TY  - THES
A1  - Oehme, Anett
T1  - Studien zur Zusammensetzung der Inhaltsstoffe getrockneter Heidelbeeren und Formulierungen zum Colon-Targeting von Anthocyanen
T1  - Studies on the composition of ingredients of dried bilberries and formulations for the colon-targeting of anthocyanins
N2  - Die Ergebnisse verschiedener in vitro Untersuchungen und Tierstudien deuten darauf hin, dass Anthocyane zur Prävention und Therapie von intestinalen Erkrankungen wie akutem Durchfall oder chronisch entzündlichen Darm¬erkrankungen (CED) sowie Darmkrebs geeignete Naturstoffe sind. Mit bis zu 780 mg/100 g Frischgewicht weisen Heidelbeeren (Vaccinium myrtillus L.) besonders hohe Anthocyan¬¬gehalte auf. In getrockneter Form sind diese Beeren ein bewährtes Therapeutikum in der Volksheilkunde und werden als pharmazeutische Droge Myrtilli fructus zur Unterstützung der Therapie unspezifischer akuter Durchfall¬erkrankungen eingesetzt. Diese traditionellen Anwendungen hat man jüngst in einer Studie am Modell der experimentellen murinen DSS-Colitis aufgegriffen, in welcher ein therapeutischer Effekt von getrockneten Heidelbeeren (gHB) nachwiesen wurde. Ob die Anthocyane oder andere Inhaltsstoffe verantwortlich für die beobachteten Wirkungen sind, ist noch unbekannt. Ein erstes Ziel der vorliegenden Arbeit war es deshalb, gHB zu charakterisieren, indem potentielle Wirkkomponenten anhand analytischer Inhalts-stoffbestimmung identifiziert und bei der Trocknung ablaufende Prozesse untersucht wurden: I. Nach extraktiver Probenaufarbeitung wurden Anthocyanprofil und -gehalt von gHB-Handelsware mittels HPLC-ESI-MS/MS und HPLC-UV/Vis bestimmt. Dabei zeigte sich, dass sich das Anthocyanprofil der untersuchten gHB, die in oben genanntem DSS-Colitis-Modell verwendet worden waren, von dem frischer Wildheidelbeeren (V. myrtillus L.) unterschied. Die gHB wiesen zusätzlich eine Delphinidin-hexose-pentose sowie verschiedene Anthocyanpentosen auf, wie sie für die Heidelbeerart V. arctostaphylos L. charakteristisch sind. Infolgedessen ist davon auszugehen, dass V. arcto-staphylos L.-Beeren zur Herstellung der gHB verwendet wurden. In den untersuchten gHB wurde ein Anthocyangehalt von 384 ± 39 mg/100g TM bestimmt. Im Vergleich zu frischen V. myrtillus L.- sowie zu V. acto¬staphylos L.-Früchten wiesen die gHB damit einen deutlich geringeren Anthocyan-gehalt auf. II. Als momomere Nicht-Anthocyan-Polyphenole wurden verschiedene phenolische Säuren, Quercetinglycoside sowie das Aglycon Quercetin mittels HPLC-ESI-MS/MS bzw. HPLC-DAD identifiziert und quantifiziert. Chlorogensäure stellte dabei mit 147 ± 5 mg/100 g TM die Haupt¬kompo¬nen-te dar. Der Gesamtgehalt an monomeren Nicht-Anthocyan-Poly¬phenolen von 288 ± 8 mg/100 g TM war mit dem der Anthocyane vergleich¬bar. III. Kondensierte Gerbstoffe (Procyanidine) in gHB wurden mittels Thiolyse erfasst. Mit 2,23 ± 0,05 g/100 g TM war ihr Anteil dreimal höher als die Summe der monomeren Polyphenole, Anthocyane, phenolische Säuren und Flavonole. IV. Mit 44 ± 2 g/100 g TM waren Ballaststoffe die dominierende Nährstoff¬gruppe in gHB. Zur Untersuchung der Zusammensetzung dieser Fraktion wurden nach Hydrolyse Neutralzucker als Alditolacetate mittels HRGC-MS bzw. HRGC-FID analysiert sowie Uronsäuren photo¬metrisch bestimmt. Derart identifizierte