TY - THES A1 - Looser, Jens T1 - Funktionelle Analyse der Photoaktivierten Adenylatzyklase (PAC) aus Euglena gracilis T1 - Functional analysis of Euglena gracilis photoactivated adenylyl cyclase (PAC) N2 - Die Photoaktivierte Adenylatzyklase PAC ist in E. gracilis an der Phototaxis beteiligt und besteht aus den zwei unterschiedlich großen Proteinen PACalpha und PACbeta. Beide besitzen jeweils zwei FAD bindende (BLUF) Domänen F1 und F2 sowie zwei Zyklasedomänen C1 und C2. An den Zyklasedomänen findet die Umsetzung von ATP in cAMP statt und die BLUF-Domänen werden für die Lichtaktivierung benötigt. Für diese Arbeit wurde PAC und Mutanten davon heterolog in Oocyten von Xenopus laevis exprimiert. PAC besitzt bereits im Dunkeln Adenylatzyklaseaktivität, die durch Belichtung erhöht werden kann. Die Zunahme der Aktivität erfolgt mit einer Zeitkonstante von unter 100 ms, die Abnahme nach der Belichtung hat eine Zeitkonstante im Bereich von 10ms. Das für die katalytische Umsetzung in allen Klasse III Nukleotidzyklasen benötigte Dimer zweier Zyklasedomänen ist in PAC das Dimer aus C1 und C2. Durch Messungen mit PAC-Mutanten, bei denen jeweils eine Zyklasedomäne defekt war, konnte gezeigt werden, dass diese Dimerisierung in PACalpha intermolekular auftritt. Ebenso wurde gezeigt, dass ein solches Dimer aus Zyklasedomänen von PACalpha und PACbeta bestehen kann. Der Austausch der Zyklasedomänen von PACalpha durch Zyklasedomänen der Guanylatzyklasen GCY35 und GCY36 aus C. elegans führte zu einem Verlust der Zyklaseaktivität. Die Proteine wurden aber zumindest teilweise korrekt gefaltet, was durch Dimerbildung mit Knockoutmutanten von PAC in Koexpressionsexperimenten gezeigt werden konnte. Die Fusionsproteine aus PACalpha und den CNG-Kanälen CNGA2 und OLF führten in Oocyten zu einer deutlich geringeren Leitwertänderung als eine Expression der Einzelproteine. Sowohl bei einer N-terminalen Fusion des Kanals an PAC als auch bei der C-terminalen Fusion war es jeweils der Kanal, der im Fusionsprotein stark gehemmt war. Eine Deletion des C-Terminus von PACalpha führte zu einem nicht funktionsfähigen Protein, das auch in Koexpression mit PAC-Knockoutmutanten keine messbare Adenylatzyklaseaktivität zeigte. Wurde die F2-Domäne deletiert, so verlor PAC ebenfalls seine Zyklaseaktivität vollständig. Die C1-Domäne war aber korrekt gefaltet, was durch eine Koexpression mit PAC-Mutanten gezeigt werden konnte, die in einer ihrer Zyklasedomänen defekt waren. Beide Chimären aus PACalpha und PACbeta besaßen Adenylatzyklaseaktivität. Diese war bei der Chimäre mit dem C-terminalen Teil von PACalpha deutlich höher als bei der Chimäre mit dem C-terminalen Teil von PACbeta, was darauf hindeutet, dass im C-terminalen Teil von PAC der Grund für den Aktivitätsunterschied zwischen PACalpha und PACbeta liegt. Für die Veränderung der Substratspezifität von einer Adenylat- zu einer Guanylatzyklase waren Mutationen an mindestens drei Aminosäuren erforderlich. Die ebenfalls hergestellten Einzel- und Doppelmutanten verhielten sich wie der Wildtyp oder hatten eine deutlich eingeschränkte Adenylatzyklaseaktivität. Bei der Tripelmutante PACalpha K250E T319G S329Y war Guanylatzyklaseaktivität nachweisbar, die aber geringer war als die noch vorhandene Adenylatzyklaseaktivität. Die Quadrupelmutante PACalpha K250E D317K T319G S329Y zeigte ebenfalls lichtinduzierbare Adenylatzyklaseaktivität, die ca. 0,3% der Aktivität der Wildtyp-PACalpha entsprach. Die Guanylatzyklaseaktivität dieser Mutante war ca. dreifach höher als deren Adenylatzyklaseaktivität. Somit konnte gezeigt werden, dass sich durch die Mutation weniger einzelner Aminosäuren die Substratspezifität von PAC von ATP nach GTP verschieben lässt. N2 - The photoactivated adenylyl cyclase PAC is involved in phototaxis in E. gracilis. It consists of two subunits of different size which are called PACalpha and PACbeta. Both of them harbour two FAD-binding domains (F1, F2) and two cyclase domains (C1, C2). PAC and mutants of PAC have been heterologously expressed in Oocytes of Xenopus laevis. Already in darkness PAC shows a basal level of adenylyl cyclase activity, which can be increased by illumination. The increase in cyclase activity occurs with a