TY  - THES
A1  - Frischholz, Sebastian
T1  - Resveratrol Counteracts IL-1β-mediated Impairment of Extracellular Matrix Deposition in 3D Articular Chondrocyte Constructs
T1  - Resveratrol wirkt der IL-1β-vermittelten Beeinträchtigung von Extrazellulärmatrix-Deposition in 3D Konstrukten aus artikulären Chondrozyten entgegen
N2  - Articular cartilage is an exceptional connective tissue which by a network of fibrillar collagen and glycosaminoglycan (GAG) molecules allows both low- friction articulation and distribution of loads to the subchondral bone (Armiento et al., 2018, Ulrich-Vinther et al., 2003). Because of its very limited ability to self-repair, chondral defects following traumatic injury increase the risk for secondary osteoarthritis (OA) (Muthuri et al., 2011). Still, current OA treatments such as common nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) and joint replacement primarily address end-stage symptoms (Tonge et al., 2014). As low-grade inflammation plays a pivotal role in the pathogenesis of OA (Robinson et al., 2016), there is a strong demand for novel therapeutic concepts, such as integrating application of anti-inflammatory agents into cartilage cell- based therapies in order to effectively treat OA affected joints in early disease stages. The polyphenolic phytoalexin resveratrol (RSV), found in the skin of red grapes, berries, and peanuts, has been shown to have effective anti-inflammatory properties (Shen et al., 2012). However, its long-term effects on 3D chondrocyte constructs cultured in an inflammatory environment with regard to tissue quality have remained unexplored so far. Therefore, in this study, pellets made from expanded porcine articular chondrocytes were cultured for 14 days with either the pro-inflammatory cytokine interleukin-1β (IL-1β) (1 - 10 ng/ml) or RSV (50 μM) alone, or a co-treatment with both agents. Constructs treated with chondrocyte medium only served as control. Treatment with IL-1β at 10 ng/ml resulted in a significantly smaller pellet size and reduced DNA content. However, RSV counteracted the IL-1β-induced decrease and significantly enhanced diameter and DNA content. Also, in terms of GAG deposition, treatment with IL-1β at 10 ng/ml resulted in a tremendous depletion of absolute GAG content and GAG/DNA. Again, RSV co-treatment counteracted the inflammatory stimulus and led to a partial recovery of GAG content. Histological analysis utilizing safranin-O staining confirmed these findings. Marked expression of the cartilage-degrading enzyme matrix metalloproteinase 13 (MMP13) was detected in IL-1β-treated pellets, but none upon RSV co- treatment. Moreover, co-treatment of IL-1β-challenged constructs with RSV significantly increased absolute collagen content. However, under non- inflammatory conditions, RSV induced gene expression and protein accumulation of collagen type X, a marker for undesirable hypertrophy. Taken together, in the present thesis, RSV was demonstrated to elicit marked beneficial effects on the extracellular matrix composition of 3D cartilaginous constructs in long-term inflammatory culture in vitro, but also induced hypertrophy under non-inflammatory conditions. Based on these findings, further experiments examining multiple concentrations of RSV under various inflammatory conditions appear desirable concerning potential therapeutic applicability in OA.