Hauptbausteine der Zellwandpolysaccharide waren Glucose, Xylose sowie Uronsäure. Als Rückstand nach Hydrolyse wurde gravi¬-metrisch das sog. Klason-Lignin erfasst. Zellwandpoly¬saccharide und Klason-Lignin waren mit jeweils ca. 36 % in der Ballaststofffraktion enthalten und stellten deren Haupt¬komponenten dar. V. Als Indikator für die thermische Belastung bei Trocknung der gHB wurde 5 Hydroxymethylfurfural mit HPLC-MS/MS und HPLC-DAD nachgewiesen und quantifiziert. Der ermittelte Gehalt von 7,9 ± 0,2 mg/100 g TM lag in einem für getrocknete Früchte üblichen Bereich. VI. Um den Einfluss der Trocknung auf den Polyphenolgehalt direkt zu verfolgen, wurden frische Kulturheidelbeeren (V. corymbosum L.) bei 30°C, 50°C und 70°C im Umlufttrocken¬schrank bis zur Gewichtskonstanz ge-trocknet. Vor und nach Trocknung wurden Polyphenole mittels HPLC-MS/MS und HPLC-DAD bzw. HPLC-UV/Vis untersucht. Trocknung bei 30°C führte zu einer leichten Zunahme im Anthocyangehalt, wohingegen der Temperaturanstieg auf 50°C sowie 70°C mit einem deutlichen Anthocyan-abbau verbunden war. Phenolische Säuren und Flavonole erwiesen sich als thermostabiler; ein geringer Abbau wurde nur bei Chlorogensäure beobachtet. VII. Die Stabilität der Anthocyanine Cyanidin-3-galactosid und Cyanidin-3-glucosid wurde in einem in vitro Modell untersucht, das die Bedingungen in der Pflanzenzelle während der Trocknung von Früchten simulierte. Der dabei beobachtete Anthocyanabbau wies eine Reaktionskinetik 1. Ordnung auf. Die Reaktionsgeschwindigkeit war stark von der Temperatur abhängig, der Zuckerrest hatte dagegen keinen Einfluss. Als Abbauprodukt wurde Protocatechusäure mittels HPLC-DAD-MS/MS identifiziert. Neben der Menge der mit der Nahrung aufgenommener Anthocyane ist deren Verfügbarkeit am Wirkort die Grundlage für potentielle Effekte. Während der Passage durch den Gastrointestinaltrakt (GIT) unterliegen Anthocyane bekanntlich einem chemischen und mikrobiellen Abbau, wodurch die effektive Wirkkonzentration stark vermindert wird. Colon-Targeting, bei dem Wirkstoffe durch Verkapselung vor einem chemischen und enzymatischen Abbau im oberen GIT geschützt werden, stellt eine Möglichkeit dar, die Verfügbarkeit von Anthocyanen für direkte Effekte im Dickdarm zu erhöhen. Die Zielsetzung im zweiten Teil der Arbeit beinhaltete daher die Herstellung und Charakterisierung von im Lebens¬mittelbereich zugelassenen Formulierungen für das Colon-Targeting von Anthocyanen. Für diese Studien dienten kommerziell aus Wildheidelbeeren V. myrtillus L. gewonnene Extrakte (Anthocyangehalte von 65 bis 84 g/100g) als Anthocyanquelle. I. Zur Charakterisierung der Freisetzungseigenschaften der hergestellten Colon-Targeting-Formulierungen wurde ein in vitro und ex vivo Modell entwickelt und angewendet, das durch aufeinanderfolgende Inkubation der Materialien in Magen¬saft¬simulanz (3 h bei pH 2) und Ileostomie- (4 h bei pH 6,3) sowie Colo-stomieflüssigkeit (15 h bei pH 6,2) die Passage des humanen GIT simulierte. Freigesetzte Anthocyangehalte wurden mittels HPLC-DAD erfasst. II. Im Labormaßstab wurde der Heidelbeerextrakt mittels Eintropf¬technik nach dem Prinzip der ionotropen Gelierung mit Calciumionen in eine Matrix aus amidiertem Pektin verkapselt. Durch anschließendes hydrophobes Coating mit Schellack wurde