TY - THES A1 - Nedvetsky, Pavel I. T1 - Regulation of the nitric oxide receptor, soluble guanylyl cyclase T1 - Regulation des Rezeptor des Stickstoffoxides löslicher Guanylylcyclase N2 - Soluble guanylyl cyclase (sGC) is the best established receptor for nitric oxide (NO) and regulates a great number of important physiological functions. Surprisingly, despite the wellappreciated roles of this enzyme in regulation of vascular tone, smooth muscle cell proliferation, platelet aggregation, renal sodium secretion, synaptic plasticity, and other functions, extremely little is known about the regulation of sGC activity and protein levels. To date, the only well-proven physiologically relevant sGC regulator is NO. In the present study, some additional possibilities for sGC regulation were shown. Firstly, we evaluated the ability of different NO donors to stimulate sGC. Significant differences in the sGC stimulation by SNP and DEA/NO were found. DEA/NO stimulated sGC much stronger than did SNP. Interestingly, no correlation between the sGC protein and maximal activity distribution was found in rat brain regions tested, suggesting the existence of some additional regulatory mechanisms for sGC. The failure of SNP to stimulate sGC maximally might be one of the reasons why the lack of correlation between the distribution of sGC activity and proteins in brain was not detected earlier. Prolonged exposure of endothelial cells to NO donors produced desensitization of the cGMP response. This desensitization cannot be explained by increased PDE activity, since PDE inhibitors were not able to prevent the NO donor-induced decrease of the maximal cGMP response in endothelial cells. The failure of SH-reducing agents to improve the cGMP response after its desensitization by NO suggests that a SH-independent mechanism mediates NO effects. Demonstration that the potency of the recently described activator of oxidized (heme-free) sGC, BAY58-2667, to stimulate sGC increases after prolonged exposure of the cells to an NO donor, DETA/NO, suggests that oxidation of heme may be a reason for NOinduced desensitization of sGC and decrease in sGC protein level. Indeed, the well-known heme-oxidizing agent ODQ produces a dramatic decrease in sGC protein levels in endothelial cells and BAY58-2667 prevents this effect. Although the mechanism of sGC activation and stabilization by BAY58-2667 is unknown, this substance is an interesting candidate to modulate sGC under conditions where sGC heme iron is oxidized. Very little is known about regulation of sGC by intracellular localization or translocation between different intracellular compartments. In the present study, an increase in sGC sensitivity to NO under membrane association was demonstrated. Treatment of isolated lung with VEGF markedly increased sGC in membrane fractions of endothelial cells. Failure of VEGF to stimulate sGC membrane association in cultured endothelial cells allows us to propose a complex mechanism of regulation of sGC membrane association and/or a transient character of sGC membrane attachment. A very likely mechanism for the attachment of sGC to membranes is via sGCinteracting proteins. These proteins may participate also in other aspects of sGC regulation. The role of the recently described sGC interaction partner, Hsp90, was investigated. Shortterm treatment of endothelial cells with an Hsp90 inhibitor does not affect NO donor or calcium ionophore-stimulated cGMP accumulation in the cells. However, inhibition of Hsp90 results in a rapid and dramatic decrease in sGC protein levels in endothelial cells. These effects were unrelated to changes in sGC transcription, since inhibition of transcription had much slower effect on sGC protein levels. In contrast, inhibitors of proteasomes abolished the reduction in sGC protein levels produced by an Hsp90 inhibitor, suggesting involvement of proteolytic degradation of sGC proteins during inhibition of Hsp90. All these data together suggest that Hsp90 is required to maintain mature sGC proteins. In conclusion, in the present study it was demonstrated that multiple mechanisms are involved in the regulation of sGC activity and its sensitivity to NO. Oxidation of sGC heme by NO seems to be one of the mechanisms for negative regulation of sGC in the presence of high or prolonged stimulation with NO. Another possible means of regulating sGC sensitivity to NO is via the intracellular translocation of the enzyme. It has been also demonstrated here that attachment of sGC to the membrane fraction results in an apparent increase in the enzyme sensitivity to NO. Additionally, Hsp90 was required to maintain sGC protein in endothelial and other cell types. However, we could not find any acute affect of Hsp90 on sGC activity, as reported recently. All these findings demonstrate that the regulation of sGC activity and protein level is a much more complex process than had been assumed earlier. N2 - Lösliche Guanylylcyclase (sGC) ist der Hauptrezeptor für Stickstoffmonooxid (NO), der sich an der Regulation zahlreicher physiologischer Funktionen beteiligt. Trotz ihrer sehr gut untersuchten Rolle in der Regulation der Blutgefässenrelaxation, synaptische Plastizität, Aggregation der Trombozyten, renale Sekretion und anderen wichtigen Funktionen, ist die Regulation der sGC selber noch nicht ausreichend verstanden. Der einzige, zur Zeit bekannte, physiologische Regulator der sGC ist NO. In der vorgelegten Arbeit wurde die Existenz anderer Möglichkeiten der sGC Regulation gezeigt. Zuerst, wurde die Fähigkeit verschiedener NO Donoren sGC zu stimulieren untersucht. DEA/NO stimulierte sGC viel stärker als SNP. Interessanterweise, wurde keine Korrelation zwischen der Verteilung des sGC Proteins und der Enzymaktivität unter Vmax- Bedingungen in verschiedenen Rattenhirnregionen gefunden. Das deutet auf zusätzliche Regulationsmechanismen hin. Die fehlende Fähigkeit von SNP sGC maximal zu stimulieren könnte ein Grund dafür sein, warum dieses Phänomen nicht schon früher gezeigt wurde. Langfristige Behandlung von Endothelzellen mit NO Donoren produzierte eine Desensitisierung der nachfolgenden cGMP Antwort. Diese Desensitisierung kann nicht durch erhöhte Phosphodiesterase-Aktivität erklärt werden, da Phosphodiesterasenhemmer die durch NO Donor verursachte Abnahme der cGMP Antwort nicht rückgängig macht. SHreduzierende Substanzen waren nicht in der Lage die cGMP Antwort zu verbessern, was zur Annahme führt, dass SH-Gruppenoxidation keine wichtige Rolle bei der Wirkung von NO auf sGC spielt. Es müssen daher andere Regulationsmechanismen vorhanden sein. Oxidation des Häms