TY - THES A1 - Rüdt von Collenberg, Cora Freifrau T1 - The role of Ciliary Neurotrophic Factor in hippocampal synaptic plasticity and learning T1 - Die Rolle von Ciliary Neurotrophic Factor bei hippocampaler synaptischer Plastizität und Lernen N2 - Ciliary neurotrophic factor (Cntf) acts as a differentiation and survival factor for different types of neurons and glial cells. It is expressed by peripheral Schwann cells and astrocytes in the central nervous system and mediates its effects via a receptor complex involving CntfRα, LifRß and gp130, leading to downstream activation of Stat3. Recent studies by our group have shown that Cntf modulates neuronal microtubule dynamics via Stat3/stathmin interaction. In a mouse model for motor neuron disease, i.e. pmn, Cntf is able to rescue axonal degeneration through Stat3/stathmin signaling. While these findings suggest a role of Cntf in controlling axonal functions in the neuromuscular system, additional data indicate that Cntf might also play a role in synaptic plasticity in the hippocampus. Electrophysiological recordings in hippocampal organotypic cultures and acute slices revealed a deficit in long-term potentiation (LTP) in Cntf -/- mice. This deficit was rescued by 24 h stimulation with Cntf, combined with an acute application of Cntf during LTP-measurements indicating that Cntf is both necessary and sufficient for hippocampal LTP, and possibly synaptic plasticity. Therefore, Cntf knockout mice were investigated to elucidate this possible role of Cntf in hippocampal LTP and synaptic plasticity. First, we validated the presence of Cntf in the target tissue: in the hippocampus, Cntf was localized in Gfap-positive astrocytes surrounding small blood vessels in the fissure and in meningeal areas close to the dentate gyrus. Laser micro-dissection and qPCR analysis showed a similar distribution of Cntf-coding mRNA validating the obtained immunofluorescent results. Despite the strong LTP deficit in organotypic cultures, in vivo behavior of Cntf -/- mice regarding hippocampus-dependent learning and anxiety-related paradigms was largely inconspicuous. However, western blot analysis of hippocampal organotypic cultures revealed a significant reduction of pStat3 levels in Cntf -/- cultures under baseline conditions, which in turn were elevated upon Cntf stimulation. In order to resolve and examine synaptic structures we turned to in vitro analysis of cultured hippocampal neurons which indicated that pStat3 is predominantly located in the presynapse. In line with these findings, presynapses of Cntf -/- cultures were reduced in size and when in contact to astrocytes, contained less pStat3 immunoreactivity compared to presynapses in wildtype cultures. In conclusion, our findings hypothesize that despite of a largely inconspicuous behavioral phenotype of Cntf -/- mice, Cntf appears to have an influence on pStat3 levels at hippocampal synapses. In a next step these two key questions need to be addressed experimentally: 1) is there a compensatory mechanism by members of the Cntf family, possibly downstream of pStat3, which explains the in vivo behavioral results of Cntf -/- mice and can likewise account for the largely inconspicuous phenotype in CNTF-deficient humans? 2) How exactly does Cntf influence LTP through Stat3 signaling? To unravel the underlying mechanism further experiments should therefore investigate whether microtubule dynamics downstream of Stat3 and stathmin signaling are involved in the Cntf-induced modulation of hippocampal synaptic plasticity, similar to as it was shown in motoneurons. N2 - Ciliary neurotrophic factor (Cntf) wirkt als Differenzierungs- und Überlebensfaktor für verschiedene Arten von Neuronen und Gliazellen. Es wird von peripheren Schwann´schen Zellen und Astrozyten des zentralen Nervensystems exprimiert und vermittelt seine Effekte über einen Rezeptorenkomplex, der aus CntfRα, LifRß und gp130 besteht, und zu einer nachfolgenden Aktivierung von Stat3 führt. Jüngste Studien unserer Arbeitsgruppe haben gezeigt, dass Cntf neuronale Mikrotubulidynamik über Stat3/stathmin Interaktion modulieren kann. In pmn Mäusen, einem Mausmodell für Motoneuronenerkrankungen, ist Cntf in der Lage, durch Stat3/Stathmin Signaltransduktion die zugrundeliegende axonale Degeneration wieder aufzuheben. Während diese Ergebnisse eine Rolle von Cntf bei der Kontrolle axonaler Funktionen im neuromuskulären System postulieren, deuten zusätzliche Daten darauf hin, dass Cntf ebenfalls eine Funktion bei synaptischer Plastizität im Hippocampus ausübt. Elektrophysiologische Messungen in hippocampalen organotypischen Kulturen und akuten Schnitten zeigen ein Defizit in der Langzeitpotenzierung (LTP) bei Cntf -/- Mäusen. Dieses Defizit konnte durch eine 24 stündige Stimulation mit Cntf, in Kombination mit akuter Zugabe von Cntf während der LTP Messungen, kompensiert werden. Dies weist darauf hin, dass Cntf sowohl notwendig als auch ausreichend für hippocampale LTP und möglicherweise synaptische Plasizität ist. Deshalb wurden Cntf knockout Mäuse untersucht, um diese putative Rolle von Cntf bei hippocampaler LTP und synaptischer Plastizität zu untersuchen. Zunächst haben wir die Lokalisation von Cntf in unserem Zielgewebe bestätigt: im Hippocampus war Cntf sowohl in Gfap-positiven Astrocyten lokalisiert, die kleine Blutgefäße in der Fissur umschließen, als auch in Gfap-positiven Astrocyten nahe des Gyrus dentatus. Lasermikrodissektion und qPCR-Analysen zeigten eine ähnliche Verteilung von Cntf kodierender mRNA, und bestätigten somit die durch Immunoflureszenz-Färbung erworbenen Ergebnisse. Trotz des starken LTP Defizits in organotypischen Kulturen zeigten jedoch Cntf -/- Mäuse in Hippocampus-abhängigen lern- und angstbedingten Verhaltensparadigmen keinen offensichtlichen Phänotyp. Allerdings zeigten Western Blot Analysen hippocampaler Kulturen eine signifikante Reduktion der pStat3 Level