die vorzeitige Freisetzung der Pigmente aus den Anthocyan-Pektin-Kugeln (APK) P4BRT im Magensaft¬simulanz deutlich ver¬ringert, sodass mit Schellack gecoateten APK P4BSch im genannten Modell-System ein Anthocyantransport in den Dickdarm erreicht wurde. III. Aufgrund seiner Säureunlöslichkeit wurde auch die Eignung von Kollagen aus dem Meeresschwamm Chondrosia reniformis Nardo als Verkapselungsmatrix unter¬sucht. Es gelang, Heidelbeerextrakt in dieses Material zu verkapseln. Trotz partieller Magensaftresistenz waren die Formulierungen jedoch aufgrund von Degradation im simulierten Dünndarm nicht zum Colon-Targeting geeignet. IV. Zur Bereitstellung von mit Schellack gecoateten APK für in vivo Studien war eine Steigerung der Produktionsrate vom Gramm- in den Kilogramm-Maßstab erforderlich, was durch Einsatz der „Laminar Jet Break-up“-Technologie realisiert wurde. APK P4BG wurden mit dieser Methode ebenfalls durch iono-trope Gelierung einer anthocyanhaltigen Pektinlösung in Gegenwart von Calcium¬¬¬¬ionen hergestellt. Im Unterschied zum Labormaßstab war der Einsatz von Glycerin als Weichmacher in der Formulierung erforderlich. Das anschlie-ßende Coating der so hergestellten APK P4BG erfolgte mittels Wurster-Technologie unter Verwendung von wässriger Schellack¬lösung. Materialien mit Coatinglevel von 8, 15 bzw. 19 % w/w (P4BGwSch8, P4BwSch15 und P4BwSch19) wurden erzeugt. Die Formulierungen wiesen Anthocyangehalte von 2,2 bis 2,6 g/100g auf. Im vorgestellten in vitro und ex vivo Inkubations-Modell zeigten un¬modifizierte APK P4BG eine vorzeitige Anthocyan-Freisetzung in Magensaft¬simulanz infolge schneller Ablösung der sehr gut wasserlöslichen Pigmente von der Oberfläche. Dieser Effekt wurde durch Coating mit Schellack in Abhängigkeit vom Coatinglevel verringert. Das Material P4BGwSch19 stellte das am besten geeignete Colon-Targeting-System dar, da mit diesem Anthocyane im simulierten Magen und Dünndarm zurückgehalten und im Dick-darm freigesetzt wurden. V. Um das Auflösungsverhalten der Schellackschicht zu optimieren, wurden APK P4BG mit wässriger Schellacklösung gecoatet, welcher der wasserlösliche Poren¬bildner Hydroxypropylmethylcellulose (HPMC) in Konzen¬trationen von 5 % bzw. 15 % (w/w, bezogen auf Schellack) zugesetzt war. Die so herge¬stell-ten gecoateten APK HPMC5 und HPMC15 zeigten eine verbesserte Magen¬¬saft-resistenz im Vergleich zum nur mit Schellack gecoateten Material. Aufgrund des mit 5 % vergleichweise geringen HPMC-Anteils ähnelte das weitere Freisetzungsverhalten von HPMC5 dem von P4BGwSch19. Mit HPMC15 wurde bei beschleunigter Anthocyan-Freisetzung in Ileo¬stomie¬flüssigkeit ein vollstän¬diger Abbau des Materials in Colostomie¬flüssigkeit erzielt. VI. Der in vivo Effekt des entwickelten anthocyanhaltigen Colon-Targeting-Systems P4BGwSch19 bei entzündlichen Darmerkrankungen wurde am Modell der murinen DSS-Colitis untersucht. Im Gegensatz zur Gabe der identischen Dosis an unverkapseltem Heidelbeerextrakt resultierte die orale Zufuhr der mit Schellack gecoateten APK in keinem signifikanten Unterschied in Colonlänge, histolog¬ischem Score sowie IL6- und IFNγ-Sekretion im Vergleich zu Placebo- und Kontrollgruppen. Eine unzureichende Eignung des verwendeten murinen Modells für Freisetzungsstudien könnte hierfür verantwortlich sein.
