TY - THES
A1 - Höhn, Marie
T1 - Veränderung der Tumorimmunumgebung muriner Mamma-Karzinome durch Inhibierung der Kollagensynthese
T1 - Alteration of the tumor immune environment in murine mamma carcinomas by inhibition of collagen synthesis
N2 - Das Mamma-Karzinom gehört zu den sogenannten desmoplastischen Tumorarten. Hierbei handelt es sich um Tumoren mit erhöhter Ansammlung von Bindegewebszellen und einer Akkumulation von Extrazellulärer Matrix (EZM). Diese verdichtete EZM wirkt sowohl auf mechanischer als auch auf Signalweg-vermittelter Ebene als eine Barriere, welche die therapeutische Wirksamkeit erheblich vermindert.
Einer der Hauptbestandteile der EZM ist Kollagen. Durch Anwendung von Präparaten, welche die Kollagensynthese und -reifung inhibieren, kann die rigide Struktur aufgelockert werden. Daraus ergibt sich eine verbesserte Versorgung mit Nährstoffen und eine verbesserte Infiltrationsmöglichkeit für Immunzellen. Dies ist für die Effizienz der Immuntherapie, welche sich in den letzten Jahren als vielversprechende Alternative zu den Grundsäulen der Krebstherapie entwickelt hat, unabdinglich.
In der vorliegenden Arbeit wurden murine Mamma-Karzinome der 4T1-Linie nach Behandlung mit EZM-destabilisierenden Kollageninhibitoren auf ihre Immunumgebung hin untersucht.
Verwendet wurden drei Wirkstoffe, welche an unterschiedlichen Punkten in die Kollagensynthese und -reifung eingreifen: βAPN als LOX(L)-Inhibitor, 1,4-DPCA als P4HA-Inhibitor und Minoxidil als LH-Inhibitor. Die Behandlung führte zu einem deutlichen Anstieg aller untersuchten Immunzellen und deutet somit auf eine verbesserte Infiltrationsmöglichkeit hin. Zudem wurde die Expression maligner Signalwege, wie die der Angiogenese, Hypoxie, Metastasierungsneigung, Invasivität und Immunsuppression, verringert und tumorsuppressive Immunantworten verstärkt.
Die Kollageninhibition hatte zusätzlich ein verringertes Tumorwachstum und eine Reduktion der Blutgefäßdichte zufolge.
Als Fazit gilt es festzuhalten, dass die Verwendung von Kollageninhibitoren in der Immuntherapie eine vielversprechende Option zur Verbesserung der Effizienz dieser Therapeutika darstellt. Diese Erkenntnis gilt es im Rahmen künftiger wissenschaftlicher Untersuchungen weiterzuentwickeln.
N2 - The mamma carcinoma is a desmoplastic tumor which shows an accumulation of fibrotic tissue and of extracellular matrix (ECM). This highly dense ECM acts as a physical and signaling-mediated barrier reducing the efficacy of various therapeutic approaches. One of the main components of the ECM is collagen. The rigid structure can be loosened by drugs which inhibit collagen synthesis and maturation. This potentially leads to improved infiltration with nutrients and a better access for immune cells. These are absolutely necessary for the effectiveness of the immune therapy that has been established as a promising alternative approach in the last years in addition to the classical cancer therapy options. In this dissertation murine mamma carcinomas of the 4T1-tumor cell line were treated with collagen inhibitors, with the aim to destabilize the rigid ECM and analyze following changes of the immune environment.
The drugs, that were used, inhibit at different stages collagen synthesis and maturation: βAPN as a LOX(L)-inhibitor, 1,4-DPCA as a P4HA-inhibitor and Minoxidil as a LH-inhibitor. The treatment led to an accumulation of different kinds of immune cells which shows the improved infiltration. Furthermore, malignant pathways concerning angiogenesis, hypoxia, invasiveness, metastasis, and immunosuppression are reduced. Tumor suppressive immune responses are enhanced.
Moreover, we could ascertain a reduced tumor growth and microvessel density after treatment.
All in all, the tumors show, because of the changed quantity and constellation of immune cells, a stronger immune stimulating function. This embodies the promising potential of the usage of collagen inhibitors as an additional treatment to immune therapy to facilitate its efficacy, which has to be examined by further studies.
KW - Brustkrebs
KW - Kollagen
KW - Immunsystem
KW - Inhibition
KW - Tumor
KW - Tumorimmunumgebung
KW - Kollageninhibition
Y1 - 2023
U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-284929
ER -
TY - THES
A1 - Schäfer, Florian
T1 - Kontraktionsverhalten neonataler Rattenkardiomyozyten bei Überexpression phosphorylierungsdefizienter RKIP Mutanten S51/S52
T1 - Contractility of neonatal rat cardiomyocytes after overexpression of phosphorylation-deficient RKIP mutants S51 /S52
N2 - Durch Phosphorylierung inaktiviert GRK2 kardiale ß-Adrenorezeptoren und vermindert dadurch die Kontraktilität von neonatalen Rattenkardiomyozyten. Als natürlicher Inhibitor der GRK2 beeinflusst RKIP die Signalweiterleitung bei Stimulation von ß-Adrenorezeptoren. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine Überexpression von RKIP die Kontraktilität von neonatalen Rattenkardiomyozyten erhöht. Es wurde die Anzahl auftretender Spontankontraktionen vor und nach Stimulation mit Isoproterenol erfasst sowie eine zeitliche Analyse der Calciumfreisetzung und –aufnahme nach elektrischer Stimulation durchgeführt. Im unstimulierten Zustand zeigten neonatale Rattenkardiomyozyten, die Wildtyp-RKIP überexprimierten, verglichen mit der Kontrollgruppe, keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich auftretender Spontankontraktionen. Nach Stimulation mit Isoproterenol zeigten neonatale Rattenkardiomyozyten, in denen Wildtyp-RKIP überexprimiert wurde, eine signifikant höhere Anzahl auftretender Spontankontraktionen. Eine Analyse der Calciumtransienten zeigte bei RKIP-Wildtyp überexprimierenden neonatalen Rattenkardiomyozyten eine erhöhte Calciumfreisetzung während der Systole sowie eine beschleunigte Calciumwiederaufnahme während der Diastole. Zudem wurden die RKIP-Mutanten RKIPS51V und RKIPS52V im Hinblick auf ihre Kontraktilität untersucht. Neonatale Rattenkardiomyozyten welche RKIPS51V und RKIPS52V überexprimierten zeigten weder im Hinblick auf auftretende Spontankontraktionen noch bei der Analyse der Calciumtransienten signifikante Unterschiede zur Kontrollgruppe. Da auch eine Phosphorylierung an Aminosäureposition 51 bzw. Aminosäureposition 52 ohne direkte Auswirkung auf die Kontraktilität möglich ist, wurde in einem in vitro Kinase Assay analysiert, ob neben der bekannten Phosphorylierungsstelle S153 eine weitere Phosphorylierung von RKIP durch PKA oder PKC erfolgt. Bei Einsatz der an Aminosäureposition 153 phosphorylierungsdefizienten RKIP Mutante RKIPS153A konnte keine Phosphorylierung beobachtet werden. In der vorliegenden Arbeit konnte neben einer Phosphorylierung an S153 keine weitere Phosphorylierung von RKIP durch PKC oder PKA beobachtet werden.
N2 - By phosphorylation, GRK2 inactivates cardiac ß-adrenoreceptors and thereby reduces the contractility of neonatal rat cardiomyocytes. As a natural inhibitor of GRK2, RKIP influences cell signaling when ß-adrenoreceptors are stimulated. The presented research shows that an overexpression of RKIP increases the contractility of neonatal rat cardiomyocytes. The number of spontaneous contractions occurring before and after stimulation with isoproterenol was recorded and a temporal analysis of calcium release and uptake after electrical stimulation was performed. In the unstimulated state, neonatal rat cardiomyocytes which overexpressed wild-type RKIP showed no significant differences in terms of spontaneous contractions compared with the control group. After stimulation with isoproterenol, neonatal rat cardiomyocytes in which wild-type RKIP was overexpressed showed a significantly higher number of occurring spontaneous contractions.
Neonatal rat cardiomyocytes overexpressing wild-type RKIP showed an increased calcium release during systole and an accelerated calcium reuptake during diastole.
The RKIP mutants RKIPS51V and RKIPS52V were examined regarding their contractility. Neonatal rat cardiomyocytes which overexpressed RKIPS51V and RKIPS52V showed no significant differences compared to the control group in terms of spontaneous contractions or calcium cycling. Since phosphorylation at amino acid position 51 or amino acid position 52 could also be possible without direct effect on contractility, an in vitro kinase assay focusing on PKA and PKC was performed.
In the presented work, apart from phosphorylation at S153, no further phosphorylation of RKIP by PKC or PKA could be observed.
