TY - THES A1 - Braasch, Ingo T1 - Evolution by genome duplication: insights from vertebrate neural crest signaling and pigmentation pathways in teleost fishes T1 - Evolution durch Genomverdoppelung: Erkenntnisse aus Analysen der Signalwege in der Neuralleiste der Vertebraten und in den Pigmentzellen im Fisch N2 - Gene and genome duplications are major mechanisms of eukaryotic genome evolution. Three rounds of genome duplication have occurred in the vertebrate lineage, two rounds (1R, 2R) during early vertebrate evolution and a third round, the fish-specific genome duplication (FSGD), in ray-finned fishes at the base of the teleost lineage. Whole genome duplications (WGDs) are considered to facilitate speciation processes and to provide the genetic raw material for major evolutionary transitions and increases in morphological complexity. In the present study, I have used comparative genomic approaches combining molecular phylogenetic reconstructions, synteny analyses as well as gene function studies (expression analyses and knockdown experiments) to investigate the evolutionary consequences and significance of the three vertebrate WGDs. First, the evolutionary history of the endothelin signaling system consisting of endothelin ligands and receptors was reconstructed. The endothelin system is a key component for the development of a major vertebrate innovation, the neural crest. This analysis shows that the endothelin system emerged in an ancestor of the vertebrate lineage and that its members in extant vertebrate genomes are derived from the vertebrate WGDs. Each round of WGD was followed by co-evolution of the expanding endothelin ligand and receptor repertoires. This supports the importance of genome duplications for the origin and diversification of the neural crest, but also underlines a major role for the co-option of new genes into the neural crest regulatory network. Next, I have studied the impact of the FSGD on the evolution of teleost pigment cell development and differentiation. The investigation of 128 genes showed that pigmentation genes have been preferentially retained in duplicate after the FSGD so that extant teleost genomes contain around 30% more putative pigmentation genes than tetrapods. Large parts of pigment cell regulatory pathways are present in duplicate being potentially involved in teleost pigmentary innovations. There are also important differences in the retention of duplicated pigmentation genes among divergent teleost lineages. Functional studies of pigment synthesis enzymes in zebrafish and medaka, particularly of the tyrosinase family, revealed lineage-specific functional evolution of duplicated pigmentation genes in teleosts, but also pointed to anciently conserved gene functions in vertebrates. These results suggest that the FSGD has facilitated the evolution of the teleost pigmentary system, which is the most complex and diverse among vertebrates. In conclusion, the present study supports a major role of WGDs for phenotypic evolution and biodiversity in vertebrates, particularly in fish. N2 - Gen- und Genomverdopplungen sind wichtige Mechanismen der Genomevolution in Eukaryonten. Im Verlauf der Evolution der Wirbeltiere gab es drei wichtige Genomduplikationen. Zwei Genomverdopplungen (1R, 2R) fanden während der sehr frühen Vertebratenevolution statt. In der Linie der Fische kam es an der Basis der Teleostier zu einer weiteren, fischspezifischen Genomduplikation (FSGD). Man nimmt an, dass Genomduplizierungen Artbildungsprozesse begünstigen und dass sie zusätzliches genetisches Material für wichtige evolutionäre Übergänge und für die Steigerung morphologischer Komplexität erzeugen. In der vorliegenden Arbeit wurden Methoden der vergleichenden und funktionellen Genomik gewählt, um die Auswirkungen und die Bedeutung der drei Genomverdopplungen bei Vertebraten zu untersuchen. Dazu wurden molekularphylogenetische Stammbaumanalysen und Synteniedaten mit Genexpressionsstudien und Knockdown-Experimenten kombiniert. Zunächst wurde die Evolution des Endothelin-Signalsystems rekonstruiert. Dieses besteht aus Endothelin-Liganden und -Rezeptoren und hat eine Schlüsselrolle in die Entwicklung der Neuralleiste. Die Neuralleiste und die von ihr abgeleiteten Zelltypen sind