scheint ein möglicher Mechanismus der NO-induzierten sGC Desensitisierung. Einkürzlich beschriebener Aktivator der oxidierten (bzw. Häm-freien) sGC, BAY58-2667, stimulierte sGC nach Vorbehandlung mit NO Donoreb stärker als ohne Vorbehandlung. Es wird vermutet, dass oxidierte sGC verstärkt abgebaut wird was die durch NO oder Häm oxidierende Substanzen induzierte sGC Proteinabnahme erklären würde. Tatsächlich, nahm sGC Proteinlevel nach der Behandlung mit der Häm oxidierenden Substanz, ODQ, ab. BAY58-2667 verhinderte diesen Effekt. Ferner erhöht die Membranassoziation von sGC derer Empfindlichkeit gegenüber NO. Die Membranassoziation der sGC in Endothelzellen ist reguliert. Behandlung isolierter Lunge mit VEGF erhöht den Anteil an membrangebundener sGC in Endothelzellen dramatisch. In kultivierten Endothelzellen könnte VEGF die Membranassoziation jedoch nicht stimulieren, was einen komplexen Mechanismus der Membranassoziation der sGC in vivo vermuten lässt. Wenig ist bekannt über die Interaktionen von sGC mit anderen Protein und der möglichen Rolle dieser Interaktionen bei der Regulation des Enzyms. Proteininteraktionen scheinen aber ein möglicher Mechanismus für die Membranassoziation der sGC zu sein. Aus diesem Grund wurde die Rolle eines vor kurzem beschriebenen sGC-bindenden Proteins, Hsp90, auf die sGC Regulation untersucht. Kurzfristige Behandlung der Endothelzellen mit Hsp90 Inhibitoren hat keine Auswirkung auf NO Donor- und Calciumionophore-stimulierte cGMP-Produktion. Langfristige Hemmung von Hsp90 führte dagegen zur schnellen und deutlichen Abnahme des sGC Proteins. Dieser Effekt ist nicht durch eine Veränderung der Translation zu erklären, weil Tranlationshemmer einen viel langsameren sGC Abfall verursachten. Im Gegenteil, konnte ein Proteasomeninhibitor, MG132, die Effekte von Hsp90 Hemmern rückgängig machen. Das lässt eine proteolytische Abbau der sGC für die Effekte von Hsp90 Hemmer verantwortlich machen. Diese Daten deuten darauf hin, dass Hsp90 für Aufrechterhaltung des Enzyms notwendig ist. Zusammenfassend, wurde in der vorliegenden Arbeit gezeigt, dass sGC Aktivität und ihre Empfindlichkeit gegenüber ihren Aktivator NO durch multiple Faktoren beeinflusst werden kann. Oxidation des Häms durch NO könnte ein Mechanismus der negativen Regulation der sGC bei dauernd erhöhter Konzentration von NO sein. Ein zusätzlicher Mechanismus der Regulation der Empfindlichkeit der sGC gegenüber NO scheint die intrazellulare Translokation zu sein. Wir konnten hier zeigen, das die Membranassoziation der sGC ihre Empfindlichkeit gegenüber NO erhöht. Auch dieProteinlevel der sGC scheinen unter Kontrolle verschiedener Faktoren zu sein. Einer davon ist Hsp90, der für die Aufrechterhaltung des sGC Proteins sowohl in Endothelzellen als auch in anderen Zelltypen notwendig ist. Alle diese Daten zeigen, dass Regulation der sGC ein viel komplexerer Vorgang ist als bis her angenommen wurde und eröffnen interessante neue Forschungsrichtungen innerhalb dieses wichtigen Signalweges. KW - Guanylatcyclase KW - Regulation KW - lösliche Guanylylcyclase KW - cGMP KW - Häm KW - Hsp90 KW - soluble guanylyl cyclase KW - cGMP KW - heme KW - Hsp90 Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7046 ER - TY - THES A1 - Vogt, Christian Roland Jens T1 - Verbesserung der vaskulären Dysfunktion bei Diabetes mellitus durch Aktivierung der Guanylatzyklase T1 - Improvement of Vascular Dysfunction in Diabetes mellitus by Chronic Guanylyl Cyclase Activation N2 - Die vorliegende Arbeit untersucht den Effekt des Guanylatzyklase-Aktivators HMR1766 auf die vaskuläre Dysfunktion bei Streptozotozin-(STZ-)induziertem Diabetes mellitus im experimentellen Rattenmodell. Zunächst wird anhand funktioneller Studien die vaskuläre Reaktivität aortaler Gefäßringe gesunder, Placebo- und HMR1766-behandelter Tiere verglichen. Davon ausgehend werden weiterführende experimentelle Daten dargestellt, die mögliche Wirkungsmechanismen von HMR1766 im STZ-Diabetes-Modell beschreiben und einen Erklärungsansatz für die funktionell gewonnenen Daten liefern. Es wird gezeigt, dass eine chronische Behandlung mit HMR1766 die endotheliale Dysfunktion im STZ-Diabetes signifikant verbessern kann. HMR1766 verstärkt den Stickstoffmonoxid-(NO-)Signalweg über die lösliche Guanylatzyklase zum zyklischen Guanosinmonophosphat (cGMP), normalisiert die eingeschränkte Vasorelaxation, führt zu einer gesteigerten NO-Bioverfügbarkeit und erhöht so die inhibitorische Wirkung von NO auf die Superoxid-produzierende NADPH-Oxidase. Dadurch wird der oxidative Stress signifikant reduziert und die NO-Inaktivierung durch Superoxid verringert. Die vorgelegten Daten stellen ferner einen Zusammenhang her zwischen dem vaskulären Kontraktionsdefizit bei Diabetes und einem Ungleichgewicht im Arachidonsäuremetabolismus. Durch eine Überexpression von Cytochrom-P450-2E1 (CYP2E1) im STZ-Modell kommt es zu einem Defizit der vasokonstriktorisch wirkenden 20-Hydroxyeicosatetraensäure (20-HETE). Dies führt zu einem verminderten Ansprechen der Gefäße auf Vasokonstriktoren wie Phenylephrin. HMR1766 kann durch die Verbesserung des NO/cGMP-Signals die katalytische Aktivität von CYP2E1 hemmen, dadurch das 20-HETE-Defizit ausgleichen und die vaskuläre Reaktivität wieder normalisieren. Zusammenfassend zeigen die dargestellten Ergebnisse, dass eine Behandlung mit HMR1766 bei STZ-induziertem Diabetes mellitus zu einer signifikanten Verbesserung der vaskulären Dysfunktion führt. Eine Behandlung mit HMR1766 könnte daher ein sinnvoller Ansatz sein zur Vermeidung vaskulärer Komplikationen bei Diabetes mellitus. N2 - Background: Vascular endothelial dysfunction and the so-called non-contractile phenotype of smooth muscle cells are well described in diabetes mellitus. Endothelial dysfunction results in decreased signalling through the NO/sGC/cGMP-pathway leading to decreased levels of cGMP in diabetes. This study investigated in STZ-diabetic rats whether chronic stimulation of guanylyl cyclase with the novel activator HMR1766 would improve vascular reactivity in diabetes. Results: Endothelium-dependent as well as endothelium-independent nitric oxide-mediated vasorelaxation was significantly impaired in diabetic placebo-treated animals and was completely normalized by treatment with HMR1766, indicating improved signalling through the NO/sGC/cGMP-signalling cascade. NOS-inhibitor-induced contraction of slightly preconstricted aortic rings was significantly attenuated in diabetic animals indicating reduced NO-bioavailability. This was also normalized by treatment with HMR1766. Oxidant stress is a major cause of reduced endothelial