time constant lower than 100 ms, whereas the decrease after illumination has a time constant around 10 ms. The dimer of two cyclase domains, which is necessary for catalytic conversion in all class III cyclases, is formed of C1 and C2 in PAC. In electrophysiological experiments with PAC mutants which were defective in either of the cyclase domains it has been shown, that this dimer in PACalpha occurs intermolecularly. Furthermore it has been shown, that this dimer can occur between PACalpha and PACbeta. Mutants of PACalpha where the cyclase domains have been substituted by the cyclase domains of the guanylyl cyclases GCY35 and GCY36 from C. elegans lost their ability to produce cAMP. However coexpression experiments with PAC knockout mutants indicated correct translation of the substitution mutants. Expression of fusion proteins of PACalpha with the CNG channels CNGA2 and OLF showed less light-inducable conductance changes than the expression of the single protein. In both the N-terminal and C-terminal fusion of the channel to PACalpha it was the channel which was the most affected part of the fusion protein. Deletion of the C-terminus of PACalpha results in a non-functional protein, which in coexpression with PACalpha knockout mutants shows no measurable cyclase activity. When deleting the F2-domain, PACalpha also loses its cyclase activity completely. However, the C1-domain was transcribed correctly, which could be shown by coexpression with a C1-knockout mutant. Both PACalpha-PACbeta chimeras showed adenylyl cyclase activity. Whereas the activity in the chimera with the C-terminal part of PACbeta showed little cyclase activity, the chimera possessing the C-terminal part of PACalpha showed adenylyl cyclase acitvity, which was comparable to the wildtype of PACalpha. This indicates that the part of PAC which is responsible for the difference in cyclase activity between PACalpha and PACbeta must be present in the C-terminal half of PAC. For altering PAC’s substrate specificity it was necessary to mutate at least three amino acids. The single and double mutants of PACalpha which were generated resulted in wildtypelike behaviour or reduced adenylyl cyclase activity. The triple mutant PACalpha K250E T319G S329Y showed guanylyl cyclase activity which was lower than its remaining adenylyl cyclase activity. The quadruple mutant PACalpha K250E D317K T319G S329Y also showed adenylyl cyclase activity, which was about 0.3% of the activity in PACalpha wildtype. The guanylyl cyclase activity of this mutant was about threefold higher than its adenylyl cyclase activity. Thus, it could be shown, that by mutating few single amino acids the substrate specificity of PACalpha was shifted from ATP to GTP. KW - Euglena gracilis KW - Glatter Krallenfrosch KW - Adenylatcyclase KW - Guanylatcyclase KW - BLUF KW - PAC KW - photoaktiviert KW - BLUF KW - PAC Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48283 ER - TY - THES A1 - Poppe, Heiko Anton T1 - Bestimmung der Substrat- und Inhibitorspezifität von Phosphodiesterasen mittels Mikrokaloriemetrie T1 - Phosphodiesterase activity and specificity measured using microcalorimetry N2 - Neben den cAMP- und cGMP-abhängigen Proteinkinasen (PKA bzw. PKG) sind als zyklonukleotid-regulierte Effektorproteine die Ionenkanäle CNG1-4, der "guanine nucleotide exhange factor“ Epac sowie die zyklonukleotid-spaltende Familie der Phosphodiesterasen (PDEs) von Bedeutung. Industriell synthetisierte cGMP- und cAMP-Analoga besitzen zwar meist eine hohe Affinität für ihr Zielprotein, über ihre Hydrolysestabilität gegenüber PDEs in der Zelle ist jedoch wenig bekannt. In dieser Arbeit wurden die kinetischen Konstanten von elf der am häufigsten genutzten cAMP-und cGMP-Analoga an verschiedenen Vertretern der PDE-Familien mittels Mikrokaloriemetrie bestimmt. Zudem konnte in den Messungen der inhibitorisch Effekt hydrolysestabiler Derivate auf die PDEs qualitativ und quantitativ ermittelt werden kann. Die Ergebnisse zeigen, dass Phosphodiesterasen in der Lage sind, auch chemisch modifizierte Analogsubstanzen der Cyclonukleotide cAMP und cGMP zu hydrolysieren. Hydrolysestabile Derivate dagegen entwickeln häufig inhibitorische Wirkung auf die PDEs und