TY - JOUR A1 - Tauscher, Sabine A1 - Nakagawa, Hitoshi A1 - Völker, Katharina A1 - Werner, Franziska A1 - Krebes, Lisa A1 - Potapenko, Tamara A1 - Doose, Sören A1 - Birkenfeld, Andreas L. A1 - Baba, Hideo A. A1 - Kuhn, Michaela T1 - β Cell-specific deletion of guanylyl cyclase A, the receptor for atrial natriuretic peptide, accelerates obesity-induced glucose intolerance in mice JF - Cardiovascular Diabetology N2 - Background: The cardiac hormones atrial (ANP) and B-type natriuretic peptides (BNP) moderate arterial blood pressure and improve energy metabolism as well as insulin sensitivity via their shared cGMP-producing guanylyl cyclase-A (GC-A) receptor. Obesity is associated with impaired NP/GC-A/cGMP signaling, which possibly contributes to the development of type 2 diabetes and its cardiometabolic complications. In vitro, synthetic ANP, via GC-A, stimulates glucose-dependent insulin release from cultured pancreatic islets and β-cell proliferation. However, the relevance for systemic glucose homeostasis in vivo is not known. To dissect whether the endogenous cardiac hormones modulate the secretory function and/or proliferation of β-cells under (patho)physiological conditions in vivo, here we generated a novel genetic mouse model with selective disruption of the GC-A receptor in β-cells. Methods: Mice with a floxed GC-A gene were bred to Rip-CreTG mice, thereby deleting GC-A selectively in β-cells (β GC-A KO). Weight gain, glucose tolerance, insulin sensitivity, and glucose-stimulated insulin secretion were monitored in normal diet (ND)- and high-fat diet (HFD)-fed mice. β-cell size and number were measured by immunofluorescence-based islet morphometry. Results: In vitro, the insulinotropic and proliferative actions of ANP were abolished in islets isolated from β GC-A KO mice. Concordantly, in vivo, infusion of BNP mildly enhanced baseline plasma insulin levels and glucose-induced insulin secretion in control mice. This effect of exogenous BNP was abolished in β GC-A KO mice, corroborating the efficient inactivation of the GC-A receptor in β-cells. Despite this under physiological, ND conditions, fasted and fed insulin levels, glucose-induced insulin secretion, glucose tolerance and β-cell morphology were similar in β GC-A KO mice and control littermates. However, HFD-fed β GC-A KO animals had accelerated glucose intolerance and diminished adaptative β-cell proliferation. Conclusions: Our studies of β GC-A KO mice demonstrate that the cardiac hormones ANP and BNP do not modulate β-cell's growth and secretory functions under physiological, normal dietary conditions. However, endogenous NP/GC-A signaling improves the initial adaptative response of β-cells to HFD-induced obesity. Impaired β-cell NP/GC-A signaling in obese individuals might contribute to the development of type 2 diabetes. KW - cylic GMP KW - guanylyl cyclase-A KW - insulin KW - natriuretic peptides KW - obesity KW - β-cells Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-176322 VL - 17 IS - 103 ER - TY - THES A1 - Herbst, Andreas Sebastian T1 - Untersuchungen zu in vitro modifizierten humanen Blutmonozyten : Immunhistochemisch-morphologische Charakterisierung und funktioneller Nachweis von Insulin T1 - Investigation of in vitro modified human blood monocytes : Characterisation by immunohistochemistry and functional proof of their insulin N2 - Insulin-produzierende Zellen als Ersatz für die beim Diabetes mellitus Typ 1 zerstörten Betazellen stellen einen hochattraktiven Forschungsansatz dar. Ziel dieser Arbeit war, Insulin-positive Zellen aus in vitro modifizierten Blutmonozyten zu gewinnen. Blutmonozyten sind nicht nur, wie bereits seit längerem bekannt, in der Lage, sich in Makrophagen und dendritischen Zellen zu differenzieren, sondern auch in eine Vielzahl nicht-phagozytierender Zellen, wie z.B. Insulin-produzierender Zellen. Für die optimale Zelltherapie ist zu fordern, dass die gewünschten Zellen in vivo nicht nur ihre Funktion beibehalten, sondern dass von diesen Zellen auch kein immunologisches Risiko für den Patienten ausgeht. Eine dauerhafte Immunsuppression, wie sie für die Vollorgantransplantation notwendig ist, ist für Zelltransplantate nicht angebracht. Hier besteht Übereinkunft, dass Immunsuppressiva, wenn überhaupt, nur kurzfristig einzusetzen sind. Blutmonozyten lassen sich einfach gewinnen und stünden somit als autologer Zellersatz für eine mögliche Zelltherapie zur Verfügung. Ein wesentlicher Aspekt dieser Arbeit war, die in vitro Differenzierung von Blutmonozyten zu charakterisieren. Dabei sollte die Expression von Insulin, Gluka¬gon und dem Glukosetransporter Glut-2 nachgewiesen werden. Auch morpho¬logische Veränderungen während der Kultur sollten beobachtet werden. Die kultivierten Monozyten entwickelten sich mit zunehmender Kulturdauer eindeutig zu Makrophagen. Dabei waren zwei verschiedene Zellmorphologien zu unterscheiden: Der erste Zelltyp (Typ 1) war oval mit Ausläufern. Der zweite Zelltyp (Typ 2) war sehr groß, teilweise mit einem Durchmesser von über 500 μm, häufig von ovaler Form und polynukleär. Dieser Zelltyp wies zudem häufig einen breiten, um das Kerngebiet gruppierten Saum auf. Mit zunehmender Kulturdauer dominierte dieser Zelltyp die Kultur. Der Großteil der Typ 1-Zellen blieb CD14 positiv. Gab es CD14-negative Zellen in der Kultur, so gehörten sie mit großer Wahrscheinlichkeit zu den Typ 2-Zellen. Nur in den in vitro modifizierten, nicht aber in den frisch isolierten Monozyten waren Insulin, C-Peptid, Glukagon und GLUT-2 immunhistochemisch nachzu¬weisen. Mit zunehmender Kulturdauer dominierten stark adhärente Makrophagen die Kultur. Das aus ca. 5x106 Monozyten isolierte Insulin senkte den Blutzuckerspiegel diabetischer Mäuse innerhalb einer Stunde nach Injektion um 66,1±12,8 Prozent (n=5). Zum Vergleich: 170 pg Humaninsulin senkten den Blutzuckerspiegel um 84,2±8,4 Prozent (n=4). Insulin-negative Monozyten beeinflussten nicht den Blutzuckerspiegel diabeticher Mäuse. Zudem lassen erste elektronenmikroskopische Aufnahmen von in vitro modifizierten Monozyten Insulin-haltige Vesikel erkennen. Zum jetzigen Zeitpunkt ist gesichert, dass