NO-bioavailability in diabetes. Increased expression of NAD(P)H-oxidase subunits was demonstrated in this study, resulting in enhanced oxidative stress and reduced NO-bioavailability. Chronic treatment with HMR1766 reduced the enhanced superoxide formation and expression of the NAD(P)H-oxidase subunit gp91phox in STZ-diabetic aortae. Diabetic rats displayed a highly significant reduction in vascular contraction compared to healthy control animals as described for the diabetic, non-contractile phenotype. Furthermore, this study shows that the increased expression of CYP2E1 in STZ-diabetes also contributes – due to a following imbalance in arachidonic acid metabolism and decreased levels of 20-HETE – to a decreased vasoconstriction in the aortic rings. Treatment with HMR1766 reduced the catalytic activity of CYP2E1 and normalized vascular contraction. Conclusion: Chronic guanylyl cyclase activation in diabetes improves vascular relaxation and contraction by improving release of and sensitivity for nitric oxide. HMR1766 significantly enhanced the reduced signaling through the NO/sGC/cGMP-pathway in diabetes and might be a new potential therapeutic approach for treatment of vascular dysfunction in diabetes. KW - Stickstoffmonoxid KW - Guanylatcyclase KW - Diabetes mellitus KW - Streptozocin KW - HMR1766 KW - Nitric oxide KW - Diabetes mellitus KW - Guanylyl cyclase KW - HMR1766 Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-37379 ER - TY - THES A1 - Flierl, Ulrike T1 - Einfluss der chronischen Aktivierung der Guanylatcyclase auf die Regulation der Thrombozytenaktivität bei Diabetes mellitus T1 - Influence of chronic activation of soluble guanylyl cyclase on platelet activation in diabetes N2 - Die vorliegende Arbeit beschreibt die günstigen Auswirkungen der chronischen Aktivierung der löslichen Guanylatcyclase durch HMR 1766 auf die Regulation der Thrombozytenaktivität im experimentellen Diabetes mellitus. Es konnte die zugrunde liegende Hypothese eines aktivierten Zustands von Thrombozyten im Diabetes bestätigt und darüber hinaus die Reversibilität dieser Aktivierung durch medikamentöse, direkte, NO-unabhängige, chronische Stimulation der sGC, dem Schlüsselenzym zur Vermittlung endogener NO-Wirkung, gezeigt werden. Hierzu wurden mit Hilfe durchflusszytometrischer Bestimmungen in frisch entnommenem Vollblut verschiedene thrombozytäre Marker analysiert. Zum einen deuteten die Ergebnisse auf eine verminderte NO-Bioverfügbarkeit beziehungsweise eine verringerte Aktivität des Effektorenzyms im Diabetes und eine gesteigerte Aktivität des Enzyms bei HMR 1766-behandelten Versuchstieren hin, zum anderen konnte ein Rückgang der Expression thrombozytärer Aktivierungsparameter in Richtung des Niveaus gesunder Kontrollen bei Thrombozyten der Tiere gezeigt werden, die den GC-Aktivator erhielten. Darüber hinaus stellte sich eine verminderte Aktivierbarkeit auf externe Stimuli bei in vitro Versuchen in Vollblut als auch in PRP heraus. Bei aggregometrischen Untersuchungen mit PRP zeigte sich eine verminderte Aggregation als Reaktion auf Fractalkine-Inkubation und anschließende direkte Stimulation mit ADP bei dem Material HMR 1766 behandelter Tiere. Zur Untersuchung von Akut-Effekten der Substanz wurden Proben gesunder beziehungsweise diabetischer Tiere teils direkt mit dem Medikament inkubiert, und es wurde einmalig medikamentös behandelten Tieren Blut entnommen. Hier stellte sich eine verminderte ADP-induzierte Aggregation bei behandelten Proben heraus, zudem zeigten sich positive Akut-Effekte hinsichtlich der basalen als auch der mit einem NO-Donor stimulierten VASP-Phosphorylierung. Bei der Betrachtung hämatologischer und metabolischer Parameter fiel bei sonst unauffälligen Ergebnissen das MPV auf, das im Diabetes erhöht, nach Behandlung mit dem GC-Aktivator jedoch wieder auf Kontrollwerte reduziert war. Die vielversprechenden Ergebnisse könnten ein Schritt zur Etablierung dieser Substanz als zukünftiges Medikament zur Prävention beziehungsweise Behandlung kardiovaskulärer Komplikationen bei Diabetes sein. N2 - Platelet activation significantly contributes to cardiovascular morbidity and mortality in diabetes. An association between impaired NO-mediated platelet inhibition and platelet activation has recently been demonstrated in experimental diabetes. Guanylyl cyclase activation enhances the reduced signaling via the NO/cGMP pathway. Chronic treatment with HMR1766 enhanced NO/cGMP-mediated signaling in platelets from diabetic rats determined by in vivo phosphorylation of platelet vasodilator-stimulated phosphoprotein (VASP) at Ser157 and Ser239. In parallel, platelet-binding of fibrinogen, surface-expression of P-selectin, appearance of platelet-derived microparticles, and platelet-aggregates with other blood cells were significantly reduced by chronic treatment with HMR1766. CONCLUSIONS: Chronic activation of soluble guanylyl cyclase in diabetic rats improved markers of platelet activation and is a rationale approach for prevention of adverse cardiovascular events in diabetes. KW - Guanylatcyclase KW - Diabetes mellitus KW - Thrombozyt KW - platelet KW - diabetes KW - guanylyl cyclase Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-38541 ER - TY - THES A1 - Looser, Jens T1 - Funktionelle Analyse der Photoaktivierten Adenylatzyklase (PAC) aus Euglena gracilis T1 - Functional analysis of Euglena gracilis photoactivated adenylyl cyclase (PAC) N2 - Die Photoaktivierte Adenylatzyklase PAC ist in E. gracilis an der Phototaxis beteiligt und besteht aus den zwei unterschiedlich großen Proteinen PACalpha und PACbeta. Beide besitzen jeweils zwei FAD bindende (BLUF) Domänen F1 und F2 sowie zwei Zyklasedomänen C1 und C2. An den Zyklasedomänen findet die Umsetzung von ATP in cAMP statt und die BLUF-Domänen werden für die Lichtaktivierung benötigt. Für diese Arbeit wurde PAC und Mutanten davon heterolog in Oocyten von Xenopus laevis exprimiert. PAC besitzt bereits im Dunkeln Adenylatzyklaseaktivität, die durch Belichtung erhöht werden kann. Die Zunahme der Aktivität erfolgt mit einer Zeitkonstante von unter 100 ms, die Abnahme nach der Belichtung hat eine Zeitkonstante im Bereich von 10ms. Das für die katalytische Umsetzung in allen Klasse III Nukleotidzyklasen benötigte Dimer zweier Zyklasedomänen ist in PAC das Dimer aus C1 und C2. Durch Messungen mit PAC-Mutanten, bei denen jeweils eine Zyklasedomäne defekt war, konnte gezeigt werden, dass diese Dimerisierung in PACalpha intermolekular auftritt. Ebenso wurde gezeigt, dass ein solches Dimer aus Zyklasedomänen von PACalpha und PACbeta bestehen kann. Der Austausch der Zyklasedomänen