wirbeltierspezifische Innovationen. Die Analyse zeigt, dass das Endothelin-System in einem gemeinsamen Vorfahren der Vertebraten entstanden ist. Die in den Genomen rezenter Vertebraten vorkommenden Komponenten des Endothelin-Systems sind durch die drei Genomverdoppelungen entstanden. Nach jeder der Duplizierungen kam es zur Ko-Evolution der Liganden- und Rezeptorenfamilien. Die Evolution des Endothelin-System unterstreicht daher die Bedeutung der Genomduplizierungen für den Ursprung und die Diversifizierung der Neuralleiste. Sie weist aber auch auf eine wichtige Rolle für die Integrierung neuer Gene in das regulatorische Netzwerk der Neuralleiste hin. Im Weiteren wurde der Einfluss der FSGD auf die Evolution der Pigmentzellentwicklung und differenzierung in Teleostiern untersucht. Die evolutionäre Analyse von 128 Genen zeigte, dass Pigmentierungsgene nach der FSGD bevorzugt in zwei Kopien erhalten geblieben sind. Daher besitzen rezente Teleostier im Vergleich zu Landwirbeltieren zusätzlich ca. 30% mehr Gene mit potentiellen Funktionen für die Pigmentierung. Große Teile der regulatorischen Signalwege in den Pigmentzellen liegen daher als zwei Kopien vor. Diese waren möglicherweise an der Evolution von Innovationen in der Körperfärbung von Teleostiern beteiligt. In der vorliegenden Arbeit wurden auch wichtige Unterschiede zwischen verschiedenen Fischgruppen im Erhalt duplizierter Pigmentierungsgene gefunden. Funktionelle Studien bei Zebrafish und bei Medaka an Enzymen der Pigmentsynthese, insbesondere der Tyrosinase-Familie, gaben Hinweise darauf, dass die funktionelle Evolution duplizierter Pigmentierungsgene in Fischen linienspezifisch verlaufen kann. Die Studien ergaben außerdem, dass bestimmte Funktionen der Pigmentsyntheseenzyme innerhalb der Vertebraten konserviert sind. Die Evolution des Pigmentierungssystems der Fische, welches das vielfältigste und komplexeste innerhalb der Wirbeltiere ist, wurde somit maßgeblich durch die FSGD beeinflusst. Zusammenfassend weisen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit darauf hin, dass die Verdopplung ganzer Genome ein wichtiger Mechanismus der phänotypische Evolution bei Vertebraten ist und damit in besonderem Maße zur ihrer Biodiversität beiträgt. KW - Molekulare Evolution KW - Fische KW - Entwicklungsbiologie KW - Evolutionsbiologie KW - Genanalyse KW - Pigmentierung KW - Melanin KW - Vertebrat KW - Neuralleiste KW - Gen-/Genomverdoppelung KW - gene/genome duplication KW - fish KW - vertebrate KW - neural crest KW - pigmentation Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-35702 ER - TY - THES A1 - Liang, Chunguang T1 - Tools for functional genomics applied to Staphylococci, Listeriae, Vaccinia virus and other organisms N2 - Genome sequence analysis A combination of genome analysis application has been established here during this project. This offers an efficient platform to interactively compare similar genome regions and reveal loci differences. The genes and operons can be rapidly analyzed and local collinear blocks (LCBs) categorized according to their function. The features of interests are parsed, recognized, and clustered into reports. Phylogenetic relationships can be readily examined such as the evolution of critical factors or a certain highly-conserved region. The resulting platform-independent software packages (GENOVA and inGeno), have been proven to be efficient and easy to handle in a number of projects. The capabilities of the software allowed the investigation of virulence factors, e.g., rsbU, strains’ biological design, and in particular pathogenicity feature storage and management. We have successfully investigated the genomes of Staphylococcus aureus strains (COL, N315, 8325, RN1HG, Newman), Listeria spp. (welshimeri, innocua and monocytogenes), E.coli strains (O157:H7 and MG1655) and Vaccinia strains (WR, Copenhagen, Lister, LIVP, GLV-1h68 and parental strains). Metabolic network analysis Our YANAsquare package offers a workbench to rapidly establish the metabolic network of such as Staphylococcous aureus bacteria in genome-scale size as well as metabolic networks of interest such as the murine phagosome lipid signalling network. YANAsquare recruits reactions from online databases using an integrated KEGG browser. This