TY - THES A1 - Labib, Samira T1 - Ex-vivo-Studien zum intestinalen Metabolismus von Flavonoiden N2 - Das erste Ziel der vorliegenden Arbeit war, ein Modell zu etablieren, mit dessen Hilfe Interaktionen zwischen Flavonoiden und Dickdarmbakterien schnell und zuverlaessig erfasst werden koennen, ohne hierzu aufwendige Humanstudien einzusetzen. Zu diesem Zweck wurde Schweine-Caecum eingesetzt; Mensch und Schwein weisen eine grosse Aehnlichkeit hinsichtlich der Anatomie und Physiologie des Gastrointestinaltraktes auf. In einer speziell entwickelten Anaerobenkammer erfolgte unter anoxischen Bedingungen die Inkubation von Modellverbindungen wie Quercetin (3,5,7,3',4'-Pentahydroxyflavon), ein hinsichtlich seiner Metabolisierung schon ausfuehrlich untersuchtes Flavonol, Chrysin (5,7-Dihydroxyflavon), Naringenin (5,7,4'-Trihydroxyflavanon) und Hesperetin (5,7,3'-Trihydroxy-4'-methoxyflavanon) mit dem Caecum-Inhalt. Die Identifizierung und Strukturaufklaerung der im Zeitraum von 24 h gebildeten Metabolite erfolgte mittels Hochleistungs-fluessigchromatographie-Diodenarray-Detektion (HPLC-DAD), HPLC-Elektrospray-Ionisierung-Tandemmassenspekrometrie (ESI-MS/MS) und Kapillargaschromatographie-Massenspektrometrie (HRGC-MS). Unter den gewaehlten experimentellen Bedingungen wandelte die Schweine-Caecum-Mikroflora Quercetin in Phloroglucin, 3,4-Dihydroxyphenylessigsaeure und 3,4-Dihydroxytoluol um. Das Flavon Chrysin wurde hingegen nicht abgebaut. Naringenin wurde zu 3-(4-Hydroxyphenyl)-propionsaeure und 3-Phenylpropionsaeure metabolisiert; aus Hesperetin entstanden via Eriodictyol Phloroglucin und 3-(3-Hydroxyphenyl)-propionsaeure. Der mittels HPLC-DAD-Analytik untersuchte zeitliche Verlauf des mikrobiellen Abbaus von Quercetin, Naringenin und Hesperetin zeigte einen langsamen Abbau von Naringenin im Gegensatz zur schnellen Metabolisierung von Quercetin und Hesperetin. Die erhaltenen Resultate stimmten mit Literaturergebnissen sehr gut ueberein und belegten somit die Anwendbarkeit von Schweine-Caecum als geeignetes ex-vivo-Modell zur Untersuchung des intestinalen Metabolismus von Flavonoiden. Mit dem entwickelten Modell wurde in weiteren Studien die Biotransformation ausgewaehlter Flavonoide im Dickdarm simuliert. Neben Ringspaltungen, Hydrolyse, Demethylierungs- und Dehydroxylierungsreaktionen entstanden bevorzugt aromatische Carbonsaeuren. So wurde beispielhaft das erstmals auf seine intestinale Metabolisierung untersuchte Hispidulin (5,7,4'-Trihydroxy-6-methoxyflavon) – ein hoch wirksamer Benzodiazepinrezeptor-Ligand – durch die Schweine-Caecum-Mikroflora rasch zu Scutellarein O-demethyliert, welches dann langsam zu 3-(4-Hydroxyphenyl)-propionsaeure weiter abgebaut wurde. Anhand der beobachteten Abbaukinetik ergab sich der Hinweis, dass Flavonoide in Abhaengigkeit von ihrem jeweiligen Substitutionsmuster unterschiedlich schnell von den Darmbakterien umgesetzt werden. Da auch Ausmass und Geschwindigkeit des Abbaus von Flavonoiden deren Bioverfuegbarkeit beeinflussen, war es ein weiteres Ziel dieser Arbeit zu ueberpruefen, inwieweit ein Zusammenhang zwischen Hydroxylierungsgrad des B-Ringes von Flavonoiden und deren mikrobiellen Abbaurate besteht. Hierzu wurden Flavonole, d.h. Galangin (3,5,7-Trihydroxyflavon), Kaempferol (3,5,7,4'-Tetrahydroxyflavon) und erneut Quercetin sowie Flavone, d.h. Chrysin, Apigenin (5,7,4'-Trihydroxyflavon) und Luteolin (5,7,3',4'-Tetrahydroxyflavon), die sich jeweils lediglich im Hydroxylierungsgrad des B-Ringes unterscheiden, ausgewaehlt und als Substrate (in jeweils gleicher Konzentration) fuer die Umsetzung durch Schweine-Caecum-Mikroflora gleicher Donoren eingesetzt. Der mikrobielle Abbau wurde ueber einen Zeitraum von 24 Stunden mittels HPLC-DAD-Analysen verfolgt. Ein Vergleich der mikrobiellen Umsetzungsraten der geprueften Flavonole und Flavone liess den Schluss zu, dass unabhaengig von der Flavonoid-Unterklasse eine Hydroxylierung in Position C-4' des B-Ringes den Abbau von