TY - THES A1 - Eppli, Nenad T1 - Untersuchung des Einflusses der ERK1/2-Autophosphorylierung an Threonin 188 auf Mausherzen mittels transgener Mäuse mit ubiquitärer Überexpression von ERK2\(^{T188D}\) T1 - Study on the effects of autophosphorylation of ERK1/2 at threonine 188 on murine hearts by means of transgenic mice ubiquitiously overexpressing ERK2\(^{T188D}\) N2 - Die ERK2Thr188-Autophosphoylierung stellt einen regulatorischen Signalweg dar, der infolge einer hypertrophen Stimulation die kardiale Hypertrophie begünstigt. Eine Hemmung dieser Phosphorylierung in Kardiomyozyten verhindert die Ausbildung der kardialen Hypertrophie ohne Beeinflussung der kardioprotektiven Funktionen von ERK1/2. Demgegenüber führt die dauerhafte Simulation zu einem gain-of-function-Phänotypen mit ausgeprägter Hypertophie, Fibrose und einer reduzierten Herzfunktion. In dieser Arbeit wurde die dauerhafte Simulation ERK2Thr188-Phosphorylierung (T188D) in einem Mausmodell mit ubiquitärer Expression dieser Mutation untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich nach Stimulation durch TAC in diesen Tieren ein etwas stärkerer hypertropher Phänotyp mit vergrößerten Kardiomyozyten, gesteigerter interstitieller Fibrosierung und reduzierter Herzfunktion ausbildet als in Mäusen mit kardiomyozyten-spezifischer Überexpression diese Mutante. In Fibroblasten- und VSMC-Zelllinien wurde eine gesteigerte Proliferation der T188D-überexprimierenden Zellen im Vergleich zu Kontrollen festgestellt. Somit scheint die ERK2Thr188-Phosphorylierung auch in kardialen Nicht-Myozyten einen maladaptiven Einfluss auf das Herz auszuüben. N2 - Autophosphorylation of ERK2 on threonine 188 is a regulatory signaling pathway facilitating cardiac hypertrophy due to a hypertrophic stimulation. The formation of cardiac hypertrophy can be impaired by inhibition of the phosphorylation without interfering with the cardioprotective functions of ERK1/2. In contrast, permanent stimulation of ERK2Thr188 phosphorylation leads to a gain-of-function phenotype with distinct hypertrophy fibrosis and a reduced cardiac function. Here, we examined a murine model with ubiquitous overexpression of ERK2Thr188 phosphorylation (T188D). We point out that mice showed an increased hypertrophic phenotype with augmented cardiomyocytes, enhanced interstitial fibrosis and reduced cardiac function in response to TAC compared to mice with overexpression of this mutant limited to cardiomyocytes. Fibroblasts and vascular smooth muscle cells overexpressing T188D showed an enhanced proliferation compared to controls. Taken together, the phosphorylation of ERK2 on threonine 188 exerts a maladaptive influence on non-myocytes in the heart as well. KW - Herzhypertrophie KW - cardiac hypertrophy KW - ERK1/2-Autophosphorylierung KW - autophosphorylation of ERK1/2 Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-216558 ER - TY - THES A1 - Gruse, Tamara T1 - Untersuchung der Rolle der ERK-Dimerisierung bei der ERK1/2- vermittelten Proliferation von Tumorzellen T1 - Investigation of the role of ERK dimerization in the ERK1/2-mediated proliferation of tumor cells N2 - Bei vielen Erkrankungen wie z.B. Herzhypertrophie, Diabetes und Entzündungen spielt die Raf-MEK-ERK-Signalkaskade eine wichtige Rolle. ERK1/2 ist in vielen zellulären Prozessen, u.a. Proliferation, Differenzierung, Wachstum, Hypertrophie und Apoptose involviert. Auch in der Tumorentstehung besitzt dieser MAPK-Signalweg eine signifikante Funktion, da er bei ca. 50% aller Krebsarten deutlich aktiviert ist. Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle einer neu entdeckten Phosphorylierungsstelle an Threonin188 an ERK2 bei der Entstehung und der möglichen Therapie von Tumoren zu erarbeiten. Dafür wurde ein Myc-ERK2309-357-Peptid verwendet, das 2013 in der Arbeitsgruppe Lorenz entwickelt wurde. Myc-ERK2309-357 zeigte in bisher unveröffentlichten Versuchen, dass es direkt an ERK2 bindet, eine Dimerisierung von ERK1/2 hemmen und eine vermehrte Lokalisation von ERK2 im Zellkern verhindern kann. Im Rahmen dieses Projekts konnten wir belegen, dass mit Hilfe des Myc-ERK2309-357-Peptids die Tumorzellproliferation von verschiedenen Krebszelllinien (Caco-2, SCC68, PC/1-1 und PC/13-1) um 60-80% vermindert werden konnte. Des Weiteren konnten wir zeigen, dass Myc-ERK2309-357 keinen Einfluss auf die Phosphorylierung von ERK1/2 am TEY-Motiv besitzt. Die Aktivierung von ERK1/2 durch die Kinasen MEK1/2 wird somit nicht beeinflusst und die zytosolischen ERK-Funktionen, wie z.B. der anti-apoptotische Effekt, würden somit bestehen bleiben. Außerdem fanden wir heraus, dass Myc-ERK2309-357 im Vergleich zu den MEK-Inhibitoren U0126 und PD98059 und verglichen mit dem EGF-Rezeptor-Antikörper Cetuximab die Proliferation signifikant besser hemmt. N2 - The Raf-MEK-ERK signaling cascade plays an important role in many diseases, such as cardiac hypertrophy, diabetes and inflammation. ERK1/2 is involved in many cellular processes, i.a. proliferation, differentiation, growth, hypertrophy and apoptosis. This MAPK signaling pathway also has a significant function in tumorigenesis because it is clearly activated in about 50% of all cancers. The aim of this work was to investigate the role of a newly discovered phosphorylation site on threonine188 in ERK2 in the genesis and possible therapy of tumors. For this, a Myc- ERK2309-357 peptide was used, which was developed in the research group Lorenz in 2013. It has previously been shown that Myc-ERK2309-357 binds directly to ERK2, inhibits ERK1/2 dimerization, and prevents increased localization of ERK2 in the nucleus. In this project we demonstrated that the Myc-ERK2309-357 peptide reduces the tumor cell proliferation of various