N2  - Results of various in vitro tests and animal models indicate the potential of anthocyanins as natural substances in the prevention and therapy of intestinal diseases such as acute diarrhea or chronic inflammatory bowel disease. Bilberries (V. myrtillus L.) possess notably high anthocyanin contents up to 780 mg/100g fresh weight. After drying these berries represent a proven remedy in folk medicine. In addition, they are applied as pharmaceutical drug Myrtillus fructus to support the therapy of unspecific acute diarrheal diseases. Recently, this traditional usage was picked up in a model study on experimental murine DSS colitis that demonstrated a therapeutic effect of dried bilberries (DBB). However, so far it is not known whether anthocyanins or other ingredients account for the observed results. Thus, the first object of the present work was to characterize DBB by identification of potential active compounds with analytical methods as well as by analysis of processes occurring during drying. I. After extractive sample preparation the anthocyanin profil and the content of commercially available DBB were determined by HPLC-ESI-MS/MS and HPLC-UV/Vis. It was shown that anthocyanin profil of the analyzed DBB, used in the above mentioned DSS colitis model, differed from that of fresh bilberries (V. myrtillus L.). DBB additionally contained a delphinidin hexose pentose as well as several anthocyanin pentoses, characteristic for the bilberry species V. arctostaphylos L. Thus, it is assumed that berries of V. arctostaphylos L. were used for manufacturing of DBB. The analyzed DBB revealed an anthocyanin content of 384 ± 39 mg/100g dry matter (dm). In comparison to fresh V. myrtillus L. as well as V. arctostaphylos L. fruits the berries showed a significantly reduced anthocyanin content. II. Phenolic acids, quercetin glycosides as well as the aglycon quercetin were identified as monomeric non anthocyanin like polyphenols and quantified by HPLC-ESI-MS/MS and HPLC-DAD, respectively. With 147 ± 5 mg/100g dm chlorogenic acid represented the dominating compound. The overall content of non-anthocyanin like polyphenols of 288 ± 8 mg/100g was similar to the anthocyanin content. III. Condensed tannins (procyanidins) in DBB were analyzed by thiolysis. With 2.23 ± 0.05 g/100g dm the content of condensed tannins was found to be three times higher compared to the sum of monomeric polyphenols (anthocyanins, phenolic acids, flavonols). IV. With 44 ± 2 g/100g dm dietary fiber was the dominant nutrient group in dried bilberries. To characterize the composition of this fraction the neutral sugars were analyzed after acid hydrolysis and derivatization to alditol acetates by HRGC-MS and HRGC-FID, respectively. Uronic acids were investigated photo-metrically. Main cell wall constituents identified by this way were glucose, xylose as well as uronic acid. As the residue after acid hydrolysis Klason-Lignin was determined by gravimetric technique. Cell wall polysaccharide as well as Klason-Lignin were enclosed each with approximately 36 % in the fiber fraction, hence representing the dominating compounds. V. 5-(Hydroxymethyl)furfural was detected as an indicator of thermal treatment during drying of the DBB and quantified by HPLC-MS/MS and HPLC-DAD. The content of 7.9 ± 0.2 mg/100g found is characteristic for dried fruits. VI. In order to directly investigate the influence of drying on the polyphenol content, fresh bilberries V. corymbosum L. were dehydrated in a drying cabinet at 30°C, 50°C as well as 70°C to constant weight. Before and after drying polyhenols were analyzed by HPLC-MS/MS as well as HPLC-DAD and HPLC-UV/Vis, respectively. During drying at 30°C a slight increase of anthocyanin content was found. Rise of temperature to 50°C and 70°C was connected with clear anthocyanin degradation. Phenolic acids and flavonols possessed accelerated thermo resistance. A slight degradation was determined only for chlorogenic acid. VII. Stability of anthocyanins cyanidin-3-galactoside and cyanidin-3-glucoside was studied in an in vitro model simulating the conditions in the plant cell during drying of fruits. The observed anthocyanin degradation showed a reaction kinetic of 1st order. Reaction speed had a strong temperature dependency. In contrast, the type of sugar residue had no influence. Protocatechuic acid was identified by HPLC-DAD-MS/MS as degradation