Flavonoiden foerdert (bei den Flavonen sogar erst ermoeglicht) und dass eine zusaetzliche Hydroxylierung des B-Ringes keinerlei Einfluss auf den Abbau hat. Die Ergebnisse dieser Studie lassen weiterhin vermuten, dass die Hydroxylierung in Position C-3 des C-Ringes eine foerdernde Rolle im Abbau von Flavonoiden durch caecale Mikroflora spielt. Im Rahmen dieser Arbeit erfolgten ferner Untersuchungen zur Interaktion von Flavonoiden mit alpha-Glucosidase aus Schweine-Caecum. Als potentielle Hemmstoffe kamen die Flavone Scutellarein, Baicalein und Luteolin zur Verwendung; als Substrate wurden p-Nitrophenyl-alpha-D-glucopyranosid und Saccharose eingesetzt. Fuer keines der eingesetzten Flavonoide war ein Einfluss auf die Aktivitaet der alpha-Glucosidase festzustellen. Diese Ergebnisse weisen auf strukturelle Unterschiede zwischen bakteriellen alpha-Glucosidasen und solchen aus dem Duenndarm der Saeugetiere hin, bei denen fuer u. a. Scutellarein und Baicalein hohe alpha-Glucosidase-Inhibitor-Aktivitaet beschrieben worden ist. N2 - The first objective of the present work was to establish a model that allows us to study the interactions between flavonoids and the large intestine bacteria rapidly and reliably without using complex human study. For this purpose the pig caecum was used; human and pig exihibit a large similarity regarding anatomy and physiology of the gastrointestinal tract. In a special developed anaerobic chamber model compounds such as quercetin (3,5,7,3',4'-pentahydroxyflavone), a flavonol whose metabolism has already been studied thoroughly, chrysin (5,7-dihydroxyflavone), naringenin (5,7,4'-trihydroxyflavanone) and hesperetin (5,7,3'-trihydroxy-4'-methoxyflavanone) were incubated under anoxic conditions with the caecum contents. Identification and structural elucidation of the metabolites formed within 24 h of incubation were performed by high-performance liquid chromatography- diode array detection (HPLC-DAD), HPLC-electrospray ionizationtandem mass spectrometry (ESI-MS/MS) and high-resolution gas chromatography-mass spectrometry (HRGC-MS). The pig caecal microflora converted quercetin, under the experimental conditions used, to phloroglucinol, 3,4-dihydroxyphenylacetic acid und 3,4-dihydroxytoluene. However, the flavon chrysin was not degraded. Naringenin was metabolized to 3-(4-hydroxyphenyl)-propionic acid and 3-phenylpropionic acid. Hesperetin was transformed via eriodictyol to phloroglucinol and 3-(3-hydroxyphenyl)-propionic acid. The time course of microbial conversion of quercetin, naringenin and hesperetin was determined by HPLC-DAD-analysis, revealing slow degradation of naringenin and rapid transformation of quercetin and hesperetin. The obtained results are in full agreement with literature data and demonstrate the use of pig caecum as a suitable ex vivo model for studying the intestinal metabolism of flavonoids. In further studies the developed model was used in order to simulate the biotransformation of selected flavonoids in the large intestine. Among ring fission, hydrolysis, demethylation and dehydroxylation reactions the formation of aromatic acids was preferred. For example, hispidulin (5,7,4'-trihydroxy-6-methoxyflavone) – a potent ligand of the central human benzodiazepine receptor – was rapidly O-demethylated by the caecal microflora to scutellarein. The subsequent degradation of scutellarein to 3-(4-hydroxyphenyl)-propionic acid proceeded slowly. The observed degradation kinetics indicated that the time the gut bacteria need to metabolize the flavonoids depends on the flavonoids substitution pattern. Since extent and kinetics of degradation of flavonoids also affect the bioavailability of flavonoids, a further aim of this work was to examine to what extent a correlation between the hydroxylation grad of the B-ring of flavonoids and their microbial degradation rates exist. Therefore, selected flavonols, i.e. galangin (3,5,7-trihydroxyflavone), kaempferol (3,5,7,4'-tetrahydroxyflavone) and