N2  - Gelenkknorpel ermöglicht als spezielles Bindegewebe aus Kollagenfasern und Glykosaminoglykanen (GAG) sowohl die reibungsarme Beweglichkeit in Gelenken als auch die Lastübertragung auf angrenzende Knochen (Armiento et al., 2018, Ulrich-Vinther et al., 2003). Aufgrund der sehr begrenzten Fähigkeit zur intrinsischen Erneuerung erhöhen chondrale Defekte nach traumatischen Verletzungen das Risiko für sekundäre Arthrose (Osteoarthritis; OA) (Muthuri et al., 2011). Dennoch konzentrieren sich derzeitige Behandlungsansätze, einschließlich nichtsteroidaler Antirheumatika (NSAR) und des operativen Gelenkersatzes, hauptsächlich auf Symptome im Endstadium der Erkrankung (Tonge et al., 2014). Da eine geringgradige Entzündung eine entscheidende Rolle in der Pathogenese der Arthrose spielt (Robinson et al., 2016), besteht ein starker Bedarf an neuartigen Therapiekonzepten, wie der Kombination von anti- inflammatorischen Wirkstoffen mit knorpelzellbasierten Therapien, um von Arthrose betroffene Gelenke in frühen Krankheitsstadien wirksam zu behandeln. Das polyphenolische Phytoalexin Resveratrol (RSV), welches in der Schale roter Weintrauben, in Beeren und Erdnüssen vorkommt, besitzt starke entzündungshemmende Eigenschaften (Shen et al., 2012). Langzeiteffekte auf 3D-Knorpelkonstrukte unter inflammatorischen Bedingungen sind hinsichtlich der Gewebequalität jedoch bislang unerforscht geblieben. Daher wurden in der vorliegenden Studie Pellets aus expandierten porcinen Gelenkknorpelzellen über einen Zeitraum von 14 Tagen entweder mit dem pro-inflammatorischen Zytokin Interleukin-1β (IL-1β) (1 - 10 ng/ml) oder RSV (50 μM) allein, oder mit beiden Agenzien kombiniert behandelt. Konstrukte, welche nur serumfreies Chondrozytenmedium erhielten, dienten als Kontrolle. Die Behandlung mit IL- 1β in einer Konzentration von 10 ng/ml führte zu einem signifikant geringeren Durchmesser der Pellets sowie einem verringerten DNA-Gehalt. RSV wirkte dieser IL-1β-vermittelten Reduktion entgegen und steigerte signifikant sowohl Durchmesser als auch DNA-Gehalt der untersuchten Konstrukte. Auch in Bezug auf die Deposition von GAG-Molekülen führte die Kultur mit IL-1β (10 ng/ml) zu einer massiven Abnahme des absoluten GAG-Gehaltes und der GAG/DNA- Ratio. Abermals wirkte die gleichzeitige Behandlung mit RSV dem Entzündungsreiz deutlich entgegen und resultierte in einer partiellen Wiederherstellung des GAG-Gehaltes. Die histologische Analyse unter Verwendung von Safranin-O-Färbungen bestätigte diese Ergebnisse. Darüber hinaus manifestierte sich eine ausgeprägte Expression des knorpelabbauenden Enzyms Matrix-Metalloproteinase 13 (MMP13) in IL-1β behandelten Pellets, nicht jedoch in denen, die simultan mit RSV behandelt wurden. Außerdem resultierte die gleichzeitige Behandlung von IL-1β-stimulierten Konstrukten mit RSV in einer signifikanten Erhöhung des absoluten Kollagengehaltes. Unter nicht-inflammatorischen Bedingungen induzierte RSV die Genexpression und Proteinakkumulation von Kollagen Typ X, einem Marker für unerwünschte Hypertrophie. Zusammengefasst wurde in der vorliegenden Arbeit gezeigt, dass RSV deutliche positive Effekte auf die Extrazellulärmatrix von 3D- Knorpelkonstrukten in einer Langzeit-Entzündungskultur in vitro hervorruft, allerdings unter nicht-inflammatorischen Bedingungen Hypertrophie induziert. Basierend auf diesen Befunden erscheinen weitere Experimente zur Untersuchung unterschiedlicher RSV-Konzentrationen unter verschiedenen Entzündungsbedingungen hinsichtlich einer möglichen therapeutischen Anwendbarkeit bei OA wünschenswert.
