TY - THES A1 - Brandes, Nicolas T1 - Oxidative Thiol Modifications in Pro- and Eukaryotic Organisms T1 - Oxidative Thiol Modifikationen in Pro- und Eukaryotischen Organismen N2 - Cystein spielt eine wichtige Rolle in der Biochemie vieler Proteine. Aufgrund der Redox-Eigenschaften und der hohen Reaktivität der freien Thiol-Gruppe sowie dessen Fähigkeit Metallionen zu koordinieren, ist Cystein oft Bestandteil von katalytischen Zentren vieler Enzyme. Zudem lassen sich Cysteine durch reaktive Sauerstoff- und Stickstoffspezies leicht reversibel oxidativ modifizieren. In den letzten Jahren wurde gezeigt, dass Proteine redox-bedingte Thiol-Modifikationen nutzen, um Veränderungen ihrer Aktivität zu steuern. Diese redox-regulierten Proteine spielen eine zentrale Rolle in vielen physiologischen Prozessen. Das erste Ziel meiner Arbeit war die Identifizierung von Stickstoffmonoxid (NO)-sensitiven Proteinen in E. coli. Die redox-bedingten Funktionsänderungen solcher Proteine erklären möglicherweise die veränderte Physiologie von E. coli Zellen, die unter NO-Stress leiden. Um E. coli Proteine zu identifizieren, die unter Einwirkung von NO-Stress reversibel Thiol-modifiziert werden, wandte ich eine Kombination aus differentiellem Thiol-Trapping und 2D Gel-Elektrophorese an. Es wurden zehn Proteinen identifiziert, welche NO-sensitive Thiol-Gruppen enthalten. Genetische Studien ergaben, dass Modifikationen an AceF & IlvC mitverantwortlich sind für die NO-induzierte Wachstumshemmung. Bemerkenswert ist es, dass die Mehrheit der identifizierten Proteine speziell nur gegen reaktive Stickstoffspezies empfindlich ist, welches an einem der identifizierten Stickstoffmonoxid-sensitiven Proteinen, der kleinen Untereinheit von Glutamate synthase, getestet wurde. In vivo und in vitro Aktivitätsstudien zeigten, dass es zu einer schnellen Inaktivierung von Glutamate synthase nach NO-Behandlung kommt, das Protein aber resistent gegenüber anderen Oxidationsmittel ist. Diese Resultate implizieren, dass reaktive Sauerstoff- und Stickstoffspezies unterschiedliche physiologische Vorgänge in Bakterien beeinflussen. Das zweite Ziel meiner Arbeit war es, redox-sensitive Proteine in S. cerevisiae zu identifizieren und deren Redox-Zustand als in vivo Read-Out zu verwenden, um die Rolle von oxidativen Stress während des Alterungsprozess eukaryotischer Zellen zu analysieren. Zunächst bestimmte ich in Hefezellen mit Hilfe von OxICAT, einer hochsensiblen quantitativen Methode, die Thiol-Trapping mit Massenspektrometrie verbindet, den exakten in vivo Thiol-Status von fast 300 Proteinen. Diese Proteine lassen sich in vier Gruppen einteilen: 1) Proteine, deren Cysteinreste resistent gegen Oxidation sind; 2) Proteine, in denen Cysteinmodifikationen strukturelle Aufgaben übernehmen; 3) Proteine mit oxidationsempfindlichen Cysteinen, die bereits eine gewisse Oxidation in exponentiell wachsenden Hefezellen aufweisen; 4) Proteine, die reduziert sind, aber redox-sensitive Cysteinreste enthalten, die die Funktion der Proteine bei Vorhandensein von oxidativen Stress beeinflussen. Die Sensitivität dieser Proteine gegenüber oxidativen Stress wurde durch Exposition subletaler Konzentrationen von H2O2 oder Superoxid auf Hefezellen nachgewiesen. Es wurde gezeigt, dass die wichtigsten zellulären Angriffspunkte von H2O2- und Superoxid-bedingtem Stress Proteine sind, die an Vorgängen der Translation, Glykolyse, des Citratzyklus und der Aminosäure-Biosynthese beteiligt sind. Diese Zielproteine zeigen, dass Zellen für die Bekämpfung von oxidativen Stress Metabolite schnell in Richtung des Pentosephosphatweges umleiten, um die Produktion des Reduktionsmittels NADPH sicherzustellen. Die hier präsentierten Ergebnisse belegen, dass die quantitative Bestimmung des Oxidationsstatus von Proteinen eine wertvolle Methode ist, um redox-sensitive Cysteinreste zu identifizieren. Die OxICAT Technologie wurde dann verwendet, um das genaue Ausmaß und die Entstehung von oxidativen