in Cntf -/- Kulturen unter Kontrollbedingungen, die nach Cntf Zugabe wieder erhöht werden konnten. Um synaptische Strukturen besser darstellen und evaluieren zu können, wurden hippocampale Neurone in vitro kultiviert, in denen Stat3 überwiegend in Präsynapsen lokalisiert war. In Übereinstimmung mit diesen Beobachtungen zeigten Cntf -/- Präsynapsen eine geringere Größe und enthielten, verglichen zu Präsynapsen in Wildtypkulturen, weniger pStat3 Immunreaktivität, gerade dann, wenn sie sich in Kontakt mit Astrozyten befanden. Zusammenfassend weisen unsere Befunde darauf hin, dass Cntf – trotz eines weitgehend unaufälligen Verhaltensphänotyps bei Cntf -/- Mäusen – einen Einfluss auf den Level von pStat3 an hippokampalen Synapsen zu haben scheint. In einem nächsten Schritt sollten die folgenden zwei Schlüsselfragen experimentell geklärt werden: 1) gibt es einen kompensierenden Mechanismus, über welchen Mitglieder der Cntf Familie wirken könnten – möglicherweise nachfolgend von pStat3 – und welcher das Verhalten der Cntf -/- Mäuse, sowie den größtenteils unauffälligen Phänotyp bei CNTF defizienten Menschen erklären könnte? 2) Wie genau wirkt sich Cntf induziertes pStat3 auf LTP aus? Um diesen zugrundeliegenden Mechanismus aufzuklären, sollten weitere Experimente untersuchen, ob pStat3 und Stathmin abhängige Mikrotubulidynamik in der durch Cntf induzierten Modulation hippocampaler Plastizität eine Rolle spielt – ähnlich, wie es in Motoneuronen bereits gezeigt wurde. KW - Hippocampus KW - Ciliary neurotrophic factor KW - hippocampus KW - synaptic plasticity KW - learning KW - Hippocampus KW - synaptische Plastizität KW - Lernen Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-206646 ER - TY - THES A1 - Kiser, Dominik Pascal T1 - Gene x Environment Interactions in Cdh13-deficient Mice: CDH13 as a Factor for Adaptation to the Environment T1 - Gen x Umwelt-Interaktionen in Cdh13-defizienten Mäusen: CDH13 als ein Faktor für Umweltanpassung N2 - Neurodevelopmental disorders, including attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD) and autism spectrum disorder (ASD) are disorders of mostly unknown etiopathogenesis, for which both genetic and environmental influences are expected to contribute to the phenotype observed in patients. Changes at all levels of brain function, from network connectivity between brain areas, over neuronal survival, synaptic connectivity and axonal growth, down to molecular changes and epigenetic modifications are suspected to play a key roles in these diseases, resulting in life-long behavioural changes. Genome-wide association as well as copy-number variation studies have linked cadherin-13 (CDH13) as a novel genetic risk factor to neuropsychiatric and neurodevelopmental disorders. CDH13 is highly expressed during embryonic brain development, as well as in the adult brain, where it is present in regions including the hippocampus, striatum and thalamus (among others) and is upregulated in response to chronic stress exposure. It is however unclear how CDH13 interacts with environmentally relevant cues, including stressful triggers, in the formation of long-lasting behavioural and molecular changes. It is currently unknown how the environment influences CDH13 and which long term changes in behaviour and gene expression are caused by their interaction. This work therefore investigates the interaction between CDH13 deficiency and neonatal maternal separation (MS) in mice with the aim to elucidate the function of CDH13 and its role in the response to early-life stress (ELS). For this purpose, mixed litters of wild-type (Cdh13+/+), heterozygous (Cdh13+/-) and homozygous knockout (Cdh13-/-) mice were maternally separated from postnatal day 1 (PN1) to postnatal day 14 (PN14) for 3 hours each day (180MS; PN1-PN14). In a first series of experiments, these mice were subjected to a battery of behavioural tests starting at 8 weeks of age in order to assess motor activity, memory functions as well as measures of anxiety. Subsequently, expression of RNA in various brain regions was measured using quantitativ real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). A second cohort of mice was exposed to the same MS procedure, but was not behaviourally tested, to assess molecular changes in hippocampus using RNA sequencing. Behavioural analysis revealed that MS had an overall anxiolytic-like effect, with mice after MS spending more time in the open arms of the elevated-plus-maze (EPM) and the light compartment in the light-dark box (LDB). As a notable exception, Cdh13-/- mice did not show an increase of time spent in the light compartment after MS compared to Cdh13+/+ and Cdh13+/- MS mice. During the Barnes-maze learning task, mice of most groups showed a similar ability in learning the location of the escape hole, both in terms of primary latency and primary errors. Cdh13-/- control (CTRL) mice however committed more primary errors than Cdh13-/- MS mice. In the contextual fear conditioning (cFC) test, Cdh13-/- mice showed more freezing responses during the extinction recall, indicating a reduced extinction of fear memory. In the step-down test, an impulsivity task, Cdh13-/- mice had a tendency to wait longer before stepping down from the platform, indicative of more hesitant behaviour. In the same animals, qRT-PCR of several brain areas revealed changes in the GABAergic and glutamatergic systems, while also highlighting changes in the gatekeeper enzyme Glykogensynthase-Kinase 3 (Gsk3a), both in relation to Cdh13 deficiency and MS. Results from the RNA sequencing study and subsequent gene-set enrichment analysis revealed changes in adhesion and developmental genes due to Cdh13 deficiency, while also highlighting a strong link between CDH13 and endoplasmatic reticulum function. In addition, some results suggest that MS increased pro-survival pathways, while a gene x environment analysis showed alterations