-knockout/ neuronal nitric oxide synthase knockout and apolipoprotein E-knockout control animals. Mice were fed a “western type” diet for 14 and 24 weeks respectively. After 14 weeks of diet immunhistochemistry revealed neuronal nitric oxide synthase expression in the neointima and male apolipoprotein E-knockout/ neuronal nitric oxide synthase knockout animals showed a significant 66% increase in % lesion-area. In contrast lesion-area in female apolipoprotein E-knockout/ neuronal nitric oxide synthase knockout animals was unchanged at the 14 weeks time point, but significantly increased by 32% after 24 weeks. Total aortic area, total body weight and total plasma cholesterol did not differ between male animals and female animals of both genotypes. The mean arterial blood pressure was significantly reduced in female apolipoprotein E-knockout/ neuronal nitric oxide synthase knockout animals but was unchanged in male animals. The reduced blood pressure in female apolipoprotein E-knockout/ neuronal nitric oxide synthase knockout animals could be a possible explanation why lesion progression was delayed in this group. This data shows that a genetic deficiency of neuronal nitric oxide synthase increases atherosclerosis development in apolipoprotein E-knockout animals suggesting an atheroprotective effect of the neuronal nitric oxide synthase isoform. KW - Atherosklerose KW - neuronale Stickstoffmonoxidsynthase KW - Stickstoffmonoxid KW - atherosclerosis KW - neuronal nitric oxide synthase KW - nitric oxide Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-22093 ER - TY - THES A1 - Kamawal, Ariana T1 - Auswirkungen des NOS1 ex1f-VNTR Polymorphismus auf die Bewältigung kognitiver Shift-Aufgaben unter Messung der Hirnoxygenierung mittels funktioneller Nahinfrarotspektroskopie T1 - NOS1 ex1f-VNTR Polymorphism affects Brain Oxygenation in a Setshifting Task N2 - Ziel dieser Arbeit war eine verhaltensgenetische Untersuchung des NOS1-Gens, welches den NOS1 ex1f-VNTR Polymorphismus beinhaltet. Dieser gilt als Hotspot für mehrere psychiatrische Erkrankungen wie Schizophrenie, adultes ADHS und Impulsivitätsstörung. Er besitzt eine Funktionalität, durch die seine Genexpression von der Allelvariante (Long, L/Short, S) abhängig ist. Da der NOS1 ex1f- VNTR Polymorphismus hauptsächlich im Striatum exprimiert wird, wurde in der vorliegenden Arbeit die striatale Funktion mittels Setshifting-Paradigma unter Messung der Hirnoxygenierung durch funktionelle Nahinfrarotspektroskopie untersucht. In einer Pilotstudie wurde die region of interest erfasst. 62 gesunde Hauptprobanden wurden je nach Genotyp in drei Gruppen stratifiziert (LL/SS/SL). Es zeigten sich zwischen den Gruppen keine signifikanten Unterschiede im Bereich der Reaktionszeiten und Impulsivitätsneigung. Jedoch wies die SS-Gruppe eine signifikant höhere Hirnaktivierung und Fehlerrate im Vergleich zur LL-Gruppe auf. Somit konnte durch die vorliegende Arbeit die Funktionalität des NOS1 ex1f-VNTR Polymorphismus sowie die bei Short/Short-Allelträgern vorliegende striatale Dysfunktion bestätigt werden. N2 - NOS1 ex1f-VNTR Polymorphism is associated with several psychiatric diseases such as schizophrenia or impulsivity related disorders (i.e. adult ADHD, cluster B personality disorder). It is characterized by its functionality in that long (L) allel variants enhance gene expression and short (S) allele variants decrease transcriptional activity. Since the NOS1 ex1f-VNTR Polymorphism is mainly expressed in striatal neurons, striatal function was examined in a Setshifting-Paradigm while measuring prefrontal oxygenation with functional near-infrared spectroscopy. Region of interest was determined in a pilot study. 62 heathy control subjects were stratified in 3 groups according to their genotype (LL/SS/SL). While there were no significant differences in reaction time and self-reported impulsiveness, homozygous short alleled carrier showed significantly more activation and significantly higher error rates compared to homozygous long alleled carrier. These results confirm the functionality of NOS1 ex1f-VNTR Polymorphism and support the thesis of striatal dysfunction in short/short allele carrier. KW - Polymorphismus KW - Stickstoffmonoxid KW - NIR-Spektroskopie KW - NOS1 ex1f-VNTR Polymorphismus KW - Setshifting Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-184450 ER - TY - THES A1 - Bettaga, Noomen T1 - Bedeutung der NO-sensitiven Guanylyl Cyclase bei der Angiogenese und der Arteriogenese in der Maus T1 - Role of NO-sensitive guanylyl cyclase in angiogenesis and arteriogenesis in mice N2 - Stickstoffmonoxid (NO) spielt eine wichtige Rolle bei Gefäßremodelling-Prozessen wie Angiogenese und Arteriogenese. Die NO-Synthese im Gefäßsystem wird hauptsächlich durch die endotheliale NO-Synthase (eNOS) gewährleistet. Sie kann durch verschiedene Faktoren wie Scherkräfte und Zytokine wie der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) reguliert werden. VEGF ist ein wichtiger Stimulator der Angiogenese und wird während dieses Prozesses hochreguliert. Die meisten physiologischen Effekte von NO werden durch die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (NO-GC) vermittelt. Als Hauptrezeptor für NO produziert die NO-GC den sekundären Botenstoff cyklisches Guanosinmonophosphat (cGMP) und führt dadurch zur Stimulation der verschiedenen Effektoren wie z.B. der PKG. Ob die Wirkung von NO in Angiogenese und Arteriogenese ebenfalls durch NO-GC vermittelt wird, war bis zum Beginn dieser Arbeit noch unklar. Die NO-GC besteht aus zwei Untereinheiten (α und ß). Die Deletion der ß1-Untereinheit in Mäusen resultiert in einer vollständigen Knockout Maus (GCKO). Mithilfe des Cre-LoxP-Systems wurden zusätzlich zellspezifische Knockout-Mäuse für glatte Muskelzellen (SMC-GCKO) und Endothelzellen (EC-GCKO) generiert. Um die Rolle der NO-GC in der Angiogenese und Arteriogenese zu untersuchen, wurden drei gut etablierte Methoden benutzt. Im ersten Teil des Projekts sollte die Expression der NO-GC in Endothelzellen untersucht werden. Zu diesem Zweck wurde die reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) benutzt. Die Ergebnisse zeigen, dass die NO-GC in Endothelzellen der Lunge nur äußerst gering wenig exprimiert ist. Durch den Aortenring-Assay wurde eine Rolle der NO-GC bei der VEGF-vermittelten Angiogenese festgestellt. Dabei zeigte sich eine stärkere Angiogeneserate bei globaler Abwesenheit der NO-GC. Bei Fehlen der NO-GC ausschließlich in Endothelzellen zeigte sich kein Unterschied in den aussprossenden Aorten im Vergleich zu den Kontroll-Tieren. Dies zeigt, dass die NO-GC in Endothelzellen sehr wahrscheinlich keine Rolle bei der VEGF-vermittelten Angiogenese spielt. Im zweiten Teil wurde die Rolle der NO-GC bei der Angiogenese in einem in vivo-Modell untersucht. In dem Modell der Sauerstoff-induzierten-Retinopathie zeigten die GCKO-Mäuse eine verringerte Vaso-Obliteration, eine verlangsamte Angiogenese und eine erhöhte Tuft-Bildung. Ähnliche Ergebnisse wurden bei den SMC-GCKO-Tieren beobachtet. EC-GCKO-Mäuse zeigten eine gegenüber den Kontroll-Tieren unveränderte Vaso-Obliteration, Angiogeneserate und Tuft-Bildung. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die NO-GC in Endothelzellen keine Rolle spielt. Immunfluoreszenz-Aufnahmen zeigten die Expression von NO-GC in Perizyten der Gefäßkapillaren der Mausretina. Daher könnte die NO-GC in diesem Zelltyp letztendlich für die Effekte bei den GCKO- und SMC-GCKO-Tieren verantwortlich sein. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde eine Versuchsreihe unter Anwendung des Hinterlauf-Ischämie-Modells durchgeführt. Hierbei entwickelten die Pfoten aller GCKO- und teilweise der SMC-GCKO-Tiere nach der Ligation der Femoralarterie eine Nekrose. Die Regeneration der Hinterläufe der EC-GCKO-Tiere nach der Operation verlief normal. Diese Ergebnisse schließen eine bedeutende Rolle der NO-GC in Endothelzellen aus, zeigen allerdings, dass die NO-GC in den glatten Muskelzellen essentiell für den Arteriogenese-Prozess ist. Zusammengefasst führt die Deletion der NO-GC in glatten Muskelzellen und wahrscheinlich auch in Perizyten zur einer verlangsamten Angiogenese und Inhibierung der Arteriogenese. N2 - Nitric oxide (NO) plays an important role in vascular remodelling processes such as angiogenesis and arteriogenesis. The synthesis of NO in the vascular system is ensured mainly by endothelial NO synthase (eNOS). It can be regulated by a number of factors, such as shear stress and cytokines like the vascular endothelial growth factor (VEGF). VEGF is an important stimulator of angiogenesis and is upregulated during this process. Most of the physiological effects of NO are mediated by the NO-sensitive guanylyl cyclase (NO-GC). As the main receptor for NO, NO-GC produces the second messenger cyclic guanosine monophosphate (cGMP) and thereby leads to a variety of physiological effects. However, whether the effects of NO in angiogenesis and arteriogenesis are also mediated by NO-GC is still unclear. NO-GC consists of two subunits (α and ß). The deletion of the ß1 subunit in mice results in a global knockout mouse (GCKO). Using the Cre-LoxP system we also generated smooth muscle cell-specific (SMC GCKO) and endothelial cell-specific knockout mice (EC GCKO). To investigate the role of NO-GC in angiogenesis and arteriogenesis, three well-established methods have been used. In the first part of the project, the expression of the NO-GC in endothelial cells should be investigated. By using the reverse transcription polymerase chain reaction method (RT-PCR), the results show a very weak expression of the NO-GC in endothelial cells of the lung. A role for NO-GC in the VEGF-mediated angiogenesis was ascertained by the aortic ring assay. The results show an increased angiogenesis in the global absence of NO-GC. However, the EC-GCKO shows no difference compared to control mice. This indicates that NO-GC in endothelial cells is unlikely to play a major role in VEGF-mediated angiogenesis. In the second part of the project, the role of NO-GC in angiogenesis was investigated in an in vivo model. In the oxygen induced-retinopathy model (OIR), GCKO mice showed reduced vaso-obliteration, slowed angiogenesis and increased tuft formation. Similar results were observed in the SMC-GCKO animals. In contrast, EC-GCKO mice showed vaso-obliteration as well as angiogenesis rate and tuft formation similar to those seen in control animals. The results of this experiment suggest that NO-GC in endothelial cells is not involved in vaso-obliteration, physiological angiogenesis and tuft formation. Immunhistochemical analyses showed the expression of NO-GC in pericytes of the vascular capillaries of the mouse retina. Therefore, NO-GC in this cell type could be responsible for the effects in GCKO- and SMC-GCKO animals. In the last part of this thesis, hindlimb-ischemia experiments were performed. For this purpose, the paws of all GCKO- and some SMC-GCKO animals showed necrosis after ligation of the femoral artery. The regeneration of legs from EC-GCKO animals after the operation was normal. These results exclude a major role of NO-GC in endothelial cells, but show that NO-GC in smooth muscle cells is essential in the arteriogenesis process. In summary, the deletion of NO-GC in smooth muscle cells and probably also in pericytes leads to a slowed angiogenesis and inhibits arteriogenesis. KW - Guanylylcyclase KW - cGMP KW - Stickstoffmonoxid KW - Angiogenese KW - Arteriogenese KW - Maus Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-111284 ER - TY - THES A1 - Mai, Sandra T1 - Beeinflussung des oralen Entzündungsstatus und der Stickstoffmonoxid-Produktion bei nitratreicher Ernährung während kieferorthopädischer Behandlung T1 - Influence of nitrate-rich diet on oral inflammatory status and nitric oxide production during orthodontic treatment N2 - Während der Behandlung mit festsitzenden kieferorthopädischen Multibracket-Apparaturen sind gingivale Entzündungen, Plaque und Karies häufig beobachtete Beeinträchtigungen der oralen Gesundheit. Diese sind häufig auf Biofilme zurückführbar, welche sich durch Eingliederung von Multibracket-Apparaturen auf zusätzlichen Oberflächen und Nischen etablieren können. Ziel dieser klinischen Studie war es, zu evaluieren, ob der 14-tägige Verzehr eines nitratreichen Gemüsesafts bei Kindern und Jugendlichen mit Multibracket-Apparaturen zu einer Beeinflussung des oralen Entzündungsstatus und der Stickstoffmonoxid-Produktion führen kann. Es zeigte sich eine tendenzielle Verbesserung des Plaque Control Record bei Patienten/innen, welche der Saftgruppe zugeteilt waren, jedoch erreichte diese Änderung nicht das Signifikanzniveau. Der Gingiva Index reduzierte sich nach der Safteinnahme signifikant, wohingegen er in der Kontrollgruppe im Studienverlauf anstieg. Die Messung des Stickstoffmonoxid-Gehalts zeigte in keiner der Studiengruppen signifikante Erkenntnisse. Nach der Safteinnahme konnte die Anzahl an kariogener Laktobazillen signifikant verringert werden. Die Messung der tiefen Taschen und der Blutung auf Sondierung (BoP) kam zu dem Ergebnis, dass in der Saftgruppe von Termin 1 zu 2 (Zeitpunkt der Safteinnahme) im Bereich der Frontzähne, Eckzähne und