in vitro modifizierte Monozyten über biologisch aktives Insulin verfügen, das den Blutzuckerspiegel diabetischer Tiere senkt. Der Nachweis von C-Peptid deutet zudem darauf hin, dass es sich hierbei um de novo Insulin handelt. Dies bedeutet, dass das Insulin-Gen in den in vitro modifizierten Monozyten aktiv ist und sie Insulin mRNA exprimieren, die anschließend in Insulin translatiert wird. Der elektronenmikroskopische Nachweis Insulin-haltiger Granula deutet außerdem darauf hin, dass diese Zellen Insulin speichern können. Inwieweit sie jedoch auch zur Glukose-ab¬hängigen Insulin-Ausschüttung in der Lage sind, ist in weiteren Experimenten zu überprüfen. N2 - Promising cell replacement strategies may restore insulin-secretion in patients with type 1 diabetes. Cells suitable for such a strategy must demonstrate prolonged function in vivo and should not induce immunological responses. A chronic immuno¬suppressive therapy which is requisite for organ grafts is not suitable for cell grafts. Peripheral human blood monocytes easily obtained from patients can be modified in vitro into insulin-positive cells and, therefore may be perfect for autologic cell replacement strategies. The purpose of this study was to characterise cultured monocytes for the presence of insulin and C-peptide as a well-defined indicator for insulin synthesis by immunohistochemistry. In addition, the expression of glucagon and the glucose transporter Glut-2 was proved. During culture, monocytes differentiated into cells with unique morphology. The cell type 1 showed a lengthy-oval shape with branches, like fibroblasts. The cell type 2 was very large, oval in shape and often polynuclear. These cells demonstrated the morphology of long-term cultured macrophages and dominated the culture in the course of time. Cultured monocytes were positive for insulin, C-peptide, glucagon and Glut-2 in contrast to freshly isolated monocytes. Evidence from the electron microscopy indicated that insulin-positive monocytes store their insulin in vesicles. Insulin isolated from 5x106 insulin-positive monocytes was able to reduce blood glucose levels of diabetic mice (> 22 mmol/L) about 66.1±12.8 percent (n=5) within one hour after injection. In comparison, 170 pg of human insulin decreased blood glucose levels of diabetic mice about 84.2±8.4 percent (n=4). Insulin-negative monocytes were unable to reduce blood glucose levels. In this study the possibility of modifying monocytes into insulin-positive cells during culture was confirmed. The detection of C-peptide supports the existence of de novo insulin within these cells which was stored in granula and biologically active. In further studies these cells have to prove whether they are really able to secrete insulin in a dose-dependent manner qualifying them as long-term cell replacements. KW - Insulin KW - Monozyt KW - Langerhans-Inseln KW - Diabetes mellitus KW - Zellulartherapie KW - Hepatozyten-Wachstumsfaktor KW - Antigen CD14 KW - Bauchspeicheldrüse KW - B-Zel KW - insulin KW - monocyte KW - diabetes KW - cell replacement therapy KW - beta cells Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-28404 ER - TY - JOUR A1 - Bankoglu, Ezgi Eyluel A1 - Tschopp, Oliver A1 - Schmitt, Johannes A1 - Burkard, Philipp A1 - Jahn, Daniel A1 - Geier, Andreas A1 - Stopper, Helga T1 - Role of PTEN in Oxidative Stress and DNA Damage in the Liver of Whole-Body Pten Haplodeficient Mice JF - PLoS One N2 - Type 2 diabetes (T2DM) and obesity are frequently associated with non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) and with an elevated cancer incidence. The molecular mechanisms of carcinogenesis in this context are only partially understood. High blood insulin levels are typical in early T2DM and excessive insulin can cause elevated reactive oxygen species (ROS) production and genomic instability. ROS are important for various cellular functions in signaling and host defense. However, elevated ROS formation is thought to be involved in cancer induction. In the molecular events from insulin receptor binding to genomic damage, some signaling steps have been identified, pointing at the PI3K/AKT pathway. For further elucidation Phosphatase and Tensin homolog (Pten), a tumour suppressor phosphatase that plays a role in insulin signaling by negative regulation of PI3K/AKT and its downstream targets, was investigated here. Dihydroethidium (DHE) staining was used to detect ROS formation in immortalized human hepatocytes. Comet assay and micronucleus test were performed to investigate genomic damage in vitro. In liver samples, DHE staining and western blot detection of HSP70 and HO-1 were performed to evaluate oxidative stress response. DNA double strand breaks (DSBs) were detected by immunohistostaining. Inhibition of PTEN with the pharmacologic inhibitor VO-OHpic resulted in increased ROS production and genomic damage in a liver cell line. Knockdown of Pten in a mouse model yielded increased oxidative stress levels, detected by ROS levels and expression of the two stress-proteins HSP70 and HO-1 and elevated genomic damage in the liver, which was significant in mice fed with a high fat diet. We conclude that PTEN is involved in oxidative stress and genomic damage induction in vitro and that this may also explain the in vivo observations. This further supports the hypothesis that the PI3K/AKT pathway is responsible for damaging effects of high levels of insulin. KW - insulin KW - mouse models DNA damage KW - oxidative stress KW - mammalian genomics KW - fatty liver KW - micronuclei KW - insulin signaling Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-146970 VL - 11 IS - 11 ER - TY - THES A1 - Karwen, Till T1 - Platelets promote insulin secretion of pancreatic β-cells T1 - Thrombozyten fördern die Insulinsekretion von pankreatischen β-Zellen N2 - The pancreas is the key organ for the maintenance of euglycemia. This is regulated in particular by α-cell-derived glucagon and β-cell-derived insulin, which are released in response to nutrient deficiency and elevated glucose levels, respectively. Although glucose is the main regulator of