KW - Herzinsuffizienz
KW - Raf-Kinasen
KW - Inhibition
KW - Beta-Rezeptor
KW - beta-adrenerge Signalwege
KW - phopohrylierungsdefizient
Y1 - 2020
U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-213747
ER -
TY - THES
A1 - Wettstein, Lars
T1 - Elektrochemische Abscheidung von Bruschitschichten auf Titan in Gegenwart von Kristallisationsinhibitoren zur Steuerung von Kristallitgröße und biologischer Reaktion
T1 - Brushite coatings on titanium by electrochemical deposition in the presence of crystallization inhibitors to control of crystallite size and biological reaction
N2 - Es erfolgte eine elektrochemische Abscheidung von Bruschitschichten auf Titan in Gegenwart von Kristallisationsinhibitoren. Dabei wurden die Kristallisationsinhibitoren Zitronensäure, treta-Natriumdiphosphat-Decahydrat und Phytinsäure verwendet und die entstandenen Schichten mit denen ohne Inhibitorzugabe verglichen. Um das Ausmaß der Inhibierung zu verifizieren, wurde die Masse aller Schichten gemessen, welche für die Inhibition mit Zitronensäure und Phytinsäure abnahm und für Natriumdiphosphat zunahm. Die kristallographische Zusammensetzung der mit und ohne Inhibierung abgeschiedenen Schichten wurde mit Hilfe der Röntgendiffraktometrie bestimmt und zeigte, dass sich reine Bruschitschichten mit unterschiedlichem amorphem Anteil abschieden. Die daraus entstandenen Werte lieferten zugleich die Informationen über die einzelnen Kristallitgrößen innerhalb der Schichten. Über den Einfluss der Inhibitoren auf die Schichtmorphologie gaben rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen weiteren Aufschluss. Die Inhibition verursachte teils mit Rissen durchzogene Schichten, deren Kristallformationen sich von Standardelektrolyt unterschieden. Ausgewählte Proben wurden unter verschiedenen Bedingungen desinfiziert bzw. sterilisiert und nachfolgend erneut gewogen und mittels Röntgendiffraktogrammetrie und Rasterelektronenmikroskopie analysiert. Nach der Desinfektion entstanden reine Bruschitschichten, die an Masse verloren aber trotzdem die typischen Kristallformationen zeigten. Die Sterilisation führte zur Umwandlung von Bruschit in Monetit und Hydroxylapatit. Des Weiteren wurde die biologische Reaktion der Schichten auf humane fötale Osteoblasten-Zelllinien zur Überprüfung der Zellverträglichkeit ermittelt. Die entstandenen Ergebnisse waren nicht verwertbar und enthielt sehr hohe Standardabweichungen.
N2 - Brushite coatings were deposited on titanium by electrochemical deposition in the presence of various crystallization inhibitors such as citric acid, treta-sodium diphosphate decahydrate and phytic acid. The resulting layers were compared with those without inhibitor addition. To verify the extent of inhibition, the mass of all layers was measured, which decreased for inhibition with citric acid and phytic acid and increased for sodium diphosphate. The crystallographic composition of the layers deposited with and without inhibition was determined by X-ray diffraction and showed pure brushite caotings with different amorphous content. The resulting values also provided information about the individual crystallite sizes within the layers. Scanning electron microscope images provided further information about the influence of the inhibitors of the layer morphology. The inhibition caused layers partly interspersed with cracks, whose crystal formations differed from the standard electrolyte. Selected samples were disinfected or sterilized under various conditions and subsequently reweighed and analyzed by X-ray diffraction and scanning electron microscopy. After disinfection, pure brushite caotings were formed, which lost mass but still showed the typical crystal formations. Sterilization led to the transformation of brushite into monetite and hydroxyapatite. Furthermore, the biological response of the layers to human fetal osteoblast cell lines was determined to test cell compatibility. The results obtained were not usable and contained very high standard deviations.
KW - Elektrochemische Abscheidung
KW - Bruschitbeschichtung
KW - Inhibition
KW - electrochemical deposition
KW - brushite coating
Y1 - 2020
U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-217502
ER -
TY - THES
A1 - Quenzer, Anne
T1 - Der antiproliferative Effekt des Multidrug resistance-Protein 1 (MRP1)-Inhibitors Reversan und der Laktatdehydrogenase (LDH)-Inhibitoren Natriumoxamat und Galloflavin an kolorektalen Karzinomzellen bei tumorphysiologischen Sauerstoffkonzentrationen
T1 - Antiproliferative effects of multidrug resistance protein 1 (MRP1) inhibitor Reversan and lactate dehydrogenase (LDH) inhibitors Natriumoxamat and Galloflavin in human colorectal cells exposed to oxygen levels characteristic for tumor oxygenation
N2 - Ziel der vorliegenden Arbeit waren pharmakologische Untersuchungen zum antiproliferativen Effekt der beiden Laktatdehydrogenase (LDH)-Inhibitoren Natriumoxamat und Galloflavin sowie des MRP1-Inhibitors Reversan einzeln und in Kombination bei verschiedenen Sauerstoffkonzentrationen in vitro zu untersuchen. Zusätzlich wurde der antiproliferative Effekt der drei Inhibitoren mit dem antiproliferativen Effekt von 5-FU verglichen.
Das Konzept zu dieser Arbeit basiert auf Gemeinsamkeiten zwischen LDH und MRP1 in malignen Zellen. Eine ist, dass beide Moleküle von zahlreichen Tumoren überexprimiert werden. Weiter sind beide an der Ausbildung von Chemoresistenz beteiligt und beide werden auch in Hypoxie exprimiert. Zudem wird das für die Funktion von MRP1 notwendige ATP in malignen Zellen hauptsächlich mit der hyperaktiven Glykoloyse gebildet, deren Stoffumsatz auch von der LDH-Aktivität abhängig ist. Eine kombinierte Inhibition beider Zielstrukturen scheint somit geeignet zu sein, um die Proliferation maligner Zellen gezielt zu hemmen. Da in großen Teilen solider Tumoren hypoxische bzw. anoxische Bedingungen vorherrschen, wurde die Wirksamkeit der drei Inhibitoren auch bei 5 % und 1 % Sauerstoff, die als tumorphysiologisch gelten, untersucht.
Die wichtigsten Ergebnisse aus dieser Arbeit sind, dass die beiden LDH-Inhibitoren Natriumoxamat und Galloflavin und der MRP1-Inhibitor Reversan einen antiproliferativen Effekt bei kolorektalen Karzinomzellen auslösen, der auch für tumorphysiologische Sauerstoffkonzentrationen nachzuweisen war. So verringerte sich durch Natriumoxamat bzw. Galloflavin der Anteil vitaler Zellen um bis zu 45 % und durch Reversan um bis zu 60 % bei 5 % und 1 % Sauerstoff im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle.
Auch unterschiedliche Kombination aus Natriumoxamat, Galloflavin und Reversan führten zu einer Steigerung des antiproliferativen Effektes, der auch immer bei tumorphysiologischen Konzentrationen nachzuweisen war. Den stärksten antiproli-ferativen Effekt wies die Dreifachkombination aus Galloflavin, Natriumoxamat und Reversan auf. So verringerte sich der Anteil vitaler Zellen bei 1 % Sauerstoff durch diese Kombination auf bis zu 28 % bei vier der fünf kolorektalen Karzinomzelllinien. Die Dreifachkombination wies einen gleichstarken bzw. stärkeren antiproliferativen Effekt auf als das Chemotherapeutikum 5-FU und zwar ebenfalls bei 5 % und 1 % Sauerstoff.
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zum antiproliferativen Effekt von Natriumoxamat, Galloflavin (beides LDH-Inhibitoren) und Reversan (MRP1-Inhibitor) in vitro lassen den Schluss zu, dass das Konzept der Arbeit, einen antiproliferativen Effekt auch bei tumorphysiologischen Sauerstoffkonzentrationen zu induzieren, grundsätzlich bestätigt wurde. Auch löste die gemeinsame Hemmung von LDH und MRP1 einen teilweise stärkeren antiproliferativen Effekt aus als 5-FU. Weitere Untersuchungen sind aber ohne Frage nötig, um die molekularen Interaktion zwischen LDH und MRP1 sowie ihrer Inhibition im Detail zu verstehen.
N2 - The aim of the present study was to investigate the antiproliferative effect of the two lactate dehydrogenase (LDH) inhibitors sodium oxamate and galloflavin and the MRP1 inhibitor reversan at different oxygen concentrations in vitro. The inhibitors were used individually and in combination. In addition, the antiproliferative effect of the three inhibitors was compared with the antiproliferative effect of 5-FU.
The concept of this study is based on similarities between LDH and MRP1 in malignant cells: their overexpression by numerous tumors; their contribution to chemoresistance and their expression in hypoxia. In addition, the ATP necessary for the function of MRP1 is mainly formed in malignant cells by an increased turnover of the hyperactive glycolysis, which also depends on the LDH activity. Thus, a combined inhibition of both targets appears to inhibit tumor cell proliferation effectively. Since hypoxic or anoxic conditions prevail in large parts of solid tumors, the efficacy of the three inhibitors was also investigated at 5% and 1% oxygen, which are considered to be physiological for solid tumors.
The most important results of the study are that both sodium oxamate and galloflavin, as well as reversan trigger an antiproliferative effect in colorectal carcinoma cells, even in the presence of tumor physiological oxygen concentrations. For example, the pro-portion of viable cells decreased up to 45% with sodium oxamate or galloflavin and up to 60% with reversan, even at 5% and 1% oxygen compared to untreated control cells.
Different combinations of sodium oxamate, galloflavin and reversan resulted in en-hanced antiproliferative effects, which were also demonstrated at tumor physiological oxygen concentrations. The strongest antiproliferative effects were observed with the triple combination of galloflavin, sodium oxamate and reversan. In this combination, the proportion of viable cells decreased to 28% at 1% oxygenation in four of the five colorectal carcinoma cell lines. The triple combination caused an antiproliferative effect that was equal to or even more potent than the antiproliferative effect of the chemotherapeutic agent 5-FU also at 5% and 1% oxygen.