KW  - Resveratrol
KW  - Interleukin 1-beta
KW  - Gelenkknorpel
KW  - Extrazelluläre Matrix
KW  - Osteoarthritis
KW  - IL-1β
KW  - articular chondrocytes
KW  - cartilage
KW  - cell-based therapy
KW  - extracellular matrix
KW  - inflammation
KW  - osteoarthritis
KW  - resveratrol
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-237453
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kraus, Michael
T1  - The Conversion of Bifidobacterium adolescentis Sucrose Phosphorylase into a Polyphenol Transglucosidase via Structure-based Enzyme Engineering
T1  - Umwandlung einer Sacharose Phosphorylase in eine Polyphenol Transglukosidase durch strukturbasiertes Enzyme Engineering
N2  - The initial goal was the conversion of Bifidobacterium adolescentis Sucrose Phosphorylase (BaSP) into a polyphenol glucosidase by structure based enzyme engineering. BaSP was chosen because of its ability to utilize sucrose, an economically viable and sustainable donor substrate, and transfer the glucosyl moiety to various acceptor substrates. The introduction of aromatic residues into the active site was considered a viable way to render it more suitable for aromatic acceptor compounds by reducing its polarity and potentially introducing π-π-interactions with the polyphenols. An investigation of the active site revealed Gln345 as a suitable mutagenesis target. As a proof of concept BaSP Q345F was employed in the glycosylation of (+)-catechin, (-)-epicatechin and resveratrol. The variant was selective for the aromatic acceptor substrates and the glucose disaccharide side reaction was only observed after almost quantitative conversion of the aromatic substrates. A crystal structure of BaSP Q345F in complex with glucose was obtained and it displayed an unexpected shift of an entire domain by 3.3 Å. A crystal structure of BaSP D192N-Q345F, an inactive variant in complex with resveratrol-3-α-D-glucosid, the glucosylation product of resveratrol, synthesized by BaSP Q345F was solved. It proved that the domain shift is in fact responsible for the ability of the variant to glycosylate aromatic compounds. Simultaneously a ligand free crystal structure of BaSP Q345F disproved an induced fit effect as the cause of the domain shift. The missing link, a crystal structure of BaSP Q345F in the F-conformation is obtained. This does not feature the domain shift, but is in outstanding agreement with the wildtype structure. The domain shift is therefore not static but rather a step in a dynamic process. It is further conceivable that the domain shifted conformation of BaSP Q345F resembles the open conformation of the wild type and that an adjustment of a conformational equilibrium as a result of the Q345F point mutation is observed. An investigation into the background reaction, the formation of glucose-glucose disaccharides of BaSP Q345F and three further variants that addressed the same region (L341C, D316C-L341C and D316C-N340C) revealed the formation of nigerose by BaSP Q345F.
N2  - Saccharose Phosphorylase aus Bifidobacterium adolescentis (BaSP) sollte durch strukturbasiertes Enzym-Engineering in die Lage versetzt werden Polyphenole zu glukosylieren. In die katalytische Tasche sollten aromatische Seitenketten eingeführt werden um die Polarität an jene der gewünschten Akzeptorsubstrate anzupassen und eine weitere Stabilisierung durch π-π-Wechselwirkungen zwischen Enzym und Substrat zu erlauben. BaSP Q345F war in der Lage die Zielsubstrate zu glukosylieren und behielt gleichzeitig ausreichen Aktivität bei. Die weitere Untersuchung dieses Enzyms ist in vier Studien beschrieben. Die Kristallstruktur einer inaktiven Variante, BaSP D192Q-Q345F in komplex mit dem Glukosylierungsprodukt Resveratrol-3-α-D-Glukosid wurde gelöst. Dadurch konnte gezeigt werden, dass einer Verschiebung einer Domäne für die Fähigkeit der Variante Glukose auf aromatische Substrate zu übertragen, verantwortlich ist. Die Orientierung des π-Systems von Resveratrol erlaubt weiterhin T-förmige π-π-Wechselwirkungen mit Phe156 und Phe345.Die detaillierte kinetische Untersuchung von BaSP Q345F mit acht Akzeptorsubstraten ergab eine starke Affinität der Variante zu den aromatischen Substraten (KM 0.08 bis 1.55 mM). Weitere Strukturdaten zeigen, dass die Verschiebung der Domäne Teil eines dynamischen Prozesses ist. Des weiteren ist die Q345F Variante in der Lage, den seltenen Zucker Nigerose zu synthetisisern.