insulin secretion, it is significantly enhanced by various potentiators. Platelets are anucleate cell fragments in the bloodstream that are essential for hemostasis to prevent and stop bleeding events. Besides their classical role, platelets were implemented to be crucial for other physiological and pathophysiological processes, such as cancer progression, immune defense, and angiogenesis. Platelets from diabetic patients often present increased reactivity and basal activation. Interestingly, platelets store and release several substances that have been reported to potentiate insulin secretion by β-cells. For these reasons, the impact of platelets on β-cell functioning was investigated in this thesis. Here it was shown that both glucose and a β-cell-derived substance/s promote platelet activation and binding to collagen. Additionally, platelet adhesion specifically to the microvasculature of pancreatic islets was revealed, supporting the hypothesis of their influence on glucose homeostasis. Genetic or pharmacological ablation of platelet functioning and platelet depletion consistently resulted in reduced insulin secretion and associated glucose intolerance. Further, the platelet-derived lipid fraction was found to enhance glucose-stimulated insulin secretion, with 20-hydroxyeicosatetraenoic acid (20-HETE) and possibly also lyso-precursor of platelet-activating factor (lysoPAF) being identified as crucial factors. However, the acute platelet-stimulated insulin secretion was found to decline with age, as did the levels of platelet-derived 20-HETE. In addition to their direct stimulatory effect on insulin secretion, specific defects in platelet activation have also been shown to affect glucose homeostasis by potentially influencing islet vascular development. Taking together, the results of this thesis suggest a direct and indirect mechanism of platelets in the regulation of insulin secretion that ensures glucose homeostasis, especially in young individuals. N2 - Der Pankreas ist das Schlüsselorgan für die Aufrechterhaltung der Glukosehomöostase. Diese wird insbesondere durch das von α-Zellen stammende Glukagon und von β-Zellen stammende Insulin reguliert, die als Reaktion auf Nährstoffmangel beziehungsweise erhöhte Glukosespiegel freigesetzt werden. Obwohl Glukose der Hauptregulator der Insulinsekretion ist, wird sie durch verschiedene Potentiatoren erheblich gesteigert. Thrombozyten sind kernlose Zellfragmente im Blutkreislauf, die für die Hämostase unerlässlich sind. Neben ihrer klassischen Funktion sind sie auch an anderen physiologischen und pathophysiologischen Prozessen beteiligt, etwa an der Tumorentwicklung, der Immunabwehr und der Angiogenese. Thrombozyten von Diabetikern weisen häufig eine erhöhte Reaktivität und basale Aktivierung auf. Außerdem speichern und sekretieren sie Substanzen, von denen bekannt ist, dass sie die Insulinsekretion durch β-Zellen verstärken. Aus diesen Gründen wurde in dieser Arbeit der Einfluss von Thrombozyten auf die Funktion von β-Zellen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl Glukose als auch eine aus β-Zellen stammende Substanz/en die Thrombozytenaktivierung und die Bindung an Kollagen fördern. Darüber hinaus wurde eine spezifische Thrombozytenadhäsion an der Mikrovaskulatur der pankreatischen Inseln festgestellt, was die Hypothese ihres Einflusses auf die Glukosehomöostase unterstützt. Eine genetische oder pharmakologische Ablation der Thrombozytenfunktion sowie eine Depletion von Thrombozyten führten zu einer verminderten Insulinsekretion und einer damit verbundenen Glukoseintoleranz. Hierbei erwies sich die Lipidfraktion von Thrombozyten als essentieller Potentiator für die glukosestimulierte Insulinsekretion, wobei 20-Hydroxyeicosatetraensäure (20-HETE) und die Lyso-Vorstufe des Plättchen-Aktivierenden Faktors (LysoPAF) als entscheidende Faktoren identifiziert werden konnten. Weiterhin wurde festgestellt, dass sowohl der direkte stimulierende Effekt von Thrombozyten auf die Insulinsekretion, als auch deren 20-HETE Sekretion mit zunehmendem Alter abnimmt. Thrombozyten beeinflussten außerdem die Inselvaskularisierung, welche mutmaßlich zusätzlich zu Glukoseintoleranz führt. Insgesamt deuten die Ergebnisse dieser Arbeit auf einen direkten und indirekten Mechanismus der Thrombozyten bei der Regulierung der Insulinsekretion hin, der die Glukosehomöostase insbesondere bei jungen Menschen gewährleistet. KW - platelet KW - β cell KW - insulin KW - pancreas KW - diabetes KW - Thrombozyt KW - Insulinsekretion Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-313933 ER - TY - JOUR A1 - Viera, Jonathan Trujillo A1 - El-Merahbi, Rabih A1 - Nieswandt, Bernhard A1 - Stegner, David A1 - Sumara, Grzegorz T1 - Phospholipases D1 and D2 Suppress Appetite and Protect against Overweight JF - PLoS ONE N2 - Obesity is a major risk factor predisposing to the development of peripheral insulin resistance and type 2 diabetes (T2D). Elevated food intake and/or decreased energy expenditure promotes body weight gain and acquisition of adipose tissue. Number of studies implicated phospholipase D (PLD) enzymes and their product, phosphatidic acid (PA), in regulation of signaling cascades controlling energy intake, energy dissipation and metabolic homeostasis. However, the impact of PLD enzymes on regulation of metabolism has not been directly determined so far. In this study we utilized mice deficient for two major PLD isoforms, PLD1 and PLD2, to assess the impact of these enzymes on regulation of metabolic homeostasis. We showed that mice lacking PLD1 or PLD2 consume more food than corresponding control animals. Moreover, mice deficient for PLD2, but not PLD1, present reduced energy expenditure. In addition, deletion of either of the PLD enzymes resulted in development of elevated body weight and increased adipose tissue content in aged animals. Consistent with the fact that elevated content of adipose tissue predisposes to the development of hyperlipidemia and insulin resistance, characteristic for the pre-diabetic state, we observed that Pld1\(^{-/-}\) and Pld2\(^{-/-}\) mice present elevated free fatty