in apoptotic pathways and migration, as well as immune factors and membrane metabolism. An analysis of the overlap between gene and environment, as well as their interaction, highlighted an effect on cell adhesion factors, underscoring their importance for adaptation to the environment. Overall, the stress model resulted in increased stress resilience in Cdh13+/+ and Cdh13+/- mice, a change absent in Cdh13-/- mice, suggesting a role of CDH13 during programming and adaptation to early-life experiences, that can results in long-lasting consequences on brain functions and associated behaviours. These changes were also visible in the RNA sequencing, where key pathways for cell-cell adhesion, neuronal survival and cell-stress adaptation were altered. In conclusion, these findings further highlight the role of CDH13 during brain development, while also shedding light on its function in the adaptation and response during (early life) environmental challenges. N2 - Neuronale Entwicklungsstörungen (NES), wie Aufmerksamkeitsdefizit-Hyperaktivitätssyndrom (ADHS) oder Autismus Spektrums Störung (ASS), haben eine größtenteils unbekannte Krankheitsentwicklung, deren klinisches Erscheinungsbild bei dem Patienten durch die individuelle Genetik und Umwelt beieinflusst wird. Veränderungen in allen funktionellen Ebenen des Gehirns, von Netzwerkaktivität zwischen unterschiedlichen Gehirnregionen, über synaptischer Verschaltung, axonalem Wachstum und den Überlebenschancen einzelner Neuronen, bis hin zu molekularen und epigenetischen Modifikationen werden als Schlüsselrollen in NES betrachtet, welche schlussendlich zu langfristigen Verhaltensauffälligkeiten führen. Genome-weite-Assoziations und genomische Kopiezahlvariations Studien haben Cadherin 13 (CDH13) als neuartiges Risikogen für neuropsychiatrische und neuronale Entwicklungsstörungen identifizieren können. CDH13 wird sowohl während der embryonalen Entwicklung, als auch im adulten Gehirn, stark exprimiert und kann dort in Regionen wie dem Hippocampus, Striatum und Thalamus gefunden werden. Darüber hinaus wird es als Reaktion auf akuten (physiologischen und psychologischen) Stress exprimiert. Gegenwärtig ist jedoch nicht bekannt, wie Umwelteinflüsse mit CDH13 interagieren und langanhaltende Veränderungen im Verhalten und der Gene Expression im Gehirn herbeiführen. Die vorliegende Arbeit untersucht daher die Interaktion zwischen CDH13 und Stress während eines frühen Lebensabschnitts. Hierfür wurden Würfe mit wildtyp (Cdh13+/+), heterozygoten (Cdh13+/-) und homozygoten knockout (Cdh13-/-) Mäusen zwischen dem ersten und vierzehnten Tag nach der Geburt für jeweils 3 Stunden von ihren Müttern getrennt (englisch: maternal separation, MS). In einem ersten Experiment wurden diese Mäuse dann im Alter von 8 Wochen in einer Reihe von Verhaltensversuchen auf ihre motorischen Fähigkeiten und Gedächtnisleistung getestet. Im Anschluss daran wurde mittels der quantitativen Polymerase Kettenreaktion (qPCR) verschiedene Gehirnregionen dieser Tiere auf Expressionsunterschiede in Faktoren für Neurotransmittersysteme, Neurogenese und DNA Methylierungsmechanismen hin analysiert. Das Hippocampus-Gewebe einer zweiten gleich aufgebauten Versuchsgruppe wurde mittels RNA Sequenzierung untersucht. Die Verhaltensanalyse zeigt das MS einen überwiegend angst-lindernden Einfluss auf die Mäuse hatte. Im Vergleich zu Mäusen ohne MS verbrachten MS-Mäuse mehr Zeit auf dem offenen Arm eines erhöhten Plus-Labyrinths, so wie in der hell-erleuchteten Seite einer Hell-Dunkel Box (HDB). Eine auffallende Ausnahme stellten jedoch die Cdh13-/- Mäuse dar, welche in der HDB keinen Zeitanstieg wie ihre Cdh13+/+ und Cdh13+/- MS Geschwister auf der hell-erleuchteten Seite aufwiesen. In dem Barnes Labyrinth (einem Test für räumliches Lernen) zeigte sich, dass alle Tiere, gemessen an den Fehlern und der Zeit die sie brauchten bis sie den Ausgang fanden, zunächst ähnliche Lernerfolge hatten. Im zweiten Teil des Experiments, in dem der Ausgang auf eine neue Position gelegt wurde, begangen Cdh13-/- Mäuse ohne MS hingegen mehr Fehler als Cdh13-/- MS Mäusee. In der Kontext-Angst-Konditionierung (KAK) zeigten männliche Cdh13-/- Mäuse mehr Angst-Starre während der Extinktions-Wiederholung; ein Befund der eine reduzierte Angst-Auslöschung impliziert. Im Abstiegs-Test, einem Impulsivitätstest, blieben Cdh13-/- Mäuse länger auf einem Podest stehen. Mittels qPCR konnte außerdem gezeigt werden dass sowohl ein Cdh13-/- Defizit, als auch MS, Veränderungen von GABAergen und glutamatergen Faktoren, so wie Änderungen in dem wichtigen Signalmolekühl Glykogensynthase-Kinase 3 (Gsk3a) verursacht haben. Die Ergebnisse der RNA Sequenzierung zeigten eine Anreicherung von Veränderungen in Adhesions-, Entwicklungs- und Endoplasmatischen Reticulumgenen in Cdh13-/- defiziten Tieren im Vergleich zu Cdh13+/+ Mäusen. Im selben Versuch trug MS zu einer erhöhten Aktivierung von Anti-Apoptotischen Signalwegen im Hippocampus bei, während Zell-Adhesionsmoleküle maßgeblich von der Wechselwirkung beider Faktoren betroffen waren. Zusammenfassend waren Cdh13+/+ und Cdh13+/- Mäuse im Gegensatz zu Cdh13-/- Tieren größtenteils stressresitenter, während die RNA Sequenzierung aufzeigte, dass CDH13 Schlüsselkomponenten von Zell-Zell-Adhesions, Überlebens und Zell-Stress-Signalwegen reguiert. Dies suggeriert, dass CDH13 die Programmierung und Anpassung an Umwelteinflüsse steuert, was wiederum lang anhaltende Auswirkungen auf molekularer Ebene und auf das Verhalten der Mäuse zur Folge hat. Abschließend legen die Befunde eine Rolle von CDH13 in der Umgebungsanpassung während der Entwicklung nahe. KW - Cadherine KW - Genexpression KW - Tiermodell KW - Animales Nervensystem KW - Verhalten KW - Cdh13 KW - RNA Sequencing KW - Gene by Environment KW - Neurodevelopmental Disorder KW - ADHD KW - Hippocampus KW - Prefrontal cortex KW - Amygdala KW - Raphe KW - Adaptation Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-179591 ER - TY - THES A1 - Kroker, Katja T1 - Establishment and validation of hippocampal LTP for characterization of memory enhancing drugs as potential treatment of Alzheimer’s disease T1 - Etablierung und Validierung hippocampalen LTPs zur Charakterisierung gedächtnissteigernde Substanzen zur potentiellen Behandlung der Alzheimer’schen Erkrankung N2 - Die Alzheimer’sche Erkrankung ist eine neurodegenerative Erkrankung des Gehirns. Um geeignete Medikamente für die Behandlung der Alzheimer’schen Erkrankung zu finden, werden experimentelle Modellsysteme zur Erforschung von Substanzkandidaten verwendet. Ein solches experimentelles System ist die hippocampale Langzeitpotenzierung (LTP), welche ein anerkanntes in vitro Modell für die Erforschung der zugrundeliegenden zellulären Prozesse der Gedächtnisbildung ist. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Etablierung und Validierung von LTP in hippocampalen Hirnschnitten der Ratte um gedächtnissteigernde Substanzen zur potentiellen Behandlung der Alzheimer’schen Erkrankung zu charakterisieren. Dazu wurde zunächst ein Messsystem zur parallelen Charakterisierung mehrerer Schnitte aufgebaut, das Messungen bis zu sieben Stunden erlaubt (Kapitel 2). Dann wurden unterschiedliche Protokolle etabliert um Früh- und Spätphasen-LTP zu generieren. Dabei würde Frühphasen-LTP konzeptionell eher mit dem Kurzzeitgedächtnis einhergehen, während Spätphasen-LTP dem Langzeitgedächtnis gleichkommen würde (Kapitel 3). Da in Alzheimer-Patienten hauptsächlich ein Defizit cholinerger und glutamaterger Neurone vorliegt, wurden die validierten LTP Formen benutzt, um solche Substanzen zu analysieren, die potentiell cholinerge und/oder glutamaterge neuronale Funktion erhöhen. Die Effekte zweier ausschließlich cholinerge Funktion erhöhender Substanzen wurden analysiert: Der α4β2 nicotinische Acetylcholin-Rezeptor Agonist TC-1827 (Kapitel 4) und der Acetylcholinesterase-Inhibitor Donepezil (Kapitel 5). Beide Substanzen erhöhten Frühphasen-LTP, aber hatten keinen Effekt auf Spätphasen-LTP. Desweiteren wurden zwei Substanzen getestet, die ausschließlich mit glutamaterger Funktion interferieren: Der metabotrope Glutamatrezeptor 5 positiv allosterische Modulator ADX-47273 (Kapitel 3) und der Phosphodiesterase (PDE) 9A-Inhibitor BAY 73-6691 (Kapitel 5). ADX-47273 erhöhte Spätphasen-LTP, aber hatte keinen Effekt auf Frühphasen-LTP, wohingegen BAY 73-6691 eine erhöhende Wirkung auf beide LTP Formen aufwies und sogar Früh- in Spätphasen-LTP umwandelte. Die gleichen Effekte, wie bei dem PDE9A-Inhibitor, konnten auch mit dem partiellen α7 nicotinische Acetylcholin-Rezeptor Agonisten SSR180711 (Kapitel 4) demonstriert werden. SSR180711 wirkt sowohl auf cholinerge, als auch auf glutamaterge neuronale Funktion. Dann wurde die Fähigkeit der Substanzen überprüft, durch lösliche Aβ Oligomere verschlechtertes LTP zu verbessern (Kapitel 6). Lösliche Aβ Oligomere, auch als amyloid-β derived diffusible ligands (ADDLs) bezeichnet, werden zurzeit als eine mutmaßliche Ursache der Alzheimer’schen Erkrankung angesehen. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass ADDLs Früh- und Spätphasen-LTP in verschiedenem Ausmaß vermindern. Donepezil und TC-1827 konnten die durch ADDLs induzierten Defizite bei Frühphasen-LTP geringfügig wiederherstellen, aber sie hatten keinen Einfluss auf das durch ADDLs verschlechterte Spätphasen-LTP. Im Gegensatz dazu, konnten sowohl SSR180711 als auch BAY 73-6691 ein durch ADDLs verschlechtertes Früh- und Spätphasen-LTP komplett wiederherstellen. ADX-47273 hatte keinen positiven Effekt auf Frühphasen-LTP, welches durch ADDLs verschlechtert worden war, konnte aber ein durch ADDLs verschlechtertes Spätphasen-LTP teilweise wiederherstellen. Somit wurde der vorherige Befund der Arbeit bestätigt: Substanzen, welche die glutamaterge Funktion verbessern, scheinen nicht nur wirksamer im Bezug auf LTP-Erhöhung zu sein als Substanzen die ausschließlich cholinerge Funktion erhöhen, sondern sie sind auch in der Lage, durch lösliche Aβ Oligomere verursachte Defizite bei LTP zu verbessern. Aus einem präklinischen Blickwinkel und basierend auf den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit weisen demnach Substanzen, die glutamaterge Funktionen verbessern, ein hohes therapeutisches Potential als alternative Ansätze bezüglich kognitiver Defizite auf. Möglicherweise könnten sie sogar wirksamere Ansätze für die symptomatische Behandlung der Alzheimer’schen Erkrankung darstellen, als derzeitige Behandlungen, die ausschließlich cholinerge Funktion verbessern. N2 - Alzheimer’s disease (AD) is a progressive neurodegenerative disease of the brain. Today AD is the most common form of dementia in elderly people. It is clinically characterized by a progressive loss of memory and later on a decline in higher cognitive functions. The pathological hallmarks of AD, consistently demonstrated in brain tissue of patients, are extracellular amyloid-β (Aβ plaques, intracellular neurofibrillary tangles of tau protein and a profound loss of mainly cholinergic and glutamatergic synapses and ultimatively neurons. Estimates foresee that more than 80 million individuals will be affected by the disease by 2040 due to population aging worldwide underlining the high medical need for this disease. In order to find suitable drugs for the treatment of AD, experimental model systems are utilized to explore potential drug candidates. Such an experimental system is hippocampal long-term potentiation (LTP), which is widely accepted as an in vitro model of cellular processes fundamentally involved in memory formation. The present thesis focuses on the establishment and validation of LTP in rat hippocampal slices to characterize memory enhancing drugs as a potential treatment of AD. First, a multi-slice recording system was set up enabling stable measurements of LTP for up