Prämolaren beide Parameter signifikant reduziert werden konnten. Im Bereich der Molaren kam es zu einer nicht signifikanten Reduktion. In der Kontrollgruppe hingegen stieg der BoP-Wert im Studienverlauf an und die tiefen Taschen zeigten keine signifikanten Änderungen. Die Daten dieser klinischen Studie legen nahe, dass der Konsum eines Gemüsesafts mit erhöhtem Gehalt an Nitrat bei Kindern mit festsitzenden kieferorthopädischen Multibracket-Apparaturen zu einer Reduktion von Gingivitis, Plaque, erhöhten Taschentiefen und Blutung auf Sondierung führen kann. Die erhobenen Daten stellen daher eine Grundlage für zukünftige Studien zur Optimierung der klinischen Behandlung von Patienten/innen mit Multibracket-Apparatur-induzierten Entzündungen dar. N2 - During treatment with fixed orthodontic multibracket appliances gingival inflammation, plaque and caries are frequently observed impairments of oral health. These are often due to biofilms, which can be established on additional surfaces and niches. The aim of this clinical study was to evaluate whether the 14-day consumption of a nitrate-rich vegetable juice in children and adolescents with multibracket appliances can lead to an influence on oral inflammatory status and nitric oxide production. There was a trend toward improvement in the Plaque Control Record in patients assigned to the juice group, but this change did not reach the significance level. The Gingiva Index decreased significantly after juice intake, whereas it increased in the control group during the course of the study. Measurement of nitric oxide levels showed no significant findings in any of the study groups. There was a significant reduction in the number of cariogenic lactobacilli after juice ingestion. Measurement of deep pockets and Bleeding on Probing (BoP) concluded that both parameters were significantly reduced in the juice group from date 1 to 2 (time of juice intake) in the anterior, canine and premolar regions. In the molar region, there was a non-significant reduction. In the control group, however, the BoP increased over the course of the study and the deep pockets showed no significant changes. The data from this clinical study suggest that the consumption of a vegetable juice with an increased nitrate level may lead to a reduction of gingivitis, plaque, increased pocket depths, and Bleeding on Probing in children with fixed orthodontic multibracket appliances. The data collected therefore provide a basis for future studies to optimize the clinical management of patients with multibracket appliance-induced inflammation. KW - Gingivitis KW - oraler Entzündungsstatus KW - Zahnfleischentzündung KW - Gemüsesaft KW - Stickstoffmonoxid KW - Multibracket-Apparatur Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-328029 ER - TY - THES A1 - Schröttle, Angelika T1 - Die Inhibition der Leukozyten-Endothelzell-Interaktionen durch endotheliales Stickstoffmonoxid T1 - The inhibition of leukocyte-endothelial cell-interactions by endothelial nitric oxide N2 - Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle der endothelialen Stickstoffmonoxid-Synthase in Hinblick auf die Leukozyten-Endothelzell-Interaktionen bei der spontanen Arterioskleroseentwicklung zu untersuchen. Apolipoprotein E knockout-Mäuse und Apolipoprotein E knockout/endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase knockout-Mäuse dienten dabei als genetisches Modell. Durch IVM-, Real-time PCR-, Western Blot und immunhistochemische Versuche konnte gezeigt werden, dass apoE/eNOS dko-Tiere im Vergleich zu apoE ko-Kontrollen signifikant erhöhte L/E-Interaktionen, eine verstärkte endotheliale Adhäsionsmolekülexpression und eine gesteigerte Makrophagen-Infiltration in die Gefäßwand aufweisen. Duplexsonographisch vergleichbare Widerstands-Indices bei beiden Genotypen belegen eine ähnliche Hämodynamik und schließen veränderte Flussbedingungen als Ursache der erhöhten L/E-Interaktionen aus. Zusammenfassend kann man sagen, dass die verminderte NO-Produktion in apoE/eNOS dko-Mäusen die gesteigerten Leukozyten-Endothelzell-Interaktionen in diesem Modell bedingt und andere Quellen vaskulären Stickstoffmonoxids, genauer gesagt nNOS und iNOS, dies nicht zu kompensieren vermögen. Überraschenderweise nahm die eNOS-Deletion keinen Einfluss auf die Thrombozyten-Endothelzell-Interaktionen, was gegen eine bedeutende Rolle von Blutplättchen bei der beschleunigten Arterioskleroseentwicklung von apoE/eNOS dko-Mäusen spricht. N2 - It was the aim of the study to analyse the role of the endothelial nitric oxide synthase with regard to the leukocyte-endothelial cell-interactions in spontaneous arteriosclerosis development. Apolipoprotein E knockout mice and apolipoprotein E/endothelial nitric oxide synthase double knockout mice served as genetic models. Intravital microscopy, real-time PCR, western blot and immunohistochemical experiments revealed significantly increased leukocyte-endothelial cell (L/E)-interactions, an elevated expression of endothelial surface adhesion molecules and a heightened macrophage infiltration in carotid arteries in apoE/eNOS dko mice compared to apoE ko control animals. Comparable resistance indexes in duplex ultrasonography of both genotypes show similar hemodynamics and exclude altered flow conditions as cause of increased L/E-interactions. In summary you can say that reduced NO-production in apoE/eNOS dko mice causes the increased L/E-interactions and that other sources of vascular nitric oxide, more precisely nNOS and iNOS, are unable to compensate for that. Surprisingly, eNOS deletion didn’t influence platelet-endothelial cell-interactions, which argues against an important role of platelets in accelerated arteriosclerosis development of apoE/eNOS dko mice. KW - Arteriosklerose KW - Stickstoffmonoxid KW - Leukozyt KW - Endothel KW - endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase KW - Leukozyten-Endothelzell-Interaktionen KW - endotheliale Adhäsionsmoleküle KW - ApoE/eNOS dko-Mäuse KW - arteriosclerosis KW - endothelial nitric oxide synthase KW - leukocyte-endothelial-interactions KW - endothelial adhesion molecules Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-54411 ER - TY - THES A1 - Rosel, Eva Annemarie T1 - Die Rolle der endothelialen Stickstoff-Monoxid-Synthase (eNOS) in der Endothelaktivierung T1 - The role of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) in endothelial activation N2 - Im Mittelpunkt der Arbeit stand die Rolle der endothelialen Stickstoff-Monoxid-Synthase (eNOS) für die Endothelaktivierung. Für diese Untersuchungen wurde die MLEC-Zellkulturtechnik (murine lung endothelial