von PACalpha durch Zyklasedomänen der Guanylatzyklasen GCY35 und GCY36 aus C. elegans führte zu einem Verlust der Zyklaseaktivität. Die Proteine wurden aber zumindest teilweise korrekt gefaltet, was durch Dimerbildung mit Knockoutmutanten von PAC in Koexpressionsexperimenten gezeigt werden konnte. Die Fusionsproteine aus PACalpha und den CNG-Kanälen CNGA2 und OLF führten in Oocyten zu einer deutlich geringeren Leitwertänderung als eine Expression der Einzelproteine. Sowohl bei einer N-terminalen Fusion des Kanals an PAC als auch bei der C-terminalen Fusion war es jeweils der Kanal, der im Fusionsprotein stark gehemmt war. Eine Deletion des C-Terminus von PACalpha führte zu einem nicht funktionsfähigen Protein, das auch in Koexpression mit PAC-Knockoutmutanten keine messbare Adenylatzyklaseaktivität zeigte. Wurde die F2-Domäne deletiert, so verlor PAC ebenfalls seine Zyklaseaktivität vollständig. Die C1-Domäne war aber korrekt gefaltet, was durch eine Koexpression mit PAC-Mutanten gezeigt werden konnte, die in einer ihrer Zyklasedomänen defekt waren. Beide Chimären aus PACalpha und PACbeta besaßen Adenylatzyklaseaktivität. Diese war bei der Chimäre mit dem C-terminalen Teil von PACalpha deutlich höher als bei der Chimäre mit dem C-terminalen Teil von PACbeta, was darauf hindeutet, dass im C-terminalen Teil von PAC der Grund für den Aktivitätsunterschied zwischen PACalpha und PACbeta liegt. Für die Veränderung der Substratspezifität von einer Adenylat- zu einer Guanylatzyklase waren Mutationen an mindestens drei Aminosäuren erforderlich. Die ebenfalls hergestellten Einzel- und Doppelmutanten verhielten sich wie der Wildtyp oder hatten eine deutlich eingeschränkte Adenylatzyklaseaktivität. Bei der Tripelmutante PACalpha K250E T319G S329Y war Guanylatzyklaseaktivität nachweisbar, die aber geringer war als die noch vorhandene Adenylatzyklaseaktivität. Die Quadrupelmutante PACalpha K250E D317K T319G S329Y zeigte ebenfalls lichtinduzierbare Adenylatzyklaseaktivität, die ca. 0,3% der Aktivität der Wildtyp-PACalpha entsprach. Die Guanylatzyklaseaktivität dieser Mutante war ca. dreifach höher als deren Adenylatzyklaseaktivität. Somit konnte gezeigt werden, dass sich durch die Mutation weniger einzelner Aminosäuren die Substratspezifität von PAC von ATP nach GTP verschieben lässt. N2 - The photoactivated adenylyl cyclase PAC is involved in phototaxis in E. gracilis. It consists of two subunits of different size which are called PACalpha and PACbeta. Both of them harbour two FAD-binding domains (F1, F2) and two cyclase domains (C1, C2). PAC and mutants of PAC have been heterologously expressed in Oocytes of Xenopus laevis. Already in darkness PAC shows a basal level of adenylyl cyclase activity, which can be increased by illumination. The increase in cyclase activity occurs with a time constant lower than 100 ms, whereas the decrease after illumination has a time constant around 10 ms. The dimer of two cyclase domains, which is necessary for catalytic conversion in all class III cyclases, is formed of C1 and C2 in PAC. In electrophysiological experiments with PAC mutants which were defective in either of the cyclase domains it has been shown, that this dimer in PACalpha occurs intermolecularly. Furthermore it has been shown, that this dimer can occur between PACalpha and PACbeta. Mutants of PACalpha where the cyclase domains have been substituted by the cyclase domains of the guanylyl cyclases GCY35 and GCY36 from C. elegans lost their ability to produce cAMP. However coexpression experiments with PAC knockout mutants indicated correct translation of the substitution mutants. Expression of fusion proteins of PACalpha with the CNG channels CNGA2 and OLF showed less light-inducable conductance changes than the expression of the single protein. In both the N-terminal and C-terminal fusion of the channel to PACalpha it was the channel which was the most affected part of the fusion protein. Deletion of the C-terminus of PACalpha results in a non-functional protein, which in coexpression with PACalpha knockout mutants shows no measurable cyclase activity. When deleting the F2-domain, PACalpha also loses its cyclase activity completely. However, the C1-domain was transcribed correctly, which could be shown by coexpression with a C1-knockout mutant. Both PACalpha-PACbeta chimeras showed adenylyl cyclase activity. Whereas the activity in the chimera with the C-terminal part of PACbeta showed little cyclase activity, the chimera possessing the C-terminal part of PACalpha showed adenylyl cyclase acitvity, which was comparable to the wildtype of PACalpha. This indicates that the part of PAC which is responsible for the difference in cyclase activity between PACalpha and PACbeta must be present in the C-terminal half of PAC. For altering PAC’s substrate specificity it was necessary to mutate at least three amino acids. The single and double mutants of PACalpha which were generated resulted in wildtypelike behaviour or reduced adenylyl cyclase activity. The triple mutant PACalpha K250E T319G S329Y showed guanylyl cyclase activity which was lower than its remaining adenylyl cyclase activity. The quadruple mutant PACalpha K250E D317K T319G S329Y also showed adenylyl cyclase activity, which was about 0.3% of the activity in PACalpha wildtype. The guanylyl cyclase activity of this mutant was about threefold higher than its adenylyl cyclase activity. Thus, it could be shown, that by mutating few single amino acids the substrate specificity of PACalpha was shifted from ATP to GTP. KW - Euglena gracilis KW - Glatter Krallenfrosch KW - Adenylatcyclase KW - Guanylatcyclase KW - BLUF KW - PAC KW - photoaktiviert KW - BLUF KW - PAC Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48283 ER - TY - THES A1 - Eder, Elisabeth Christiane T1 - Die Wirkung von Sildenafil auf das kardiovaskuläre System in zwei murinen Modellen der Myokardhypertrophie T1 - Effects of Sildenafil on the cardiovascular system, investigated in two murine models of left ventricular hypertrophy N2 - Myokardhypertrophie stellt einen Adaptationsmechanismus des Herzens an erhöhte Belastungen wie chronische arterielle Hypertonie, Myokardinfarkt, Koronare Herzkrankheit, Myokarditis und Kardiomyopathien dar. Sowohl biomechanische als auch neurohumorale Stimuli führen auf einer Reihe von Signalwegen zur Myokardhypertrophie, die als Größenzunahme postmitotischer Kardiomyozyten definiert ist. Zyklisches 3´5´-Guanosinmonophosphat ist ein ubiquitärer intrazellulärer Signalträger, der im kardiovaskulären System auf mindestens drei bekannten Wegen aus Guanosintriphosphat durch Abspaltung