quercetin as well as flavones, i.e. chrysin, apigenin (5,7,4'-trihydroxyflavone) and luteolin (5,7,3',4'-tetrahydroxyflavone), which differ only in their hydroxylation patterns on the B-ring were used (in same concentration, respectively) as substrates for the fermentation by caecal microflora from the same donors, and the microbial degradations were continuously, over 24 h, analyzed by HPLC-DAD. Comparison of the microbial degradation rates of the flavonols and flavones under study led to the conclusion that the presence of a hydroxy group in 4'-position at the B-ring, regardless of the flavonoid subclass, enhances the degradation of flavonoids, and an additional hydroxy group at the B-ring does not affect the degradation degree of flavonoids. In addition, it can be assumed, according to the results of this study, that the presence of a hydroxy group in 3-position at the C-ring enhances the microbial transformation of flavonoids. Furthermore the interactions of flavonoids with alpha-glucosidase from the pig caecum were investigated in the context of this work. The flavones scutellarein, baicalein and luteolin were used as potential alpha-glucosidase inhibitor in these experiments. p-Nitrophenyl-alpha-D-glucoside and sucrose served as substrates. None of the tested flavonoids showed an inhibitory activity against á-glucosidase from the pig caecum. These results indicate structural differences between bacterial alpha-glucosidase and mammalian intestinal alpha-glucosidase, as against rat intestinal alpha-glucosidase some flavonoids, for example scutellarein and baicalein, showed a potent inhibitory activity. KW - Flavonoide KW - Blinddarm KW - Schwein KW - Stoffwechsel KW - Flavonoide KW - Schweine-Caecum-Modell KW - Metabolismus KW - Hispidulin KW - flavonoids KW - pig-caecum-model KW - metabolism KW - hispidulin Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18466 ER - TY - THES A1 - Kavvadias, Dominique T1 - Liganden des Benzodiazepin-Rezeptors: Studien über Benzodiazepine in pflanzlichen Geweben sowie über Hispidulin T1 - Ligands of the benzodiazepine receptor. Studies of benzodiazepines in plant tissues and of hispidulin. N2 - Im Rahmen dieser Arbeit wurden Liganden des zentralen Benzodiazepin-Rezeptors (BZD-R) aus pflanzlichen Geweben untersucht. Der erste Teil war dem Studium „natürlicher“ Benzodiazepine (BZD) gewidmet. Deren Vorkommen ist vielfach belegt; an ihrer Biogenese sind möglicherweise Mikroorganismen beteiligt. Es war nun zu prüfen, ob BZD auch unter Sterilbedingungen, d.h. nach Ausschluss mikrobieller Aktivität auftreten können. Hierzu wurden steril kultivierte pflanzliche Kalli und Regenerate, unter anderem von Kartoffelkraut und Estragon untersucht. Methanolische Extrakte wurden auf ihre Aktivität am zentralen BZD-R im Radiorezeptorbindungsassay (RRA) geprüft und mittels Festphasenextraktion bzw. präparativer HPLC-Fraktionierung gereinigt. Nach erneuter Prüfung im RRA erfolgte die Analyse aktiver Fraktionen mit Hilfe der online HPLC-ESIpos-Tandemmassenspektrometrie (HPLC-ESIpos-MS/MS) im SRM-Modus. Auf diese Weise gelang es, die BZD Delorazepam und Temazepam in Sterilkulturen von Estragon (Artemisia dracunculus), sowie Diazepam und Temazepam in Kartoffelkraut (Solanum tuberosum), nachzuweisen. Der zweite Teil der Arbeit war der Suche nach natürlichen Nicht-BZD-artigen Liganden des BZD-R gewidmet. Hierzu wurden methanolische Extrakte verschiedener in der Volksmedizin als Sedativa genutzter Pflanzen im RRA auf BZD-R-Aktivität getestet. Für die Isolierung von Nicht-BZD-artigen Liganden wurde der Salbeiblätterextrakt (Salvia officinalis L.) ausgewählt. In einer RRA-begleiteten chromatographischen Fraktionierung des Extraktes wurden fünf aktive Komponenten, drei Flavone und zwei Diterpene, isoliert. Die BZD-R-aktiven Flavone wurden als Apigenin (5,7,4’-Trihydroxyflavon), Hispidulin (5,7,4’-Trihydroxy-6-methoxyflavon)und Cirsimaritin (5,4’-Dihydroxy-6,7-dimethoxyflavon