to seven hours from several slices simultaneously (chapter 2). Then, distinct protocols to induce early and late CA1 LTP, resembling short-term and long-term memory, were established. They were validated by addressing the hallmarks accepted for these forms of LTP: protein-synthesis independence and NMDA receptor dependence without contribution of L-VDCCs for early LTP, as opposed to protein-synthesis and NMDA / L-VDCCs dependence for late LTP (chapter 3). As in AD patients a loss of mainly cholinergic and glutamatergic synapses is obvious, these validated forms of LTP were used to study drugs potentially being able to enhance cholinergic and/or glutamatergic neuronal functions. The effects of two drugs exclusively interfering with cholinergic function on LTP were tested: the α4β2 nicotinic acetylcholinergic receptor agonist TC-1827 (chapter 4) and the acetylcholine esterase inhibitor donepezil (chapter 5). Both drugs were found to increase early LTP, but to not affect late LTP. Furthermore, two drugs exclusively interfering with glutamatergic function were analyzed: the metabotropic glutamate 5 receptor postive allosteric modulator ADX-47273 (chapter 3) and the phosphodiesterase (PDE) 9A inhibitor BAY 73-6691 (chapter 5). ADX-47273 increased late LTP, but had no effect on early LTP, whereas BAY 73-6691 showed enhancing effects on both early and late LTP and even transformed early into late LTP. The same effects like for the PDE9A inhibitor were observed for the α7 nicotinic acetylcholinergic receptor partial agonist SSR180711 (chapter 4), which interferes with both, cholinergic and glutamatergic function. Thus, drugs facilitating glutamatergic function or both glutamatergic and cholinergic function seem to be more efficacious in enhancing LTP than drugs facilitating solely cholinergic function. To evaluate whether this finding also proves true for experimental circumstances mimicking decreased cognitive function together with pathophysiology in AD patients, the ability of the drugs to ameliorate LTP impaired by soluble Aβ oligomer was analyzed (chapter 6). Soluble Aβ oligomers, also referred to as amyloid-β derived diffusible ligands (ADDLs), are thought to a putative cause of AD. Here, they were demonstrated to impair early and late LTP to different extents by exclusively targeting NMDA receptors and/or their signaling. These results further contribute to the hypothesis that soluble Aβ oligomers cause synaptic dysfunction which might lead to cognitive decline seen in AD patients. Regarding drug effects, donepezil and TC-1827 slightly restored ADDLs induced impairment of early LTP, but had no effect on late LTP impaired by ADDLs. In contrast, both, SSR180711 and BAY 73-6691 completely rescued early as well as late LTP impaired by ADDLs. ADX-47273 had no restoring effect on ADDLs induced early LTP impairment, but partially restored late LTP impaired by ADDLs. Thus, the earlier finding of the present thesis was confirmed: drugs facilitating glutamatergic function not only seem to be more efficacious in enhancing LTP than drugs facilitating solely cholinergic function, but are also superior in ameliorating soluble Aβ oligomer induced LTP deficits. Therefore, from a preclinical perspective and based on the results of the present thesis, drugs interfering with glutamatergic function seem to have a high therapeutic potential as alternative treatment concerning cognitive deficits. Probably, they represent more efficacious approaches for the symptomatic treatment of AD than current treatments solely facilitating cholinergic function. KW - Alzheimerkrankheit KW - Long-term potentiation KW - hippocampus KW - rat KW - learning and memory KW - Langzeitpotenzierung KW - Hippocampus KW - Ratte KW - Wirkstoff Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85412 ER - TY - THES A1 - Schraut, Karla-Gerlinde T1 - Epigenetic programming by prenatal stress in female serotonin transporter deficient mice T1 - Epigenetische Programmierung durch Pränatalstress in weiblichen Serotonintransporter-defizienten Mäusen N2 - Early life stress, including exposure to prenatal stress (PS), has been shown to affect the developing brain and induce severe effects on emotional health in later life, concomitant with an increased risk for psychopathology. However, some individuals are more vulnerable to early-life stress, while others adapt successfully, i.e. they are resilient and do not succumb to adversity. The molecular substrates promoting resilience in some individuals and vulnerability in other individuals are as yet poorly investigated. A polymorphism in the serotonin transporter gene (5­HTT/SLC6A4) has been suggested to play a modulatory role in mediating the effects of early-life adversity on psychopathology, thereby rendering carriers of the lower-expressing short (s)-allele more vulnerable to developmental adversity, while long (l)-allele carriers are relatively resilient. The molecular mechanisms underlying this gene x environment interaction (GxE) are not well understood, however, epigenetic mechanisms such as DNA methylation and histone modifications have been discussed to contribute as they are at the interface of environment and the genome. Moreover, developmental epigenetic programming has also been postulated to underlie differential vulnerability/resilience independent of genetic variation. The present work comprises two projects investigating the effects of prenatal maternal restraint stress in 5-HTT deficient mice. In the first study, we examined to which extent previously observed changes in behavior and hippocampal gene expression of female 5-Htt+/- prenatally stressed (PS) offspring were associated with changes in DNA methylation patterns. Additionally, we investigated the expression of genes involved in myelination in hippocampus and amygdala of those animals using RT-qPCR. The genome-wide hippocampal DNA methylation screening was performed using methylated-DNA immunoprecipitation (MeDIP) on Affymetrix GeneChip® Mouse Promoter 1.0R arrays. In order to correlate individual gene-specific DNA methylation, mRNA expression and behavior, we used hippocampal DNA from the same mice as assessed before. 