The results of this study on the antiproliferative effect of sodium oxamate, galloflavin (both LDH inhibitors) and reversan (MRP1 inhibitor) in vitro seems to confirm the aim of the study, which was to induce an antiproliferative effect even in tumor physiologi-cal oxygen concentrations. In part, the combined inhibition of LDH and MRP1 caused a stronger antiproliferative effect than 5-FU. However, further investigations are neces-sary to comprehend the molecular interaction between LDH and MRP1 as well as its inhibition in detail.
KW - Lactatdehydrogenase
KW - 5-FU
KW - Multidrug-Resistance-Related Proteine
KW - Inhibition
KW - Metabolismus
KW - Tumorzellen
KW - Tumormetabolismus
KW - Chemoresistenz
KW - tumorspezifische Therapie
KW - Intratumorale Heterogenität
Y1 - 2018
U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-156051
ER -
TY - THES
A1 - Schmid, Evelyn
T1 - Effekte des Raf Kinase Inhibitor Proteins (RKIP) auf β-adrenerge Signalwege, Herzfunktion und die Entwicklung der Herzinsuffizienz
T1 - Effects of the Raf Kinase Inhibitor Protein (RKIP) on β-adrenergic signalling, cardiac function and the development of heart failure
N2 - Das Raf kinase inhibitor protein (RKIP) ist ein Kinaseregulator, der im Herzen eine Präferenz für die G-Protein-gekoppelte Rezeptorkinase 2 (GRK2) zeigt. Die Regulation erfolgt durch direkte Interaktion beider Proteine, wird durch eine PKC-Phosphorylierung an Serin 153 des RKIP induziert und inhibiert die GRK2-vermittelte Phosphorylierung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR). Die GRK2 desensitiviert GPCR und eine Hemmung der GRK2-Aktivität wirkt sich so positiv auf die Ansprechbarkeit von GPCR aus. Die \textbeta-adrenergen Rezeptoren (\textbeta AR) sind im Herzen maßgeblich an der Regulation der kardialen Kontraktilität beteiligt. Erste Zusammenhänge zwischen der RKIP-Expression und der kontraktilen Antwort von Kardiomyozyten wurden bereits in einer früheren Arbeit untersucht und bestätigt. Sie begründen die Fragestellung nach Effekten einer verstärkten RKIP-Expression auf \textbeta-adrenerge Rezeptorsignale, Herzfunktion und die Entwicklung der Herzinsuffizienz.
Im Rahmen dieses Projektes konnten die Effekte des RKIP auf \textbeta-adrenerge Signalwege detaillierter beschrieben werden. Dabei erwies sich die inhibitorische Funktion auf die GRK2 als rezeptorspezifisch ohne Einfluss auf zytosolische Angriffspunkte der GRK2 zu nehmen. Verstärkte \textbeta-adrenerge Signale zeigten sich in neonatalen Kardiomyozyten an Hand der erhöhten cAMP-Level, PKA-Aktivität, sowie Kontraktionsrate und Relaxationsgeschwindigkeit nach \textbeta-adrenerger Stimulation. Im Einklang damit konnte eine erhöhte PKA- und CaMKII-Aktivität und eine positive Inotropie in transgenen Tieren, mit herzspezifischer Überexpression von RKIP, beobachtet werden. Durch Messung des Calcium-\textit{Cyclings} in Kardiomyozyten konnte der Phänotyp auf eine verbesserte Rückführung des Calciums, einer daraus resultierenden erhöhten Calciumbeladung des sarkoplasmatischen Retikulums und einem gesteigerten systolischen Calciumspiegel, zurückgeführt werden. Die Untersuchung der Phosphorylierung von Calciumkanälen, L-Typ-Calciumkanal und Ryanodin-Rezeptor 2, die den einwärtsgerichteten Calciumstrom vermitteln konnte ihre Beteiligung an der positiv inotropen Wirkung ausschließen.
Neben dem kontraktilen Phänotyp konnten zusätzliche protektive Effekte beobachtet werden. In Modellen, die eine chronische \textbeta-adrenerge Stimulation imitieren, bzw. eine Nachlasterhöhung induzieren konnte eine Verringerung der interstitiellen Fibrose und der damit assoziierten Marker, gezeigt werden. Mit Hilfe von \textit{in vivo} EKG-Messungen konnte die Neigung zur Ausbildung von Arrhythmien untersucht werden. Auch im Hinblick auf die Anzahl der Extrasystolen waren RKIP-transgene Tiere geschützt. Infolge der Untersuchung der Phänotypen in Deletionshintergründen der einzelnen \textbeta AR-Subtypen (\textbeta\textsubscript{1}AR, \textbeta\textsubscript{2}AR) konnte die positive Inotropie mit den spezifischen Signalwegen des \textbeta\textsubscript{1}AR assoziiert und die protektiven Effekte gegenüber den Umbauprozessen und der Arrhythmieneigung dem \textbeta\textsubscript{2}-adrenergen Signalen zugeschrieben werden. Zusätzlich bestätigt sich eine besondere Rolle der G\textalpha\textsubscript{i}-Kopplung des \textbeta\textsubscript{2}AR, durch die er einen hemmenden Einfluss auf die \textbeta\textsubscript{1}AR-Singale nehmen kann.
Die Untersuchung einiger Marker, die eine physiologische von einer pathologischen Hypertrophie unterscheiden, konnte das in den RKIP-transgenen Mäusen auftretende Wachstum der Kardiomyozyten als kompensatorische und physiologische Hypertrophie charakterisieren. Zusammengenommen weisen diese Ergebnisse auf eine ausgeglichene Aktivierung der beiden Rezeptoren hin, die sich gegenseitig regulieren und durch die Inhibition der GRK2 in ihrer Anregbarkeit erhalten bleiben. Mittels einer AAV9-vermittelten Gentherapie konnte das therapeutische Potential dieses Prinzips weiter bestätigt werden, da es die prominentesten Veränderungen während der Herzinsuffizienzentwicklung, wie die Verschlechterung der linksventrikulären Funktion, die Dilatation des linken Ventrikels, die Ausbildung von Lungenödemen und interstitieller Fibrose sowie die Expression von Herzinsuffizienz-assoziierten Genen, verhindern konnte. Auch konnten die Auswirkungen der Deletion des RKIP, die sich durch eine beschleunigte und gravierendere Herzinsuffizienzentwicklung auszeichnet, durch Reexpression von RKIP verhindert werden.
Diese Arbeit kann somit zeigen, dass das RKIP eine ausgeglichene Verstärkung von \textbeta-adrenergen Signalwegen verursacht, die positiv inotrop und gleichzeitig protektiv wirkt. Dieses Wirkprinzip könnte ferner eine Strategie zur Erhöhung der Kontraktilität in der Herzinsuffizienz darstellen, die entgegen etablierter Theorien auf der Stimulation beider \textbeta AR basiert.
N2 - The Raf kinase inhibitor protein (RKIP) is a kinase regulator with a preference for the G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) in the heart. The mechanism is a direct interaction of GRK2 and RKIP, which is triggered by a PKC-mediated phosphorylation at serine 153 of RKIP. By binding the GRK2, RKIP prevents the GRK2-mediated GPCR-phosphorylation and, thus, desensitisation of GPCR. As a result, inhibition of GRK2-activity positively affects the responsiveness of cardiac G protein-coupled receptors (GPCR). The GPCR primarly responsible for the regulation of the cardiac contractility are the \textbeta-adrenergic receptors (\textbeta AR). Previous work proved an interrelation of RKIP-expression and contractile response of cardiomyocytes and set a basis for the subject of this thesis, dealing with the effects of RKIP-expression on beta-adrenergic signalling, cardiac function and the development of heart failure.
The work describes the impact of RKIP on \textbeta-adrenergic signaling in more detail. An important feature of the inhibitory function of RKIP on GRK2 is a specificity for receptor targets (\textbeta AR) with no, or only minor, impact on the cytosolic targets of the GRK2. RKIP also increases \textbeta-adrenergic signalling. This appears in neonatal cardiac myocytes through an increased cAMP-generation, PKA-activity, contractile action and relaxation velocity after \textbeta-adrenergic stimulation. Similarly, RKIP-transgenic mice, with heart specific RKIP-expression, showed higher PKA and CaMKII-activities as well as, a positive inotropy. Analysis of the calcium cycling in these cardiomyocytes provided an explanation for the hypercontractile phenotype: an enhanced calcium reuptake into the sarcoplasmatic reticulum (SR), the resulting higher calcium load of the SR and an increased calcium amplitude in the cytosol during the systole cause the augmented contractile force. Furthermore, it could be ruled out, that two inward rectifying channels - L-type calcium channnel and Ryanodin Receptor 2 contribute to the positve inotropy in RKIP-transgenic mice.
Besides, the RKIP-expression had additional protective effects in heart failure development, which were investigated by desease models. Hypertrophy was induced by chronic \textbeta-adrenergic stimulation and heart failure by induction of pressure overload. Under these conditions, RKIP could reduce the development of interstitial fibrosis and the expression of associated marker genes. The occurence of arrhythmias, in particular ectopic beats, was assessed by the analysis of \textit{in vivo} ECG-traces. Rated by the number of ectopic beats RKIP-transgenic mice were also protected against the induction of arrhythmia.