cancer cell lines (Caco-2, SCC68, PC / 1-1 and PC / 13-1) by 60-80%. Furthermore, we could show that Myc-ERK2309-357 has no influence on the phosphorylation of ERK1/2 on the TEY motif. The activation of ERK1/2 by the kinases MEK1/2 is thus unaffected and the cytosolic ERK functions, e.g. the anti-apoptotic effect, would thus persist. In addition, we discovered that Myc-ERK2309-357 inhibits proliferation of the tumor cells significantly better compared to the MEK inhibitors U0126 and PD98059 and compared to the EGFR antibody Cetuximab. KW - Dimerisierung KW - MAP-Kinase KW - Carcinogenese KW - ERK1/2 Dimerisierung KW - Tumorzellproliferation KW - Krebs Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-159847 ER - TY - THES A1 - Basali, Timo T1 - Untersuchung der Nierenschädigung durch Aldosteron am Rattenmodell über die Quantifizierung von Schädigungsmarkern mittels Real-Time PCR-Technik T1 - Exploring renal damage caused by aldosterone by quantifying damage markers in rats via real time PCR technique N2 - Die Breite der Wirkungen von Aldosteron auf Nierenzellen wurde lange Zeit unterschätzt. Inzwischen zeigte sich ein nicht unerheblicher Anteil des Hyperaldosteronismus an arterieller Hypertonie und ebenso mehren sich die Hinweise auf damit assoziierter erhöhter Inzidenz für maligne Entartung von Nierengewebe. In dieser Arbeit wurde der Effekt von Hyperaldosteronismus auf Nierenzellen von Ratten in vivo untersucht. Mittels real time quantitative PCR wurden die relative Expressionsveränderungen der mRNA von validierten Nierenschädigungsmarkern im Hyperaldosteronismusmodell kontrolliert beobachtet und statistisch ausgewertet. Anders als im analog durchgeführten Vorversuch mit DOCA an der Stelle von Aldosteron, ließ sich größtenteils kein über der natürlichen Streuung der Daten liegender, signifikanter Effekt der Nierenschädigung durch überhöhte Aldosteronspiegel nachweisen. Hierfür kommen vielfältige Gründe in Frage. Neben der technischen Variabilität, der Beschaffenheit der internen Kontrolle, potentiell vorhandenen Inhibitoren und der Qualität der mRNA, konnten eine Reihe von weiteren Gründen als Ursache für die Diskrepanz zu den Ergebnissen der mit DOCA behandelten Tiere ausgeschlossen werden. Neben der theoretischen Möglichkeit inter-methodischer Differenzen und sich daraus ergebender Variationen, sowie der noch weiter zu untersuchenden Rolle des Glukokortikoidrezeptors durch dessen variable gleichzeitige Aktivierung, ist die Interpretation im Sinne eines zu gering ausgeprägten Schädigungseffektes durch den Hyperaldosteronismus für den gewählten Stichprobenumfang naheliegend. Hiermit stimmt auch die Tatsache überein, dass der Effekt der Behandlung mit Aldosteron im Vergleich zur Behandlung mit DOCA von vorne herein deutlich geringer ausfallend erwartet wurde. N2 - The broad spectrum of effects of aldosterone on renal cells has been underestimated for a long time. Meanwhile it has been shown that hyperaldosteronism has a considerable share of all cases of arterial hypertension, and the indications for an associated higher incidence of malignant transforming of kidney tissue are also increasing. The subject of this study was to investigate the effect of Hyperaldosteronism on kidney cells in rats. By means of real-time quantitative PCR, the change in the relative expression of mRNA of validated kidney cell damage markers in the hyperaldosteronism model were monitored and statistically evaluated under controlled conditions. In contrast to the previous pre-test with DOCA instead of aldosterone, a significant effect of renal impairment due to excessive aldosterone levels could not be detected. Numerous reasons are conceivable for that. In addition to the technical variability, the nature of the internal control, potentially present inhibitors and the quality of the mRNA, a number of further reasons could be excluded as a cause of the discrepancy with the results of the animals treated with DOCA. Besides the theoretical possibility of inter-methodical differences and resulting variations, as well as the role of the glucocorticoid receptor, which is still to be investigated, the closest interpretation is a damage effect too small to be detected by the given sample size. This is also in agreement with the fact that the effect of the treatment with aldosterone compared with the treatment with DOCA was expected to be significantly lower from the outset. KW - Aldosteron KW - Nierenzellkarzinom KW - Real-Time quantitative PCR KW - Nierenschädigung KW - Aldosteron KW - Nierenschädigung KW - Real-Time quantitative PCR KW - Nierenschädigungsmarker Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-151311 ER - TY - THES A1 - Ramge, Vanessa Magali T1 - Untersuchung der Genotoxizität von Pyrrolizidinalkaloiden \(in\) \(vitro\) am Beispiel von Riddelliin und Lasiocarpin T1 - Investigating the genotoxic potential of pyrrolizidine alkaloids \(in\) \(vitro\) using the example of riddelliin and lasiocarpin N2 - PA sind natürliche Pflanzeninhaltsstoffe, die wegen ihres genotoxischen Potentials bekannt sind. Nach Applikation mikromolarer Konzentrationen können bei in vitro Untersuchungen von Leberzellen chromosomale Schäden detektiert werden. PA stehen im Verdacht nach Aufnahme bei Menschen hepatotoxische und kanzerogene Wirkungen nach sich zu ziehen. In dieser Studie wurden Lasiocarpin und Riddelliin an der humanen Leberkarzinomzelllinie Huh6 auf Genotoxizität getestet. Die ausgewählten Methoden waren der MK-Test, der alkalische und der FPG Comet Assay und die γ-H2AX-Färbung. In den Vorversuchen mit BaP und CPA wurde gezeigt, dass die Zellen durch Prodrugs genotoxisch geschädigt werden. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass Riddelliin und Lasiocarpin im MK-Test eine dosisabhängige, genotoxische Wirkung auf die Huh6 Zellen haben. Der Einfluss von Lasiocarpin war im MK-Test im Vergleich zum Einfluss von Riddelliin bei geringerer Konzentration detektierbar. Nach einer simultanen Behandlung der Huh6 Zellen mit verschiedenen PA kann konkludiert werden, dass keine signifikante Erhöhung an DNA-Schäden im Vergleich zu Behandlungen mit den Einzelsubstanzen festgestellt werden konnte, was möglicherweise auf eine Erschöpfung der metabolischen Kapazität der Zellen zurückzuführen ist. Insgesamt ist es den Ergebnissen zufolge wahrscheinlich, dass die Entstehung von Crosslinks durch Lasiocarpin und Riddelliin eher eine Rolle in der Genotoxizitätsinduktion auf Huh6 Zellen spielen als oxidativer Stress. Doppelstrangbrüche konnten nicht als sicherer Induktor von Genotoxizität identifiziert werden. Die Besonderheiten der Stoffwechselwege einzelner PA und die Spezifizierung einzelner, für die Metabolisierung relevanter Enzyme sollte in Zukunft Gegenstand der Forschung sein, um die kumulativen Wirkungen von PA besser nachzuvollziehen und die für den Menschen entstehenden Risiken durch die Aufnahme von PA konkretisieren zu können. N2 - PA are naturally occurring secondary plant metabolites which are known for their genotoxic potential. In vitro studies can detect chromosomal damage after application of micromolar doses. Notoriously, some PA are suspected to cause hepatotoxicity and carcinogenicity in human beings as well as in animals. In this study the genotoxic effects of Lasiocarpin and Riddelliin were tested on the human hepatoma cell line Huh6. Therefore, the micronucleus test, the alkaline and the FPG Comet Assay and γ-H2AX Assay were performed. The genotoxic potential of these prodrugs on Huh6 cells was proven in preliminary tests with BaP and CPA. In conclusion, the selected PA Riddelliin and Lasiocarpin induced micronuclei in Huh6 cells in a dose-dependent manner. In comparison to Riddelliin, the influence of Lasiocarpin was detectable at lower concentrations in micronucleus test. After the simultaneous treatment with different structure types of PA it can be observed that there is no significant elevation of DNA damage compared to the single substance tests. Possibly the reason for this is a depletion of the metabolic capacity of the Huh6 cells. Overall, according to the findings of the performed toxicological tests with Lasiocarpin and Riddelliin, it is likely that the formation of crosslinks plays a more important role in the induction of genotoxicity on Huh6 cells than oxidative stress. Double-strand breaks could not be identified as a reliable inducer of genotoxicity in this study. The peculiarities of the metabolic pathways of individual PA and the specification of relevant enzymes for metabolization should be subject of future research to create a better understanding of the cumulative effects and the resulting risks to humans from the ingestion of PA. KW - Pyrrolizidinalkaloide KW - Lasiocarpin KW - Riddelliin KW - Huh6 Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-319793 ER - TY - THES A1 - Wassermann, Veronika T1 - Ueber die Beteiligung der Hitzeschockproteine HSP27 und HSP70 an einer Resistenz, Resistenzentwicklung unter CMF-Therapie T1 - Is heat shock protein expression an important faktor in drug resistance? N2 - Ein Problem der Therapie maligner Tumore ist die Resistez gegenüber Chemotherapeutika. Diskutiert wird ein Zusammenhang zur Expression von Hitzeschockproteinen (HSP). Insbesondere das in Mamma-Karzinomen stark exprimierte HSP27 und HSP70 scheinen hier beteiligt. Hitzeschockproteine sind Teil eines durch Noxen induzierten Mechanismus, welcher Schutz vor weiterer Noxenexposition verleiht, also die entsprechenen Zellen im Unterschied zu nicht exponierten Kontrollzellen zu überleben befähigt. Es kommt nach einem Streßereignis zu einer Veränderung von Zelltod unter nachfolgenden Bedingungen, z.B. Verhütung von Apoptose (physiologischer Zelltod). Tumortherapie mittels Zytostatika stellt eine „kontrollierte Apoptose“ dar. Ziel dieser Therapie muß es also folglich sein, eine HSP-Induktion zu vermeiden, da eine solche den Therapieerfolg und Benefit für den Patienten schmälert. Die Exposition einer Tumorzelle mit einem chemotherapeutisch wirksamen Medikament bedeutet für diese Zelle toxischen/oxidativen Streß, den sie nur durch Induktion entsprechender Abwehrmechanismen überleben kann. Diese Mechanismen haben letztlich einen wesentlichen Einfluß auf die Wirksamkeit des Medikamentes und Profit des Patienten durch die ihm angebotene Therapie. Eine frühe adaptive Zellantwort von Säugerzellen auf toxische Einflüsse stellt die Expression von Hitzeschockproteinen dar. Den Fokus der vorliegenden Untersuchungen stellen einerseits diejenigen Substanzen dar, welche heutzutage in der Therapie des Mamma-Karzinoms eingesetzt werden, den drei Einzelsubstanzen des CMF-Protokolls Methotrexat, 5-Fluorouracil und Cyclophosphamid, andererseits die Hitzeschockproteine mit der höchsten bekannten Bedeutung für Tumorwachstum. In einem ersten Schritt wurde in vitro mit einem Zellsystem, welches durch Transfektion mit dem humanen hsp27-Gen bei bekannter HSP70-Induzierbarkeit als einfaches isoliertes Zellsystem ein gutes Werkzeug zur spezifischen Untersuchung dieser beiden Proteine darstellt, untersucht werden, inwieweit sich diese speziellen Proteine durch die unterschiedlichen Substanzgruppen des CMF-Protokolls induzieren lassen. Es wurde also nach einer adaptiven Zellantwort in Form einer Induktion von HSP27 und HSP70 nachfolgend einer Noxenexposition gesucht werden. In einem zweiten Schritt wurde untersucht, ob die für diese beiden HSPs postulierte zytoprotektive