von Pyrophosphat synthetisiert wird. Die Synthese erfolgt unter anderem durch Aktivierung der partikulären, membranständigen Guanylylzyklase A durch Atriales Natriuretisches Peptid oder „B-Typ“ Natriuretisches Peptid und der Guanylyzyklase B, durch „C-Typ“ Natriuretisches Peptid. Des Weiteren wird über neuronale, endotheliale, oder induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase Stickstoffmonoxid synthetisiert, welches die lösliche, vorwiegend zytosolisch lokalisierte Guanylyzyklase aktiviert, die wiederum aus Guanosintriphosphat zyklisches 3´5´-Guanosinmonophosphat synthetisiert. Das intrazelluläre zyklische 3´5´-Guanosinmonophosphat lässt sich durch Behandlung mit Sildenafilcitrat, einem unter dem Markennamen Viagra® zur Therapie der Erektilen Dysfunktion und Revatio® zur Therapie der pulmonalen arteriellen Hypertonie zugelassenem Pharmakon, erhöhen. Sildenafil hemmt die Phosphodiesterase 5A, ein unter anderem in Lunge, Kardiomyozyten, Kleinhirn und glatter Muskulatur vorkommendes Isoenzym. In der vorliegenden Dissertation wurden die kardialen Effekte des Phosphodiesterase 5-Inhibitors Sildenafil an zwei Mausmodellen mit funktionell gut kompensierter Herzhypertrophie getestet. Die mittlere Tagesdosis betrug 150 (Studie 1) bzw. 240 (Studie 2) mg/kg Körpergewicht Sildenafil, in Anlehnung an publizierte Studien mit Nagern (Takimoto et al., 2005b). Diese Dosis wurde oral über vier (Studie 1) bzw. neun Wochen (Studie 2) zugeführt. Die mittlere Plasmakonzentration von Sildenafil lag mit 60 nM weit über dessen IC 50 (3,5 nM) zur Hemmung der PDE 5 in vitro. Studie 1 In der ersten Studie wurde die Nachlast des Herzens mittels operativer transverser Aortenkonstriktion um ca. 25 - 35 mmHg über vier Wochen erhöht. Vergleichbare Anstiege des systolischen Blutdrucks werden in Patienten mit ausgeprägter essenzieller arterieller Hypertonie gemessen. Nekropsie, echokardiographische, histologische und morphometrische Untersuchungen zeigten übereinstimmend die Entwicklung einer konzentrischen Herzhypertrophie ohne interstitielle Fibrose. Echokardiographische Bestimmungen der linksventrikulären Funktion zeigten einen leichten Anstieg der Ejektionsfraktion bei unveränderter fraktioneller Verkürzung der Wand des linken Ventrikels. Proteinchemische Analysen an linksventrikulären Gewebeproben zeigen die Aktivierung von Signalwegen der Herzypertrophie, insbesondere der Mitogen-Aktivierten Protein Kinase ERK 1 / 2. Zusammengenommen belegen diese morphologischen, funktionellen und biochemischen Analysen, dass durch die moderate operative Aortenstenose die Entwicklung einer ausgeprägten, aber funktionell gut kompensierten Linksherzhypertrophie induziert wurde. Die Entwicklung dieser Herzhypertrophie wurde durch Sildenafil nicht verhindert. Im Gegenteil, es zeigte sich unter der Gabe des Pharmakons sogar eine leichte Tendenz zur funktionellen Verschlechterung des linken Ventrikels, mit leicht reduzierter Ejektionsfraktion und gesteigertem Lungenfeuchtgewicht. Auch die kardiale Aktivierung des Hypertrophiesignalweges MAPK / ERK wurde durch Sildenafil nicht beeinflusst. Studie 2 In der zweiten Studie wurden die Effekte von Sildenafil an einem monogenetischen Mausmodell mit globaler Deletion der Guanylylzyklase-A (GC-A -/-), dem Rezeptor für Atriales natriuretisches Peptid, getestet. Wie zuvor in publizierten Studien gezeigt wurde, haben GC-A -/- Mäuse eine chronische arterielle Hypertonie, mit Anstiegen des systolischen Blutdrucks um 20 - 25 mmHg. Nekropsie, Echokardiographie, Histologie und Morphometrie ergaben übereinstimmend, dass diese arterielle Hypertonie von einer ausgeprägten globalen, funktionell gut kompensierten Herzhypertrophie mit leichter interstitieller Fibrose begleitet wurde. Unter der neunwöchigen Behandlung mit Sildenafil kam es zu einem signifikanten aber inkomplettem Rückgang der systemischen arteriellen Hypertonie (um ca 8 - 10 mmHg). Trotz dieser hypotensiven Effekte wurden die Rechts- und Linksherzhypertrophie und die kardiale Fibrose der GC-A -/- Tiere durch Sildenafil nicht beeinflusst. Dagegen zeigte sich auch hier mittels Echokardiographie eine leichte Verschlechterung der linksventrikulären Funktion unter Sildenafil, mit Abnahmen der Ejektionsfraktion und der fraktionellen Verkürzung des linken Ventrikels sowie einer Zunahme des endsystolischen Kammerdurchmessers. Zusammenfassend wurden die in der Literatur beschriebenen protektiven, kardialen antihypertrophen Effekte von Sildenafil in der vorliegenden experimentellen Dissertation nicht bestätigt. N2 - Synthesis of cGMP in cardiomyocytes is stimulated by natriuretic peptides via GC-A signalling as well as nitric oxide (NO) via soluble guanylyl cyclase (sGC). Different studies in vitro / in vivo have demonstrated that cGMP can inhibit myocardial hypertrophic responses. In particular, genetic ablation of the ANP/GC-A or NO/sGC systems in mice led to exacerbated cardiac hypertrophy in response to pressure overload. Conversely, inhibition of cGMP catabolism with the PDE5 inhibitor sildenafil prevented and even reversed pathological cardiac hypertrophy after aortic banding [1]. The present ongoing study was originally designed to elucidate whether the antihypertrophic effects of PDE5 inhibition are linked to the formation of cGMP by either the NP/GC-A or the NO/sGC system. We subjected male C57Bl/6 mice (8 weeks of age, Charles River) to constriction of the transverse aorta (TAC) for 4 weeks. They were concurrently treated with the PDE5 inhibitor sildenafil (100 mg/kg/d) or vehicle mixed in solid food (n=7 per group).Furthermore, mice with genetic ablation of the GC-A receptor were treated with Sildenafil or Placebo. The studies demonstrate that Sildenafil does not exhibit direct antihypertrophic effects, but does exhibit indirect effects on left ventricular myocardium. Furthermore, Sildenafil is supposed to amplify the cGMP that is generated via ANP/GC-A system. KW - Linksherzhypertrophie KW - Sildenafil KW - Guanylatcyclase KW - Blutdruck KW - Cyclo-GMP KW - Transverse Aortenkonstriktion KW - Sildenafil KW - Left Ventricular Hypertrophy KW - Guanylatzklase-A KW - cGMP Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-54515 ER - TY - THES A1 - Börner, Juliane T1 - Charakterisierung der Phosphorylierungsstellen der Guanylyl Cyklase A, dem Rezeptor für das atriale natriuretische Peptid, mittels Massenspektrometrie T1 - Characterization of the phosphorylation sites of Guanylyl cyclase A, the receptor for atrial natriuretic peptide, by mass spectrometry application N2 - Das ANP/GC-A-System spielt durch die Produktion des sekundären Botenstoffs cGMP eine