acids (FFA) levels and are insulin as well as glucose intolerant. In conclusion, our data suggest that deficiency of PLD1 or PLD2 activity promotes development of overweight and diabetes. KW - enzyme regulation KW - insulin resistance KW - body weight KW - mouse models KW - bioenergetics KW - insulin KW - hypothalamus KW - adipose tissue Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-179729 VL - 11 IS - 6 ER - TY - JOUR A1 - Barres, B. A. A1 - Schmid, R. A1 - Sendtner, Michael A1 - Raff, Martin C. T1 - Multiple extracellular signals are required for long-term oligodendrocyte survival N2 - We showed previously that oligodendrocytes and their precursors require continuous signalling by protein trophic factors to avoid programmed cell death in culture. Here we show that three classes of such trophic factors promote oligodendrocyte survival in vitro: (1) insulin and insulin-like growth factors (IGFs), (2) neurotrophins, particularly neurotrophin-3 (NT -3), and (3) ciliary-neurotrophic factor (CNTF), leukemia inhibitory factor (LIF) and interleukin 6 (IL-6). A single factor, or combinations of factors within the same class, promote only short-term survival of oligodendrocytes and their precursors, while combinations of factors from different classes promote survival additively. Long-term survival of oligodendrocytes in vitro requires at least one factor from each class, suggesting that multiple signals may be required for long-term oligodendrocyte survival in vivo. We also show that CNTF promotes oligodendrocyte survival in vivo, that platelet-derived growth factor (PDGF) can promote the survival of oligodendrocyte precursors in vitro by acting on a novel, very high affinity PDGF receptor, and that, in addition to its effect on survival, NT-3 is a potent mitogen for oligodendrocyte precursor cells. KW - neurotrophins KW - programmed cell death KW - apoptosis KW - ciliary-neurotrophic factor KW - interleukin 6 KW - insulin KW - insulin-likegrowth factor I Y1 - 1993 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-42644 ER - TY - THES A1 - Konrad, Christian T1 - Molecular analysis of insulin signaling mechanisms in Echinococcus multilocularis and their role in the host-parasite interaction in the alveolar echinococcosis T1 - Molekulare Analyse der Insulin-Signalmechanismen in Echinococcus multilocularis und ihre Rolle in der Wirt-Parasiten-Interaktion in der Alveolären Echinokokkose N2 - The insulin receptor ortholog EmIR of the fox-tapeworm Echinococcus multilocularis displays significant structural homology to the human insulin receptor (HIR) and has been suggested to be involved in insulin sensing mechanisms of the parasite’s metacestode larval stage. In the present work, the effects of host insulin on Echinococcus metacestode vesicles and the proposed interaction between EmIR and mammalian insulin have been studied using biochemical and cell-biological approaches. Human insulin, exogenously added to in vitro cultivated parasite larvae, (i) significantly stimulated parasite survival and growth, (ii) induced DNA de novo synthesis in Echinococcus, (iii) affected overall protein phosphorylation in the parasite, and (iv) specifically induced the phosphorylation of the parasite’s Erk-like MAP kinase orthologue EmMPK1. These results clearly indicated that Echinococcus metacestode vesicles are able to sense exogenous host insulin which induces a mitogenic response. To investigate whether EmIR mediates these effects, anti-EmIR antibodies were produced and utilized in biochemical assays and immunohistochemical analyses. EmIR was shown to be expressed in the germinal layer of the parasite both on the surface of glycogen storing cells and undifferentiated germinal cells. Upon addition of exogenous insulin to metacestode vesicles, the phosphorylation of EmIR was significantly induced, an effect which was suppressed in the presence of specific inhibitors of insulin receptor-like tyrosine kinases. Furthermore, upon expression of EmIR/HIR receptor chimera containing the extracellular ligand binding domain of EmIR in HEK 293 cells, a specific autophosphorylation of the chimera could be induced through the addition of exogenous insulin. These results indicated the capability of EmIR to sense and to transmit host insulin signals to the Echinococcus signaling machinery. The importance of insulin signaling mechanisms for parasite survival and growth were underscored by in vitro cultivation experiments in which the addition of an inhibitor of insulin receptor tyrosine kinases led to vesicle degradation and death. Based on the above outlined molecular data on the interaction between EmIR and mammalian insulin, the parasite’s insulin receptor orthologue most probably mediates the insulin effects on parasite growth and is, therefore, a potential candidate factor for host-parasite communication via evolutionary conserved pathways. In a final set of experiments, signaling mechanisms that act downstream of EmIR have been analyzed. These studies revealed significant differences between insulin signaling in Echinococcus and the related cestode parasite Taenia solium. These differences could be associated with differences in the organo-tropism of both species. N2 - Der orthologe Insulinrezeptor EmIR des Fuchsbandwurmes Echinococcus multilocularis weist signifikante strukturelle Homologie zum humanen Insulinrezeptor (HIR) auf. Es wurde schon seit geraumer Zeit vermutet, dass EmIR an den Mechanismen beteiligt sein könnte, die es dem Metacestoden Larvenstadium des Parasiten erlauben Insulin zu detektieren. In dieser Arbeit wurden die Effekte von Wirtsinsulin auf Echinococcus Metacestoden-Vesikel und die vermutete Interaktion zwischen EmIR und Insulin von Säugern mittels biochemischer und zellbiologischer experimenteller Ansätze untersucht. Die exogene Zugabe von humanem Insulin zu in vitro kultivierten Parasitenlarven hatte folgende Effekte: (i) das Überleben und das Wachstum des Parasiten wurde signifikant stimuliert; (ii) die DNA de novo Synthese in Echinococcus wurde induziert; (iii) die generelle Proteinphosphorylierung des Parasiten wurde beeinflusst; (iv) die