cells) und die Gegenüberstellung des Wiltyp- und eNOS-Knockout-Genotyps verwendet. Die MLEC-Kulturen wurden aus dem mikrovaskulären Stromgebiet der Lungen von C57Bl6-Wildtyp-Mäusen (WT) und von eNOS-Knockout-Mäusen (KO) angelegt und immunomagnetisch (Anti-CD102) zweifach selektioniert. Die Reinheit der Kulturen für Endothelzellen nach zwei Selektionen lag bei über 95%. WT-Endothelzellen produzieren eine basale Menge an Stickstoff-Monoxid (NO). Sie steigern ihre NO-Produktion nach Stimulation mit VEGF (vascular endothelium growth factor), mit dem Kalzium-Ionophor Ionomycin sowie unter Scherkraftexposition. Die eNOS-Proteinexpression erhöht sich dementsprechend nach 12 Stunden Scherkraftexposition. WT- und eNOS-KO-Endothelzellen unterscheiden sich unter basalen Bedingungen nicht in ihrer Oberflächenexpression der Adhäsionsmoleküle ICAM-1, E-Selektin, P-Selektin und VCAM-1. Nach Zytokin-Stimulation erhöhen beide Genotypen ihr Adhäsionsmolekülprofil in gleicher Weise. Sowohl WT- als auch eNOS-KO-Endothelzellen verfügen zudem über einen schnellen Mechanismus, der die Hochregulation der P-Selektin-Oberflächenexpression nach Stimulation mit Thrombin oder Menadion in gleicher Weise ermöglicht. Auf Stimulation mit Thrombin oder Menadion reagieren WT-Zellen mit einem signifikanten Anstieg der Produktion von freien Sauerstoff-Radikalen (ROS, rapid oxygen species). eNOS-KO-Zellen zeigen eine im Vergleich zum WT erhöhte basale ROS-Produktion. Diese lässt sich auch nach Stimulation nicht weiter steigern. Die experimentellen Ergebnisse zeigen, dass die MLEC-Zellkulturtechnik ein verlässliches Modell für Untersuchungen an Gefäßendothelzellen darstellt. eNOS-KO-Zellen exprimieren nicht automatisch mehr Adhäsionsmoleküle an der Zelloberfläche als WT-Zellen. Allerdings ist die basale Produktion von ROS in eNOS-KO-Zellen vermehrt. Folglich ist in diesem Modell eNOS nicht für die konstitutive Suppression der endothelialen Aktivierung verantwortlich. Der NO-Effekt kann nicht in einer direkten und kontinuierlichen Unterdrückung der endothelialen Oberflächenaktivierung liegen. Das Fehlen von NO führt vielmehr zu einer Verschiebung des Gleichgewichts zwischen dem Radikalfänger NO und O2- (Superoxid) zugunsten von O2-. Aufgrund dieses Ungleichgewichts ist die basale ROS-Produktion von eNOS-KO-Zellen vermutlich erhöht. Damit wird die Endothelzelle empfindlicher gegenüber zusätzlichem oxidativen Stress. Die eNOS-KO-Zellen können die höhere ROS-Belastung in den durchgeführten Untersuchungen kompensieren. Es ist aber denkbar, dass bei zusätzlichem oxidativen Stress ein erhöhtes Maß an O2- das Startsignal für die Abläufe der endothelialen Aktivierung darstellt. N2 - The objective of this study was the role of the endothelial nitric oxide synthase (eNOS) in endothelial activation. To do this we used MLEC cell cultures (murine lung endothelial cells) and the comparison between wildtype- and eNOS-knockout-genotype. MLECs were generated from microvascular lung tissue from C57Bl6-wildtype-mice (WT) and from eNOS-knockout-mice (KO) by immunomagnetic bead selection (anti-CD102). The endothelial cell cultures purity after twofold selection was > 95%. WT-endothelial cells produced a baseline amount of nitric oxide (NO). After stimulation with VEGF (vascular endothelium growth factor), with the calcium-ionophore ionomycin or after exposure to shear stress, WT-endothelial cells produced significantly higher amounts of NO. Simultaneously eNOS-protein expression was upregulated after 12 hours of shear stress exposure. Resting WT- and eNOS-KO-endothelial cells showed no difference in their surface expression of the adhesion molecules ICAM-1, E-Selektin, P-Selektin- and VCAM-1. Stimulation with cytokines led to an equally strong increase of the adhesion molecule expression in both genotypes. WT- as well as eNOS-KO-endothelial cells show a rapid mechanism to upregulate the surface expression of P-Selektin in a similar way after stimulation with thrombin or menadione. WT-endothelial cells showed a significant increase in the generation of rapid oxygen species (ROS) following stimulation with thrombin or menadione. The baseline level of ROS generation in eNOS-KO-endothelial cells is higher than in WT-cells and cannot even be increased upon stimulation. The results show that the MLEC-cell culture technique is a valid model for experimental research in vascular endothelial cells. eNOS-KO-cells do not automatically express a higher amount of adhesion molecules on their surface. However the baseline generation of ROS in eNOS-KO-cells is increased. Therefore eNOS is not responsible for the constitutive suppression of endothelial activation in this model. eNOS-derived NO is not required for the direct and continuous suppression of endothelial surface activation. The absence of NO leads to an imbalance between the scavenger NO and O2- (superoxide) in favour of O2-. It is probably because of this imbalance that the baseline ROS-generation in eNOS-KO-cells is increased. This causes endothelial cells to be more sensitive to oxidative stress. In our experiments the eNOS-KO-cells can compensate for the higher baseline ROS-level. It is however conceivable that an increased level of O2- as an additive oxidative stress may lead to starting signals for endothelial activation. KW - Stickstoffmonoxid KW - Stickstoffmonoxid-Synthase KW - Endothel KW - Zellkultur KW - Arteriosklerose KW - eNOS KW - eNOS-knockout KW - Endothelaktivierung KW - Mausmodell KW - endothelial nitric oxide synthase KW - eNOS-knockout KW - endothelial activation KW - nitric oxide KW - mouse model Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27824 ER - TY - THES A1 - Uhlenhut, Klaus T1 - Effekte eines standardisierten Kiefernrindenextraktes und dessen Metabolit auf NO und NO-Synthasen T1 - Effects of a standardized pine bark extract and its metabolite on NO and NO-synthases N2 - Um die Grundlagen für die in klinischen Studien beim Einsatz des standardisierten Kiefernrindenextraktes (Pycnogenol®) gefundenen Effekte auf einer mechanistischen zellulären Ebene aufzuklären, wurde in der hier vorliegenden Arbeit der Einfluss der Komponenten des Extraktes und dessen Metabolit M1 (chemisch benannt δ-(3,4-Dihydroxyphenyl)-γ-valerolacton bzw. 5 (3,4 Dihydroxybenzyl)dihydrofuran 2(3H) on) hinsichtlich der Wirkung auf Stickstoffmonoxid(= NO)-produzierende Systeme untersucht. NO ist an einer Vielzahl von physiologischen und pathophysiologischen Prozessen in lebenden Organismen beteiligt. Im Menschen sind bislang drei NO-Synthasen bekannt: die induzierbare (iNOS), die hinsichtlich der Pathologie vor allem mit