wichtige Rolle bei der Regulation des Blutdruckes und des Blutvolumens. Bei Patienten mit Herzhypertrophie oder Herzinsuffizienz sind die ANP-Plasmakonzentrationen erhöht, aber die GC-A-vermittelten Effekte stark reduziert, was auf einen Defekt des Signalsystems hinweist. Studien an metabolisch markierten GC-A-überexprimierenden HEK 293-Zellen zeigten, dass der GC-A-Rezeptor im basalen Zustand stark phosphoryliert und die homologe bzw. heterologe Desensitisierung wahrscheinlich mit einer Dephosphorylierung verbunden ist. Die Desensitisierung stellt einen Mechanismus dar, der in vivo zu einem Funktionsverlust des Rezeptors beitragen könnte. Im Rahmen dieser Arbeit konnten mittels Massenspektrometrie sieben Phosphorylierungsstellen in der Kinasehomologen Domäne aus FLAG-GC-A exprimierenden HEK 293-Zellen detektiert werden: Ser487, Ser497, Thr500, Ser502, Ser506, Ser510 und Thr513. Die massenspektrometrische relative Quantifizierung basierend auf der Multiple-Reaction-Monitoring (MRM)-Methode zeigte bei ANP-induzierter, homologer Desensitisierung eine Dephosphorylierung der Phosphorylierungsstellen Ser497, Thr500, Ser502, Ser506, Ser510 und Thr513, was mit bereits publizierten Daten übereinstimmt, und einen starken Anstieg der Phosphorylierung an Ser487. Nach Inkubation mit Angiotensin II, welches eine heterologe Desensitisierung hervorruft, wurde eine Reduzierung aller Phosphorylierungen verzeichnet, die zudem stärker ausgeprägt war als bei der ANP-abhängigen Desensitisierung. Die Funktion der neu identifizierten Phosphorylierung an Ser487 wurde mittels Mutagenese analysiert. Die Substitution des Serins durch Alanin, welche den unphosphorylierten Zustand nachstellt, resultierte in einer Rezeptoraktivität und desensitisierung vergleichbar zum GC-A Wildtyp-Rezeptor. Wurde hingegen Serin gegen Glutamat getauscht, um den phosphorylierten Zustand zu imitieren, konnte der Rezeptor weder aktiviert noch desensitisiert werden. Diese Ergebnisse bestätigen vorherige Studien, dass die GC-A-Rezeptorantwort auf ANP durch die Phosphorylierungen reguliert wird. Allerdings scheint bei der homologen Desensitisierung die Phosphorylierung an der Position Ser487 eine Rolle zu spielen, da sie die Aktivität des Rezeptors inhibiert. Die Identifizierung und Charakterisierung dieser Phosphorylierungsstelle trägt zum Verständnis des Mechanismus der homologen Desensitierung bei. Zusätzlich konnten einige der beschriebenen Phosphorylierungen in Zellsystemen detektiert werden, die die GC-A endogen exprimieren. Dadurch sind unter physiologischen Bedingungen Analysen der Mechanismen möglich, die bei der Aktivierung und Deaktivierung der GC-A involviert sind und somit wichtige pathophysiologische Konsequenzen haben können. N2 - Atrial natriuretic peptide (ANP), via its guanylyl cyclase A (GC-A) receptor and intracellular guanosine 3’,5’-cyclic monophosphate production, is critically involved in the regulation of blood pressure. In patients with chronic heart failure, the plasma levels of ANP are increased, but the cardiovascular actions are severely blunted, indicating a receptor or postreceptor defect. Studies on metabolically labelled GC-A-overexpressing cells have indicated that GC-A is extensively phosphorylated, and that ANP induced homologous desensitisation of GC-A correlates with receptor dephosphorylation, a mechanism which might contribute to a loss of function in vivo. In this study, tandem MS analysis of the GC-A receptor, expressed in the human embryonic kidney cell line HEK 293, revealed that the intracellular domain of the receptor is phosphorylated at multiple residues: Ser487, Ser497, Thr500, Ser502, Ser506, Ser510 and Thr513. MS quantification based on multiple reaction monitoring demonstrated that ANP-provoked homologous desensitisation was accompanied by a complex pattern of receptor phosphorylation and dephosphorylation. The population of completely phosphorylated GC-A was diminished which is in agreement with published data. However, the phosphorylation of GC-A at Ser487 was selectively enhanced after exposure to ANP. In contrast, the Angiotensin II-provoked heterologous desensitisation resulted in a complete reduction of phosphorylation, which was even more intensive than after ANP-dependend desensitisation. The functional relevance of the newly identified phosphorylation site at serin 487 was analysed by site-directed mutagenesis. The substitution of Ser487 by alanine which mimics dephosphorylation resulted in a receptor which could be activated and desensitised like the GC-A wild-type receptor. However, the substitution by glutamate (which mimics phosphorylation) blunted the activation of the GC-A receptor by ANP, but prevented further desensitisation. These data corroborate previous studies suggesting that the responsiveness of GC-A to ANP is regulated by phosphorylation. However, in addition to the dephosphorylation of the previously postulated sites (Ser497, Thr500, Ser502, Ser506, Ser510), homologous desensitisation seems to involve the phosphorylation of GC-A at Ser487. Identification and characterisation of this phosphorylation site therefore contribute to the understanding of homologous desensitisation. Additionally, some of the detected phosphorylated residues were detected in cells endogenously expressing the GC-A receptor. Therefore future analyses of the mechanisms which are involved in the activation and desensitisation under pathophysiological conditions might be possible. KW - Guanylatcyclase KW - Phosphorylierung KW - Atriales natriuretisches Hormon KW - Massenspektrometrie KW - Guanylyl cyclase A KW - phosphorylation sites KW - atrial natriuretic peptide KW - mass spectrometry Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51914 ER - TY - THES A1 - Motschenbacher, Stephanie T1 - Einfluss einer Kombinationstherapie aus dem ACE-Hemmer Ramipril und dem Aktivator der löslichen Guanylatzyklase Ataciguat auf das kardiale Remodeling nach experimentellem Myokardinfarkt T1 - Influence of the ACE-inhibitor Ramipril and the soluble guanylyl cyclase activator Ataciguat on cardiac remodeling as a combination therapy after experimental myocardial infarction N2 - Die Aktivierung der löslichen Guanylatzyklase (sGC) durch Stickstoffmonoxid (NO) ist ein zentraler Mechanismus im NO/sGC/cGMP-Signalweg. Beim Syndrom der chronischen Herzinsuffizienz ist die Signalübertragung durch NO jedoch gestört. Daher untersuchten wir die Effekte des NO-unabhängigen sGC-Aktivators Ataciguat-Natrium (vormals HMR1766) auf Hämodynamik und linksventrikuläres Remodeling in der Postinfarktphase bei Ratten, alleine und in Kombination mit dem ACE-Hemmer Ramipril. 