identifiziert. Bei den diterpenoiden BZD-R-Liganden handelte es sich um 7-Methoxyrosmanol und Galdosol. Hispidulin sowie die Diterpene erwiesen sich mit IC 50-Werten von 1.3, 7.2 und 0.8 µM als die BZD-R-aktivsten Komponenten. Apigenin und Cirsimaritin zeigten mit IC50-Werten von 30 bzw. 350 µM geringere Affinitäten zum BZD-R. Die hohe BZD-R-Aktivität von Hispidulin im RRA veranlasste uns, Untersuchungen zum pharmakologischen Profil sowie zur in vivo-Wirksamkeit dieser Substanz durchzuführen. Da die Isolierung aus pflanzlichem Material sehr zeit- und materialaufwendig ist, wurde Hispidulin durch chemische Synthese bereitgestellt. Diese erfolgte in Anlehnung an die Baker-Venkataraman-Methode aus 4-Benzyloxy-2,3-dimethoxy-6-hydroxyacetophenon und 4-Benzyloxybenzoesäurechlorid. Die Ausgangssubstanzen wurden in getrennten Syntheserouten, ausgehend von 2,4,6-Trihydroxyacetophenon und 4-Hydroxybenzoesäure, hergestellt. Danach wurde der Benzoylester aus dem Acetophenon- und dem Säurechlorid-Baustein gebildet. Der Ester wurde nach Baker-Venkataraman zum 1,3-Diketon in basischem Milieu umgelagert. Das 1,3-Diketon zyklisierte unter Säure-und Hitzeeinwirkung zum Flavon, das zur gleichzeitigen Entfernung der Schutzgruppen und der labilen C-5-Methylgruppe mit 1 M BCl3-Lösung bei etwa –70 °C behandelt worden ist. Mit dem chemisch synthetisierten Hispidulin erfolgten Studien zu dessen pharmakologischen Eigenschaften an rekombinanten GABAA-Rezeptoren im Xenopus laevis Oozyte-Modell. Hispidulin zeigte an allen untersuchten Rezeptor-Subtypen (alpha1-3,5,6beta2,gamma2) bereits in Konzentrationen ab 50 nM eine stark positive Stimulation des GABA-induzierten Ionenstromes. Maximale relative Stimulation wurde bei einer Konzentration von 10 µM erreicht, bei der Hispidulin 24 % der maximalen Diazepam-Wirkung aufwies. Da Hispidulin einen mit BZD-Agonisten vergleichbaren, jedoch geringeren Einfluss auf die GABA-induzierten Ströme zeigte, wurde das pharmakologische Profil als partiell agonistisch charakterisiert. Die weiteren Studien waren daher auf den Nachweis einer in vivo-Wirksamkeit von Hispidulin ausgerichtet. Das Modell der Mongolischen Wüstenrennmaus (Gerbil, Meriones unguiculatus) ist ein geeignetes Tiermodell zur Untersuchung epileptiformer Krämpfe und wird eingesetzt, um die Wirkung potentieller Antiepileptika zu untersuchen. Es bot uns die Möglichkeit, erste in vivo-Studien mit Hispidulin durchzuführen. Hierzu sind mittelschwere bis schwere Anfälle mit einer Häufigkeit von etwa 90 % induziert worden. Nach siebentägiger Verfütterung von Hispidulin (10 mg/kg KG pro Tag) und Diazepam (2 mg/kg KG pro Tag) (als Positivkontrolle) wurde sowohl in der Hispidulin-, als auch in der Positivkontrollgruppe eine Reduzierung schwerer Anfälle auf 30 bzw. 25 % beobachtet. Hispidulin zeigte in vivo eine mit Diazepam vergleichbare antikonvulsive Wirkung und damit das Potential eines möglichen Antiepileptikums. N2 - In this study, ligands of the central benzodiazepine receptor (BZD-R) from plant tissues were investigated. The activity of the first part was devoted to investigations of “natural” benzodiazepines (BZD). Their occurrence has been observed in several studies; potentially, microorganisms contribute to their biogenesis. It was the aim of our studies to clarify whether BZD can be formed under sterile conditions, i.e. excluding any microbial activity. Thus, plant cell tissues and cell regenerates of Solanum tuberosum and Artemisia dracunculus, cultivated under sterile conditions, were checked for their binding affinity to the BZD-R. For this purpose, methanolic extracts were purified by solid phase extraction and preparative HPLC. Fractions with a significant displacing potency in the BZD radio receptor binding assay (RRA) were studied for their content of selected BZD by on-line HPLC-electrospray-tandem mass spectrometry (HPLC-ESIpos-MS/MS) in the ‘selected reaction monitoring’ (SRM) mode. Using this technique, delorazepam