Eigenschaften auch für Zytostatika gelten. Es wurde überprüft , inwieweit Chemotherapeutika unter dem Einfluß von HSP70 und HSP27 stehen, also inwieweit die Expression von HSP27 und HSP70 einen Zellschutz gegen toxischen Streß (durch CMF) in den verwendeten L929-Mausfibroblasten darstellen kann. N2 - Resistance to cytotoxic drugs is a major problem in tumor therapy. Paradoxycally both aquired and inhärent resistance to chemotherapeutica seem to be more common in tumors than in normal cells. A correllation to the expression of heat schock proteins (HSPs) is discussed. In particular, HSP27 and HSP70 seem to controbute to this phenomen. Our study focussed on the role of both HSPs in cellular response to methotrexate, 5-FU an cyclophosphamide, which are actually used in breast cancer therapy. KW - Hietzeschockprotein KW - Resistenzentwicklung KW - CMF-Therapie KW - Mammakarzinom KW - heat shock protein KW - resistance KW - cancer Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-12292 ER - TY - THES A1 - Nickel, Florian T1 - UCP2 und DIPP2alpha als differentiell exprimierte Kandidatengene in einem murinen Modell der Herzinsuffizienz T1 - UCP2 and DIPP2a: two candidate genes in a murine heart failure model N2 - Die Herzinsuffizienz ist eine der führenden Todesursachen weltweit. Eine auf die neurohumorale Aktivierung zugeschnittene Therapie mit ACE-Hemmern bzw. Angiotensin-Rezeptorantagonisten, Betablockern, Aldosteronantagonisten und Diuretika verbessert zwar die Symptomatik und Prognose. Letztere ist bei Diagnosestellung jedoch immer noch schlechter als die vieler maligner Erkrankungen einzuschätzen. Ziel ist daher die Entwicklung von Medikamenten, die den Krankheitsverlauf des Syndroms Herzinsuffizienz aufhalten bzw. umkehren. Ein Ansatz ist dabei die Analyse sogenannter Kandidatengene, die im kranken Herzen differentiell exprimiert werden und potentiell medikamentös beeinflussbar sind. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden zwei solcher Kandidatengene charakterisiert. Mäuse mit kardialer Überexpression b1-adrenerger Rezeptoren entwickeln eine Herzinsuffizienz mit kardialer Hypertrophie und Fibrose. In Gen Arrays mit 21000 Maus-ESTs zeigten sich unter anderem die Gene des Uncoupling Protein 2 (UCP2) und der Diphosphoinositol-Polyphosphat-Phosphohydrolase 2 alpha (DIPP2a) aktiviert. Diese Befunde wurden zunächst mittels RNase Protection Assay und RT-PCR bestätigt. Auch andere murine Herzinsuffizienzmodelle wurden untersucht. So ließ sich ebenfalls im druckinduzierten Herzinsuffizienzmodell nach artifizieller Aortenstenose sowie im b2-AR überexprimierenden Herzen eine erhöhte Konzentration von UCP2- und DIPP2a-mRNA messen. Um zu prüfen, ob diese differentielle mRNA-Expression deletäre oder protektive Effekte vermittelt, wurden jeweils transgene Mauslinien mit herzspezifischer Überexpression von UCP2 und DIPP2a generiert. Die Linie UCP2-TG1 mit hoher Überexpression sowie ein Gründer-Tier der UCP2-transgenen Mäuse entwickelten eine Herzinsuffizienz mit vergrößertem Herzen, linksventrikulärem Pumpversagen, interstitieller Fibrose und typischen Veränderungen der molekularen Marker ANF und SERCA. Zudem fanden sich dilatierte Vorhöfe sowie eine bradykarde Herzrhythmusstörung. UCP2 ist ein Entkoppler der oxidativen Phosphorylierung im Mitochondrium. Im energieintensiven Stoffwechsel des Myokards könnte eine durch UCP2 reduzierte ATP-Synthese zu den genannten Veränderungen führen. Für UCP2 wurden auch protektive Eigenschaften durch das Abfangen freier Radikale beschrieben. Die Linie UCP2-TG3 mit niedrigerem Überexpressionsniveau und ohne kardialen Phänotyp wurde deshalb einem Aortic banding unterzogen, wo sich in der Überlebenskurve kein protektiver oder deletärer Effekt einer moderat vermehrten Entkopplung im Vergleich zum Wildtyp zeigte. In drei unabhängigen Linien transgener Mäuse mit herzspezifischer Überexpression von DIPP2a ließ sich morphometrisch eine kardiale Hypertrophie nachweisen. Die Linie DIPP2a-TG9 mit dem höchsten Überexpressionsniveau zeigte zudem eine kardiale Fibrose sowie unter Dobutamin eine verminderte kardiale Kontraktilitätsreserve im Vergleich zum Wildtypen. DIPP-Proteine hydrolysieren Inositolphosphate und Nukleosiddiphosphate und greifen so in zentrale Stoffwechselvorgänge ein, die im einzelnen noch nicht geklärt sind. Es konnte hier im Mausmodell gezeigt werden, dass UCP2 und DIPP2a zwei für die Entwicklung einer Herzinsuffizienz relevante Zielproteine darstellen. Geplant ist die weitere Aufklärung der beteiligten Mechanismen, um diese letztlich auch therapeutisch beeinflussen zu können. N2 - The expression of uncoupling protein 2 (UCP2) and diphosphoinositol polyphosphate phosphohydrolase 2 alpha (DIPP2a) was shown to be upregulated in a murine model of chronic heart failure overexpressing beta1-adrenergic receptors and in other heart failure models. These candidate genes could play a protective or detrimental role in the development of chronic cardiac insufficiency. To test this hypothesis mice overexpressing UCP2 and DIPP2a, respectively, were generated. UCP2-transgenes with high expression level developed a chronic heart failure with interstitial fibrosis, cardiac hypertrophy and altered molecular markers of heart failure. They showed dysplastic atria and a bradyarrhythmia. DIPP2a-transgens with high expression level showed minor fibrotic changes in the myocardium in advanced age. Cardiac reserve was reduced as well. UCP2 and DIPP2a are two candidate genes which might be involved in the development of chronic heart failure. KW - UCP2-Protein KW - DIPP2a-Protein KW - Kandidatengene KW - Herzinsuffizienz KW - UCP2 KW - DIPP2a KW - heart failure Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-34502 