entzündlichen Vorgängen assoziiert wird, die endotheliale (eNOS), die bei Gefäß- und Herzkreislauferkrankungen eine Rolle spielt, und die neuronale (nNOS), die mit der Gedächtnisbildung, aber auch mit zytotoxischen Prozessen im Gehirn etwa bei Morbus Alzheimer oder der Parkinson-Krankheit in Verbindung gebracht wird. Der nach peroraler Einnahme des Extraktes im Darm durch metabolisierende Kolonbakterien entstehende und darauf im Plasma erscheinende Metabolit M1, dem bei allen durchgeführten Untersuchungen besonderes Augenmerk zuteil wurde, zeigte eine starke konzentrationsabhängige Inhibierung der NO-Freisetzung der iNOS aus einer durch einen Entzündungsreiz stimulierten murinen Makrophagenzellkultur (IC50= 1,28 µg/mL). Im Vergleich mit Fraktion I des Kiefernrindenextraktes, die vor allem monomere Extraktbestandteile enthält, und Hydrocortison zeigte M1 zusätzlich einen stärkeren Hemmeffekt auf die NO-Freisetzung nach dem Entzündungsreiz. Die Zytotoxizität von M1 im Testsystem war dabei als gering einzustufen. Interessanterweise wurde neben den NO-Radikalfängereigenschaften von M1 auch ein deutlich hemmender konzentrationsabhängiger Effekt auf die iNOS-Proteinexpression gefunden (IC50= 3,78 µg/mL). Da die bislang im Plasma bestimmten M1-Konzentrationen deutlich geringer als die in Zellkulturversuchen wirksamen waren, wurde eine mögliche Anreicherung von M1 in Gegenwart von Serumproteinen in humanen Endothelzellen, primären Monozyten und murinen Makrophagen untersucht. Dabei wurde eine starke Bindung von M1 an die Zellen gezeigt und Hinweise für eine potentiell erleichterte Aufnahme von M1 durch membranständige Transporter unter Einsatz eines Influx-Hemmers (Phloretin) gefunden. Zur Untersuchung der eNOS, die sehr geringe Mengen NO produziert, wurden neue methodische Ansätze entwickelt. In diesem Zusammenhang wurden zuvor unbekannte Fallstricke bei der Verwendung der Fluoreszenzsonde DAF-2 (4,5-Diaminofluorescein) zur NO-Detektion und dem Einsatz unterschiedlicher Detektionssysteme entdeckt. DAF-2 zeigte unter verschiedenen Bedingungen auch ohne extern zugegebene NO-Quelle und besonders beim Einfrieren/Auftauen unerwarteterweise eine Konversion zum korrespondierenden NO-Addukt (DAF-2T). Die eingesetzten monomeren Testsubstanzen ((+)-Catechin, (-)-Epicatechin, Resveratrol, M1) waren über die Testzeiträume deutlich instabil mit dynamischer Eigenfluoreszenz. Sowohl über kurze (≤ 45 min) als auch über längere Zeiträume (14-20 h) wurde entsprechend der Redoxaktivität der eingesetzten Polyphenole eine konzentrationsabhängige scheinbar hemmende Wirkung auf die extrazelluläre NO-Freisetzung der eNOS gezeigt. Die eNOS-Proteinexpression blieb durch die verwendeten Monomere weitestgehend unbeeinflusst. Durch eine hohe Konzentration der Fraktion I des Kiefernrindenextraktes wurde eine Steigerung der eNOS-Proteinkonzentration in Endothelzellen gefunden, wobei zytotoxische Artefakte dabei nicht auszuschließen waren. Als kompetitive endogene Inhibitoren der NOS wurden in vivo in jüngster Zeit methylierte Arginine (ADMA= asymmetrisches, SDMA= symmetrisches Dimethylarginin) entdeckt. In einer randomisierten, kontrollierten, doppelt-blinden klinischen Studie mit einem Cross-over Design am Universitätsklinikum Zürich mit 28 Patienten, die an einer koronaren Herzerkrankung litten, wurden die Plasmaspiegel methylierter Arginine vor und nach 8 wöchiger Einnahme des Kiefernrindenextraktes bestimmt. Es zeigte sich dabei trotz einer Verbesserung der flussinduzierten Gefäßerweiterungskapazität (Flow-mediated dilation) und Verringerung der 15-F2t-Isoprostan-Plasmaspiegel keine signifikante Veränderung der Plasmakonzentrationen von ADMA, SDMA und ET-1 (Endothelin-1) durch die Einnahme des Extraktes. Die nNOS kommt vor allem im Gehirn, aber auch in Muskelzellen vor. Der Einsatz des Metaboliten M1 führte zu keinen deutlichen Effekten auf die konstitutive nNOS-Expression in einem Rhabdomyosarkom(A-673)-Zellkulturmodell. Zur Beantwortung der Frage, wie wahrscheinlich es ist, dass zur möglichen Beeinflussung von (patho)-physiologischen zerebralen Prozessen Polyphenole in vivo das Gehirn erreichen, wurde erstmals ein in silico-Modell zur Vorhersage der Verteilung von ausgewählten polyphenolischen Substanzen zwischen Blut und Gehirn entwickelt. Damit wurde anschließend eine Reihenfolge mit logBB-Werten (logarithmierter Quotient aus Konzentration im Blut und im Gehirngewebe) geordnet nach einer entsprechend dem Modell wahrscheinlich höheren Verteilung ins Gehirn für die untersuchten Substanzen berechnet: Protocatechusäure < Quercetin < Cyanidin < (+) Catechin < (-)-Epicatechin < Phloretin < M1. Insgesamt schienen die untersuchten polyphenolischen Substanzen eher schwach bluthirnschrankengängig zu sein. Der Metabolit M1 zeigte den höchsten logBB-Wert und somit die höchste Wahrscheinlichkeit der untersuchten Polyphenole, die Blut-Hirnschranke in vivo zu überwinden. Im Kontext einer möglichen Anwendung bei chronisch-entzündlichen Erkrankungen wurde zusätzlich ein Extrakt aus der Frucht von Morinda citrifolia L. in einem primären Monozyten-Zellkulturmodell auf seine Eigenschaften hin die Sekretion der Matrix-Metalloprotease-9 (MMP-9) aus Immunzellen nach einem Entzündungsreiz zu beeinflussen untersucht. Dabei zeigten die Extraktverdünnungen deutliche konzentrationsabhängige Hemmeffekte um bis zu ~50 % der maximalen MMP-9 Sekretion, die mit dem Einsatz von Hydrocortison vergleichbar waren. Somit konnten in der vorliegenden Arbeit neue Beiträge zur Wirkungsweise der untersuchten Pflanzenextrakte und vor allem zum Verständnis der möglichen Effekte von Polyphenolen auf physiologisch relevante NO-Systeme sowie zur methodischen Wissenserweiterung der komplexen NO-Analytik geleistet werden. N2 - Many clinical trials with the administration of a standardized maritime pine bark extract (Pycnogenol®) have shown benefical effects. In order to study the basic mechanistic principles of how the extract might work on a cellular level the impact of the extract components and especially of the metabolite M1 (chemically named δ-(3,4-Dihydroxyphenyl)-γ-valerolactone or 5 (3,4 Dihydroxybenzyl)dihydrofuran 2(3H) one) on nitric oxide (NO) producing systems was tested and evaluated. NO is involved in many physiological and pathophysiological processes in living organisms. There are three different isoforms of NO-synthases (NOS) known in humans so far: the inducible NOS (iNOS) is pathologically associated with inflammatory processes, the endothelial NOS (eNOS) is linked to (cardio-)vascular diseases, and the neuronal NOS (nNOS) plays a role in memory formation, but is also put in