product. Besides the daily amount of anthocyanins ingested, their availability at the site of action represents the basis of the pigments’ potential effects. As it is gener¬al¬ly known, during passage of the gastrointestinal tract (GIT) anthocyanins are chemically and microbiologically degraded. This results in a severe decrease of the active dose. Colon-targeting, to protect the of active compounds from chemical and enzymatic decomposition in the upper GIT by encapsulation is a possibility to increase the availability of anthocyanins for direct effects in the colon. Thus, the objective in the second part of this work was the preparation and characterization of formulations for dietary colon-targeting of anthocyanins. In these studies, commercially manufactured extracts from bilberries V. myrtillus L. (anthocyanin content from 65 to 84 g/100g) were applied as source of anthocyanins. I. For characterization of the release properties of the designed colon-targeting-systems an in vitro and ex vivo model was used mimicking the transit of the human GIT by consecutive incubation in simulated gastric fluid (3 h, pH 2), ileostomy fluid (4 h, pH 6,3) as well as colostomy fluid (15 h, pH 6,2). The content of anthocyanins released were analyzed by HPLC-DAD. II. In laboratory scale bilberry extract was encapsulated in a matrix of amidated pectin by ionotropic gelation in the presence of calcium ions. Conventional dripping method was applied. By additional hydrophobic coating with shellac, premature release of pigments from anthocyanin pectin beads (APB) P4BRT in simulated gastric fluid was significantly reduced. Thus, an anthocyanin transport in the colon was demonstrated with shellac coated APB P4BSch in the applied model system. III. Due to its insolubility in acid media, applicability of marine sponge collagen from Chondrosia reniformis nardo as a matrix for encapsulation was also studied. We succeeded in encapsulating bilberry extract into this material. Despite partial resistance towards degradation in the simulated stomach the materials were not suitable for colon-targeting as they were degraded in ileostomy fluid. IV. To provide shellac coated ABP for in vivo tests an increase in production rate from the gram to the kilogram scale was necessary. It was realized by application of laminar jet break up-technology for manufacturing of APB P4BG by ionotropic gelation of an anthocyanin pectin solution in the presence of calcium ions. In contrast to laboratory scale, the usage of glycerol as a plasticizer in the material was necessary. Subsequent coating of these APB P4BG was performed by Wurster technique with aqueous shellac solution. Formulations with coating levels of 8, 15 and 19 % w/w, respectively, were prepared showing anthocyanin contents from 2.2 to 2.6 g/100g. In the mentioned in vitro and ex vivo model system unmodified APB P4BG showed premature anthocyanin release in simulated gastric fluid due to fast dissolution of the highly soluble pigments from the surface. This effect was reduced by shellac coating in relation to the coating level. Material P4BGwSch19 represented the most suitable colon-targeting-sys¬tem, as anthocyanins were retarded in the simulated stomach as well as the ileum and were released in the colon. V. To optimize dissolution properties of the shellac film, ABP were coated with aqueous shellac solution containing the water soluble pore former hydroxypropyl methylcellulose in concentrations of 5 and 15 % (w/w, based on shellac), respectively. Compared to shellac coated materials these formulations HPMC5 and HPMC15 exhibited an improved gastric resistance. Due to the comparatively low HPMC content of 5 % the release properties of HPMC5 were similar to that of P4BGwSch19. HPMC15 showed in connection with accelerated anthocyanin release in ileostomy fluid material a complete degradation in colostomy fluid. VI. The in vivo effect of the designed anthocyanin colon targeting-system P4BGwSch19 was studied in the model of murine DSS colitis. In contrast to application of the same dose of unmodified bilberry extract, feeding of shellac coated APB resulted in no significant difference of colon length, histological score as well as IL6- and IFNγ-secretion compared to placebo and control groups. As a consequence of this inconsistency, it has to be checked whether the murine model used is suitable for studying release properties.