The analysis of RKIP-expression in \textbeta AR subtype-KOs (\textbeta\textsubscript{1}KO, \textbeta\textsubscript{2}KO) could relate the different effects of RKIP to the signalling pathways of either \textbeta\textsubscript{1}AR or \textbeta\textsubscript{2}AR. As a result, RKIP effects the positive inotropy through signals of the \textbeta\textsubscript{1}AR and the protection against heart failure-related remodelling processes and arrhythmia through signals of the \textbeta\textsubscript{2}AR. Additionally a major importance could be assigned to the G\textalpha\textsubscript{i} coupling of the \textbeta\textsubscript{2}AR. This capacity of the \textbeta\textsubscript{2}AR can counteract potentially maladaptive signalling of the \textbeta\textsubscript{1}AR. A monitored growth of cardiomyocytes of RKIP-transgenic mice was assessed in greater depth using different markers to differentiate physiological from pathological hypertrophy. Thereby the occurring hypertrophy was characterised as physiological and compensatory.
Taken together, these results point towards a balanced activation of both \textbeta AR. They influence each other through downstream signals and are protected from desensitisation and loss of \textbeta-adrenergic responsivness through inhibition of the GRK2 by RKIP. To validate the therapeutic potential of this mode of action, an AAV9-mediated gene therapy was conducted. In this setting, RKIP was able to prevent, or strongly reduce the most prominent changes during heart failure development. Among these are the decline of the left ventricular function, dilation of the left ventricle, development of a pulmonary congestion, interstitial fibrosis and the expression of heart failure associated genes. Moreover, the consequences of RKIP deletion, which are reflected in an accelerated and deteriorated heart failure development, could be reversed by the reexpression of RKIP.
This work shows, that RKIP induces an even activation of \textbeta-adrenergic signalling, which results in a positive inotropy with concomitant protective effects. RKIPs mode of action represents a strategy and bears the possibilty to enhance cardiac contractility in the failing heart by stimulation of both \textbeta AR, which is contrary to the common belief.
KW - Herzinsuffizienz
KW - Raf-Kinasen
KW - Inhibition
KW - Kinase signaling
KW - Beta-Rezeptor
KW - beta-adrenerge Signalwege
KW - Protein
Y1 - 2016
U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-142486
ER -
TY - THES
A1 - Müller, Elisabeth
T1 - Pan-Raf-Inhibition als neue therapeutische Strategie im Multiplen Myelom
T1 - Pan-Raf-Inhibition as a new therapeutical strategy in Multiple Myeloma
N2 - Das Multiple Myelom (MM) ist eine durch monoklonale Vermehrung terminal differenzierter Antikörper-produzierender B-Lymphozyten (Plasmazellen) im Knochenmark charakterisierte maligne Krankheit, die sich v.a. in osteolytischen Knochendestruktionen, hämatopoetischer und Niereninsuffizienz äußert. Verbesserte Therapieansätze wie die Hochdosis-Chemotherapie mit Melphalan und anschließender autologer Stammzelltransplantation sowie die Einführung neuer pharmakologischer Substanzklassen (Proteasom-Inhibitoren, Cereblon-bindende Thalidomidderivate) führten zu einer Verlängerung der durchschnittlichen Überlebenszeit, für die meisten der Patienten ist die Erkrankung jedoch derzeit unheilbar. Die Erforschung neuer potenzieller therapeutischer Angriffspunkte auf Grund pathobiologischer Erkenntnisse bleibt daher unabdingbar. Ein Ansatz zur Verbesserung des Verständnisses der Pathogenese ist die funktionelle, molekulare und genetische Analyse des Signalnetzwerkes im MM. Im Zusammenhang mit diesem Konzept wurde entdeckt, dass wachstums-regulierende Signalwege in MM Zellen aktiviert oder dereguliert sind und zum Überleben und der Proliferation des Tumors beitragen. So konnte beispielsweise von unserer Arbeitsgruppe bereits gezeigt werden, dass onkogenes Ras essentiell zum Überleben der MM Zellen beiträgt. Da Ras derzeit mangels spezifischer Inhibitoren pharmakologisch nicht angreifbar ist, stellen weitere funktionelle Bestandteile des Signalweges eine potenzielle therapeutische Zielstruktur dar. Während die Blockade von MEK1/2 in MM Zellen keinen Einfluss auf das Überleben hatte, konnte durch die Blockade von Raf in ersten Tests unserer Arbeitsgruppe Apoptose hervorgerufen werden. Aus diesem Grund habe ich in der vorliegenden Arbeit zur Evaluation eines neuen Therapieansatzes die Rolle der Raf-abhängigen Signaltransduktion eingehend untersucht. Als Grundlage diente dabei die Hypothese, dass die Raf-Kinasen entscheidende Effektoren der durch onkogenes Ras vermittelten apoptotischen Effekte darstellen. In einem ersten Schritt konnte ich nachweisen, dass alle drei Raf-Isoformen (A-, B- und C-Raf) in humanen MM Zelllinien und in primären MM Zellen aktiviert sind. Mittels shRNA-vermittelter, Isoform-spezifischer Raf-Knockdown-Experimente konnte ich zeigen, dass nur ein simultaner Knockdown aller Isoformen, d.h. ein Pan-Raf-Knockdown, zu einer De-Phosphorylierung von MEK1/2 und ERK1/2 führte. Dieser Versuch ließ sich mittels pharmakologischer Raf-Inhibition, bei der ebenfalls nur eine Pan-Raf-Blockade zu einer Herunterregulation von MEK1/2 und ERK1/2 in MM Zellen führte, bestätigen. Das MEK/ERK-Modul stellte somit einen hervorragenden Surrogat- und Biomarker für die Pan-Raf-Aktivität dar. Im Gegensatz zur Blockade des MEK/ERK-Moduls führte eine Hemmung der Pan-Raf-Aktivität mittels shRNA oder pharmakologischer Inhibitoren in allen untersuchten Zelllinien und in der Mehrheit der primären MM Zellen zu einer starken Induktion von Apoptose. Da das Ansprechen auf eine Pan-Raf-Blockade nicht mit dem Ras-Mutationsstatus korrelierte, könnten die Raf-Kinasen eine von onkogenem Ras unabhängie Qualität als therapeutische Zielstruktur aufweisen. Zur Untersuchung möglicher MEK/ERK-unabhängiger Effektormechanismen der Pan-Raf-Inhibition habe ich die mRNA-basierten Genexpressionsprofile von INA-6 Zellen nach pharmakologischer Pan-Raf- oder MEK-Inhibition verglichen. Dabei führte die Pan-Raf-Inhibition zu einer Regulation von wesentlich mehr Genen, wobei sich auch die Art der regulierten Gene unterschied, darunter Gene mit tumorrelevanten Funktionen wie Regulation von Proliferation, Zellzyklus und Apoptose. Für eine dieser Gengruppen, die Gruppe der PI3K-abhängigen, mTOR-assoziierten Gene, konnte ich eine Regulation auch auf der Proteinebene nachweisen: die Phosphorylierungen von mTOR, p70S6K, Rb und AKT und die Expression von CyclinD1 und PDK1 waren nach Pan-Raf-Inhibition, nicht jedoch nach MEK-Blockade herunterreguliert. Dieses Ergebnis deutet auf eine Ko-Regulation der PI3K-abhängigen Signaltransduktion durch die Raf-kinasen hin. Mittels spezifischer PI3K-Inhibitoren ließ sich sowohl bei der Regulation der untersuchten Proteine als auch bei der Induktion von Apoptose eine deutliche Verstärkung der Pan-Raf-Inhibition in HMZL und in primären Zellen erzielen. Zusammengefasst zeigt diese Arbeit, dass die Pan-Raf-Blockade eine neue Therapiemöglichkeit darstellt, die durch Kombination mit einer PI3K/AKT-Inhibition noch verstärkt werden kann.
N2 - Multiple Myeloma (MM) is a malignant disease which is characterized by monoclonal expansion of terminally differentiated, antibody-producing B-lymphocytes (plasma cells) and results mostly in bone lesions, haematopoietic and renal insufficiency. Improved therapeutic approaches like high-dose melphalan chemotherapy followed by autologous stem-cell transplantation and the introduction of new pharmacological compounds (proteasome inhibitors, cereblon-binding Thalidomide derivates) increased the mean survival time. Nevertheless, the disease remains incurable for most of the patients. Therefore, the exploration of new potential therapeutical targets based on pathobiologic insights becomes vital. One approach to improve the understanding of the pathogenesis is to analyze functionally, molecularly and genetically the signaling network in MM. In the context of this concept, it was discovered, that growth-regulating pathways are activated or deregulated in MM cells and contribute to tumor survival and proliferation. Our working group could already proof that oncogenic Ras is crucial for cell survival. Since Ras itself does not yet represent a druggable target, therapeutical approaches should aim at other functional parts of the pathway. While blocking of MEK1/2 has no influence on MM cell survival, early reports of our working group showed that inhibiting Raf induced apoptosis. For this reason I investigated the role of Raf-dependent signaling in order to evaluate a new therapeutic approach. This was based on the hypothesis that Raf kinases act as important effectors for the apoptotic effects of oncogenic Ras. As a first step, I could prove, that all three Raf isoforms (A-, B- and C-Raf) are activated in human MM cell lines and in primary MM cells. By using of shRNA-mediated, isoform-specific Raf knockdown experiments I could reveal that only the simultaneous knockdown of all three isoforms, i.e. a Pan-Raf knockdown, led to de-phosphorylation of MEK1/2 and ERK1/2. Also pharmacological Raf inhibition showed that only Pan-Raf blockage decreases the phosphorylation of MEK1/2 and ERK1/2 and thereby confirmed the knockdown experiment. These experiments also proved that the MEK/ERK module is a strong surrogate and biomarker for Pan-Raf activity. Contrary to inhibiting the MEK/ERK module the inhibition of Pan-Raf activity by shRNAs or pharmacological inhibitors led on to a strong induction of apoptosis in the tested cell lines and in the majority of primary cells. Since the response to Pan-Raf inhibition did not correlate with Ras mutational status, the Raf kinases could probably represent a Ras-independent therapeutical target of high quality. In order to decode possible MEK/ERK-independent effector mechanisms I compared the mRNA-based gene expression profiles of INA-6 cells after pharmacological inhibition of Pan-Raf or MEK. Pan-Raf inhibition led to the regulation of a greater number of genes, taking into account that the character of the regulated genes also varied. This included genes with functions relevant for tumors like regulation of proliferation, cell cycle and apoptosis. For one of these groups, the PI3K-dependent, mTOR-associated genes, I could show the regulation on the level of the proteins: phosporylation of mTOR, p70S6K, Rb and AKT as well es the expression of cyclinD1 and PDK1 decreased after Pan-Raf inhibition, but not after MEK inhibition. This result suggests a co regulation of the PI3K-dependent signal transduction by Raf kinases. In summary, this thesis presents a rationale for Pan-Raf inhibition as a new therapeutical option, which can be enhanced by combination with PI3K/AKT-inhibition.