KW  - enzyme engineering
KW  - sucrose phosphorylase
KW  - domain shift
KW  - resveratrol
KW  - quercetin
KW  - Phosphorylase
KW  - Glucosyltransferasen
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192477
ER  - 
TY  - THES
A1  - Glaser, Nina
T1  - Influence of natural food compounds on DNA stability
T1  - Einfluss natürlicher Nahrungsbestandteile auf die DNA Stabilität
N2  - Cancer is one of the leading causes of death all over the world. Malnutrition and toxic contaminations of food with substances such as mycotoxins have been thought to account for a high percentage of cancers. However, human diet can deliver both mutagens and components that decrease the cancer risk. Genomic damage could be reduced by food components through different mechanisms such as scavenging of reactive oxygen species. In the first part of this study we tried to investigate the effects of patulin and resveratrol on DNA stability in V79 cells. Patulin is a mycotoxin, which is frequently found in spoiled apples and other fruits. The WHO has established a safety level of 50 µg/L, which is indeed not observed by all manufacturers. The acute toxicity of patulin in high concentrations is well known, however its potential carcinogenicity is still a matter of debate. Therefore we wanted to investigate further steps in the mechanism of patulin-induced genotoxicity. Patulin caused the formation of micronuclei and nucleoplasmic bridges in a dose-dependent manner. Further analysis revealed that patulin induced both kinetochore-negative and positive micronuclei. Time course of incubation indicate a new mechanism for patulin-induced nucleoplasmic bridge formation. We hypothized a mechanism via cross-linking of DNA, which was confirmed by a modified version of comet assay. Incubations of cells with patulin led to an increased number of multinucleated cells and multipolar mitoses. Cell cytometry revealed a G2 arrest by patulin, which might explain the amplification of centrosomes and patulin-induced aneuploidy. Patulin cause a dose-dependent DNA damage in comet assay which was influenced by the cellular GSH content. However, an induction of oxidative stress was just seen with higher concentrations of patulin. Levels of cellular glutathione were increased after 24 h incubation indicating an adaptive response to patulin-induced stress. There is growing interest in polyphenols such as resveratrol which have shown many positive effects on human health. The beneficial properties are partially attributed to their ability to scavenge reactive oxygen species. Co-incubation of V79 cells with patulin and 10 µM of the antioxidant resveratrol led to a slight reduction of micronucleus frequency compared to cells which were just treated with patulin. However, in higher concentrations resveratrol themselves caused the formation of micronuclei in V79 cells. Kinetochore analysis indicated only clastogenic properties for resveratrol but no disturbance of mitosis. The antioxidant properties of resveratrol were shown in ferric reducing antioxidant power (FRAP) assay. However, in cellular system resveratrol in higher concentrations revealed also prooxidative properties, as shown in 2,7-dichlordihydrofluorescein (DCF) assay. The increased level of glutathione after resveratrol treatment might reflect an adaptive response to resveratrol-induced oxidative stress. For the second part of this thesis we investigated the effects of an anthocyanin-rich grape extract on hypertensive Ren-2 rats. Ren-2 rats are an accepted genetically modified rat model for the investigation of hypertension and increased oxidative stress. We divided 23 female Ren-2 rats into three groups. One group was fed with an anthocyanin-rich Dacapo grape extract, one group was treated with the angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitor ramipril and the third group was kept without medication during the experiment. After one week untreated group showed a clear increase in systolic and diastolic blood pressure compared to the ramipril treated rats. This was in part attenuated in the animals fed with anthocyanin-rich Dacapo grape extract. Effects on blood pressure were also reflected in an increased thirst of untreated and extract fed animals. Comet assay with cells of kidney and liver revealed a slight protective impact of Dacapo extract on DNA damage compared to the other groups. Similar results were obtained after evaluation of ɣ-H2AX-staining of kidney and heart sections. However, in the small intestine oppositional effects were seen, indicating an increased number of double strand breaks probably due to the high local concentration of polyphenols after oral ingestion. Antioxidative properties of the extract were shown in FRAP assay. However, this effect was not reflected in an increased antioxidative capacity in serum or a protective impact in the dihydroethidium (DHE) assay. The extract showed protective effects on DNA damage in comet assay and ɣ-H2AX-staining, but was not able to reduce hypertension back to the control level of ramipril treated animals. High local concentrations could also result in an increased damage of the affected tissue. Therefore, the administration of such concentrated compounds should be handled with care.