verursachen dadurch Veränderungen der intrazellulären cAMP und cGMP Konzentrationen. So vermag z. B. die Epac-spezifische Substanz Sp-8-pCPT-2’-O-Me-cAMPS in den in vitro Experimenten die PDEs mit ki-Werten im einstelligen mikromolaren Bereich zu inhibieren. In mit Sp-8-pCPT-2’-O-Me-cAMPS stimulierten Thrombozyten steigt als Folge dieser PDE-Hemmung die cGMP Konzentration in der Zelle an und man beobachtet eine als Folge eine PKG-vermittelte Phosphorylierung des Substratproteins VASP – eine unerwünschte Nebenreaktion. Die erhobenen Daten lassen außerdem Rückschlüsse auf den Inhibitionsmechanismus zu. Einige Analoga inhibieren die cGMP-bindenden GAF-Domänen in den PDEs 2A, 5A, 6cone und 10A sowie die PDE 4D3 nach dem linear-mixed-Typ und beeinflussen daher, neben der katalytischen Aktivität, vermutlich auch regulatorische Zentren dieser Enzyme. Zusammenfassend erleichtern die erhobenen Daten Wissenschaftlern die Auswahl des für ihre Fragestellung am besten geeigneten Derivates. N2 - cAMP and cGMP are critical second messengers that regulate multiple targets including different cAMP/cGMP-dependent protein kinases (PKA/PKGs), exchange proteins directly activated by cAMP (Epacs), phosphodiesterases (PDEs) and cyclic nucleotide-gated ion channels (CNGs). Second and third generation cyclic nucleotide analogs are widely used to elucidate specificity of cellular signaling, mediated by these target proteins. However, the selectivity and stability of these analogs need to be fully understood in order to properly interpret results and rigorously assess the mechanisms by which these analogs work in the cell. To better understand the selectivity and cross-reactivity of these analogs I measured the activation or inhibitory activity of 13 commonly-used cyclic nucleotide analogs 8 different PDEs. To measure their stability to hydrolysis I utilized isothermal microcalorimetry, a method that allows to evaluate whether or not an analog can function as a substrate or inhibitor for PDEs. I demonstrate that indeed some of these analogs can be hydrolyzed by multiple PDEs and others are competitive inhibitors. Herein I provide Ki data for all of the non-hydrolyzable analogs and Km and Vmax values for all of the hydrolyzable analogs. Each of these values, as well as their mode of inhibition can be determined in a single experiment. The data strongly implied that several of these analogs might, in addition to their primary effects, also cause elevation of cAMP or cGMP indirectly by inhibiting PDEs in the cell. Such an effect could of course cloud interpretation of the use of these analogs. Similarly, those that are PDE substrates also might have their duration of action substantially reduced. To illustrate this point we show that Sp-8-pCPT-2’-O-Me-cAMPS, a highly specific non-hydrolyzable Epac activator in vitro, can under certain conditions enhance cGMP/PKG and cAMP/PKA signaling pathways in intact platelets. Specifically we found enhanced VASP phosphorylation at both PKA and PKG phosphorylation sites after the addition of Sp-8-pCPT-2’-O-Me-cAMPS. These data indicate that this “selective Epac activator” is able to indirectly activate the cAMP/PKA and cGMP/PKG signalling pathways presumably through inhibition of platelet PDE5 and/or PDE3. The data together allow to provide recommendations for how best to probe the different cyclic nucleotide signalling pathways using cyclic nucleotide analogs. In summary, the data provide evidence that most cAMP and cGMP analogs have multiple targets. Therefore, interpretation of any effects these analogs have in cells should take into consideration their possible cross-target reactivities. KW - Cyclisches Nucleotid Phosphodiesterase <3 KW - 5-> KW - Proteinkinase A KW - Hydrolyse KW - Mikrokalorimetrie KW - Cyclo-GMP KW - Cyclo-GMP-Derivate KW - Dissoziationskonstante KW - Enzymkinetik KW - Inhibition KW - Cyclo-AMP KW - Signaltransduktion KW - Thrombozyt KW - Immunoblot KW - Stickst KW - Proteinkinase G KW - Adenylatcyclase KW - Epac KW - Linear Mixed Inhibition KW - GAF Domaine KW - Proteinkinase G KW - Adenylylcyclase KW - Epac KW - Linear mixed inhibition KW - Gaf domaine Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-34477 ER -