KW - Plasmozytom
KW - Raf-Kinasen
KW - Inhibition
KW - Multiples Myelom
KW - Pan-Raf-Inhibition
KW - Behandlungsoption
Y1 - 2015
U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-124666
ER -
TY - THES
A1 - Völker, Michael
T1 - Entwicklung, Charakterisierung und Anwendung neuer In-vitro-Methoden zur Untersuchung des Fremdstoffmetabolismus und der Inhibition fremdstoffmetabolisierender Enzyme
T1 - Development, characterisation and application of new in-vitro-methods for the investigation of xenobiotic metabolism and the inhibition of xenobiotic metabolising enzymes
N2 - Arzneistoffe werden nach ihrer Applikation durch verschiedene fremdstoff-metabolisierende Enzyme des Organismus biochemisch verändert. Durch eine Hemmung dieser Enzyme, z. B. durch Grapefruitsaft oder einen gleichzeitig eingenommenen Arzneistoff, kann es insbesondere bei Arzneistoffen mit geringer therapeutischer Breite, wie z. B. Theophyllin oder Phenprocoumon, zu gefährlichen Nebenwirkungen kommen. Besonders gefährdet sind multimorbide Patienten, die eine Therapie mit einer Vielzahl von Arzneimitteln erhalten. Um den Metabolismus von neuen Wirkstoffen und deren Interaktionspotential zu untersuchen, werden u. a. In-vitro-Experimente mit Zellfraktionen oder einzelnen Enzymen durchgeführt. Bei Inhibitionsassays wird der Einfluss von Arzneistoffen auf die Umsetzung eines Testsubstrates untersucht. Ein Großteil dieser Arbeit beschäftigt sich daher mit der Entwicklung von Methoden, mit denen die Inhibition wichtiger fremd-stoffmetabolisierender Enzyme, wie Cytochrom-P450-Enzyme (CYP-Enzyme), Glutathion-S-Transferasen (GSTs) und Carboxylesterasen (CES), untersucht werden kann. Dabei wurde auch eine Charakterisierung der Testsubstrate vorgenommen. Darüber hinaus wurden die Bioaktivierung von Clopidogrel und die Bildung von reaktiven Metaboliten untersucht.
Aufgrund aktueller Diskussionen über die Interaktion zwischen Clopidogrel und Omeprazol wurde in dieser Arbeit die Bioaktivierung von Clopidogrel mit Hilfe von LC/MS/MS-Analysen und rekombinanten CYP-Enzymen sowie humanen Lebermikrosomen untersucht. Aufgrund der Instabilität des aktiven Metaboliten wurde in den inkubierten Proben eine Derivatisierung mit Dimedon durchgeführt. Die Untersuchungen zeigten, dass die Umwandlung zum 2-Oxo-Clopidogrel durch mehrere CYP-Enzyme erfolgt. Neben CYP2C19 sind CYP1A2, CYP2B6, CYP2C9 und CYP3A4 beteiligt. Anhand von selektiven Inhibitoren konnte CYP3A4 für die Bildung des aktiven Metaboliten aus 2-Oxo-Clopidogrel identifiziert werden. Neben der Biotransformation durch CYP-Enzyme wird hauptsächlich der Carbonsäureester des Clopidogrels hydrolysiert. Untersuchungen mit humanen Subzellfraktionen und rekombinanten Carboxylesterasen zeigen, dass die Esterhydrolyse durch CES1 katalysiert wird. Des Weiteren wurde der Metabolismus von Omeprazol untersucht. Es stellte sich heraus, dass die 5-Hydroxylierung und die 5-O-Demethylierung hauptsächlich durch CYP2C19 und CYP2D6 erfolgen. Dabei besitzt Omeprazol die höchste Affinität zu CYP2C19. Die Bildung von Omeprazolsulfon wird hingegen nur durch CYP3A4 katalysiert. Mit Hilfe etablierter CYP-Inhibitionsassays wurde der Einfluss von Clopidogrel und Omeprazol auf neun verschiedene CYP-Enzyme untersucht. Durch Clopidogrel wurden CYP2B6 (IC50 = 6 nM), CYP2C19 (IC50 = 0.4 µM) und CYP1A2 (IC50 = 2.8 µM) gehemmt. Omeprazol inhibiert v. a. CYP2C19 (IC50 = 2 µM) und CYP3A4 (IC50 = 17 µM). Im Folgenden wurde auch der Einfluss von Omeprazol auf die Bildung von 2-Oxo-Clopidogrel untersucht. Die Bioaktivierung wurde allerdings erst bei einer Omeprazol-Konzentration von mehr als 10 µM beeinflusst. Am stärksten wurde dabei CYP2C19 (IC50 ca. 100 µM) gehemmt. Aufgrund der recht schwachen Inhibition von CYP2C19 durch Omeprazol und der Tatsache, dass mehrere CYP-Enzyme die Bildung von 2-Oxo-Clopidogrel katalysieren, lässt sich der Wirkungsverlust von Clopidogrel bei einer gleichzeitigen Einnahme von Omeprazol anhand der Ergebnisse der In-vitro-Versuche nicht durch eine Hemmung von CYP2C19 erklären.
Eine bisher nur wenig bei In-vitro-Interaktionsstudien untersuchte Klasse fremdstoffmetabolisierender Enzyme sind die Carboxylesterasen (CES), die v. a. bei der Bioaktivierung von Esterprodrugs eine wichtige Rolle spielen. Für die Entwicklung von Inhibitionsassays wurden zunächst verschiedene Modellsubstrate ausgewählt. Nach Inkubation dieser Substrate mit humanen Subzellfraktionen und rekombinanten Carboxylesterase-Enzymen wurden die Metaboliten mit Hilfe einer HPLC/UV-Analyse quantifiziert. Es zeigte sich, dass Methyl-4-nitrobenzoat und Mycophenolatmofetil selektiv durch CES1 hydrolysiert werden. Die Hydrolyse von Phenylacetat, p-Nitrophenylacetat und 4-Methylumbelliferylacetat wurde durch alle verwendeten Enzyme katalysiert. Darüber hinaus konnte eine Hydrolyse der aus Boswellia-Arten (Weihrauch) stammenden 3-O-Acetyl-11-keto--boswelliasäure durch CES2 beobachtet werden. Aufgrund der bei den meisten Modellsubstraten auftretenden Instabilität im Inkubationspuffer war eine Korrektur mit Hilfe von Blindproben erforderlich. Die Hydrolyse konnte durch Erniedrigung des pH-Wertes des Inkubationspuffers von 7.4 auf 6.5 und durch die Zugabe von Essigsäure zur Stopplösung verlangsamt werden. Anschließend wurde die Beeinflussung der Hydrolyse von p-Nitrophenylacetat durch Pflanzenextrakte untersucht. Es zeigte sich, dass zahlreiche Extrakte die Esterasen aus der humanen Leber hemmten und die Aktivität bei einer Extraktkonzentration von 25-50 µg/ml weit unterhalb von 50 % lag. Die Inhibition von CES durch Pflanzenextrakte stellt daher ein bisher unbekanntes Risiko für Arzneimittelinteraktionen dar.