and temazepam were found in the extract of Artemisia dracunculus cell tissue, whereas Solanum tuberosum herb contained diazepam and temazepam. The second part of our work comprised studies on novel natural non-BZD-like ligands of the BZD-R. Thus, methanolic extracts from several plant species were screened for their activity in the RRA. We focused our interest on plants which are known for their sedative and anticonvulsive effects and , thus used in folkloric medicine. The extract from Salvia officinalis L. was chosen for subsequent RRA guided analyses. After several chromatographic purification steps, three flavones and two abietane diterpenes functioning as BZD-R active components were separated. The BZD-R active flavones were identified as apigenin (5,7,4’-trihydroxyflavone) (1), hispidulin (5,7,4’- trihydroxy-6-methoxyflavone) (2) and cirsimaritin (5,4’-dihydroxy-6,7-dimethoxyflavone) (3). The two diterpenes were characterized as 7-methoxyrosmanol (4) and galdosol (5). Hispidulin (2), 7-methoxyrosmanol (4) and galdosol (5) showed the strongest binding activities to the BZD-R with IC50 values of 1.3, 7.2 and 0.8 µM, respectively. The affinities measured for apigenin (1) and cirsimaritin (3) were lower, revealing IC 50 values of 30 and 350 µM, respectively. The high BZD-R activity of hispidulin in the RRA prompted us to investigate its pharmacological profile and in vivo efficiency. As the isolation from plant material is very time- and material-consuming, we provided hispidulin by chemical synthesis. This was realized in accordance with the method of Baker-Venkataraman, starting with 4-benzyloxy-2,3-dimethoxy-6-hydroxyacetophenone and 4-benzyloxybenzoic acid chloride. Reactants were prepared in separate routes from 2,4,6-trihydroxyacetophenone and 4-hydroxybenzoic acid, respectively. The benzoyl ester was built from the actophenone and acid chloride component and rearranged to the corresponding 1,3-diketone under basic conditions. The 1,3-diketone cyclized to the flavone in the presence of acid and heat. In the last step, the protection groups and the labile C-5-methoxy group were removed by reaction with 1 M BCl3 solution at -70 °C. Chemically synthesized hispidulin was investigated for its pharmacological properties with recombinant GABAA receptors in the Xenopus laevis oocyte model. Substance concentrations of 50 nM and higher strongly stimulated the GABA-induced chloride ion influx at all receptor subtypes (alpha1-3,5,6beta2gamma2). Maximum relative stimulation was achieved with 10 µM hispidulin. At this concentration, hispidulin showed 24 % of the maximum diazepam efficiency. Hispidulin therefore showed positive modulation of the GABAA receptor with lower efficiency compared to BZD. The pharmacological profile was thus characterized as partially agonistic. Consequently, further studies were focused on the in vivo efficacy of hispidulin. BZD agonists show antiepileptic effects in vivo. The mongolian gerbil model (Meriones unguiculatus) is a natural animal model to investigate epileptic seizures and effects of potential antiepileptics. It provided the possibility for a first in vivo experiment with hispidulin to simultaneously detect its biological relevance and in vivo efficiency. Strong seizures were induced in about 90 % of the animals. After oral application of hispidulin (10 mg/kg body weight per day; test group) and diazepam (2 mg/kg body weight per day; positive control group) for seven days, both groups showed reduction of strong seizures to 30 and 25 %, respectively. Hispidulin revealed anticonvulsive in vivo effects, which were comparable to diazepam. It therefore exhibits the potential of a putative antiepileptic drug. KW - Benzodiazepin-Rezeptor-Liganden KW - Artemisia dracunculus KW - Solanum tuberosum KW - Hispidulin KW - Benzodiazepine receptor ligands KW - Artemisia dracunculus KW - Solanum tuberosum KW - hispidulin Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5372 ER -