Phosphorylierung der orthologen Erk-like MAP Kinase, EmMPK1, des Parasiten wurde spezifisch induziert. Diese Beobachtungen zeigen deutlich, dass Echinococcus Metacestoden-Vesikel exogenes Insulin des Wirtes detektieren können und dass dieses Insulin einen mitogenischen Effekt auf den Parasiten hat. Um zu untersuchen, ob diese Effekte durch EmIR vermittelt werden, wurden anti-EmIR Antikörper hergestellt und in biochemischen experimentellen Ansätzen und immunohistochemischen Analysen eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass EmIR in der Germinalschicht des Parasiten expremiert wird, sowohl an der Oberfläche von Glykogen-Speicherzellen als auch von undifferenzierten Germinalzellen. Nach der Zugabe von exogenem Insulin konnte eine signifikante Zunahme der Phosphorylierung von EmIR festgestellt werden. Diese Stimulierung konnte durch die Zugabe eines spezifischen Inhibitors für Insulinrezeptor-ähnliche Tyrosinkinasen unterdrückt werden. Desweiteren konnte mittels der Expression eines chimären EmIR/HIR-Rezeptors, der die extrazelluläre Ligandenbindungsdomäne von EmIR enthielt, in HEK293 Zellen gezeigt werden, dass die Zugabe von exogenem Insulin eine spezifische Autophosphorylierung der Chimäre induziert. Diese Ergebnisse bezeugen die Fähigkeit von EmIR Insulin-abhängige Signale des Wirtes einerseits zu detektieren und andererseits an die Echinococcus Signalwege weiter zu leiten. Die Bedeutung von Insulin-Signalmechanismen für das Überleben und das Wachstum des Parasiten konnte durch in vitro Kultivierungsexperimente aufgezeigt werden. Die Zugabe eines Inhibitors spezifisch für Insulinrezeptor Tyrosinkinasen verursachte die Degradation und den Tod der Metacestoden-Vesikel. Basierend auf den dargelegten molekularen Daten bezüglich der Interaktion zwischen EmIR und Insulin von Säugern erscheint es sehr wahrscheinlich, dass der orthologe Insulinrezeptor des Parasiten die Effekte von Insulin auf das Wachstum des Parasiten vermittelt. Aus diesem Grund ist EmIR ein potentieller Kandidat für die Kommunikation zwischen Wirt und Parasiten mittels evolutionär konservierten Signalwegen. Die Signalmechanismen unterhalb von EmIR wurden in abschließenden Experimenten untersucht. Diese offenbarten deutliche Unterschiede in der Weiterleitung von Insulin induzierten Signalen zwischen Echinococcus und dem verwandten parasitären Zestoden Taenia solium. Diese Unterschiede könnten mit dem unterschiedlichen Organtropismus beider Arten in Verbindung stehen. KW - Fuchsbandwurm KW - Insulin KW - Echinokokkus KW - Insulin KW - Helminth KW - EmERK KW - Echinococcus KW - insulin KW - helminth KW - EmERK Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-22636 ER - TY - JOUR A1 - Klement, Rainer A1 - Kämmerer, Ulrike T1 - Is there a role for carbohydrate restriction in the treatment and prevention of cancer? N2 - Over the last years, evidence has accumulated suggesting that by systematically reducing the amount of dietary carbohydrates (CHOs) one could suppress, or at least delay, the emergence of cancer, and that proliferation of already existing tumor cells could be slowed down. This hypothesis is supported by the association between modern chronic diseases like the metabolic syndrome and the risk of developing or dying from cancer. CHOs or glucose, to which more complex carbohydrates are ultimately digested, can have direct and indirect effects on tumor cell proliferation: first, contrary to normal cells, most malignant cells depend on steady glucose availability in the blood for their energy and biomass generating demands and are not able to metabolize significant amounts of fatty acids or ketone bodies due to mitochondrial dysfunction. Second, high insulin and insulin-like growth factor (IGF)-1 levels resulting from chronic ingestion of CHO-rich Western diet meals, can directly promote tumor cell proliferation via the insulin/IGF1 signaling pathway. Third, ketone bodies that are elevated when insulin and blood glucose levels are low, have been found to negatively affect proliferation of different malignant cells in vitro or not to be usable by tumor cells for metabolic demands, and a multitude of mouse models have shown antitumorigenic properties of very low CHO ketogenic diets. In addition, many cancer patients exhibit an altered glucose metabolism characterized by insulin resistance and may profit from an increased protein and fat intake. In this review, we address the possible beneficial effects of low CHO diets on cancer prevention and treatment. Emphasis will be placed on the role of insulin and IGF1 signaling in tumorigenesis as well as altered dietary needs of cancer patients. KW - Medizin KW - Ketogenic diet KW - cancer KW - review KW - low carbohydrate diet KW - cachexia KW - insulin KW - insulin-like growth factor 1 (IGF1) Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69178 ER - TY - THES A1 - Mühlemann, Markus T1 - Intestinal stem cells and the Na\(^+\)-D-Glucose Transporter SGLT1: potential targets regarding future therapeutic strategies for diabetes T1 - Intestinale Stammzellen und der Na\(^+\)-D-Glukose Transporter SGLT1: potentielle Ansatzpunkte neuartiger Therapien für Diabetes Patienten N2 - The pancreas and the small intestine are pivotal organs acting in close synergism to regulate glucose metabolism. After absorption and processing of dietary glucose within the small intestine, insulin and glucagon are released from pancreatic islet cells to maintain blood glucose homeostasis. Malfunctions affecting either individual, organ-specific functions or the sophisticated interplay of both organs can result in massive complications and pathologic conditions. One of the most serious metabolic diseases of our society is diabetes mellitus (DM) that is hallmarked by a disturbance of blood glucose homeostasis. Type 1 (T1DM) and type 2 (T2DM) are the main forms of the disease and both are characterized by chronic hyperglycemia, a condition that evokes severe comorbidities in the long-term. In the past, several standard treatment options allowed a more or less adequate therapy for diabetic patients. Albeit there is much effort