context to neuronal cytotoxicity within the course of Alzheimer’s and Parkinson’s disease. The metabolite M1 is generated by microbiota in the human colon after per os ingestion of the pine bark extract and thereafter enters the circulation. M1 showed a strong concentration dependent inhibition of NO-release by iNOS from murine macrophages after an inflammatory stimulus (IC50= 1.28 µg/mL). M1 was even more potent at inhibiting NO-release from macrophages than fraction I of the pine bark extract, which predominantly contains monomeric extract compounds, and slightly more potent than hydrocortisone. Cytotoxicity of M1 was found to be modest in the test system. In addition to the NO-radical scavenging activities of M1 there were also profound concentration dependent inhibitory effects on iNOS protein expression (IC50= 3.78 µg/mL). As there is a gap between determined plasma concentrations of M1 after pine bark extract ingestion and required bioactive concentrations in cell culture test systems the binding of M1 to human endothelial cells, human monocytes and murine macrophages in the presence of serum proteins was determined in order to test for cellular M1 accumulation. There was a strong binding of M1 to these cells and a possible facilitated uptake via distinct membrane transporters was shown with using an influx-inhibitor (phloretin). In order to analyze the very small amounts of NO produced by eNOS new methodic approaches were established. Formerly unkown pitfalls and limitations with using the fluorescence dye DAF-2 (4,5-diaminofluorescein) and with applying different detection systems for NO were revealed. DAF-2 was subject to conversion to the NO adduct triazolofluorescein (DAF-2T) even without an externally added NO source under certain assay and storage conditions, especially after freezing and thawing sample solutions. Thus control of spontaneous reagent conversion is advisable. The monomers (+)-catechin, (-)-epicatechin, resveratrol, and M1 were not stable over time and displayed highly dynamic auto-fluorescence. In accordance with their radical scavenging activity the polyphenols seemingly showed a concentration dependent inhibitory effect on NO-release from endothelial cells over short (≤ 45 min) and longer incubation periods (14-20 h). After incubation with the monomers eNOS-protein expression was not markedly affected. When applying very high concentrations of fraction I of the extract an increase of cellular eNOS protein content was observed, but cytotoxic artefacts could not be ruled out though. Recently, competitive endogenous in vivo inhibitors of NOS were identified as methylated arginines (ADMA= asymmetric-, SDMA= symmetric dimethylarginine). In the course of a randomized, double-blind, placebo-controlled and cross-over designed clinical trial, which was conducted at the University of Zurich and enrolled 28 coronary heart disease patients, plasma concentrations of methylated arginines before and after the 8-week intake of pine bark extract were determined. Despite of improvements in flow-mediated dilation parameters and decrease of 15-F2t-Isoprostane plasma concentrations there was no significant alteration of plasma concentrations of ADMA, SDMA and ET-1 (endothelin-1) after the pine bark extrakt intake. The nNOS is found in neuronal cells but is also expressed in other cell types like muscle cells. In a rhabdomyosarcoma (A-673) cell culture model the metabolite M1 had no meaningful effect on nNOS expression. In order to contribute answering the question whether polyphenols are likely to cross the blood brain barrier an in silico model for predicting polyphenol distribution between blood and brain tissue (logBB) was developed. logBB values for selected polyphenols were calculated and resulted in the following rank order with increasing probability of an uptake into the brain: protocatechuic acid< quercetin < cyanidin < (+) catechin < (-)-epicatechin < phloretin < M1. The metabolite M1 showed the highest logBB value of the tested polyphenols and thus had the highest predicted feasibility for crossing the blood brain barrier as described with the newly established computer based model. The extract of the fruits from Morinda citrifolia L. is traditionally utilized for the treatment of inflammatory diseases. Applying a primary human monocyte cell culture model the extract was tested for its ability to inhibit the secretion of matrix-metalloprotease-9 after an inflammatory stimulus. Dilutions of the extract in cell culture media showed profound concentration dependent inhibitory effects with up to a ~50 % decrease of metalloprotease secretion that were comparable to hydrocortisone. Thus, new and substantial contributions were made in this work allowing a better understanding of the mode of action of the tested plant extracts, especially of the effects of polyphenols on physiological relevant nitric oxide systems, and gaining a deeper methodical knowledge in the challenging field of NO-analysis. KW - Stickstoffmonoxid KW - Strandkiefer KW - Rinde KW - Extrakt KW - Stickstoffmonoxid-Synthase KW - Metabolit KW - EA.hy 926 KW - DAF-2 KW - Radikal KW - HPLC KW - Monozyten KW - free radicals KW - DAF-2 KW - (+)-Catechin KW - nitric oxide KW - metabolite KW - hplc KW - EA.hy 926 KW - monocyte KW - macrophage Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72102 ER - TY - THES A1 - Dünnes, Sarah T1 - Einfluss der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase auf den cGMP/cAMP-Crosstalk und die Steifigkeit der murinen Aorta T1 - Influence of NO-sensitive guanylyl-cyclase on cGMP/cAMP crosstalk and the stiffness of the murine aorta N2 - Die NO/cGMP-vermittelte Signalkaskade ist im vaskulären System entscheidend an der Regulation des Blutdrucks beteiligt. Innerhalb der Kaskade nimmt die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (NO-GC) eine Schlüsselfunktion als wichtigster Rezeptor für das Signalmolekül Stickstoffmonoxids (NO) ein. NO wird endogen von verschiedenen Isoformen der NO Synthase produziert. Die Bindung von NO an die NO GC führt zur Produktion des sekundären Botenstoffs cyclisches Guanosinmonophosphat (cGMP). Dieser Botenstoff aktiviert verschiedene Effektor-Moleküle und bewirkt letztlich eine Relaxation der glatten Muskulatur. Ein weiterer sekundärer Botenstoff, das Signalmolekül cyclisches Adenosinmonophosphat (cAMP), ist ebenfalls an der Regulation des Tonus der glatten Muskulatur und dadurch an der Blutdruckregulation beteiligt. Unterschiedliche Phosphodiesterasen (PDE) bauen die sekundären Botenstoffe ab und beenden dadurch die Signalkaskaden. Die PDE3 spielt hierbei eine