reduces the efforts in building large metabolic networks. The involved calculation routines (METATOOL-derived wrapper or native Java implementation) readily obtain all possible flux modes (EM/EP) for metabolite fluxes within the network. Advanced layout algorithms visualize the topological structure of the network. In addition, the generated structure can be dynamically modified in the graphic interface. The generated network as well as the manipulated layout can be validated and stored (XML file: scheme of SBML level-2). This format can be further parsed and analyzed by other systems biology software, such as CellDesigner. Moreover, the integrated robustness-evaluation routine is able to examine the synthesis rates affected by each single mutation throughout the whole network. We have successfully applied the method to simulate single and multiple gene knockouts, and the affected fluxes are comprehensively revealed. Recently we applied the method to proteomic data and extra-cellular metabolite data of Staphylococci, the physiological changes regarding the flux distribution are studied. Calculations at different time points, including different conditions such as hypoxia or stress, show a good fit to experimental data. Moreover, using the proteomic data (enzyme amounts) calculated from 2D-Gel-EP experiments our study provides a way to compare the fluxome and the enzyme expression. Oncolytic vaccinia virus (VACV) We investigated the genetic differences between the de novo sequence of the recombinant oncolytic GLV-1h68 and other related VACVs, including function predictions for all found genome differences. Our phylogenetic analysis indicates that GLV-1h68 is closest to Lister strains but has lost several ORFs present in its parental LIVP strain, including genes encoding CrmE and a viral Golgi anti-apoptotic protein, v-GAAP. Functions of viral genes were either strain-specific, tissue-specific or host-specific comparing viral genes in the Lister, WR and COP strains. This helps to rationally design more optimized oncolytic virus strains to benefit cancer therapy in human patients. Identified differences from the comparison in open reading frames (ORFs) include genes for host-range selection, virulence and immune modulation proteins, e.g. ankyrin-like proteins, serine proteinase inhibitor SPI-2/CrmA, tumor necrosis factor (TNF) receptor homolog CrmC, semaphorin-like and interleukin-1 receptor homolog proteins. The contribution of foreign gene expression cassettes in the therapeutic and oncolytic virus GLV-1h68 was studied, including the F14.5L, J2R and A56R loci. The contribution of F14.5L inactivation to the reduced virulence is demonstrated by comparing the virulence data of GLV-1h68 with its F14.5L-null and revertant viruses. The comparison suggests that insertion of a foreign gene expression cassette in a nonessential locus in the viral genome is a practical way to attenuate VACVs, especially if the nonessential locus itself contains a virulence gene. This reduces the virulence of the virus without compromising too much the replication competency of the virus, the key to its oncolytic activity. The reduced pathogenicity of GLV-1h68 was confirmed by our experimental collaboration partners in male mice bearing C6 rat glioma and in immunocompetent mice bearing B16-F10 murine melanoma. In conclusion, bioinformatics and experimental data show that GLV-1h68 is a promising engineered VACV variant for anticancer therapy with tumor-specific replication, reduced pathogenicity and benign tissue tropism. N2 - Genom Sequenz Analyse Im Zuge der vorliegenden Doktorarbeit wurden verschiedene Programme zur Genomanalyse kombiniert, um eine effiziente Plattform zum interaktiven Vergleich lokaler Ähnlichkeiten bzw. Unterschiede in Genomen bereitzustellen. Damit können Gene und Operons schnell untersucht und “local collinear blocks” entsprechend ihrer Funktion kategorisiert werden. Phylogenetische Beziehungen, wie beispielsweise die Evolution spezifischer Elemente oder stark konservierter Regionen können leicht überprüft werden. Die hierfür entwickelte plattformunabhängige Software (GENOVA und inGeno) hat sich in mehreren Projekten als effizient und leicht handhabbar bewährt. Die Programme erlauben die Untersuchung