Stress in chronologisch alternden S. cerevisiae Zellen zu bestimmen. Für diese Bestimmung wurde der Oxidationsstatus von Proteinen in alternden Hefezellen als physiologischer Read-Out verwendet. Ich zeigte, dass die zelluläre Redox-Homöostase in chronologisch alternden Hefezellen global zusammenbricht, wobei es sich dabei um einen Prozess handelt, der dem Zelltod vorausgeht. Der Beginn dieses Zusammenbruchs scheint mit der Lebensdauer der Hefezellen zu korrelieren, da Kalorienrestriktion die Lebensdauer der Hefezellen erhöht und den Zusammenbruch des Redox-Gleichgewichts verzögert. Die Oxidation einer kleinen Anzahl an Proteinen (z.B. Thioredoxin reductase) geht dem Redox-Zusammenbruch deutlich voraus, was maßgeblich zum Verlust der Redox-Homöostase beitragen könnte. Diese Studien an alternden Hefezellen erweitern unser Verständnis, wie sich Veränderungen in der Redox-Homöostase auf die Lebensdauer von Hefezellen auswirken. Zudem bestätigen die hier präsentierten Ergebnisse die Bedeutung von oxidativen Thiol-Modifikationen als eine der wichtigsten posttranslationalen Proteinmodifikationen in pro-und eukaryotischen Organismen N2 - Cysteines play important roles in the biochemistry of many proteins. The high reactivity, redox properties, and ability of the free thiol group to coordinate metal ions designate cysteines as the amino acids of choice to form key catalytic components of many enzymes. Also, cysteines readily react with reactive oxygen and nitrogen species to form reversible oxidative thiol modifications. Over the last few years, an increasing number of proteins have been identified that use redox-mediated thiol modifications to modulate their function, activity, or localization. These redox-regulated proteins are central players in numerous important cellular processes. First aim of this study was to discover nitric oxide (NO) sensitive proteins in E. coli, whose redox-mediated functional changes might explain the physiological alterations observed in E. coli cells suffering from NO-stress. To identify E. coli proteins that undergo reversible thiol modifications upon NO-treatment in vivo, I applied a differential thiol trapping technique combined with two-dimensional gel analysis. 10 proteins were found to contain thiol groups sensitive to NO-treatment. Subsequent genetic studies revealed that the oxidative modifications of AceF & IlvC are, in part, responsible for the observed NO-induced growth inhibition. Noteworthy, the majority of identified protein targets turned out to be specifically sensitive towards reactive nitrogen species. This oxidant specificity was tested on one NO-sensitive protein, the small subunit of glutamate synthase. In vivo and in vitro activity studies demonstrated that glutamate synthase rapidly inactivates upon nitric oxide treatment but is resistant towards other oxidative stressors. These results imply that reactive oxygen and nitrogen species affect distinct physiological processes in bacteria. The second aim of my study was to identify redox-sensitive proteins in S. cerevisiae and to use their redox state as in vivo read-out to assess the role of oxidative stress during the eukaryotic aging process. I first determined the precise in vivo thiol status of almost 300 yeast proteins located in the cytosol and sub-cellular compartments of yeast cells using a highly quantitative mass spectrometry based thiol trapping technique, called OxICAT. The identified proteins can be clustered in four groups: 1) proteins, whose cysteine residues are oxidation resistant; 2) proteins with structurally or functionally important cysteine modifications 3) proteins with highly oxidation-sensitive active site cysteines, which are partially oxidized in exponentially growing yeast cells due to their exquisite sensitivity towards low amounts of ROS; 4) proteins that are reduced in exponentially growing cells but harbor redox-sensitive cysteine(s) that affect the catalytic function of the