5-Htt genotype, PS and their interaction differentially affected the DNA methylation signature of numerous genes, a part of which were also differentially expressed. More specifically, we identified a differentially methylated region in the Myelin basic protein (Mbp) gene, which was associated with Mbp expression in a 5-Htt-, PS- and 5-Htt x PS-dependent manner. Subsequent fine-mapping linked the methylation status of two specific CpG sites in this region to Mbp expression and anxiety-related behavior. We furthermore found that not only the expression of Mbp but of large gene set associated with myelination was affected by a 5-Htt x PS interaction in a brain-region specific manner. In conclusion, hippocampal DNA methylation patterns and expression profiles of female PS 5-Htt+/- mice suggest that distinct molecular mechanisms, some of which are associated with changes in gene promoter methylation, and processes associated with myelination contribute to the behavioral effects of the 5-Htt genotype, PS exposure, and their interaction. In the second study, we aimed at investing the molecular substrates underlying resilience to PS. For this purpose, we exposed 5-Htt+/+ dams to the same restraint stress paradigm and investigated the effects of PS on depression- and anxiety-like behavior and corticosterone (CORT) secretion at baseline and after acute restraint stress in female 5-Htt+/+ and 5-Htt+/- offspring. We found that PS affected the offspring’s social behavior in a negative manner. When specifically examining those PS animals, we grouped the PS offspring of each genotype into a social, resilient and an unsocial, vulnerable group. While anxiety-like behavior in the EPM was reduced in unsocial, but not social, PS 5-Htt+/+ animals when compared to controls, this pattern could not be found in animals of the other genotype, indicating that social anxiety and state anxiety in the EPM were independent of each other. We then assessed genome-wide hippocampal gene expression profiles using mRNA sequencing in order to identify pathways and gene ontology (GO) terms enriched due to 5-Htt genotype (G), PS exposure (E) and their interaction (GxE) as well as enriched in social, but not unsocial, PS offspring, and vice versa. Numerous genes were affected by 5-Htt genotype, PS and most of all a GxE-interaction. Enrichment analysis using enrichr identified that the genotype affected mitochondrial respiration, while GxE-interaction-affected processes associated primarily with myelination and chromatin remodeling. We furthermore found that 5-Htt+/- mice showed profound expression changes of numerous genes in a genomic region located 10 mio kb upstream of the 5 Htt locus on the same chromosome. When looking at social vs. unsocial mice, we found that a much higher number of genes was regulated in 5 Htt+/- animals than in 5-Htt+/+ animals, reflecting the impact of GxE-interaction. Double the number of genes was regulated in social PS vs. control mice when compared to unsocial PS vs. control in both genotypes, suggesting that the successful adaption to PS might have required more active processes from the social group than the reaction to PS from the unsocial group. This notion is supported by the up-regulation of mitochondrial respiration in social, but not in unsocial, PS 5-Htt+/- mice when compared to controls, as those animals might have been able to raise energy resources the unsocial group was not. Next to this, processes associated with myelination seemed to be down-regulated in social 5-Htt+/- mice, but not in unsocial animals, when compared to controls. Taken together, PS exposure affected sociability and anxiety-like behavior dependent on the 5-Htt genotype in female offspring. Processes associated with myelination and epigenetic mechanisms involved in chromatin remodeling seemed be affected in a GxE-dependent manner in the hippocampus of these offspring. Our transcriptome data furthermore suggest that mitochondrial respiration and, with this, energy metabolism might be altered in 5-Htt+/- offspring when compared to 5-Htt+/+ offspring. Moreover, myelination and mitochondrial respiration might contribute to resilience towards PS exposure in 5-Htt+/- offspring, possibly by affecting brain connectivity and energy capabilities. N2 - Frühes Stresserleben wie zum Beispiel in Form von pränatalem Stress (PS) kann sich auf die Entwicklung des Gehirns auswirken und einen gravierenden Einfluss auf die emotionale Gesundheit im Erwachsenenaltern ausüben, was mit einem erhöhten Risiko für eine Psychopathologie einhergeht. Manche Individuen sind jedoch frühem Stresserleben gegenüber vulnerabler, während andere Individuen sich erfolgreich anpassen, d.h. resilient sind, und widrigen Umständen nicht erliegen. Die molekularen Substrate, die Resilienz in manchen und Vulnerabilität in anderen Individuen bedingen, sind bisher nur unzureichend erforscht. Ein Polymorphismus im Serotonintransportergen (5-HTT/SLC6A4) soll eine modulierende Rolle in der Vermittlung der Effekte von frühem Stresserleben auf die Entwicklung einer Psychopathologie spielen, wobei Träger des niedrig-exprimierenden kurzen (s-) Allels empfänglicher gegenüber Stresserlebnissen während der Entwicklung sind, während Träger des langen (l-) Allels als resilienter gelten. Die molekularen Mechanismen, die dieser Gen-Umwelt-Interaktion zu Grunde liegen, sind noch nicht aufgeklärt. Epigenetische Mechanismen wie DNA-Methylierung und Histonmodifikationen könnten jedoch dazu beitragen, da sie an der Schnittfläche zwischen Genom und Umwelt liegen. Des Weiteren wird vermutet, dass epigenetische Programmierung während der