KW  - Vaccinium myrtillus <Homöopathie>
KW  - Verkapselung
KW  - Anthocyane
KW  - Schellack
KW  - Colon-Targeting
KW  - getrocknete Heidelbeeren
KW  - dried bilberries
KW  - anthocyanin
KW  - shellac
KW  - colon-targeting
KW  - encapsulation
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-54308
ER  - 
TY  - THES
A1  - Ackermann, Matthias
T1  - Studien zum Verhalten von Anthocyanen aus Heidelbeeren im Humanstoffwechsel - Stabilisierung und Bindung durch Proteine
T1  - Studies on anthocyanins in human metabolism - the stabilization and binding by proteins
N2  - Identifizierung und Strukturaufklärung von Anthocyanen und ihrer Metabolite erfolgten mit Hilfe der mittels Hochleistungsflüssigchromatographie-Diodenarray-Detektion-Elektro-spray-Tan¬dem¬massen¬spektrometrie (HPLC-DAD-ESI-MS/MS). Quantitative Analysen wurden via HPLC-DAD durchgeführt. Die hierzu erforderlichen Referenzverbindungen wurden mittels präparativer HPLC aus Heidelbeeren isoliert (Reinheit zwischen 85,8% und 99,4%). Der Gehalt an Anthocyanen in den untersuchten Heidelbeerfrüchten lag bei 6 g/kg. Bezüglich der mengen¬mäßigen Verteilung dominierten Delphinidin- und Cyanidin¬glykoside vor den Glykosiden von Malvidin, Petunidin und Peonidin. Als konjugierte Zucker¬reste kamen vor allem Glukose und Galaktose vor, der Gehalt an Arabinosiden war weit geringer. Bei oraler Aufnahme erfolgt ein erster Kontakt der Anthocyane mit Speichel. Daher wurde dessen Wirkung auf die Heidelbeeranthocyane in ex vivo-Studien über einen (unphysio-logisch langen) Zeitraum von bis zu 30 Minuten untersucht. Dabei konnte wurde ins-besondere der Einfluß des pH-Wertes auf die Stabilität der Anthocyane aufgezeigt werden. Zur Simulation des Verhaltens von Anthocyanen im Magen wurden die einzelnen Heidelbeeranthocyane mit künstlichem Magensaft (pH 1,81) über vier Stunden inkubiert. Hier erwiesen sich alle untersuchten Verbindungen als stabil. Die anschließend von uns mit simuliertem Duodenalsekret (pH 7,2) über einen Zeitraum von 24 Stunden durchgeführten Studien zeigten, dass die Anthocyane unterschiedlich starken Modifizierungen unterlagen. Unter den schwach alkalischen Bedingungen wurden vor allem die Glykoside des Delphinidins schnell abgebaut, aber auch die übrigen Anthocyane erwiesen sich unter diesen Bedingungen als nicht stabil; nach 24 h war kein Anthocyan mehr nachweisbar. Um die Metabolisierungsvorgänge der Anthocyane im Dünn- und Dickdarm zu untersuchen, wurden ex vivo-Inkubationen jeweils mit frischem Ileo- bzw. Kolo¬stoma-beutel¬inhalt durchgeführt. Während die Abbaugeschwindigkeit in der ilealen Flüssigkeit vor allem von der pH-Stabilität des Aglykons abhänig war, konnten im Dickdarm einzig die Arabinoside nach einer Stunde noch alle in geringen Konzentrationen identifiziert werden. Die meisten Glukoside