protein during oxidative stress. These oxidative stress sensitive proteins were identified by exposure of yeast cells to sublethal concentrations of H2O2 or superoxide. It was shown that the major targets of peroxide- and superoxide-mediated stress in the cell are proteins involved in translation, glycolysis, TCA cycle and amino acid biosynthesis. These targets indicate that cells rapidly redirect the metabolic flux and energy towards the pentose phosphate pathway in an attempt to ensure the production of the reducing equivalent NADPH to counterattack oxidative stress. These results reveal that the quantitative assessment of a protein’s oxidation state is a valuable tool to identify catalytically active and redox-sensitive cysteine residues. The OxICAT technology was then used to precisely determine extent and onset of oxidative stress in chronologically aging S. cerevisiae cells by utilizing the redox status of proteins as physiological read-out. I found that chronological aging yeast cells undergo a global collapse of the cellular redox homeostasis, which precedes cell death. The onset of this collapse appears to correlate with the yeast life span, as caloric restriction increases the life span and delays the redox collapse. These results suggest that maintenance of the redox balance might contribute to the life expanding benefits of regulating the caloric intake of yeast. Clustering analysis of all oxidatively modified proteins in chronological aging yeast revealed a subset of proteins whose oxidative thiol modifications significantly precede the general redox collapse. Oxidation of these early target proteins, which most likely results in a loss of their activity, might contribute to or even cause the observed loss of redox homeostasis (i.e., thioredoxin reductase) in chronologically aging yeast. These studies in aging yeast expand our understanding how changes in redox homeostasis affect the life span of yeast cells and confirm the importance of oxidative thiol modifications as key posttranslational modifications in pro- and eukaryotic organisms. KW - Oxidativer Stress KW - Cystein KW - Saccharomyces cerevisiae KW - Escherichia coli KW - Wasserstoffperoxid KW - Hyperoxide KW - Sauerstoffradikal KW - Thiolgruppe KW - Altern KW - Oxidation KW - Biologische Oxidation KW - Oxidative Thiol Modifikationen KW - Reaktive Sauerstoffspezies KW - Chronologisches Altern KW - Reversibel KW - Posttranslational KW - oxidative thiol modification KW - chronological aging KW - reactive oxygen species KW - Saccharomyces cerevisiae KW - thioredoxin reductase Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46542 ER - TY - THES A1 - Seltmann, Martin Alexander T1 - Bildung und Funktion von Jasmonaten während Seneszenz-Prozessen in Arabidopsis thaliana T1 - Formation an Function of Jasmonates during Senescence-Processes in Arabidopsis thaliana N2 - Jasmonsäure und verwandte Oxylipine wurden bisher als Substanzen, die an der Regulation von Initialisierung und Progression der Blattseneszenz beteiligt sein sollen, kontrovers diskutiert. Bisherige Studien haben sich dabei auf die exogene Applikation von Jasmonaten oder die Messung endogener Spiegel beschränkt. Um die Funktion von Jasmonaten in der Seneszenz-Regulation zu klären, wurden in dieser Arbeit die Profile freier und membranveresterter Oxylipine sowie die Auswirkungen verminderter Oxylipinbildung während der natürlichen Seneszenz und Seneszenz-ähnlicher Prozesse induziert durch Dunkel- und Sorbitol-Inkubation in Blättern von Arabidopsis thaliana untersucht. Jasmonsäure sowie freie 12-Oxo-Phytodiensäure steigen während dieser drei Prozesse an, mit dem stärksten Anstieg von Jasmonsäure nach Dunkelinkubation. Eine deutliche Akkumulation membranveresterter Oxylipine (Arabidopside) konnte lediglich nach Flottierung auf Sorbitol festgestellt werden. Die Mengen an plastidären Mono- und Digalaktosyl-Diacylglycerolen verringerten sich jedoch während der Behandlungen