ER - TY - THES A1 - Engelhardt, Stefan T1 - Transgene Mausmodelle zur Charakterisierung der Funktion kardialer beta-adrenerger Rezeptoren T1 - Characterization of cardiac beta-adrenergic receptors through the use of transgenic mouse models N2 - In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion kardialer beta-adrenerger Rezeptoren mit Hilfe einer Kombination aus transgenen Mausmodellen und physiologischen und molekularbiologischen Methoden untersucht. Durch gezielte Überexpression des humanen beta1-adrenergen Rezeptors im Herzen transgener Mäuse konnte gezeigt werden, daß die chronische Aktivierung dieses Rezeptors eine trophische Wirkung auf die Herzmuskelzellen hat. Über einen Zeitraum von mehreren Monaten führte dies zur Entwicklung einer Herzinsuffizienz. In der menschlichen Herzinsuffizienz kommt es zu einem ähnlichen Phänomen: Durch deutlich erhöhte Freisetzung von endogenen Katecholaminen kommt es zu einer chronischen Dauerstimulation kardialer beta1-adrenerger Rezeptoren. Daß diese schädlich ist belegen das hier beschriebene Mausmodell und zudem einige neuere klinische Studien, die zeigen daß eine pharmakologische Blockade beta-adrenerger Rezeptoren zu einer Verminderung der Herzinsuffizienzmortalität führt. Dieses Mausmodell erlaubte es erstmals den beta1-adrenergen Rezeptor hinsichtlich seiner spontanen Rezeptoraktivität in einem physiologischen Modell zu untersuchen. Dabei zeigte sich, daß der humane beta1-adrenerge Rezeptor spontane Aktivität aufweist, jedoch in einem deutlich geringeren Ausmaß als der beta2-adrenerge Rezeptor. Dies könnte klinisch relevant sein, da klinisch verwendete beta-Rezeptor-Antagonisten die spontane Aktivität des beta1-adrenergen Rezeptors in unserem Modell unterschiedlich stark unterdrückten. In der vorliegenden Arbeit wurde zudem untersucht, ob sich die beiden kardial exprimierten Beta-Rezeptor-Subtypen Beta1 und Beta2 hinsichtlich ihrer Signaltransduktion unterscheiden. Ausgehend von dem Befund, daß die chronische Aktivierung der beiden Subtypen in transgenen Mausmodellen zu deutlich unterschiedlichen Phänotypen führt, wurden verschiedene intrazelluläre Signalwege auf ihre Aktivierung hin überprüft. Abweichend von publizierten, in vitro nach kurzzeitiger Rezeptorstimulation erhobenen Daten zeigte sich, daß die chronische Aktivierung der Rezeptorsubtypen zu einer unterschiedlichen Aktivierung der kardialen MAP-kinasen (ERK) führt. Die beta1-spezifische Aktivierung dieser Kinasen könnte die beobachtete unterschiedliche Hypertrophieentwicklung in diesen beiden Mausmodellen erklären. Einen weiteren Schwerpunkt bei der Aufklärung des Mechanismus beta-adrenerg induzierter Hypertrophie bildete die Untersuchung der zellulären Calcium-homöostase. Als früheste funktionelle Veränderung in der Entwicklung einer beta-adrenerg induzierten Herzhypertrophie und -insuffizienz trat dabei eine Störung des intrazellulären Calciumtransienten auf. Als möglicher Mechanismus für die Störung des Calciumhaushalts konnte eine zeitgleich auftretende veränderte Expression des Calcium-regulierenden Proteins Junctin beschrieben werden. Einen neuen therapeutischen Ansatz für die Therapie der Herzinsuffizienz könnten schließlich vielleicht die Untersuchungen zum kardialen Na/H-austauscher ergeben: Es konnte erstmals gezeigt werden, daß der kardiale Na/H-Austauscher maßgeblich an der beta-adrenerg induzierten Herzhypertrophie- und Fibrose-entstehung beteiligt ist und daß die pharmakologische Inhibition dieses Proteins sowohl Hypertrophie als auch die Fibrose wirksam unterdrücken kann. KW - Beta-Rezeptor KW - Maus KW - Transgene Tiere KW - Herzinsuffizienz KW - Transgene Mäuse KW - beta-adrenerge Rezeptoren KW - Hypertrophie KW - Fibrose KW - Na/H-Austauscher KW - Herzinsuffizienz KW - transgenic mice KW - cardiac hypertrophy KW - fibrosis KW - Na/H-exchanger KW - heart failure Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1181950 ER - TY - THES A1 - Jonas, René T1 - Toxizität und Gentoxizität von Phytohormonen und deren Metaboliten T1 - Toxicity and genotoxicity of phytohormones and their metabolites N2 - Phytohormone, insbesondere solche mit östrogenem Potential werden heute vermehrt in der postklimakterischen Hormonersatztherapie als natürliche Alternative zu Designeröstrogenen eingesetzt, da sie vermutlich ein besseres Wirkungs-Nebenwirkungsprofil besitzten. Mengenmäßig am bedeutensten sind die Phytoöstrogene aus den Stoffgruppen der Isoflavone, Cumestane und Indol-3-carbinole. Weit über 100 Pflanzen produzieren Phytohormone. Die bekanntesten sind die Sojabohne, Weintrauben, Leinsamen, Haferflocken, Spargel, Traubensilberkerze und roter Klee. Phytohormone können täglich in großer Menge aufgenommen werden (1mg pro kg Körpergewicht), wobei durchaus Plasmaspiegel von über 1µM erreicht werden. Gerade deshalb darf nicht davon ausgegangen werden, daß natürliche Produkte per se gut für die Gesundheit wären. Phytohormone und insbesondere deren Metaboliten, die während der intestinalen Passage entstehen, wurden vielfach nicht den gleichen Prüfbedingungen unterzogen wie sie für andere in Lebensmitteln vorkommenden Substanzen, wie z.B. Konservierungs-, Farb- oder Aromastoffen, heute selbstverständlich ist. Diese Arbeit soll deshalb anhand von in-vitro Tests an Mauslymphomzellen L5178Y für eine Auswahl an Phytohormonen und deren Metaboliten mögliche toxische oder gentoxische Effekte detektieren und die bestehende Datenlage ergänzen. Aus der Gruppe der Isoflavone wurden die Daidzeinmetaboloiten Equol und O-desmethylangolensin und die Glyceteinmetaboliten 3,4,7- und 4,6,7-Trihyroxyisoflavon untersucht. Aus der Gruppe der Flavone wurde Fisetin und aus der Gruppe der Stilbene Resveratrol untersucht. Weiterhin