Entwicklung unabhängig von genetischer Varianz zur Ausbildung von Resilienz bzw. Vulnerabilität beiträgt. Die vorliegende Arbeit umfasst zwei Projekte, in denen die Auswirkungen von pränatalem „maternal restraint“ Stress in 5-HTT defizienten Mäusen behandelt werden. In der ersten Studie wurde untersucht, in ob und in welchem Maß zuvor beobachtete Veränderungen im Verhalten und in der hippocampalen Genexpression in weiblichen PS Mäusen mit Veränderungen in DNA-Methylierungsmustern einhergingen. Des Weiteren untersuchten wir mittels RT-qPCR die Expression von Genen, die mit Myelinisierung im Zusammenhang stehen, im Hippocampus und in der Amygdala dieser Tiere. Ein genomweites hippocampales DNA-Methylierungsscreening wurde durchgeführt indem methylierte DNA mit Hilfe der Methyl-DNA-Immunoprezipitation angereichert und auf Affymetrix GeneChip® Mouse Promoter 1.0R Arrays aufgetragen wurde. Um individuelle genspezifische DNA-Methylierung, mRNA-Expression und Verhalten miteinander korrelieren zu können, wurde hippocampale DNA derselben Mäuse, die zuvor getestet wurden, dafür eingesetzt. Der 5-Htt Genotyp, PS und ihre Interaktion veränderten die DNA-Methylierung von zahlreichen Genen, wovon ein Teil auch differentiell exprimiert war. Um genau zu sein, identifizierten wir eine differentiell methylierte Region im Myelin basic protein (Mbp) Gen, was mit Mbp Expressionsveränderungen auf Grund eines 5-Htt-, PS und eines 5-Htt x PS-Effekts einherging war. Eine anschließende genauere Untersuchung dieser Region zeigte eine Assoziation zwischen dem Methylierungsstatus zweier spezifischer CpG-Stellen mit der Mbp Expression und Angst-ähnlichem Verhalten. Es zeigte sich weiterhin, dass nicht nur die Expression von Mbp sondern eines ganzes Satzes an Genen, die mit Myelinisierung im Zusammenhang stehen, durch eine 5-Htt x PS-Interaktion in einer Gehirnregionen-spezifischen Weise verändert war. Zusammenfassend weisen die hippocampalen DNA-Methylierungsmuster und Genexpressionprofile der weiblichen PS 5-Htt+/- Mäuse darauf hin, dass eindeutige molekulare Mechanismen, wovon einige mit Veränderungen in der Promotermethylierung einhergingen, und Prozesse, die mit Myelinisierung im Zusammenhang stehen, zu den Verhaltenseffekten des 5-Htt Genotyps, PS-Exposition und ihrer Interaktion beitragen. Die zweite Studie hatte zum Ziel, molekulare Substrate, die einer Resilienz gegenüber PS zu Grunde liegen, zu erforschen. Zu diesem Zweck wandten wir das gleiche „restrainst stress“ Paradigma wie zuvor auf schwangere 5-Htt+/+ Weibchen an und untersuchten die PS-Effekte auf Depressions- und Angst-ähnliches Verhalten sowie auf die Corticosteronausschüttung im Grundzustand und nach akutem „restraint stress“ im weiblichen 5-Htt+/+ und 5-Htt+/- Nachwuchs. Wir stellten fest, dass sich PS negativ auf das Sozialverhalten auswirkte. Als wir die PS Tiere genauer untersuchten, teilten wir den PS Nachwuchs jeden Genotyps in je eine soziale, resiliente und eine unsoziale, vulnerable Gruppe ein. Während das Angst-ähnliche Verhalten im EPM in unsozialen, aber nicht sozialen, 5-Htt+/+ PS Tieren im Vergleich zu Kontrolltieren verringert war, konnte man diesen Effekt im anderen untersuchten Genotyp nicht finden, was darauf hinweist, dass soziale Ängstlichkeit und die sogenannte „state anxiety“, wie in potentiell angsteinflößenden Situationen zu Tage tritt, unabhängig voneinander funktionierende Prozesse sind. Wir erstellten anschließend mittels mRNA-Sequenzierung genomweite hippocampale Genexpressionsprofile um Netzwerke und Gene Ontology (GO) Terms zu identifizieren, die auf Grund des 5-Htt Genotyps (G), der PS-Exposition (E) oder einer Interaktion (GxE) sowie in sozialem, aber nicht in unsozialem, PS Nachwuchs und umgekehrt angereichert waren. Die Expression zahlreicher Gene war durch den 5-Htt Genotyp, der PS-Exposition und vor allem einer GxE-Interaktion verändert. Durch eine Anreicherungsanalyse mittels enrichr stellten wir fest, dass die mitochondriale Atmungskette vom Genotyp beeinflusst wurde, wohingegen sich die GxE-Interaktion vor allem auf Prozesse, die mit Myelinisierung und Chromatinumgestaltung in Verbindung standen, auswirkte. Darüber hinaus fanden wir in 5-Htt+/- Mäusen höchst signifikante Expressionsveränderungen zahlreicher Gene, die in einer genomischen Region 10 mio kb in 5‘ Richtung des 5-Htt Lokus auf dem gleichen Chromosom lagen. Als wir soziale und unsoziale PS Mäuse verglichen, zeigte sich, dass eine deutlich höhere Anzahl an Genen in 5-Htt+/- Mäusen als in 5-Htt+/+ Mäusen reguliert war, was die Auswirkungen der GxE-Interaktion widerspiegelt. In beiden Genotypen war die doppelte Anzahl an Genen in sozialen PS vs. Kontroll-Tieren im Vergleich zu unsozialen PS vs. Kontroll-Tieren verändert, was darauf hinweist, dass eine erfolgreiche Anpassung an PS den sozialen Tieren möglicherweise mehr aktive Prozesse abverlangte als die Reaktion auf PS in der unsozialen Gruppe. Diese Vorstellung wird durch eine Steigerung der mitochondrialen Atmungskette auf mRNA-Ebene in sozialen, aber nicht in unsozialen, 5-Htt+/- Mäusen im Vergleich zu Kontrollmäusen unterstützt, da diese Tiere in der Lage gewesen sein könnten, Energieressourcen zu mobilisieren, die den unsozialen Tieren nicht zur Verfügung standen. Des Weiteren schienen Prozesse, die mit Myelinisierung im Zusammenhang stehen, in sozialen, aber nicht in unsozialen, PS 5-Htt+/- Mäusen im Vergleich zu Kontrollmäusen herunterreguliert zu sein. Zusammengefasst wirkte sich die PS-Exposition auf das Sozial- und Angst-ähnliche Verhalten abhängig vom 5-Htt Genotyp im weiblichen Nachwuchs aus. Prozesse, die mit Myelinisierung im Zusammenhang stehen, und epigenetische Mechanismen, die in der Chromatinumgestaltung beteiligt sind, schienen von einer GxE-Interaktion im Hippocampus dieser Tiere beeinflusst zu sein. Unsere Transkriptomdaten gaben des weiteren Hinweise darauf, dass die mitochondriale Atmungskette, und damit