bzw. im Verlauf der Alterung. Zur Untersuchung möglicher Funktionen ansteigender Jasmonat-Konzentrationen wurden Lipoxygenase 2 RNAi-Pflanzen konstruiert, welche basal Jasmonsäure und 12-Oxo-Phytodiensäure produzieren können, jedoch keinen Anstieg während Seneszenz- bzw. Stress-Prozessen zeigen. Die Gehalte an Chlorophyll und Membranlipiden sowie die Genexpression entwicklungsspezifischer Seneszenzmarker waren während der natürlichen und der dunkelinduzierten Seneszenz in diesen Pflanzen nicht verändert. Dies legt nahe, dass diese Oxylipine im Verhältnis zu anderen endogenen Faktoren keine bzw. nur geringe Wirkungen auf die Seneszenz-Progression haben. Aus den gemachten Beobachtungen kann vielmehr geschlossen werden, dass bei diesen Prozessen die Akkumulation von Jasmonaten eher die Folge eines veränderten Lipid-Metabolismus als ein Auslöser der Seneszenz ist. Im Gegensatz dazu zeigen die Lipoxygenase 2 RNAi-Linien eine verlangsamte Seneszenz nach Sorbitol-Behandlung. Ähnlich verhält sich die Allenoxid-Synthase Mutante dde2-2, die zwar 13-Lipoxygenase-Produkte aber keine Jasmonate bilden kann. Dies bedeutet, dass die Jasmonate und nicht andere 13-Lipoxygenase-Produkte für die Seneszenz-ähnlichen Symptome unter diesen Bedingungen verantwortlich sind. Dabei stellt die Sorbitol-induzierte Seneszenz einen Stress-Prozess dar, der sich in vielen Punkten von der natürlichen Seneszenz unterscheidet aber große Ähnlichkeiten zur Seneszenz-Induktion nach exogener Jasmonat-Applikation aufweist. Lipoxygenase 2 ist also durch die Bereitstellung von Oxylipinen weniger in Entwicklungs- als vielmehr in Stress-Prozesse involviert. N2 - Jasmonic acid and related oxylipins have been controversely discussed to be involved in regulating the initiation and progression of leaf senescence. Present studies mostly focus on exogenous application of jasmonates or measurements of endogenous levels. To this end we analysed profiles of free and esterified oxylipins during natural senescence and upon induction of senescence-like phenotypes by dark treatment and flotation on sorbitol in Arabidopsis thaliana. Jasmonic acid and free 12-oxo-phytodienoic acid increased during all three processes with the strongest increase of jasmonic acid after dark treatment. Arabidopside content did only increase considerably in response to sorbitol treatment. Mono- and digalactosyldiacylglycerols decreased during these treatments and aging. Lipoxygenase 2 RNAi plants were generated which produce basal levels of jasmonic acid and 12-oxo-phytodienoic acid but do not exhibit accumulation during natural senescence or upon stress treatment. Chlorophyll loss, degradation of membrane lipids as well as expression of senescence markergenes during aging and upon dark incubation was not altered suggesting that these oxylipins are less or not involved in regulating these processes in comparison to other endogenous factors. From these observations it could be further concluded, that jasmonate accumulation in those processes is rather a result of altered lipid metabolism than a promoter of senescence. In contrast, lipoxygenase 2 RNAi lines and the allene oxid synthase deficient mutant dde2-2 were less sensitive to sorbitol treatment than the wild type. This indicates that jasmonates but not other 13-lipoxygenase products are responsible for senescence-like symptoms. Furthermore sorbitol-induced senescence represents a stress-related process, which is similar to senescence processes induced by exogenous jasmonate application but rather than to natural developmental processes. To this end lipoxygenase 2 is rather involved in stress-related processes by providing oxylipins than in developmental functions. KW - Ackerschmalwand KW - Jasmonate KW - Altern KW - Schmalwand KW - Lipide KW - Lipidstoffwechsel KW - Oxylipine KW - Lipoxyg KW - Senescence KW - Jasmonates KW - Lipids KW - Oxylipins KW - Lipoxygenase Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51563 ER -