von Virulenzfaktoren auf Sequenz- oder Annotationsebene. Während der vorliegenden Doktorarbeit konnten so die Genome von verschiedenen Staphylococcus aureus, Listeria spp., Escherichia coli und Vaccinia Stämmen untersucht werden. Metabolische Netzwerk Analyse Unser “YANAsquare” Programmpaket bietet eine Oberfläche um schnell metabolische Netzwerke vom genomweiten Anzatz bis hinunter zum Einzelnetzwerk zu analysieren. Dafür greift YANA mit Hilfe des integrierten KEGG-Browsers auf Onlinedatenbanken zu, um die notwendigen Informationen zum metabolischen Reaktionsweg bereitzustellen und reduziert so maßgeblich den Arbeitsaufwand beim Beschreiben von Netzwerke. Die implementierten Methoden zur Berechnung (METATOOL, eigene Implementation in Java) des Netzwerkes liefern exakt alle die möglichen Elementarmoden (EM/EP) für die Metabolite zurück. Durch den Einsatz von fortgeschrittenen Layout Algorithmen wird anschliessend die Darstellung der Netzwerktopologie möglich. Außerdem kann in der grafischen Darstellung das generierte Netzwerklayout dynamisch verändert werden. Das Speichern der Daten erfolgt im XML (SBML level-2) Format und erlaubt so die Weiterverwendung in anderen systembiologischen Programmen, wie dem “CellDesigner”. Mit Hilfe einer gen-Knockout Simulations Methode kann der Einfluss von einzelnen Mutationen im gesamten Netzwerk auf die Syntheseraten untersucht werden. Wir konnten mit dieser Methode Einzel- sowie Mehrfachgenknockouts und deren Effekte auf die Elementarmoden analysieren. Die Methode wurde ebenfalls auf Proteomdaten und extrazelluläre Metabolite von Staphylokokken angewandt, um Änderungen bezüglich der Flussverteilung zu untersuchen. Die Simulationen zu verschieden Zeitpunkten und unter verschiedenen Stessbedingungen zeigen große Übereinstimmung mit experimentell erhobenen Daten. Onkolytischer Vaccinia Virus (VACV) Wir haben die genetischen Unterschiede zwischen der de novo Sequenz des rekombinanten onkolytischen Virus GLV-1h68 und anderen VACVs untersucht und gefundene Unterschiede funktionell charakterisiert. Die phylogenetische Analyse zeigt das GLV-1h68 mit dem Lister Stamm am nächsten verwandt ist. Auffällig ist dabei der Verlust von einigen open reading frames (ORFs), die noch im Eltern LIVP Stamm vorhanden sind (CrmE, v-GAAP). Beim Vergleich der Funktion viraler Gene aus Lister, WR und COP Stämmen treten stamm-, gewebe- und wirtsspezifische Gene auf. Diese Tatsache ermöglicht die Optimierung der onkolytischen Virusstämme für den Einsatz bei humanen Krebstherapien. Die beim Vergleich identifizierten Unterschiede zwischen den ORFs enthalten Gene für die Wirtsselektion, Virulenz und immunmodulierende Proteine (Ankyrin ähnliche Proteine, Serine-Proteinasen Inhibitor SPI-2/CrmA, Tumor Nekrose Faktor (TNF) Rezeptorhomolog CrmC, semaphorinähnliche und Interleukin-1 rezeptorhomologe Proteine). An den Loki F14.5L, J2R und A56R des GLV-1h68 Virus wurden die Vorteile der eingesetzten fremden Genexpressionskassetten untersucht. So zeigt GLV-1h68 mit F14.5L-Inaktivierung gegenüber der F14.5L-Revertanten Viren eine reduzierte Virulenz. Das erlaubt die Schlussfolgerung, dass die Insertion von fremden Genexpressionskassetten in nicht-essentielle Loki zur Verminderung der Virulenz von VACVs führt, besonders, wenn der nicht-essentielle Lokus selbst ein Virulenzgen enthält. Das Replikationsvermögen, welches ausschlaggebend für die onkolytische Aktivität des Virus ist, wird trotz der verminderten Virulenz nicht eingeschränkt. Die reduzierte Pathogenität des GLV-1h68 Virus wurde durch experimentelle Daten unserer Kollaborationspartner in männlichen Mäusen mit Ratten C6 Gliom und in immunokompetenten Mäusen mit B16-F10 Mausmelanom nachgewiesen. Zusammenfassend zeigen experimentelle und bioinformatisch gewonnene Daten, dass GLV-1h68 eine vielversprechende VACV Variante für die Krebstherapie mit tumorspezifischer Replikation, verringerter Pathogenität und hoher Gewebsspezifität ist. KW - Genanalyse KW - Bioinformatik KW - Systembiologie KW - bacterial KW - virulence KW - systems biologie KW - genomic KW - algorithm KW - metabolic KW - network KW - pathway KW - flux KW - Bacterial KW - genomics KW - algorithm KW - tool KW - metabolic Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48051 ER -