vermutlich auch der Energiemetabolismus, in 5-Htt+/- Tieren im Vergleich zu 5-Htt+/+ Tieren verändert sein könnte. Ferner könnten Veränderungen in der Myelinisierung sowie in der mitochondrialen Atmungskette zur Resilienzentwicklung gegenüber PS in 5-Htt+/- Mäusen beitragen, möglicherweise durch Veränderungen in der Gehirnkonnektivität und in den zu mobilisierenden Energieressourcen. KW - Stress KW - Serotonin KW - Pränatale Entwicklung KW - Maus KW - Epigenetic KW - DNA methylation KW - Epigenetik KW - Hippocampus KW - Depression Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-120270 ER - TY - THES A1 - Bacmeister, Lucas T1 - Effect of Cadherin-13 inactivation on different GABAergic interneuron populations of the mouse hippocampus T1 - Effekt der Cadherin-13 Inaktivierung auf verschiedene GABAerge Interneuronenpopulationen im Hippocampus der Maus N2 - Cadherin-13 (CDH13) is an atypical member of the cadherin superfamily, a group of membrane proteins mediating calcium-dependent cellular adhesion. Although CDH13 shows the classical extracellular cadherin structure, the typical transmembrane and cytoplasmic domains are absent. Instead, CDH13 is attached to the cell membrane via a glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor. These findings and many studies from different fields suggest that CDH13 also plays a role as a cellular receptor. Interestingly, many genome-wide association studies (GWAS) have found CDH13 as a risk gene for attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD) and other neurodevelopmental disorders. In previous work from our research group, strong expression of Cdh13 mRNA in interneurons of the hippocampal stratum oriens (SO) was detected. Therefore, double-immunofluorescence studies were used to evaluate the degree of co-expression of CDH13 with seven markers of GABAergic interneuron subtypes. For this purpose, murine brains were double stained against CDH13 and the respective marker and the degree of colocalization in the SO of the hippocampus was assessed. Based on the result of this immunofluorescence study, quantitative differences in interneuron subtypes of the SO between Cdh13 knockout (ko), heterozygote (het) and wildtype (wt) mice were investigated in this dissertation using stereological methods. In addition, genotype- dependent differences in the expression of genes involved in GABAergic and glutamatergic neurotransmission were analyzed by quantitative real-time PCR (qRT-PCR). Primers targeting different GABA receptor subunits, vesicular GABA and glutamate transporter, GABA synthesizing enzymes and their interaction partners were used for this purpose. The results of the stereological quantification of the interneuron subtypes show no significant differences in cell number, cell density or volume of the SO between Cdh13 ko, het and wt mice. On the other hand, qRT-PCR results indicate significant differences in the expression of tropomyosin-related kinase B gene (TrkB), which encodes the receptor of brain-derived neurotrophic factor (BDNF), a regulator of GABAergic neurons. This finding supports a role for CDH13 in the regulation of BDNF signaling in the hippocampus. N2 - Cadherine sind eine große Gruppe von calciumabhängigen Typ-1 Transmembranproteinen, die an der Ausbildung von Zell-Zell-Kontakten beteiligt sind. Cadherin-13 (CDH13) ist ein atypisches Mitglied dieser Proteinfamilie. Obwohl es die gleiche extrazelluläre Struktur wie klassische Cadherine besitzt, fehlen sowohl die cytoplasmatische als auch die Transmembrandomäne. Stattdessen ist CDH13 über einen GPI-Anker an der zellulären Plasmamembran befestigt. Diese Ergebnisse und viele andere Studien aus unterschiedlichen Bereichen lassen vermuten, dass CDH13 auch als zellulärer Rezeptor wirkt. Interessanterweise ergaben verschiedene genomweite Assoziationsstudien, dass CDH13 ein vielversprechendes Kandidatengen für das Auftreten von Aufmerksamkeitsdefizit-/Hyperaktivitätsstörung (ADHS) und anderen Störungen der neuronalen Entwicklung ist. In früheren Studien unserer Arbeitsgruppe wurde eine starke Expression von Cd13 mRNA in Interneuronen des stratum oriens (SO) des Hippocampus festgestellt. Daher wurde mit Hilfe von Immunfluoreszenz der Grad der Koexpression von CDH13 mit 7 verschiedenen Markern von Subtypen GABAerger Interneuronen ermittelt. Zu diesem Zweck wurden Doppelfärbungen gegen CDH13 und den jeweiligen Marker durchgeführt und anschließend der Grad der Kolokalisation im SO des Hippocampus berechnet. Ausgehend von diesen Ergebnissen wurden in dieser Dissertation quantitative Unterschiede zwischen verschiedenen Subtypen von Interneuronen in Cdh13 knockout (ko), heterozygoten (het) und Wildtyp (wt)-Mäusen mit Hilfe von stereologischen Methoden ermittelt. Darüber hinaus wurden genotypabhängige Unterschiede in der GABAergen und glutamatergen Neurotransmission mit quantitativer Echtzeit-PCR (qRT-PCR) evaluiert. Hierzu wurden Primer eingesetzt, die sowohl auf Untereinheiten des GABA Rezeptors, GABA-synthetisierende Enzyme als auch auf GABA- und Glutamat-Transporter innerhalb synaptischer Vesikel abzielen. In der stereologischen Quantifizierung der Interneuron-Subtypen wurden keine signifikanten Unterschiede bezüglich der Zellzahl, der Zelldichte oder des Volumens des SO zwischen den verschieden Genotypen gefunden. Im Gegensatz dazu zeigten sich in der qRT-PCR signifikante Unterschiede in der Expression von tropomyosin-related kinase B (TrkB), einem Gen, das für den Rezeptor des brain-derived neurotrophic factor (BDNF) kodiert. Bei diesem handelt es sich um einen Regulator von GABAergen Neuronen. Diese Ergebnisse bekräftigen, dass CDH13 an der Regulation des BDNF-Signalwegs im Hippocampus teilnimmt. KW - Cadherine KW - GABAerge Nervenzelle KW - Hippocampus KW - Cadherin-13 KW - CDH13 KW - Tropomyosin receptor kinase B KW - TrkB KW - Maus Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-172693 ER -