Cytochrom-P450-Enzyme (CYP-Enzyme) sind die wichtigste Gruppe fremdstoff-metabolisierender Enzyme. Zur Untersuchung der Beeinflussung dieser Enzyme durch neue Wirkstoffe werden daher standardmäßig In-vitro-Interaktionsstudien durchgeführt. Von der Food and Drug Administration (FDA) wurden daher für jedes CYP-Enzym verschiedene Arzneistoffe als Testsubstrate vorgeschlagen. Zusätzlich kommen bei solchen Untersuchungen Modellsubstrate zum Einsatz, deren Metaboliten fluoreszieren und die somit für ein Hochdurchsatz-Screening mit Hilfe von Mikrotiterplatten verwendet werden können. In dieser Arbeit wurde eine Reihe von Modellsubstanzen (Cumarin- und Harman-Derivate) auf ihre Eignung als Substrate für CYP-Inhibitionsassays untersucht. Nach der Entwicklung von Methoden zur Detektion der Metaboliten, die durch LC/MS/MS-Analysen oder durch HPLC/Fluoreszenzanalysen erfolgte, wurden die CYP-Enzyme identifiziert, die an der Umsetzung der Substrate beteiligt sind und mit Hilfe von CYP-Enzymen und humanen Lebermikrosomen wurden die Km-Werte der Substrate bestimmt. Die Untersuchungen zur Stabilität der CYP-Enzyme über 60 min zeigten, dass diese bei 37 °C stark an Aktivität verlieren, insbesondere CYP1A2. Für eine maximale Umsetzungsgeschwindigkeit war eine NADPH-Konzentration von 1 mM ausreichend. Die Untersuchung von 14 Standardsubstraten ergab, dass die Mehrheit selektiv durch das entsprechende CYP-Enzym umgesetzt wird. Die Amodiaquin-N-deethylierung, die Tolbutamidhydroxylierung, die Chlorzoxazon-6-hydroxylierung und die 4-Nitrophenol-2-hydroxylierung wurden durch mehrere CYP-Enzyme katalysiert. Als Positivkontrollen für die Inhibitionsassays und zur Identifizierung der am Metabolismus beteiligten CYP-Enzyme werden von der FDA verschiedene Inhibitoren vorgeschlagen. Da nicht zu allen Inhibitoren Daten über deren Isoenzymselektivität vorliegen, wurde mit Hilfe der Assays die inhibitorische Aktivität von zwölf Inhibitoren auf neun verschiedene CYP-Enzyme untersucht. Alle Inhibitoren hemmten das jeweilige angegebene CYP-Enzym. Bei Furafyllin (CYP1A2), Tranylcypromin (CYP2A6), Clopidogrel (CYP2B6), Montelukast (CYP2C8), Sulfaphenazol (CYP2C9), Chinidin (CYP2D6) und Ketoconazol (CYP3A4) konnte eine Konzentration ermittelt werden, bei der nur ein CYP-Enzym gehemmt wird. Für Quercetin, Nootkaton, Diethyldithiocarbamat, Sertralin und Ticlopidin wurde eine Inhibition mehrerer CYP-Enzyme festgestellt. Mit Hilfe der CYP-Inhibitionsassays wurden Extrakte lebertoxischer Arzneipflanzen, wie z. B. Tussilago farfara (Huflattich) oder Chelidonium majus (Schöllkraut), untersucht. Alle Extrakte hemmten konzentrationsabhängig die CYP-Enzyme, am stärksten die Enzyme der Subfamilie CYP2C.
Als In-vitro-Substrate für CYP-Inhibitionsassays werden aufgrund ihrer starken Fluoreszenz häufig Cumarin-Derivate eingesetzt. In dieser Arbeit wurden daher 18 O-alkylierte bzw. O-benzylierte Derivate von 7-Hydroxycumarin, 7-Hydroxy-4-methylcumarin und 7-Hydroxy-4-trifluormethylcumarin synthetisiert und die Umsetzung durch verschiedene CYP-Enzyme mit Hilfe der zuvor optimierten LC/LC/Fluoreszenz-basierten Assays untersucht. An der O-Desalkylierung der Cumarin-Derivate waren hauptsächlich CYP1A2, CYP2B6 und im geringeren Ausmaß CYP2C19, CYP2D6 und CYP2E1 beteiligt. Die höchste Affinität besaßen die Substrate zu CYP1A2. Debenzylierungen wurden neben CYP1A2 hauptsächlich durch CYP3A4 katalysiert. Die höchsten Umsetzungsgeschwindigkeiten wurden für die Debenzylierung von 7-Benzyloxy-4-methylcumarin (BMC, 14 pmol/pmol P450/min) und 7-Benzyloxy-4-trifluormethylcumarin (BFC, 9 pmol/pmol P450/min) beobachtet. Für 7-Methoxy-4-trifluormethylcumarin (MFC) war die Umsetzungs¬geschwindigkeit für die O-Demethylierung mit CYP1A2 und CYP2B6 im Vergleich zu CYP2C9 deutlich höher. MFC und 7-Ethoxy-4-trifluormethylcumarin (EFC) eignen sich daher v. a. für Inhibitionsuntersuchungen von CYP2B6. Bei den untersuchten 7 Alkyloxycumarinen handelt es sich in allen Fällen nicht um selektive CYP-Substrate. Sie können demnach nicht für Inhibitionsuntersuchungen mit humanen Lebermikrosomen verwendet werden. Ein Einsatz für Simultanbestimmungen der Hemmung mehrerer CYP-Enzyme in einem Versuch (Cocktail-Assay) ist aus diesem Grund ebenfalls nicht möglich. Durch LC/MS-Analysen nach Inkubation der Cumarin-Derivate mit humanen Lebermikrosomen zeigte sich, dass neben den entsprechenden O Desalkylmetaboliten mehrere Hydroxymetaboliten entstehen und der O Desalkylmetabolit insbesondere bei Derivaten mit längeren Alkylsubstituenten nicht der Hauptmetabolit ist.
Ein Ziel der Arbeitsgruppe ist es zudem, neue In-vitro-Substrate zur Untersuchung der Inhibition von CYP-Enzymen mit besseren enzymkinetischen und analytischen Eigenschaften zu entwickeln. Grundstruktur hierfür ist das -Carbolin, da -Carbolin-Derivate eine starke Fluoreszenz aufweisen. Von dem Naturstoff Harmin ist bekannt, dass dieser durch CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19 und CYP2D6 O-demethyliert wird. Durch Modifizierung der Harman-Struktur sollte die CYP-Isoenzymselektivität für die O-Dealkylierung gesteigert werden und Substrate für weitere CYP-Enzyme erhalten werden. Hierfür wurden in der Arbeitsgruppe u. a. 2-Benzyl-7-benzyloxyharman (BBH), 2-Benzyl-7-methoxyharman (BMH), 7-Methoxy-9-(4-carboxybenzyl)harman (MCBH) und 2-Methyl-7-methoxyharman (MMH) hergestellt. In dieser Arbeit wurden LC/LC/Fluoreszenz- und LC/MS/MS-Methoden zur Quantifizierung der aus diesen Derivaten entstehenden O-Desalkylmetaboliten entwickelt und die Substrate charakterisiert. Die Einführung von Benzylsubstituenten an der phenolischen Hydroxylgruppe von Harmol (BBH) führte zum Metabolismus durch CYP3A4 und die Substitution mit einem Carboxybenzylrest am Indolstickstoff (MCBH) verstärkte die Selektivität zu den Enzymen der Subfamilie 2C. Durch die Methylierung des Pyridin-Stickstoffs des Harmins (MMH) wurde ein selektives Substrat für CYP2D6 erhalten, weshalb bei dieser Substanz auch humane Lebermikrosomen verwendet werden können. Durch die im Vergleich zu anderen CYP2D6-Substraten erhaltene hohe Umsetzungsgeschwindigkeit lässt sich die Proteinkonzentration minimieren. Für die überwiegend an der O-Dealkylierung der Substrate beteiligten CYP-Enzyme wurden die Km-Werte ermittelt. Bei der Untersuchung von verschiedenen CYP-Inhibitoren zeigte sich, dass mit diesen Substraten vergleichbare IC50-Werte, wie mit den Standardsubstraten, erhalten werden. Die Harman-Derivate können daher zur Untersuchung der Inhibition wichtiger CYP-Enzyme eingesetzt werden und bieten eine Alternative zu den bisher vorhandenen Fluoreszenz-Substraten. Durch die Einstellung des pH-Wertes im Anschluss an die Inkubation lassen sich die Metaboliten ebenfalls fluorimetrisch in der Mikrotiterplatte detektieren und können für ein Hochdurchsatz-Screening eingesetzt werden. Allerdings müssen die Fluoreszenzeigenschaften weiter verbessert werden, um eine kontinuierliche Bestimmung während der Inkubation zu ermöglichen.
In der pharmazeutischen Industrie besteht ein großes Interesse an der Detektion von reaktiven Metaboliten, um eine potentielle Lebertoxizität von neuen Wirkstoffen vorhersagen zu können. Hierfür werden die Testsubstanzen mit humanen Lebermikrosomen inkubiert und die reaktiven Metaboliten mit Glutathion abgefangen. Zur Optimierung der LC/MS/MS-Analysen wurde in dieser Arbeit die Fragmentierung solcher Addukte anhand von Standardsubstanzen untersucht. Bei allen untersuchten Glutathion-Addukten trat eine Abspaltung der Pyroglutaminsäure bei positiver Polarität mit einer vergleichbaren Signalintensität auf, weshalb eine Detektion dieses Fragmentes durch einen Neutral-Loss-Scan am besten geeignet erschien. Mit Hilfe der Screening-Methode wurden zuerst Arzneistoffe untersucht, von denen reaktive Metaboliten bekannt sind. Für die Bioaktivierung von Clozapin konnten CYP1A2, CYP2D6 und CYP3A4 identifiziert werden, während die Toxifizierung von Paracetamol hauptsächlich durch CYP1A2 und CYP3A4 erfolgte. Auffällig war, dass mit steigender Paracetamolkonzentration keine Sättigung der Umsetzung auftrat. Durchgeführte Molekülveränderungen am Glutathion, wie die Einführung eines Dansylrestes oder eines Biotins, führten zu keiner deutlichen Verbesserung der Detektion der reaktiven Metaboliten. Darüber hinaus zeigte sich, dass bei den markierten GSH-Derivaten die Umsetzung durch GSTs erheblich reduziert ist. Mit der Screening-Methode wurden allerdings viele falsch positive Signale erhalten, so dass diese nicht für eine Untersuchung von Extrakten lebertoxischer Pflanzen eingesetzt werden konnte. Für eine eindeutige und schnelle Identifizierung der Signale als Glutathion-Addukte ist daher die hochauflösende Massenspektrometrie erforderlich.