und Galaktoside waren zu diesem Zeitpunkt schon vollständig abgebaut. Da im Darm von einer hydrolytischen Spaltung der Anthocyane in Anthocyanidin und Zucker ausgegangen wird, wurde die Metabolisierung von Anthocyanidinen unter physio-logischen pH-Bedingungen untersucht. Neben der jeweiligen Spaltung in das Benzoe¬säure-derivat des B-Ringes sowie Phloroglucinessigsäure traten verschiedene Poly¬merisierungs¬-produkte auf, deren Strukturen nicht aufgeklärt werden konnten. In einer weiteren Versuchsreihe wurde die renale Ausscheidung von Anthocyanen bei Ileostomieprobanden nach oraler Applikation von 300 g Heidelbeeren über einen Zeitraum von acht Stunden untersucht. Es zeigte sich, dass ein Stoma des terminalen Ileums keinen Einfluss auf die Absorption und Metabolisierung der Anthocyane hatte. Die Bilanzierung der Anthocyane im Urin erfolgte als Äquvalente von Malvidin-3-O-glukosid, da nicht alle Anthocyanmetabolite zur Verfügung standen. Der Zeitpunkt der maximalen renalen Anthocyanausscheidung sowie die Menge der ausgeschiedenen Anthocyane waren starken interindividuellen Schwankungen unterworfen. Das Aus¬sscheidungs¬maximum (tmax) lag zwischen 0,5 und zwei Stunden. Bei der ausge¬schiedenen Menge wurden Werte zwischen 0,007% und 0.019% der auf¬ge¬nommenen Anthocyane ermittelt. Aufgrund der literaturbekannten Unterschiede zwischen den in Serum und Urin gefunden Anthocyanmengen ist davon auszugehen, dass es nach Anthocyanverzehr zu Inter-aktionen mit Proteinen in Blut oder Geweben kommt. Mittels Blutfraktionierung wurde das humane Serumalbumin (HSA) als wichtigster Bindungspartner der Anthocyane im Blut identifiziert. Anhand spektroskopischer Methoden war es möglich, die Bindungs¬parameter zu berechnen. Als Bindungsort wurde der hydrophile Eingang der lipophilen Warfarin-Bindungstasche in der Subdomäne IIA des HSA-Moleküls mittels "molecular modelling" identifiziert. Nasschemische Untersuchungen ergaben, dass die Bindung der Anthocyane an HSA diese vor ihrem pH-abhängigen Abbau schützt. Eine signifikante Herab¬setzung der chemischen Abbaugeschwindig¬keit konnte auch für bovines Serumalbumin beobachtet werden. Diese Erkenntnis ließ sich auf andere, mit dem HSA-Molekül nicht strukurverwandte lebensmittelrelevante Albumine übertragen. So zeigten Anthocyane große Stabilität in Milch und Eiklar, wobei die Stabilisierung auf eine Wechselwirkung mit den Proteinen Laktalbumin und Ovalbumin zurückgeführt werden konnte. Die in dieser Arbeit erlangten Erkenntnisse hinsichtlich Absorption, Metabolisierung und systemischer Verfügbarkeit im menschlichen Organismus leisten einen Beitrag zum besseren Verständnis der Wirkungen von Anthocyanen. Die neuen Erkenntnisse der Protein¬bindung sind vor allem für die Bewertung der Verfügbarkeit der Anthocyane in humanem Gewebe relevant.