to develop new therapeutic interventions to treat diabetic patients in a more efficient way, no cure is available so far. In view of the urgent need for alternative treatment options, a more systemic look on whole organ systems, their biological relation and complex interplay is needed when developing new therapeutic strategies for DM. T1DM is hallmarked by an autoimmune-mediated destruction of the pancreatic β-cell mass resulting in a complete lack of insulin that is in most patients restored by applying a life-long recombinant insulin therapy. Therefore, novel regenerative medicine-based concepts focus on the derivation of bioartificial β-like cells from diverse stem cell sources in vitro that survive and sustain to secrete insulin after implantation in vivo. In this context, the first part of this thesis analyzed multipotent intestinal stem cells (ISCs) as alternative cell source to derive bioartificial, pancreatic β-like cells in vitro. From a translational perspective, intestinal stem cells pose a particularly attractive cell source since intestinal donor tissues could be obtained via minimal invasive endoscopy in an autologous way. Furthermore, intestinal and pancreatic cells both derive from the same developmental origin, the endodermal gut tube, favoring the differentiation process towards functional β-like cells. In this study, pancreas-specific differentiation of ISCs was induced by the ectopic expression of the pancreatic transcription factor 1 alpha (Ptf1a), a pioneer transcriptional regulator of pancreatic fate. Furthermore, pancreatic lineage-specific culture media were applied to support the differentiation process. In general, ISCs grow in vitro in a 3D Matrigel®-based environment. Therefore, a 2D culture platform for ISCs was established to allow delivery and ectopic expression of Ptf1a with high efficiency. Next, several molecular tools were applied and compared with each other to identify the most suitable technology for Ptf1a delivery and expression within ISCs as well as their survival under the new established 2D conditions. Success of differentiation was investigated by monitoring changes in cellular morphology and induction of pancreatic differentiation-specific gene expression profiles. In summary, the data of this project part suggest that Ptf1a harbors the potential to induce pancreatic differentiation of ISCs when applying an adequate differentiation media. However, gene expression analysis indicated rather an acinar lineage-determination than a pancreatic β-cell-like specification. Nevertheless, this study proved ISCs not only as interesting stem cell source for the generation of pancreatic cell types with a potential use in the treatment of T1DM but alsoPtf1a as pioneer factor for pancreatic differentiation of ISCs in general. Compared to T1DM, T2DM patients suffer from hyperglycemia due to insulin resistance. In T2DM management, the maintenance of blood glucose homeostasis has highest priority and can be achieved by drugs affecting the stabilization of blood glucose levels. Recent therapeutic concepts are aiming at the inhibition of the intestinal glucose transporter Na+-D-Glucose cotransporter 1 (SGLT1). Pharmacological inhibition of SGLT1 results in reduced postprandial blood glucose levels combined with a sustained and increased Glucagon-like peptide 1 (GLP-1) secretion. So far, systemic side effects of this medication have not been addressed in detail. Of note, besides intestinal localization, SGLT1 is also expressed in various other tissues including the pancreas. In context of having a closer look also on the interplay of organs when developing new therapeutic approaches for DM, the second part of this thesis addressed the effects on pancreatic islet integrity after loss of SGLT1. The analyses comprised the investigation of pancreatic islet size, cytomorphology and function by the use of a global SGLT1 knockout (SGLT1-/-) mouse model. As SGLT1-/- mice develop the glucose-galactose malabsorption syndrome when fed a standard laboratory chow, these animals derived a glucose-deficient, fat-enriched (GDFE) diet. Wildtype mice on either standard chow (WTSC) or GDFE (WTDC) allowed the discrimination between diet- and knockout-dependent effects. Notably, GDFE fed mice showed decreased expression and function of intestinal SGLT1, while pancreatic SGLT1 mRNA levels were unaffected. Further, the findings revealed increased isled sizes, reduced proliferation- and apoptosis rates as well as an increased α-cell and reduced β-cell proportion accompanied by a disturbed cytomorphology in islets when SGLT1 function is lost or impaired. In addition, pancreatic islets were dysfunctional in terms of insulin- and glucagon-secretion. Moreover, the release of intestinal GLP-1, an incretin hormone that stimulates insulin-secretion in the islet, was abnormal after glucose stimulatory conditions. In summary, these data show that intestinal SGLT1 expression and function is nutrient dependent. The data obtained from the islet studies revealed an additional and new role of SGLT1 for maintaining pancreatic islet integrity in the context of structural, cytomorphological and functional aspects. With special emphasis on SGLT1 inhibition in diabetic patients, the data of this project indicate an urgent need for analyzing systemic side effects in other relevant organs to prove pharmacological SGLT1 inhibition as beneficial and safe. Altogether, the findings of both project parts of this thesis demonstrate that focusing on the molecular and cellular relationship and interplay of the small intestine and the pancreas could be of high importance in context of developing new therapeutic strategies for future applications in DM patients. N2 - Das komplexe Zusammenspiel zwischen Pankreas und Dünndarm ist von großer Bedeutung für den Zucker Stoffwechsel. Während der Dünndarm Glukose aus der Nahrung absorbiert, sezerniert der Pankreas Insulin und Glukagon für die Regulation des Blutzuckerspiegels. Bereits kleinste Fehlfunktionen in einem der beiden Organe können das fein abgestimmte Zusammenspiel aus der Balance bringen und zu schwerwiegenden