N2  - Krebs ist eine der häufigsten weltweiten Todesursachen. Fehlernährung und Kontaminationen der Nahrungsmittel mit Toxinen wie Schimmelpilzgift tragen zu einem hohen Prozentsatz zu Krebserkrankungen bei. Allerdings enthält die Nahrung neben Mutagenen auch Bestandteile, die dazu beitragen das Krebsrisiko zu senken. Schäden am Genom können durch Nahrungsbestandteile über verschiedene Mechanismen, wie zum Beispiel das Abfangen von freien Radikalen reduziert werden. Im ersten Teil dieser Studie haben wir versucht die Effekte von Patulin und Resveratrol auf die DNA Stabilität von V79 Zellen zu untersuchen. Patulin ist ein Schimmelpilztoxin, welches häufig in verfaulten Äpfeln und anderen Früchten gefunden wird. Die WHO hat einen Grenzwert von 50 µg/L festgelegt, der jedoch nicht von allen Herstellern eingehalten wird. Die akute Giftwirkung von Patulin in hohen Dosen ist gut bekannt, wohingegen seine potentielle Kanzerogenität immer noch umstritten ist. Daher wollten wir weitere Schritte der Patulin induzierten Genotoxizität aufdecken. Patulin führte zu einer dosisabhängigen Bildung von Mikrokernen und Nucleoplasmic Bridges. Weitere Untersuchungen zeigten, dass Patulin sowohl kinetochor-positive wie auch kinetochor-negative Mikrokerne verursacht. Bei der Analyse des Zeitverlaufs einer Patulininkubation deutete sich ein neuer Mechanismus für die Patulin induzierte Bildung von Nucleoplasmic Bridges an. Wir haben die Hypothese einer Quervernetzung von DNA-Strängen aufgestellt, die durch eine modifizierte Version des Comet Assays bestätigt wurde. Die Inkubation mit Patulin führte zudem zu einer erhöhten Anzahl von vielkernigen Zellen und multipolaren Mitosen. Mittels Durchflusszytometrie konnten wir einen durch Patulin verursachten G2 Arrest nachweisen, der die Amplifikation von Centrosomen und die Patulin induzierte Aneuploidie erklären könnte. Patulin verursachte einen dosisabhängigen Schaden im Comet Assay, der durch den zellulären Glutathiongehalt beeinflusst ist. Eine Auslösung von oxidativem Stress wurde dagegen erst bei höheren Konzentrationen an Patulin beobachtet. Der zelluläre Gluathiongehalt war nach 24 h Inkubationszeit erhöht, was auf eine adaptive Antwort auf den durch Patulin verursachten zellulären Stress hindeutet. Polyphenole wie Resveratrol gewinnen zunehmend an Bedeutung, da zahlreiche positive Effekte auf die menschliche Gesundheit bewiesen wurden. Diese vorteilhaften Eigenschaften werden zum Teil ihrer Eigenschaft als Radikalfänger zugeschrieben. Die Co-Inkubation von V79 Zellen mit Patulin und Resveratrol führte zu einer leichten Reduktion der Mikrokernfrequenz im Vergleich zu Zellen, die nur mit Patulin inkubiert wurden. Allerdings löste Resveratrol in höheren Konzentrationen selbst die Bildung von Mikrokernen aus. Die Kinetochor-Analyse zeigte für Resveratrol clastogene