Eine weitere Klasse fremdstoffmetabolisierender Enzyme sind die Glutathion-S-Transferasen (GSTs), über deren Inhibition durch Arzneistoffe und Pflanzenextrakte in der Literatur nur wenige Daten vorliegen. Zur Entwicklung von Inhibitionsassays wurden die in der Literatur beschriebenen Substrate 1-Chlor-2,4-dinitrobenzol, 4 Nitrochinolin-N-oxid, 1,2-Dichlor-4-nitrobenzol und 4-Nitrobenzylchlorid verwendet. Die Detektion der Metaboliten erfolgte im Gegensatz zu der häufig eingesetzten Photometrie mit Hilfe der HPLC/UV- bzw. einer LC/MS/MS-Analyse. Für die Kalibrierung wurden zunächst die entsprechenden Glutathionkonjugate aus den Substraten synthetisiert. Bei den durchgeführten diskontinuierlichen Assays stellte die häufig auftretende nichtenzymatische Reaktion der Substrate mit Glutathion ein Problem dar. Durch die Erniedrigung des pH-Wertes des Inkubationspuffers von 7.4 auf 6.5 und der Senkung der Inkubationstemperatur von 37 °C auf 25 °C konnte die nichtenzymatische Reaktion während der Inkubation erheblich verlangsamt werden. Die nichtenzymatische Reaktion nach der Inkubation konnte durch Zugabe von Oxidationsmitteln gestoppt werden. Von den getesteten humanen Lebersubzell¬fraktionen besaß die cytosolische Fraktion bei allen Substraten die höchste Aktivität. Im Rahmen der Assayentwicklung wurde die Glutathion-, die Proteinkonzentration und die Inkubationszeit optimiert. Es wurden die Km- und Vmax-Werte für die Umsetzung der Substrate ermittelt. Als Positivkontrolle diente das ebenfalls synthetisierte Glutathionkonjugat der Etacrynsäure, für das die IC50-Werte mit jedem Substrat bestimmt wurden. Dabei konnte ein Einfluss des pH-Wertes des Inkubationspuffers und der Inkubationstemperatur auf die gemessene inhibitorische Aktivität beobachtet werden. Anschließend wurde ein Screening von Arzneistoffen, ausgewählten Naturstoffen und etwa 50 Pflanzenextrakten auf eine Inhibition der GSTs in humanem Lebercytosol mit 1-Chlor-2,4-dinitrobenzol, das am schnellsten von allen Substraten umgesetzt wurde, durchgeführt. Von den getesteten Naturstoffen fiel eine ausgeprägte Hemmung durch Biflavonoide auf. Nahezu alle untersuchten Pflanzenextrakte hemmten die GSTs. Eine starke Inhibition der GSTs zeigten Extrakte aus Cinnamomum cassia (Zimt), die sich als nicht-kompetitiv herausstellte. Weiterhin wurde eine starke Hemmung der Extrakte gerbstoffhaltiger Pflanzen, wie z. B. Hamamelis virginiana (virginische Zaubernuss) oder Krameria triandra (Ratanhia), beobachtet. Hier resultierten IC50-Werte zwischen 5 und 30 µg/ml. Ein Vergleich verschiedener Methoden zur Detektion des Metaboliten 2,4 Dinitrophenyl-S-glutathion zeigte, dass die Photometrie für die Untersuchung der Inhibition von Pflanzenextrakten aufgrund der Störung durch die Pflanzenmatrix ungeeignet ist. Mit Hilfe der verwendeten HPLC/UV- sowie der LC/MS/MS-Analyse konnte der Metabolit selektiv erfasst werden und reproduzierbare Ergebnisse für die Inhibition der GSTs durch Pflanzenextrakte erzielt werden.
Neben den GSTs wurde auch die Beeinflussung der Glutathionreduktase (GR) in dieser Arbeit untersucht. Hierfür wurde ein HPLC-basierter Assay entwickelt, bei dem das reduzierte Glutathion mit 5,5´-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure) derivatisiert und das entstandene gemischte Disulfid aus Glutathion und 5-Thio-2-nitrobenzoesäure quantifiziert wurde. Zur Untersuchung der Inhibition durch Pflanzenextrakte wurde humanes Lebercytosol verwendet, das von allen humanen Lebersubzellfraktionen die höchste Aktivität besaß. Im Vergleich zu den GSTs wurde die GR durch die überwiegende Zahl der ausgewählten Pflanzenextrakte kaum gehemmt. Eine nennenswerte Inhibition der GR konnte nur bei Extrakten von Juglans regia (Walnuss) beobachtet werden.
Fazit
In dieser Arbeit wurden eine Reihe von In-vitro-Methoden zur Untersuchung der Inhibition von CYP-Enzymen und weiteren fremdstoffmetabolisierenden Enzymen, wie CES oder GSTs, entwickelt. Aufgrund der dabei angewendeten selektiven HPLC-basierten Quantifizierung der Metaboliten durch UV-, Fluoreszenz- oder MS-Detektion können mit diesen Methoden auch Proben mit komplexer Matrix untersucht werden. Für alle Assays wurden die Inkubationsbedingungen optimiert und die enzymkinetischen Parameter vieler Substrate ermittelt. Darüber hinaus wurden wichtige Erkenntnisse über die Isoenzymselektivität dieser Substrate gewonnen. Die Eignung der Assays wurde anhand von Standardinhibitoren bewiesen. Schließlich wurde die inhibitorische Aktivität von zahlreichen Pflanzenextrakten bestimmt, deren Auswirkung auf fremdstoffmetabolisierende Enzyme bisher unbekannt war. Die in dieser Arbeit beschriebenen Methoden können für die Untersuchung des Metabolismus von Arzneistoffen und der Inhibition fremdstoffmetabolisierender Enzyme, die für eine Zulassung neuer Wirkstoffe erforderlich ist, routinemäßig eingesetzt werden.
N2 - Drugs are biochemically transformed by different xenobiotic metabolising enzymes after their application to humans. The inhibition of these enzymes, e. g. by grapefruit juice or a coadministrated drug, especially drugs with a small therapeutic range, for example theophylline or phenprocoumon, can result in serious side effects. Especially endangered are multimorbid patients, who get a therapy with multiple drugs. To examine the metabolism of new therapeutic agents and their potential for interactions, in-vitro-experiments will be done with tissue fractions or individual enzymes. In inhibition assays the influence of the drug on the transformation of the test substrate will be investigated. A major part of this work deals with the development of methods to test the inhibition of xenobiotic metabolising enzymes, like cytochrome P450 enzymes (CYP enzymes), glutathione S-transferases (GSTs) and carboxylesterases (CES). Thereby, a characterisation of the test substrates was performed. In addition the bioactivation of clopidogrel and the formation of reactive metabolites were investigated.
Due to current discussions about the interaction between clopidogrel and omeprazole, the bioactivation of clopidogrel was investigated by LC/MS/MS analysis and recombinant CYP enzymes or human liver microsomes. Because of the instability of the active metabolite a derivatisation of the incubated samples with dimedone were carried out. The investigation shows, that the transformation to 2 oxo-clopidogrel is catalysed by several CYP enzymes. Beside CYP2C19, the enzymes CYP1A2, CYP2B6, CYP2C9 and CYP3A4 are involved. With selective inhibitors CYP3A4 could be identified for the formation of the active metabolite from 2-oxo-clopidogrel. In addition to the biotransformation by CYP enzymes the carboxylic acid ester of clopidogrel is mainly hydrolysed. Incubations with human tissue fractions and recombinant carboxylesterases shows, that the hydrolysis of the ester is catalysed by CES1. Furthermore the metabolism of omeprazole was investigated. The results show, that the 5-hydroxylation and the 5-O-demethylation mainly is carried out by CYP2C19 and CYP2D6. Thereby omeprazole has the highest affinity to CYP2C19. In contrast, the formation of omeprazole sulfone is catalysed especially by CYP3A4. With the aid of established inhibition assays for CYP enzymes the influence of clopidogrel and omeprazole on nine different CYP enzymes was investigated. Clopidogrel inhibits CYP2B6 (IC50 = 6 nM), CYP2C19 (IC50 = 0.4 µM) and CYP3A4 (IC50 = 2.8 µM). Omeprazole inhibits especially CYP2C19 (IC50 = 2 µM) and CYP3A4 (IC50 = 17 µM). Subsequent, the influence of omeprazole on the formation of 2-oxo-clopidogrel was also investigated. However, the bioactivation of clopidogrel was decreased by concentrations of omeprazole higher than 10 µM. Here mostly CYP2C19 was inhibited with an IC50 value of about 100 µM. Due to the poor inhibition of CYP2C19 caused by omeprazole and the fact, that several CYP enzymes catalyse the formation of 2-oxo-clopidogrel, the loss of the pharmacological effect of clopidogrel during the simultaneous intake of omeprazole can not be explained with the inhibition of CYP2C19.