wurden Daten zu den Anthocyanen Delphinidin-, Pelargonidin- und Cyanidin-Chlorid erhoben. Toxische Effekte wurden anhand von Proliferatiosexperimenten, durch die Bestimmung der Zellvitalität (Ethidiumbromid-Flouresceinmethode) und durch die Analyse der Teilungsaktivität nach Behandlung mit Cytocalasin B und anschließender Bestimmung des Anteils mehrkerniger Zellen detektiert. Zur Bestimmung von gentoxischen Effekte wurde auf den Mikrokerntest zurückgegriffen. Ergänzend sollte eine Immunfloureszenzfärbung der Kinetochorproteine in Mikrokernen Aufschluß über aneugene oder klastogene Wirksamkeit der untersuchten Substanzen geben. Die in dieser Arbeit gewonnenen Daten weisen darauf hin, daß erste adverse Effekte der Phytohormone oder deren Metaboliten im Bereich der erreichbaren Plasmakonzentration liegen, so daß eine übertriebene Aufnahme hochdosierter Phytohormonen derzeit als kritisch erachtet und weiterer Forschungsbedarf festgestellt werden muß. N2 - Phytohormones, particulary those which have oestrogen potential, are nowadays increasingly used in the postclimacteric hormone replacement therapy, as a natural alternative to artificially synthesized oestrogens, since they are thought to have a better effect/side effect profile.Most important in terms of quantity are the phytoestroges which are part of either the isoflavone- coumestane- or indol 3 carbinol-substance group. For more than 100 plants produce phytohormones, the most well-known of which are the soy bean, the grape, linseeds, oat flakes, asparagus and red clover. Phytohormones can be taken up in large quantities each day (1 mg per kg body weight), whereby plasma levels of more than 1 µM can be reached. That is exactely why one can not proceed on the assumption that natural products are per se healthy. In many cases, when phytohormones and especially their metabolites, which are synthesized during the intestinal passage process, are tested, the test conditions, which are used today for the testing of other substances which are contained in food (e.g. preservatives, artificial colourings or flavouring substances), are not applied. This work is intended to detect possible toxic or genotoxic effects of phytohormones and their metabolites on the basis of tests with mouse lymphoma cells. From the isoflavone-group, the daidzein metabolites equol and o-desmethylangolensine, and the glycetein metabolites 3,4,7- and 4,6,7-trihydroxyisoflavone have therefore been examined, as well as fisetin and resveratrol from the substance-group of flavones and stilbenes respectively. This work also provides new data on anthocyanes delphinidin-, pelargonidin- and cyanidin-chloride. Toxic effects were detected o the basis of experimental registration of the proliferation process, by determining the cell vitality (ethidium bromide – flouresceine – method) and by analysis of the separation-activity after the application of cytochalsine B, directely followed by the determination of the proportion of cells with more than one nucleus. The detemination of genotoxic effects was done using the micronucleus-test. Additionally, an immune flourescense couloring of the kinetochore proteins in micronuclei should explain the aneugene or clastogene effectiveness of the substances examined. The data established through this study indicates that primary adverse effects of phytohormones or their metabolites can be detected within reachable plasma concentrations, so that an excessive take-up of phytohormones has to be classified as critical and it also shows, that there is need for further research in this field. KW - Phytohormone KW - Östrogen KW - Toxizität KW - Gentoxizität KW - Mikrokerne KW - phytohormones KW - estrogen KW - toxicity KW - genotoxicity KW - micronuclei Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-11063 ER - TY - THES A1 - Fink, Kristin T1 - Toxins in Renal Disease and Dialysis Therapy : Genotoxic Potential and Mechanisms T1 - Toxine in Nierenerkrankung und Dialyse Therapie : Genotoxisches Potential und Mechanismus N2 - In patients suffering from end-stage renal disease who are treated by hemodialysis genomic damage as well as cancer incidence is elevated. One possible cause for the increased genomic damage could be the accumulation of genotoxic substances in the blood of patients. Two possible sources for those toxins have to be considered. The first possibility is that substances from dialysers, the blood tubing system or even contaminated dialysis solutions may leach into the blood of the patients during dialysis. Secondly, the loss of renal filtration leads to an accumulation of substances which are normally excreted by the kidney. If those substances possess toxic potential, they are called uremic toxins. Several of these uremic toxins are potentially genotoxic. Within this thesis several exemplary uremic toxins have been tested for genotoxic effects (homocysteine, homocysteine-thiolactone,leptine, advanced glycated end-products). Additionally, it was analysed whether substances are leaching from dialysers or blood tubing and whether they cause effects in in vitrotoxicity testing. The focus of chemical analytisis was on bisphenol A (BPA), the main component of plastics used in dialysers and dialyser membranes. N2 - Patienten, die an terminaler Niereninsuffizienz leiden und mittels Hämodialyse behandelt werden, weisen einen erhöhten Genomschaden auf. Dieser könnte ursächlich für die erhöhte Krebsinzidenz dieser Patientengruppe sein. Eine der möglichen Ursachen für den erhöhten Genomschaden stellt die Akkumulation genotoxischer Substanzen im Blut der Patienten dar. Diese Substanzen können prinzipiell aus zwei unterschiedlichen Quellen stammen. Erstens besteht die Möglichkeit, dass während der Dialyse Substanzen aus den Dialysatoren, dem Blutschlauchsystem oder gar aus verunreinigtem Dialysat in das Blut der Patienten übertreten. Zweitens führt der Verlust der Nierenfunktion zu einer stark verminderten Exkretion harnpflichtiger Substanzen. Diese Substanzen akkumulieren im Blut und bilden, sofern sie ein toxisches Potential besitzen, die Gruppe der so genannten urämischen Toxine. Einige dieser urämischen Toxine sind potentiell auch genotoxisch. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurden exemplarische Vertreter der urämischen Toxine auf ihre genotoxische Wirkung hin untersucht (Homocstein, Homocystein-Thiolacton, Leptin, Advanced Glycation End-Products). Außerdem wurde analysiert, ob Substanzen aus Dialysatormembranen oder dem Blutschlauchsystem austreten und in in vitro-Toxizitätstests Effekte zeigen. Der Fokus der Analytik lag hierbei auf dem Nachweis von Bisphenol A, dem Hauptbestandteil verschiedener Kunststoffe die für Dialysatoren und Dialysatormembranen verwendet werden. KW - Bisphenol A KW - Homocystein KW - Extrakorporale Dialyse KW - Genomschaden KW - Urämische Toxine KW - bisphenol a KW - homocysteine KW - dialysis KW - genomic damage KW - uremic toxins Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-31082 ER - TY - THES A1 - Trösken, Eva-Regina T1 - Toxicological evaluation of azole fungicides in agriculture and food chemistry T1 - Toxikologische Beurteilung der Anwendung von Azolfungiziden in der Landwirtschaft und Lebensmittelchemie N2 - Azole sind wichtige Chemikalien, die als Fungizide in der Landwirtschaft und der Medizin eingesetzt werden. Auch als Zytostatika in der Humanmedizin finden sie Anwendung. Die fungizide Wirkung beruht auf der Hemmung der Lanosterol-14α-Demethylase (CYP51), die die Demethylierung von Lanosterol zum „Follicular Fluid Meiosis Activating Steroid (FF-MAS)“ katalysiert. Für Pilze ist das später resultierende Ergosterol ein essentieller Bestandteil der Zellmembran. Exponierten Pilzen fehlt Ergosterol was zu einem Zusammenbruch der Zellmembran führt. Säugetiere können Cholesterol, das spätere Produkt der Lanosterol-14α-Demethylierung, das zur Synthese von z.B. Gallensäuren und Sexualhormonen nötig ist, mit der Nahrung aufnehmen. FF-MAS und das resultierende T-MAS (Testis Meiosis Activating Steroids), die direkten Produkte der CYP51 katalysierten Reaktion, wirken als Meiose-aktivierende Steroide auf Ovarien und Hoden und werden nicht mit der Nahrung aufgenommen. Eine Hemmung der CYP51 Aktivität könnte das endokrine System beeinflussen und wird daher als unerwünschte Nebenwirkung der Azole betrachtet. Aromatase (CYP19) katalysiert die Demethylierung von Testosteron zu Östradiol und wird durch Azole gehemmt. Die Verringerung der Östrogenspiegel durch CYP19-Inhibition ist das Wirkprinzip der als Zytostatika genutzten Azole, bei den Fungiziden wird es als unerwünschte Nebenwirkung angesehen. Ein ideales Azol sollte Pilz-CYP51 stark inhibieren, aber sowohl humanes CYP19 wie auch humanes CYP51 sollten durch ein solches Azol nicht inhibiert werden. Ein ideales Azol-Zytostatikum sollte eine starke inhibitorische Potenz gegenüber humanem CYP19 aufweisen, hingegen sollten humanes und Pilz-CYP51 nicht inhibiert werden. Ziel dieser Arbeit war es nun festzustellen: sind Fungizide und Antimykotika starke Inhibitoren von Pilz-CYP51? Zeigen Fungizide und Antimykotika keine Aktivität gegenüber humanem CYP19 und humanem CYP51? Sind Zytostatika starke Inhibitoren von humanem CYP19? Zeigen Zytostatika keine Aktivität gegenüber humanem CYP51 und Pilz-CYP51? Die inhibitorische Potenz von 22 Azolen, aus den drei Anwendungsgebieten, wurden an vier Systemen getestet: i) an humanem CYP19 und einem fluoreszierenden Pseudosubstrat, ii) an CYP19 und Testosteron als Substrat, iii) an humanem CYP51 und iv) Candida albicans CYP51 und Lanosterol als Substrat. Die Produktbildung wurde mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie gekoppelter Tandem-Massenspektrometrie nach Photosprayionisation gemessen. Das humane CYP51 wurde von „BD Gentest Cooperation“ zur Verfügung gestellt. Ein katalytisch aktiver Enzymkomplex bestehend aus der Lanosterol-14α-Demethylase von Candida albicans und der Oxidoreduktase von Candida tropicalis, wurde im Baculovirussystem exprimiert. Ein Vergleich der inhibitorischen Wirkstärke der Substanzen auf menschliches CYP19 und CYP51 und Pilz-CYP51 zeigt, dass einige Azole das erwünschte Bild zeigen. Dazu gehören die beiden Zytostatika Fadrozol und Letrozol, sowie Fluconazol und Itraconazol, zwei Antimykotika aus der Humanmedizin, und einige Fungizide z.B. Cyproconazol und Hexaconazol. Ein unerwünschtes Bild zeigen z.B. Prochloraz, Bifonazol, Ketoconazol und Miconazol. Sieben Azole weisen ein gemischtes Bild an inhibitorischen Wirkstärken auf. Um einen modellartigen Eindruck der Rückstände von Azolen in Lebensmitteln zu erhalten, wurde eine auf LC-ESI-MS/MS basierende Rückstandsanalytik für Azole im Wein entwickelt. Alle gefunden Rückstände lagen unterhalb der behördlich festgelegten Rückstandshöchstmengen. Um die inhibitorische Wirkung der Azole auf die verschiedenen Enzymsysteme in einem größeren Zusammenhang zu bringen, wurden die IC50 Werte mit Expositionsdaten von Bauern, maximalen Plasmaspiegeln in Patienten nach der Einnahme von Antimykotika und mit Expositionsgrenzwerten für die Langzeitaufnahme von Pflanzenschutzmittelrückständen („Acceptable Daily Intake Levels“, ADI) verglichen. Basierend auf den dargestellten Ergebnissen können folgende Schlussfolgerungen gezogen werden. Das Risiko für landwirtschaftliche Arbeiter durch Exposition gegenüber Azolfungiziden kann im Bezug auf menschliches CYP19 und CYP51 als vernachlässigbar eingestuft