besondere Rolle, da sie eine gemischte Substratspezifität besitzt. Um den Einfluss der NO-GC auf das kardiovaskuläre System zu untersuchen, wurden NO-GC Knockout(KO)-Mäuse mit globaler (GCKO) oder Glattmuskel-spezifischer (SMC-GCKO) Deletion der NO-GC generiert. Um das Zusammenspiel von cAMP und cGMP näher zu beleuchten, wurde im ersten Teil dieser Arbeit die PDE3 genauer untersucht. Im Gefäßsystem wird lediglich die PDE3A und nicht die PDE3B exprimiert. Die Aorten von GCKO- und SMC-GCKO-Tieren reagieren sensitiver auf PDE3A-Blockade als die Kontroll-Tiere. Auch die akute Blockade der NO-GC führt zu diesem Sensitivitätseffekt. Die PDE3A ist in Folge der NO-GC-Deletion sowohl in ihrer Expression, als auch ihrer Aktivität um die Hälfte reduziert. Dies dient vermutlich kompensatorisch dazu, das cAMP-Signal weitgehend zu erhalten und so eine cAMP-induzierte Relaxation der Gefäße zu gewährleisten. Ohne Rückkopplung zwischen den beiden Signalwegen käme es vermutlich zu weiteren negativen Konsequenzen für das Herz-Kreislaufsystem. Diese Daten weisen auf eine direkte Regulation der PDE3 in glatten Muskelzellen durch die NO/cGMP-Signalkaskade und einen PDE3-vermittelten cAMP/cGMP-Crosstalk hin. Der genaue Mechanismus dieser Expressionsregulation ist noch unklar. Denkbar wäre eine cGMP-vermittelte Transkriptionsregulation oder eine Modulation der Translation der PDE3A. Der Verlust der NO-GC führt in GCKO- und SMC-GCKO-Mäusen zu einem erhöhten systolischen Blutdruck von ~30 mmHg. Bei der Entwicklung der arteriellen Hypertonie könnte eine erhöhte Aortensteifigkeit beteiligt sein, die im zweiten Teil dieser Arbeit näher untersucht wurde. In GCKO-Mäusen ist die aortale Steifigkeit und daraus resultierend die Pulswellengeschwindigkeit (PWV) deutlich erhöht. Die Steigerung der PWV wird in den GCKO-Tieren zusätzlich durch den verminderten Aorten-Durchmesser bedingt. Außerdem weisen die Aorten dieser Tiere eine veränderte Wandstruktur auf, die zu einer Verminderung der aortalen Windkesselfunktion führt. Diese Veränderungen könnten die Blutdruckerhöhung in GCKO-Mäusen erklären. In SMC-GCKO-Tieren tritt keine dieser Gefäß-Modifikationen auf. Eine Aortensteifigkeit als mögliche Ursache für den erhöhten systolischen Blutdruck in den SMC-GCKO-Tieren kann somit ausgeschlossen werden. Zur Aufklärung müssen weitere Versuche zum Aufbau der Gefäßwände und zur Bestimmung des peripheren Widerstands gemacht werden. Auch der Einfluss anderer Zelltypen, wie z.B. Perizyten oder Fibroblasten, auf die Blutdruckregulation sollte untersucht werden. N2 - The NO/cGMP-mediated signaling cascade is crucially involved in the regulation of blood pressure. Within the cascade, NO-sensitive guanylyl cyclase (NO-GC) plays a key role as the most important receptor for the signaling molecule nitric oxide (NO). NO is endogenously produced by three different isoforms of NO synthase. Binding of NO to NO-GC stimulates the production of the second messenger cyclic guanosine monophosphate (cGMP). cGMP, in turn, activates various effector molecules, finally leading to smooth muscle relaxation. Another second messenger, the signalling molecule cyclic adenosine monophosphate (cAMP), also participates in the regulation of smooth muscle tone and is thus also involved in the regulation of blood pressure. Phosphodiesterases (PDE) degrade cyclic nucleotides thereby ending their signalling. In order to investigate the effect of NO-GC on the cardiovascular system, mice with global (GCKO) or smooth muscle-specific (SMC-GCKO) deletion of NO-GC have been generated. To shed light into the interplay of cAMP and cGMP, PDE3 was studied in the first part of this thesis. PDE3 plays a special role in cGMP/cAMP crosstalk based on its mixed substrate specificity. From the two PDE3 isoenzymes (PDE3A and PDE3B), only PDE3A is expressed in the aorta. The aortas of GCKO- and SMC-GCKO animals are more sensitive to PDE3A inhibition than those from control animals. The acute blockade of NO-GC using ODQ also leads to this sensitivity effect. As a result of NO-GC deletion, PDE3A expression and activity are reduced by approx. 50%. This is probably a compensatory response in order to maintain functional cAMP signalling and to guarantee cAMP-induced relaxation of blood vessels. These results indicate a direct regulation of PDE3A in smooth muscle cells by the NO/cGMP-signalling cascade and a PDE3-mediated cAMP/cGMP crosstalk. The exact mechanism how NO-GC/cGMP regulates PDE3A expression remains unclear; conceivable options are a cGMP-mediated regulation of transcription or a modulation of PDE3A translation. Loss of NO-GC in GCKO and SMC-GCKO mice leads to an elevated systolic blood pressure by around 30 mmHg. In the second part of this thesis, stiffness of aortae from these KO animals was examined. In GCKO mice, the pulse wave velocity (PWV) was significantly faster than in control animals indicating an increased aortic stiffness. The increase in PWV in GCKO animals is likely to be explained by a reduced aortic diameter. Even though elastin and collagen content were unchanged, the aortas of these animals have an altered wall structure. SMC-GCKO animals show neither an increase in PWV nor morphological changes of the aorta. Thus, an increased aortic stiffness can be excluded as cause for the elevated systolic blood pressure in GCKO animals. KW - Knock-Out KW - Maus KW - Guanylatcyclase KW - Cyclo-GMP KW - Aorta KW - Guanylyl-Cyclase KW - Cyclo-AMP KW - Stickstoffmonoxid KW - Phosphodiesterase 3 KW - Pulswellengeschwindigkeit Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-141479 ER - TY - THES A1 - Heintel, Timo Michael T1 - Einfluss von Stickstoffmonoxid auf die Genexpression humaner artikulärer Chondrozyten während Expansion und Redifferenzierung in einem in-vitro-Modell T1 - Influence of nitric oxide on the gene expression of human articular chondrocytes during expansion and redifferentiation in an in vitro-modell N2 - Bei der Kultivierung humaner artikulärer Chondrozyten für eine mögliche therapeutische Anwendung gilt es, deren besondere zellphysiologische Eigenschaften zu berücksichtigen, um ein zell- und molekularbiologisch hochwertiges Transplantat erzielen zu können. Stickstoffmonoxid (NO) gilt als ein wichtiger Faktor für die Homöostase der chondrogenen Extrazellulärmatrix, der für die Funktion des hyalinen Gelenkknorpels entscheidenden Gewebekomponente. Es stellt bisherigen Untersuchungen nach einen wichtigen Regulator im sensiblen Gleichgewicht zwischen der Synthese knorpelspezifischer Matrixproteine und dem Matrixabbau dar. Trotz dieser Bedeutung ist das Wissen über die Expression der