Begleiterscheinungen führen. Die bekannteste Krankheit bezüglich eines gestörten Blutzuckerhaushaltes ist Diabetes mellitus (DM). Die wichtigsten Formen sind Typ1 und Typ 2 Diabetes, welche beide durch chronische Hyperglykämie gekennzeichnet sind, einem Zustand der langfristig zu schweren Komplikationen führt. Derzeit ist keine Heilung möglich, jedoch vermindert eine Vielzahl von Medikamenten und Therapien die auftretenden Symptome, was die Lebensqualität der Patienten erheblich verbessert. Für die Entwicklung von neuen Medikamenten und Therapien für DM Patienten, muss der Fokus vermehrt auf die Gesamtheit der Organ-Organ Interaktionen, sowie den entwicklungsbiologischen Ursprung der einzelnen Organe gerichtet werden. Bei Typ 1 Diabetes werden die insulinsekretierende β-Zellen vom Immunsystem zerstört, was zu einem Mangel an Insulin führt. Deshalb ist eine regelmäßige Insulingabe unabdingbar, um eine Hyperglykämie vorzubeugen. Ein vielversprechender Ansatz um fehlendes Insulin zu kompensieren besteht darin aus Stammzellen bioartifizielle, insulinsekretierende Zellen zu generieren. In diesem Zusammenhang ist der biologische Ursprung der zu differenzierenden Zellen von großer Bedeutung. In dieser Arbeit werden daher intestinale Stammzellen (ISZ) als mögliche alternative Zellquelle beschrieben, um insulinsekretierende Zellen zu generieren. Aus medizinischer Sicht eigenen sich ISZ besonders gut für regenerative Therapien, da sie patientenspezifisch durch eine minimal-invasive Endoskopie entnommen werden können. Des Weiteren haben die beiden Organe einen gemeinsamen embryologischen Ursprung, die endodermalen Darmröhre, was die pankreatische Differenzierung begünstigen könnte. Mithilfe der ektopischen Expression des pankreatischen Masterregulators pankreatischer Transkriptionsfaktors 1 alpha (Ptf1a), sollen ISZ in insulinsekretierende β-Zell-ähnliche Zelltypen differenziert werden. Zudem soll ein pankreas-spezifisches Differenzierungsmedium die Effizienz der Differenzierung erhöhen. Da ISZ normalerweise in einer 3D Umgebung kultiviert werden, wurde für diese Arbeit eine 2D Zellkultur etabliert, um eine hocheffiziente genetische Manipulation zur ektopischen Expression von Ptf1a zu garantieren. Im nächsten Schritt wurde die bestmögliche Methode evaluiert um Ptf1a in ISZ zu integrieren, welche gleichzeitig aber das Wachstum und Überleben der Zellen nicht beeinträchtigt. Der Erfolg der angewandten Methode wurde basierend auf der Zellmorphologie, sowie der Transkription von pankreasspezifischen Genen überprüft. Die Ergebnisse dieser Studie haben gezeigt, dass die Ptf1a-induzierte Differenzierung in Verbindung mit der Applikation eines spezifischen Differenzierungsmediums das Genexpressionsprofil von Azinär Zellen induziert und nicht wie erwartet, das von endokrinen β-Zellen. Dies bedeutet, dass Ptf1a die Kapazität aufweist, ISZ in pankreatische Zellen zu konvertieren, jedoch bei der Entwicklung in Richtung insulinsekretierende β-Zellen keine Rolle spielt. Letztendlich zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass ISZ eine interessante Alternative zu pluripotenten Stammzellen darstellen. Im Gegensatz zu Typ 1 leiden Typ 2 Diabetes Patienten an Hyperglykämie infolge von Insulinresistenz, welche oft mit blutzuckerregulierenden Medikamenten behandelt werden können. Eine gute Therapiemöglichkeit ist die Inhibition des intestinalen Glukosetransporters SGLT1, was zu einer drastisch reduzierten postprandialen Glukoseaufnahme führt und gleichzeitig die intestinale Sekretion des Inkretins Glukose-like Peptide 1 (GLP-1) erhöht. Beides wirkt sich positiv auf die Blutzuckerregulation unter diabetischen Verhältnissen aus. Obwohl SGLT1 primär im Dünndarm exprimiert ist, wurde dessen Expression auch in anderen Organen, wie dem Gehirn, dem Herz, der Lunge und in pankreatischen α-Zellen nachgewiesen. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde daher der Einfluss des Funktionsverlustes von SGLT1 auf die Integrität pankreatischer Inselzellcluster analysiert. Im diesem Rahmen wurde die Morphologie der pankreatischen Inseln, deren Architektur und Funktion mithilfe eines etablierten murinen SGLT1 Knockout (SGLT1-/-) Modelles untersucht. Da SGLT1-/- Mäuse unter einer Standard Labordiät (SD) ein schweres Glukose-Galaktose Malabsorptions Syndrom entwickeln, erhalten die Tiere eine glukose-freie, fett-angereicherte Diät (GDFE). Um diät- und knockoutspezifische Effekte unterscheiden zu können, wurden als Kontrollen SD- und GDFE-gefütterte Wildtyp Tiere mit den SGLT1-/- Mäusen verglichen. Wildtyptiere unter GDFE Diät zeigten eine verminderte Expression und Funktionalität des intestinalen SGLT1 Transporters, während im Pankreas die SGLT1 mRNA Expression nicht von der Diät beeinflusst wurde. Die Ergebnisse dieser Arbeit haben gezeigt, dass in SGLT1-/- Pankreata, die Inseln größer sind, aber auch die Proliferations- und Apoptoserate in den Inselzellen reduziert ist. Zudem befinden sich in SGLT1-/- Inseln mehr α-Zellen und weniger β-Zellen. Des Weiteren ist die typische Anordnung der endokrinen Zellen gestört. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass SGLT1 in pankreatischen Inseln eine wichtige Rolle für die strukturelle Organisation der verschiedenen Zelltypen innerhalb der Inseln spielt. Ergänzend wurde gezeigt, dass isolierte SGLT1-/- Inseln in der Gegenwart von Glukose unfähig sind Insulin oder Glukagon zu sezernieren. Weitere Untersuchungen im Tier haben ergeben, dass auch das insulinsekretionsfördernde Hormon GLP-1 in atypischer Art und Weise sekretiert wird. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die intestinale SGLT1 Expression und Funktion durch Nährstoffe beeinflusst werden kann. Des Weiteren wurde erstmals eine neue Funktion für SGLT1 bezüglich der strukturellen und zellulären Organisation pankreatischer Inselzellcluster beschrieben. Daten zu neuen klinischen SGLT1 Inhibitoren beschreiben lediglich eine intestinale SGLT1 Blockierung, während die Wirkung in weitern Organen nicht berücksichtigt wurde. Die Daten dieser Arbeit liefern klare Indizien dafür, dass starke Nebenwirkungen und Effekte auch in anderen SGLT1-exprimierenden Geweben und Organen auftreten könnten, wenn die SGLT1 Funktion verloren geht. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Regulation des Blutzuckerspiegels auf einem komplexen Zusammenspiel zwischen Dünndarm und Pankreas basiert. Daher sollten bei zukünftigen SGLT1 Inhibitions-Studien im Menschen die Interaktionen zwischen den beiden Organen unbedingt berücksichtigt werden, um die Wirksamkeit und die Sicherheit solcher Medikamente für Diabetes Patienten besser darzulegen. KW - Stammzelle KW - Diabetes mellitus KW - Sglt1 KW - GLP-1 KW - blood glucose regulation KW - Intestinal stem cell KW - Lgr5 KW - islets of Langerhans KW - pancreas KW - glucose KW - insulin Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-169266 ER - TY - THES A1 - Lazariotou, Maria T1 - Gentechnologische Reduktion der Expression des Autoantigens Glutamatdecarboxylase (GAD) in insulinproduzierenden Zellen des endokrinen Pankreas T1 - Suppression of the immunogenic potential of pancreatic beta-cells by genetic reduction of autoantigenic glutamic acid decarboxylase (GAD) expression N2 - Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte geprüft werden ob durch Reduktion der Glutamatdecarboxylase (GAD) Expression eine Reduktion des autoimmunogenen Potenzials in insulinproduzierenden Beta-Zellen des endokrinen Pankreas erreicht werden kann. Aus der Literatur ist bekannt, dass GAD als Autoantigen eine zentrale Stellung bei der Induktion der T-Zell vermittelten Insulitis einnimmt. Der Prozess, welcher zur Beta-Zell-Apoptose des Typ 1 Diabetes führt, ist ein bislang wenig verstandener komplexer Vorgang. Ein besseres Verständnis dieses Prozesses könnte zur Prävention der Beta-Zell-Zerstörung in der frühen Phase des Typ 1 Diabetes beitragen. In den für die Untersuchungen verwendeten INS-1 Zellen werden die beiden Isoformen der GAD exprimiert. Durch einen antisense Ansatz sollte in INS-1 Zellen die GAD Expression beider Isoformen supprimiert werden. In dieser Arbeit wurden zwei Methoden zur gezielten Suppression der Expression des Autoantigens GAD65 etabliert. Es konnte ein antisense Klon identifiziert werden, bei dem die endogene GAD65 mRNA fast nicht mehr detektierbar war. Auf Protein Ebene, im Westernblot konnte dieses Ergebnis jedoch nicht bestätigt werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Funktion der INS-1 Zellen mit supprimierter GAD65 Expression charakterisiert. Dieser Punkt beinhaltet die Analyse der Expression von Genen, welche die Beta-Zell-Funktion definieren, die Glukose-abhängige Insulinsekretion sowie die Regulation der Zytokin-induzierten Apoptose. Dabei zeigte sich aus Daten der RT-PCR, dass die mRNAs von anderen Beta-Zell-spezifischen Genen wie GLUT2, Glukokinase, Proinsulin, IDX1 und Nkx6.1 in unveränderter Menge nachweisbar sind. Also bleibt die Funktion der INS-1 Beta-Zellen erhalten, da selbst durch forcierte Reduktion der Expression des Autoantigens GAD65 die Glukose-induzierte Insulinsekretionskapazität im Wesentlichen nicht beeinträchtigt wird. In vitro Untersuchungen zeigten eine unveränderte Sensitivität der Zytokin-induzierten Apoptose nach GAD65 Suppression in INS-1 Zellen. Die zuvor genannten Resultate und die Tatsache, dass die GAD wohl eines der wichtigsten Autoantigene im Rahmen der Immunpathogenese des Typ 1 Diabetes ist, stellen die Grundlage für die Generierung GAD-supprimierter transplantierbarer Beta-Zellen mit guter Transplantatfunktion dar. Im Hinblick auf eine mögliche therapeutische Anwendung bei der Behandlung dieser humanen Autoimmunerkrankung demonstrieren die vorliegenden Daten, dass im Rahmen einer Inselzelltransplantation die Verwendung von GAD-supprimierten Beta-Zellen bei der Transplantation in das endokrine Pankreas des Menschen zu einer Verminderung von Autoimmunreaktionen führen könnte. N2 - In the present study we investigated genetic engineering approaches for the suppression of autoantigenic GAD expression in insulin producing pancreatic beta-cells. The enzyme glutamic acid decarboxylase (GAD) represents a major autoantigen in the early immunopathogenesis of T-cell-mediated destruction of pancreatic beta-cells in type 1 diabetes mellitus. The mechanisms which trigger the apoptotic destruction of insulin producing pancreatic beta-cells leading to autoimmune diabetes are incompletely understood. The exact mechanisms remain to be clarified. The enzyme glutamic acid decarboxylase (GAD), is expressed in INS-1 pancreatic beta-cells in two distinct isoforms GAD65 and GAD67. Thus, strategies to suppress GAD expression in INS-1 cell lines were tested. Two methods for suppression of autoantigenic GAD65 expression were established. One clone overexpression of GAD65 antisense mRNA yielded an almost complete suppression of endogenous GAD65 mRNA expression. In the second part of this thesis the characterization of INS-1 cells with suppressed autoantigenic GAD65 mRNA expression including beta-cell specific gene expression, glucose-dependent insulin secretion, and cytokine induced-apoptosis was tested. Expression of glucose transporter type 2, glucokinase, preproinsulin, islet/duodenum homeo box 1 transcription factor (IDX), and NK homeodomain transcription factor (Nkx6.1) were characterized by reverse transcription polymerase chain reaction. No differences in the amount of these beta-cell specific genes could be detected between GAD65 suppressed INS-1 cell clones and controls. Moreover, reduced GAD65 expression does not affect insulin secretory capacity in INS-1 cells. Suppression of GAD65 expression in INS-1 cells does not alter sensitivity to cytokine-induced apoptosis. The data presented here suggest that suppression of GAD expression may thus provide a therapeutical approach to prevent recurrence of autoimmune beta-cell destruction in transplanted pancreatic beta-cells in type 1 diabetic patients. KW - Glutamat-Decarboxylase KW - Diabetes mellitus KW - Transplantation KW - Insulin KW - B-Zelle KW - glutamic acid decarboxylase KW - type 1 diabetes mellitus KW - transplantation KW - insulin KW - pancreatic beta-cells Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-30878 ER -