N2  - Identification and structural analysis of anthocyanins and their metabolites was conducted by High-Performance-Liquid-Chromatography-Diode-Array-Detection-Electrospray-Tan-dem-Mass-Spectrometry (HPLC-DAD-ESI-MS/MS). Quantative analyses were realized via HPLC-DAD. The required reference compounds were isolated by preparative HPLC from blueberries (purity from 85.8% to 99.4%). The content of anthocyanines in the analysed blueberries was approximately 6 g/kg. Regarding the quantative distribution, delphinidin and cyaniding glycosides dominated, followed by malvidin, petunidin and peonidin glycosides. Regarding the conjugated sugar rests, glucose and galactose were most abundant with the content of arabinosides being much lower. When ingested orally the anthocyanins first come into contact with saliva. For this reason the effect of saliva on blueberry anthocyanins was analysed in ex vivo studies over a (unphysiologically long) period of up to 30 minutes. With this study, in particular, the influence of the pH-value on the stability of the anthocyanins was shown. For the simulation of the behaviour of anthocyanins in the stomach, the individual blueberry anthocyanins were incubated for four hours with artificial gastric juice (pH 1.81). Under these conditions all analysed components were found to be stable. The subsequent studies with simulated duodenal fluid (pH 7.2) over a period of 24 hours revealed, that the anthocyanins were modified differently. Under the weak alkaline conditions, especially the delphinidin glycosides were degraded quickly, but the other anthocyanins were also not stable under these conditions; no anthocyan was detectable after 24 hours. To analyse the metabolism processes of anthocyanins in the small and large intestines, ex vivo incubations of fresh ileostoma and colostoma bag contents were conducted. Whilst the degradation rates of the anthocyanins in the ileal liquid were dependent on the pH stability of the aglycons, only the arabinosides were detectable in small concentrations after one hour in the large intestine (colostoma incubations). Most of the glucosides and galactosides were degraded completely at this timepoint. As it is supposed that the anthocyanins are cleaved in the colon, the metabolism of anthocyanidins under physiological pH-values were analysed. Next to the respective cleavage into the benzoic acid derivative of the B-ring and phloroglucin acetic acid, different polymerisation products were found, whose structure could not be determined. In a further trial the renal excretion of anthocyanins in ileostoma patients after oral application of 300 g blueberries over a period of eight hours was determined. It was shown that the ileostoma handicap had no influence on the absorption and metabolism of anthocyanins. The quantification of anthocyanins in the urine samples were calculated as malvidin-3-O-glucoside equivalents, as not all anthocyan metabolites were available. The point of time of the maximum renal anthocyan excretion as well the amount of excreted anthocyanins underwent strong interindividual variations. The highest excretion (tmax) was between 0.5 and two hours. Values of 0.007% and 0.019% of the anthocyan uptake were recovered in the excreted material. Due to the differences known from literature between the amounts of anthocyanins found in serum and urine, it has to be assumed that there are interactions with proteins in the blood or tissue after anthocyan consumption. By fractionating blood, the human serum albumin (HSA) was identified as the most important binding partner for anthocyanins in blood. Using spectroscopic methods it was possible to calculate the binding parameters. With ‘molecular modelling’ the hydrophilic entrance of the lipophilic warfarin binding pocket in the subdomain IIA of the HSA molecule was identified as binding position. Chemical analyses showed that the binding of anthocyanins to HSA protected these from their pH-dependent degradation. A significant lowering of the chemical degradation velocity could also be observed for bovine serum albumin. This knowledge could be related to other, not structurally related food relevant albumins. Anthocyanins showed thus a large stability in milk and egg white, where the stabilising effect could be related to interactions with the proteins lactalbumin and ovalbumin. The novel information provided by this work regarding absorption, metabolism and systematic availability in the human organism leads to a better understanding of the effects of anthocyanins. The data of protein binding is particularly relevant for the assessment of the availability of anthocyanins in human tissues.
KW  - Heidelbeere
KW  - Anthocyane
KW  - Proteinbindung
KW  - Stoffwechsel
KW  - Anthocyane
KW  - Stabilität
KW  - Humanstoffwechsel
KW  - anthocyanins
KW  - binding
KW  - protein
KW  - stability
KW  - metabolism
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-53336
ER  -