NO-generierenden Enzyme in humanen artikulären Chondrozyten, insbesondere unter Kulturbedingungen, sehr begrenzt. Des Weiteren fehlen Erkenntnisse über den Einfluss von NO auf den Differenzierungsstatus dieser Zellen. Ziel der vorliegenden Arbeit war daher die Charakterisierung der Genexpression adulter Gelenkknorpelzellen während deren Expansion und anschließender Redifferenzierung in einem in vitro-Modell. Das Hauptaugenmerk wurde hierbei auf die 3 NOS-Isoformen sowie die beiden Matrixproteine Kollagen Typ II und Aggrecan gelegt. In Zusatzversuchen wurde die Bedeutung von NO für den Metabolismus sowie für Differenzierungsvorgänge humaner artikulärer Chondrozyten untersucht. Hierbei sollten funktionelle Zusammenhänge aufgezeigt und regulative Abhängigkeiten auf der Ebene der Transkription identifiziert werden. Humane artikuläre Chondrozyten wurden hierfür unter standardisierten Bedingungen enzymatisch aus Knorpelgewebe von Femurköpfen isoliert. Nach Expansion der Zellen in zweidimensionaler Monolayerkultur wurden die amplifizierten Zellen in Form dreidimensionaler Zellaggregate in einem chondrogenen Differenzierungsmedium rekultiviert. Veränderungen des zellulären Phänotyps wurden morphologisch, histochemisch, immunhistochemisch und mittels RT-PCR auf Genexpressionsebene verfolgt. Im Verlauf der Expansion konnte eine funktionelle und morphologische Dedifferenzierung der Chondrozyten dokumentiert werden. Durch 21tägige Rekultivierung in einem definierten chondrogenen Differenzierungsmedium konnten die Zellen ihre, zuvor verloren gegangenen knorpelspezifischen Eigenschaften wieder ausbilden (Redifferenzierung). Die Analyse der Genexpression der NOS-Isoformen humaner artikulärer Chondrozyten auf RNA-Ebene ergab neben der, in der Literatur bereits beschriebenen induzierbaren NOS die Expression zweier weiterer Isoformen, der neuronalen und der endothelialen NOS. In weiteren Versuchen wurde der Effekt verschiedener Mediatoren auf die Genexpression der Gelenkknorpelzellen beobachtet. So wurden Zellaggregate während verschiedener Phasen der Redifferenzierung mit rhIL-1 beta bzw. rhTNF alpha stimuliert. Die Chondrozyten reagierten darauf mit einer starker Induktion der induzierbaren NOS sowie mit einem konsekutiven Anstieg der NO-Freisetzung. Die eNOS-Expression wurde negativ reguliert. Auf die Konzentration der nNOS-Transkripte hatten beide Zytokine keinen messbaren Einfluss. Zudem konnte auf diesen Reiz hin eine drastische Reduktion der Kollagen Typ II und Aggrecan-Expression festgestellt werden. In Zusatzversuchen, bei denen u.a. ein NO-Donor und ein NOS-Inhibitor zum Einsatz kamen wurde dieser Effekt genauer erforscht. Aus den gewonnenen Ergebnissen kann geschlossen werden, dass der Effekt von IL-1 beta und TNF alpha auf die Synthese der beiden wichtigen Matrixproteine Kollagen Typ II und Aggrecan zumindest teilweise über NO vermittelt wird. In mehren Versuchsreihen gelang es des Weiteren die besondere Bedeutung von NO für die Zelldifferenzierung zu belegen. Die Modifikation des verwendeten chondrogenen Differenzierungsmediums durch Zusatz des NOS-Inhibitors NG-Amino-L-Arginin (L-NAA) führte zu einer deutlich früheren bzw. stärkeren Expression der beiden chondrogenen Markergene Kollagen Typ II und Aggrecan. N2 - Wird nachgereicht! KW - Chondrozyten KW - Stickstoffmonoxid KW - Genexpression KW - Expansion KW - Redifferenzierung KW - chondrocytes KW - nitric oxide KW - gene expression KW - expansion KW - redifferentiation Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-20456 ER - TY - THES A1 - Melichar, Volker O. T1 - Einfluß der Atherosklerose auf den NO:cGMP Signalweg am Modell des cholesteringefütterten Kaninchen T1 - Alterations of NO:cGMP -Signalling in Atherosclerosis in Cholesterol-fed Rabbits N2 - Atherosklerose ist Volkskrankheit und Todesursache Nummer Eins in den sogenannten entwickelten Ländern. Ursachen für die meisten Folgeerkrankungen sind Minderperfusion und Gefäßverschluß, verursacht durch Ablagerungen und Verdickung der Gefäßwand und durch einen pathologisch erhöhten Gefäßtonus. Mehrere zelluläre Signalwege, die im Gesunden eine Vasodilatation hervorrufen können, sind in atherosklerotischen Gefäßen gestört, so auch der NO:cGMP-Signalweg. Der Einfluß der Atherosklerose auf den NO-abhängigen Teil des Signalwegs, also NO-Produktion und -Abbau, sowie Diffusion von NO zu den glatten Muskelzellen, ist seit längerem bekannt. In dieser Studie zeigen wir, daß im fortgeschrittenen Stadium der Erkrankung auch der NO-unabhängige Teil des Signalwegs in erheblichen Maße gestört ist. Die Expression und Aktivität der Enzyme lösliche Guanylatzyklase (sGC) und cGMP-abhängige Proteinkinase-I ist vor allem in der neugebildeten Neointima reduziert. P-VASP, ein Indikator der Aktivität des gesamten NO:cGMP-Signalwegs, ist in eindrucksvoller Weise reduziert. Die Enzyme des NO-unabhängigen Teils des NO:cGMP-Signalwegs werden in zunehmenden Maße pharmakologisch beeinflußbar. Die Ergebnisse dieser Studie stellen somit eine wichtige Grundlage für neue Therapieansätze der Atherosklerose dar. N2 - Atherosclerosis is number one cause of death in the so-called developed countries. The cause of most complications of atherosclerosis is malperfusion and blood vessel occlusion, caused by plaque-formation and vessel wall thickening as well as a pathologically increased vessel tone. Several cellular signalling cascades, capable of causing vasodilatation in the healthy vessel, are known to be impaired, amongst others the NO:cGMP signalling pathway. The influence of atherosclerosis upon the NO-dependent part of this pathway, i.e. NO-synthesis and -scavenging, as well as diffusion of NO to the smooth muscle cells, has been has been intensively studied. In the present study we show, that in more progressed stages of the disease also the NO-independent part of the signalling pathway is highly impaired. Expression and activity of the enzymes soluble guanlylate cyclase (sGC) and cGMP-dependent protein kinase-I is reduced, especially in the newly formed neointima. P-VASP, a marker-protein of the activity of the entire NO:cGMP signalling pathway, is dramatically reduced. Nowadays it is possible to influence also the enzymes of the NO-independent part of the NO:cGMP signalling pathway pharmacologically. Therefore the results of this study are an important basis for new therapeutic approaches of atherosclerotic disease. KW - Atherosklerose KW - No:cGMP-Signalweg KW - Stickstoffmonoxid KW - sGC KW - VASP KW - Atherosclerosis KW - No:cGMP-Signalling KW - nitric oxide KW - sGC KW - VASP Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-3833 ER -