10 Tage nach experimentellem Myokardinfarkt wurden die Tiere für 9 Wochen über eine Sonde entweder mit Placebo, Ataciguat (10 mg/kg, zweimal täglich), Ramipril (1 mg/kg/Tag) oder einer Kombination aus beidem gefüttert. Die Infarktgröße war in allen Gruppen vergleichbar. Die Monotherapie mit Ataciguat bzw. Ramipril verbesserte die linksventrikuläre Funktion und führte zu einem geringeren Anstieg des linksventrikulären Füllungsdruckes (LVEDP) und –volumens (LVEDV) im Vergleich zu Placebo. Die Kombinationstherapie war den Monotherapien überlegen. Weiterhin konnten sowohl die Ventrikelkontraktilität (LV dP/dtmax/IP), als auch -relaxationsfähigkeit (LV dP/dtmin) verbessert werden und die Lungenflüssigkeit sowie die rechtsventrikuläre Hypertrophie signifikant durch die Monotherapien, bzw. noch weiter durch die Kombination gesenkt werden. Die in der Placebo-Gruppe erhöhten Werte für Myozytenquerschnitt und interstitielle Fibrose waren in der Ramipril- und Ataciguat-Gruppe signifikant und in der Kombination noch weiter vermindert. Zusätzlich konnte auch der Superoxidanionenspiegel im kardialen Gewebe am besten durch die Kombinationstherapie gesenkt werden. Dabei zeigte sich eine Beeinflussung der NADPH-Oxidase-Untereinheit gp91phox und des mitochondrialen Enzyms UCP3. Eine Langzeitbehandlung mit Ataciguat verbesserte also die linksventrikuläre Dysfunktion und das kardiale Remodeling bei Ratten nach Myokardinfarkt in vergleichbarem Ausmaß wie die Therapie mit Ramipril. Die Kombination aus Ataciguat und ACE-Hemmer war jedoch wesentlich effektiver. Folglich stellt die sGC-Aktivierung einen vielversprechenden Therapieansatz zur Prävention von kardialem Remodeling und Herzinsuffizienz nach Herzinfarkt dar. N2 - Impairment of nitric oxide (NO) signaling contributes to progression of heart failure. Activation of soluble guanylate cyclase (sGC) by NO is the key event in NO/sGC/cyclicGMP signaling. In this work, the effects of the NO independent sGC activator Ataciguat alone and in combination with the angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibitor ramipril, on hemodynamics and cardiac remodeling in rats after extensive myocardial infarction (MI) were investigated. KW - Herzinfarkt KW - Ratte KW - Oxidativer Stress KW - ACE-Hemmer KW - Guanylatcyclase KW - Cyclo-GMP KW - Ataciguat KW - Ramipril KW - Remodeling KW - Myokardinfarkt KW - ROS KW - Superoxidanionen KW - gp91phox KW - NOX KW - eNOS KW - cardiac remodeling KW - myocardial infarction KW - sGC KW - oxidative stress KW - Ataciguat Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-74288 ER - TY - THES A1 - Klaiber, Michael T1 - Bedeutung der cGMP-abhängigen Protein Kinase I für die kardialen Effekte des atrialen natriuretischen Peptids T1 - The role of the cGMP-dependent protein kinase I on cardiac effects of the atrial natriuretic peptide N2 - In diesem Projektteil charakterisierten wir mittels vergleichenden Analysen an Mäusen mit konditioneller, herzspezifischer Deletion der GC-A (CM GC-A KO; (Holtwick et al., 2003; Kilic et al., 2005 und 2007)) und Kontrolltieren die zellulären Mechanismen, welche bei Dysfunktion des ANP/GC-A-Systems die Entwicklung von Herzhypertrophie begünstigen. Wir untersuchten, ob/wie ANP die kardialen Effekte von -adrenerger versus Ang II/AT1 (Gs versus Gq-mediierter) Stimulation beeinflusst. Zunächst kombinierten wir an isolierten adulten murinen Kardiomyozyten elektrophysiologische Messungen der L-Typ Ca2+ Ströme (LTCS, mittels voltage-clamp Messungen in Kooperation mit Herrn Dr. M. Kruse und Herrn Prof. O. Pongs am Zentrum für Molekulare Neurobiologie, Universität Hamburg), fluorometrische Messungen der intrazellulären Calcium-Transienten (mittels Indo-1 AM) und Messungen der Kontraktilität (Zellverkürzung, mittels edge detection). Diese ex vivo Untersuchungen zeigten, dass Isoproterenol (ISO) und Ang II die LTCS, [Ca2+]i und Kontraktilität isolierter adulter Myozyten stimulieren. Interessanterweise hemmt ANP/GC-A die Effekte von Ang II, nicht aber die Effekte von ISO. Um der Bedeutung dieser Interaktion zwischen ANP und Ang II für die Entwicklung einer pathologischen Herzhypertrophie ... N2 - The cardiac hormone atrial natriuretic peptide (ANP) is critically involved in the maintenance of arterial blood pressure and blood volume homeostasis. In addition to this endocrine actions, ANP exerts local, cardiac effects which counteract pathological cardiac hypertrophy and interstitial fibrosis. These diverse cellular actions of ANP are mediatied by the cGMP forming guanylyl cyclase (GC) receptor, GC-A. In cardiomyocytes, ANP/GC-A/cGMP signalling prevents pathological [Ca2+]i increases and thereby counteracts pathological hypertrophy. However the downstream signalling pathways mediating this effect are unclear. The present thesis characterized the third and downstream intracellular messengers mediating the cardiac antihypertrophic effects of ANP, with a special focus on the role of cGMP-dependent protein kinase I (cGKI). In addition, we investigated whether and how desensitization of the GC-A receptor alters the cardiac effects of ANP. ... KW - Atriales natriuretisches Hormon KW - Guanylatcyclase KW - ANP KW - GC-A KW - PKG I KW - ANP KW - GC-A KW - PKG I Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69990 ER - TY - THES A1 - Börner, Sebastian T1 - Die endothelialen Effekte des atrialen natriuretischen Peptids (ANP) sind an der akuten Regulation des arteriellen Blutdrucks und des Blutvolumens beteiligt T1 - The endothelial effects of the atrial natriuretic peptide (ANP) are involved in the acute regulation of blood pressure and blood volume N2 - Mit dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass ANP über die Aktivierung der endothelialen Guanylyl Cyklase A (GC-A) akut die Permeabilität für Albumin an postkapillären Venolen stimuliert. Durch diesen Mechanismus ist ANP neben der chronischen auch an der akuten Reduktion des Plasmavolumens und des systolischen arteriellen Blutdrucks beteiligt. Aufgrund der wichtigen extrarenalen endothelialen Effekte stellt ANP das einzige hypovolämische Hormon im Organismus dar und ist somit ein bedeutender physiologischer Regulator der transvaskulären Volumenhomöostase. Jedoch sind diese Effekte deutlich von denen der vasoaktiven Substanzen, wie z. B. Histamin oder Thrombin und anderer diuretisch wirkender Substanzen, wie z. B. Schleifendiuretika, abzugrenzen. Vermutlich wird der permeabilitätssteigernde Effekt von ANP durch die beobachtete gesteigerte PKG- und PKA-abhängige Phosphorylierung von VASP vermittelt, wodurch möglicherweise die parazelluläre Permeabilität