werden, wenn die entsprechenden Sicherheitsvorkehrungen getroffen werden. Im medizinischen Bereich muss grundsätzlich der Einsatz von Bifonazol, Miconazol und Ketoconazol mit Blick auf die hohe inhibitorische Potenz gegenüber menschlichem CYP19 und 51 kritisch betrachtet werden. Unter der Annahme, dass die ADI Werte eingehalten werden, stellen Rückstände auf Lebensmitteln in Bezug auf die genannten Enzymsysteme keine Bedrohung für den Verbraucher da. Die Inhibition von CYP19 muss als Störung des Hormonsystems angesehen werden. Die Bedeutung von FF-MAS und T-MAS im endokrinen System muss noch abschließend geklärt werden und damit auch die Frage, wie viel Bedeutung der Inhibition von menschlichem CYP51 beigemessen werden muss. N2 - Azoles are important chemicals used as antifungal agents in agriculture and human medicine, but also as cytostatic drugs in tumour chemotherapy. Antifungal activities are based on inhibition of lanosterol-14α-demethylase (CYP51). CYP51 catalyses the oxidative removal of the methyl group # 32 of lanosterol to produce follicular fluid meiosis activating steroid (FF-MAS). For fungi the later resulting ergosterol is an essential compound of the cell membrane. Exposed fungi lack ergosterol, which leads to a collapse of the cell membrane. In mammals cholesterol, the downstream product of lanosterol-14α-demethylation necessary for the synthesis of bile acids, mineral corticoids, glucocorticoids and sex steroids, can be supplemented with food intake. However FF-MAS and the resulting T-MAS (testis meiosis activating steroids), the direct products of the CYP51 reaction, act as meiosis-activating steroids on ovaries and testes and are not supplemented with food intake. Inhibition of CYP51 in humans may therefore affect the endocrine system and is an unwanted side effect of azoles. Aromatase (CYP19) catalyses the demethylation of testosterone to estradiol and is inhibited by azoles. Reduction of estrogen levels by CYP19 inhibition is the working principle of cytostatic drugs used in breast cancer therapy but is considered an unwanted side effect for azoles used to treat fungal infections. A favourable fungicide or antifungal drug should be a strong inhibitor of fungal CYP51. In contrast human CYP51 and human CYP19 should not be inhibited by an azole fungicide or antifungal agent. The favourable cytostatic drug should show a high potency towards human CYP19. Neither human CYP51 nor fungal CYP51 should be inhibited by a cytostatic drug. The aim of this work was to assess: are fungicides and antifungal drugs strong inhibitors of fungal CYP51? In return do they not inhibit human CYP51 and human CYP19? Do cytostatic drugs strongly inhibit human CYP19? And in return do they not inhibit human CYP51 or fungal CYP51? Inhibitory potencies of 22 azole compounds used for the three purposes were tested in four inhibition assays: i) on commercially available human CYP19 utilising a fluorescent pseudo substrate dibenzylfluorescein (DBF) ii) on CYP19 utilising testosterone as substrate iii) on human CYP51 and iv) Candida albicans CYP51 utilising lanosterol as substrate. Product formation was measured by liquid chromatography – tandem mass spectrometry utilising photospray ionisation (APPI). A functional human CYP51 was available from BD Gentest Cooperation. A functional enzyme complex comprising of the Candida albicans lanosterol-14α-demethylase and the Candida tropicalis oxidoreductase was expressed in the baculovirus system. When comparing inhibitory potencies on CYP19, human CYP51 and Candida albicans CYP51 a number of agents show desirable patterns of inhibition e.g. the two cytostatic drugs, or two antifungal agents used in human medicine, fluconazole and itraconazole, and a wide variety of the fungicides, e.g. cyproconazole and hexaconazole. Undesirable patterns of inhibition were exhibited by a number of compounds, e.g. prochloraz, bifonazole, ketoconazole and miconazole. Seven compounds show a more complex picture of inhibitory potencies though. To get a picture of residue levels of azoles in food in a model case an LC-ESI-MS/MS method was developed for the determination of azole compounds in wine. All residues were below the maximum residue levels set by authorities. To classify the inhibitory potencies on the different enzyme systems IC50 values obtained were compared to exposure levels measured in farmers, maximum plasma concentrations in humans reported after exposure to antifungal drugs and to acceptable daily intake levels set by authorities. Based on the findings presented, the following conclusions can be drawn. The risk for agricultural workers set by exposure to azole fungicides with respect to human CYP51 and CYP19 can be regarded as negligible when safety measures are adhered to. As a matter of principle however, the usage of bifonazole, miconazole and ketoconazole has to be viewed with caution in respect to the high level of inhibition of human CYP51 and/or CYP19. Under the assumption that the acceptable daily intake amounts set by authorities for azole compounds are not exceeded the residues do not pose a threat to consumer safety judged by our findings. Inhibition of CYP19 with the consequence of a reduction of estradiol levels has to be regarded as a possible disrupting effect of the hormone balance. The relevance of FF-MAS and T-MAS in the endocrine system however still has to be evaluated completely bringing with it the question of how much importance has to be attached to the inhibition of human CYP51. KW - Azole KW - Fungizid KW - Toxikologie KW - CYP19 KW - CYP51 KW - Azole KW - Toxikologie KW - CYP19 KW - CYP51 KW - Azoles KW - Toxicology Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17016 ER -