Eigenschaften aber keine störende Effekte auf den Ablauf der Mitose. Die antioxidativen Eigenschaften von Resveratrol wurden im FRAP (ferric reducing antioxidant power) -Assay nachgewiesen. Im Gegensatz dazu wurden im zellulären System mittels DCF (2,7-Dichlordihydro-fluorescein) -Assay in höheren Konzentrationen auch prooxidative Eigenschaften festgestellt. Der erhöhte zelluläre Glutathionspiegel nach Resveratrol-Behandlung könnte dabei auf eine adaptive Anwort auf den durch Resveratrol ausgelösten oxidativen Stress hindeuten Im zweiten Teil dieser Doktorabeit haben wir die Effekte eines anthocyanreichen Traubenextrakts auf hypertensive Ren-2 Ratten untersucht. Ren-2 Ratten sind ein anerkanntes genetisch modifiziertes Rattenmodell zur Untersuchung von Bluthochdruck und erhöhtem oxidativem Stress. Wir haben 23 weibliche Ren-2 Ratten in 3 Gruppen geteilt. Eine Gruppe wurde mit einem anthocyan-reichen Dacapo Traubenextrakt gefüttert, eine Gruppe wurde mit dem ACE (angiotensin converting enzyme) Inhibitor Ramipril behandelt und eine dritte Gruppe wurde während dem Experiment nicht medikamentös behandelt. Nach einer Woche zeigte die nicht therapierte Gruppe einen deutlichen Anstieg des systolischen und diastolischen Blutdrucks. Dieser Anstieg war bei der mit anthocyanreichem Dacapo Traubenextrakt gefütterten Gruppe abgeschwächt. Die Effekte auf den Blutdruck spiegelten sich auch in einer erhöhten Trinkmenge der unbehandelten und mit Extrakt behandelten Tiere wider. Ein Comet Assay mit Nieren- und Leberzellen zeigte einen schwachen schützenden Einfluß des Dacapoextrakts auf den DNA Schaden im Vergleich zu den anderen Behandlungsgruppen. Ähnliche Ergebnisse wurden auch bei der Auswertung der ɣ-H2AX Färbung in Nieren- und Herzschnitten erzielt. Im Dünndarm wurden dagegen gegensätzliche Effekte beobachtet, die auf eine erhöhte Doppelstrangfrequenz durch die hohe lokale Konzentration an Polyphenolen nach oraler Aufnahme hindeuten. Die antioxidative Eigenschaften des Extrakts wurden im FRAP_Assay nachgewiesen. Diese Effekte spiegelten sich jedoch nicht in einer erhöhten antioxidativen Kapazität des Serums oder einem schützenden Effekt im DHE-Assay wider. Der Extrakt zeigte schützende Eigenschaften im Comet Assay und in der ɣ-H2AX-Färbung, war aber nicht in der Lage den Bluthochdruck auf das Kontrollniveau der Ramipril-behandelten Tiere herabzusenken. Hohe lokale Konzentrationen können auch zu einem erhöhten Schaden des betroffenen Gewebes führen. Daher sollte die Anwendung solcher hochkonzentrierter Präparate mit Vorsicht bedacht werden.
KW  - Patulin
KW  - Anthocyane
KW  - Resveratrol
KW  - Oxidativer Stress
KW  - Mutagenität
KW  - Genotoxizität
KW  - Patulin
KW  - anthocyanins
KW  - resveratrol
KW  - genotoxicity
KW  - oxidative stress
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72872
ER  -