selektiv für Albumin gesteigert wird. Den gegenregulatorischen Mechanismus zur endothelialen GC-A stellt der NPR-C dar. Durch diesen erfolgt eine verminderte PKA- und PKG-abhängige Phosphorylierung von VASP, was durch die ANP-Infusion an EC GC-A KO Mäusen beobachtet wurde und zu einer Reduktion der physiologischen Permeabilität für Albumin an den postkapillären Venolen führen könnte. Somit wird wahrscheinlich durch diesen Mechanismus das Plasmavolumen, aber nicht der systolische arterielle Blutdruck in vivo gesteigert und eine übersteigerte Reaktion der GC-A verhindert. Aufgrund der enormen Bedeutung des ANP/GC-A Systems für die Modulation der endothelialen Permeabilität und die akuten sowie chronischen Regulation des Plasmavolumens und arteriellen Blutdrucks besitzt es bei Dysfunktion eine bedeutende klinische Relevanz. Denn durch eine verminderte Sekretion von ANP oder der Dysfunktion des endothelialen GC-A-Rezeptors, durch verschiedene Single Nucleotid Polymorphismen (SNPs) oder Desensitisierung, kann dieses System an der Entstehung der essentiellen Hypertonie oder der Hypervolämie bzw. Hypernatriämie bei herzinsuffizienten Patienten beteiligt sein. N2 - Atrial natriuretic peptide (ANP) regulates arterial blood pressure and volume. Its guanylyl cyclase-A (GC-A) receptor is expressed in vascular endothelium and mediates increases in cGMP, but the functional relevance is controversial. Notably, mice with endothelial-restricted GC-A deletion [EC GC-A knockout (KO) mice] exhibit significant chronic hypervolemic hypertension. The present study aimed to characterize the endothelial effects of ANP and their relevance for the acute regulation of intravascular fluid volume. We studied the effect of ANP on microvascular permeability to fluorescein isothiocyanate-labeled albumin (BSA) using intravital microscopy on mouse dorsal skinfold chambers. Local superfusion of ANP (100 nM) increased microvascular fluorescein isothiocyanate-BSA extravasation in control but notECGC-AKO mice. Intravenous infusion of synthetic ANP (500 ng/kg min) caused immediate increases in hematocrit in control mice, indicating intravascular volume contraction. In EC GC-A KO mice, the hematocrit responses were not only abolished but even reversed. Furthermore, acute vascular volume expansion, which caused release of endogenous cardiac ANP, did not affect resting central venous pressure of control mice but rapidly and significantly increased central venous pressure of EC GC-A KO mice. In cultured lung endothelial cells, ANP provoked cGMP-dependent protein kinase I-mediated phosphorylation of vasodilator-stimulated phosphoprotein. We conclude that ANP, via GC-A, enhances microvascular endothelial macromolecule permeability in vivo. This effect might be mediated by cGMP-dependent protein kinase I-dependent phosphorylation of vasodilator-stimulated phosphoprotein. Modulation of transcapillary protein and fluid transport may represent one of the most important hypovolemic actions of ANP. (Endocrinology 149: 4193–4199, 2008) KW - Atriales natriuretisches Hormon KW - Cyclo-GMP KW - Guanylatcyclase KW - Blutdruck KW - Volumenregulation KW - ANP KW - cGMP KW - GC-A KW - NPR-A KW - NPR-C KW - ANP KW - cGMP KW - GC-A KW - NPR-A KW - NPR-C Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85351 ER - TY - THES A1 - Werner, Lennart T1 - Einfluss der pharmakologischen Langzeittherapie mit dem sGC-Aktivator Ataciguat auf die Endotheliale Dysfunktion und Thrombozytenaktivierung bei Herzinsuffizienz T1 - Influence of pharmacological treatment with the sGC-activator Ataciguat on endothelial dysfunction and platelet activation in heart failure N2 - Die vorliegende Studie befasst sich mit der medikamentösen Langzeittherapie der Endotheldysfunktion im Rahmen der klinisch manifesten Herzinsuffizienz nach Myokardinfarkt mit dem sGC-Aktivator Ataciguat. Im Rahmen der chronischen Herzinsuffizienz nach abgelaufenem Myokardinfarkt kommt es als Folge der eingeschränkten linksventrikulären Funktion und der verminderten Schubspannung am Gefäßendothel zur Endotheldysfunktion. Die Vasodynamik gerät aus dem Gleichgewicht und führt zur erniedrigten Bioverfügbarkeit von NO, zur verminderten Expression des NO-synthetisierenden Enzyms (eNOS) und zur Entkopplung der eNOS. Dieses als „eNOS-uncoupling“ bekannte Phänomen führt zur vermehrten Bildung von reaktiven Sauerstoffradikalen, welche den oxidativen Stress auf das beschädigte Endothel erhöhen. Die reaktiven Sauerstoffradikale oxidieren zusätzlich in den glatten Muskelzellen die lösliche Guanylatzyklase und reduzieren somit die Vasodilatation. Verschiedene neurohumerale Systeme beeinflussen das Gleichgewicht zwischen vasodilatativen und vasokonstriktiven Substanzen am Endothel und somit die Endothelfunktion. Diese neurohumeralen Systeme spielen wichtige Rollen in der aktuellen medikamentösen Therapie der chronischen Herzinsuffizienz und bieten zahlreiche verschiedene Therapieoptionen. Ein relativ neuartiger Therapieansatz beinhaltet die medikamentöse Therapie mit sogenannten sGC-Aktivatoren, einer Wirkstoffklasse, die durch direkte Interaktion mit der löslichen Guanylatzyklase sowohl die Bildung von Sauerstoffradikalen verringert, als auch die NO-Sensibilität am Gefäßendothel verbessert. Hierzu gehört auch das in dieser Studie untersuchte Ataciguat. Neben den direkten, „endothel-abhängigen“ Effekten am Gefäßendothel beeinflußt Ataciguat über die sogenannten „endothel-unabhängigen Effekte“ die Funktion der Blutplättchen, welche im Rahmen der Herzinsuffizienz durch die verminderte Bioverfügbarkeit von NO eine vermehrte Aktivierung und Adhäsion erfahren. Die Folge sind erhöhte Risiken für thrombembolische Ereignisse und die Formation artherosklerotischer Läsionen. Ataciguat vermindert diese Risiken. Mit den Ergebnissen dieser Studie konnten sowohl die endothel-abhängigen als auch die endothel-unabhängigen Effekte der medikamentösen Langzeittherapie mit Ataciguat im experimentellen Modell der chronischen Herzinsuffizienz nach Myokardinfarkt bestätigt werden. N2 - Chronic pharmacologic sGC-activation with Ataciguat in an experimental setting of congestive heart failure (CHF) after myocardial infarction (MI) improves vascular function and reduces platelet activation. Direct sGC-activation shows both endothelium-dependend and endothelium-independend effects by normalising endothelial function, improving NO-sensitivity and lowering platelet activation KW - Endothel KW - Herzinsuffizienz KW - Herzinfarkt KW - Guanylatcyclase KW - Endotheldysfunktion KW - Ataciguat KW - eNOS Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-104176 ER -