A previously insufficient investigated class of xenobiotic metabolising enzymes are carboxylesterases (CES) which especially play an important role in the bioactivation of ester prodrugs. For the development of inhibition assays different artificial substrates were selected. After the incubation with human tissue fractions and recombinant carboxylesterases the metabolites were quantified via HPLC/UV-analysis. It was demonstrated that methyl 4-nitrobenzoate and mycophenolate mofetil are selectively hydrolysed by CES1. The hydrolysis of phenyl acetate, p nitrophenyl acetate and 4-methylumbelliferyl acetate was catalysed by all enzymes used. Furthermore the hydrolysis of 3-O-acetyl-11-keto--boswellic acid, which can be isolated from various Boswellia species, by CES2 was obtained. Because of the instability of the most artificial substrates in the incubation buffer, a correction with a blank value was necessary. A decrease of the pH value of the incubation buffer from 7.4 to 6.5 and the addition of acetic acid to the termination solvent retards the hydrolysis. Afterwards the influence of the inhibitory activities of plant extracts on the hydrolysis of p-nitrophenyl acetate was investigated. The results shows, that numerous plant extracts inhibits esterases of the human liver and the activity with an extract concentration of 25-50 µg/ml is widely below 50 percent. Thus the inhibition of CES caused by plant extracts is until now an unknown risk of drug interactions.
Cytochrome P450 enzymes (CYP enzymes) are the most important class of xenobiotic metabolising enzymes. To investigate the influence of these enzymes due to new active substances standardised in vitro interaction studies will be performed. Thus the Food and Drug Administration (FDA) has suggested several drugs as test substrates for each CYP isoform. Additional artificial substrates are used in such studies. The metabolites of these substrates are fluorescent and therefore they are suitable for high-throughput screening analysis in multiwell plates. In this work, a series of artificial substrate (derivatives of coumarin and harmane) were investigated to their applicability as substrates for CYP inhibition assays. After the development of methods to detect the metabolites, which was done by LC/MS/MS- or HPLC/fluorescence analysis, the CYP isoforms for the transformation of the substrates were identified. With the aid of CYP enzymes and human liver microsomes the Km values were determined. The stability testing of the CYP enzymes during 60 min shows, that they strongly lose their activity at 37 °C, especially CYP1A2. For the maximum reaction velocity, a NADPH concentration of 1 mM was sufficient. The investigation of 14 standard substrates shows, that the majority was metabolised by a single CYP enzyme. The amodiaquine N-deethylation, the tolbutamide hydroxylation, the chlorzoxazone 6-hydroxylation and the 4 nitrophenole 2-hydroxylation were catalysed by several CYP isoforms. As positive control of the inhibition assays and for the identification of the CYP enzymes, which are involved in the metabolism, the FDA has also proposed several inhibitors. For many inhibitors there are no data of the selectivity to the CYP isoforms published. Therefore the inhibitory activity of 12 inhibitors with 9 different CYP enzymes by the established assays was investigated. All inhibitors inhibited the previously described CYP enzymes. For furafylline (CYP1A2), tranylcypromine (CYP2A6), clopidogrel (CYP2B6), montelukast (CYP2C8), sulfaphenazole (CYP2C9), quinidine (CYP2D6) and ketoconazole (CYP3A4) a concentration was found, which inhibited only one CYP enzyme. For quercetin, nootkatone, diethyldithiocarbamic acid, sertraline and ticlopidine an inhibition of several CYP enzymes was discovered. With the CYP inhibition assays liver toxic plant extracts of e. g. Tussilago farfara (coughwort) or Chelidonium majus (celandine) were investigated. All extracts inhibited the CYP enzymes concentration dependent, most intensive the enzymes of subfamily CYP2C.
Coumarin derivatives are often used as in vitro substrates for CYP inhibition assays because of their high fluorescence. In this work 18 O-alkylated and O-benzylated derivatives of 7-hydroxycoumarin, 7-hydroxy-4-methylcoumarin and 7-hydroxy-4-trifluoromethylcoumarin were synthesised and the transformation due to several CYP enzymes was investigated with primarily optimised LC/LC/fluorescence-based assays. On the O-dealkylation of coumarin derivatives CYP1A2, CYP2B6 were mainly participated and to a lower extent CYP2C19, CYP2D6 and CYP2E1. The highest affinity had the substrates to CYP1A2. Debenzylations were catalysed mainly by CYP1A2 and CYP3A4. The highest reaction velocities were observed for the debenzylation of 7-benzyloxy-4-methylcoumarin (BMC, 14 pmol/pmol P450/min) and 7-benzyloxy-4-trifluoromethylcoumarin (BFC, 9 pmol/pmol P450/min). For 7-methoxy-4-trifluoromethylcoumarin (MFC) the conversion rate for the O-demethylation with CYP1A2 and CYP2B6 in comparison with CYP2C9 was explicitly higher. So MFC and 7-ethoxy-4-trifluoromethylcoumarin (EFC) are suitable substrates especially for CYP2B6. All analysed 7-alkyloxycoumarin derivatives are no selective substrates. Thus they cannot be used for inhibition studies with human liver microsomes. Also their application for the simultaneous determination of the inhibition of several CYP enzymes in one sample (cocktail assay) is not possible. The LC/MS-based analysis after the incubation of the coumarin derivatives showed, that beside the O dealkylated metabolites several hydroxylated metabolites are formed. In many cases the O-dealkylated metabolite is not the main metabolite, especially by derivatives with longer alkyl chains.
An aim of our group is the development of new in vitro substrates for the investigation of the inhibition of CYP enzymes with improved kinetic and analytical properties. The basic structure is -carboline, because -carboline derivatives show a strong fluorescence. It is known about the natural product harmine, that it will be O demethylated by CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19 and CYP2D6. Due to modifications of the harmane structure, the CYP isoform selectivity for the O-dealkylation should increase and substrates should receive for further CYP enzymes. For this, our working group synthesised e. g. 2-benzyl-7-benzyloxyharmane (BBH), 2-benzyl-7-methoxyharmane (BMH), 7-methoxy-9-(4-carboxybenzyl)harmane (MCBH) and 2 methyl-7-methoxyharmane (MMH). In this work LC/LC/fluorescence- and LC/MS/MS methods were developed for quantification of the generated O dealkylated metabolites. The introduction of a benzyl residue at the phenolic hydroxyl group of harmol (BBH) caused a metabolism due to CYP3A4. The substitution with a carboxybenzyl residue on the indole nitrogen (MCBH) increased the selectivity to the subfamily CYP2C. With the methylation of the pyridine nitrogen a selective substrate for CYP2D6 was obtained. So this substrate is usable with human liver microsomes. Due to the high reaction velocity of MMH in comparison with other substrates of CYP2D6, the concentration of the protein can be minimized. The Km values of the CYP enzymes, which predominantly catalysed the O dealkylation of the harmane derivatives, were determined. The investigation of several CYP inhibitors showed, that with the new substrates comparable IC50 values to the standardised substrates were received. The harmane derivatives are suitable for the detection of the inhibition of important CYP enzymes. They are alternative substrates to the previously existing fluorescent substrates. With an adjustment of the pH value after incubation, the metabolites can be fluorimetrically detected in multiwell plates. So they are usable for high throughput screening. However, the fluorescence properties have to be improved for a continuous determination of the metabolite during the incubation.
The pharmaceutical industry is interested in the detection of reactive metabolites to predict a potential liver toxicity of new drug candidates. For this purpose the test compounds will be incubated with human liver microsomes and the reactive metabolites will be trapped with glutathione. To optimise the LC/MS/MS analysis, the fragmentation of such adducts was investigated with standard substances. At positive polarity, all glutathione adducts showed a loss of pyroglutamic acid with comparable peak intensity. Therefore the detection of this fragment with a neutral loss scan is most practicable. With the aid of the screening method first drugs were investigated from which reactive metabolites are known. CYP1A2, CYP2D6 and CYP3A4 were identified for the bioactivation of clozapine. The toxification of acetaminophen is mainly catalysed by CYP1A2 and CYP3A4. Conspicuous was the fact, that there was no saturation of the reaction velocity with increasing concentration of acetaminophen. Changes of the glutathione molecule like the introduction of a dansyl or a biotin residue do not seriously improve the detection of the reactive metabolites. Also it was shown, that the reaction of the labelled glutathione derivatives by GSTs is significantly reduced. With the developed screening methods many false positive signals were observed. So this method was not applicable for the investigation of extracts from liver toxic plants. For a definite and fast identification of signals as glutathione adducts the high resolution mass spectrometry is required.
Another class of xenobiotic metabolising enzymes are glutathione S-transferases (GSTs). About their inhibition caused by drugs and plant extracts only a few information can be found in the literature. For the development of inhibition assays well known substrates like 1-chloro-2,4-dinitrobenzene, 4-nitroquinoline N-oxide, 1,2 dichloro-4-nitrobenzene and 4-nitrobenzyl chloride were used. The metabolites were quantified by HPLC/UV- and LC/MS/MS analysis in contrast to the often used photometry. For the calibration of the methods first the appropriate glutathione conjugates were synthesised from the substrates. A problem of the discontinuous assays was the often arising non enzymatic reaction of the substrates with glutathione. With a decrease of the pH value of the incubation buffer from 7.4 to 6.5 and the reduction of incubation temperature from 37 °C to 25 °C the velocity of the non enzymatic reaction extensively slows down. The non enzymatic reaction in the samples after incubation could stopped by the addition of oxidants. For all substrates the cytosolic fraction showed the highest activity of all tested human liver tissue fractions. During the development of the assays the glutathione concentration, the protein concentration and the incubation time were optimised. The Km and Vmax values for the conversion of the substrates were determined. The also synthesised glutathione conjugate of ethacrynic acid was used as positive control, for that the IC50 values were determined with every substrate. Thereby the pH value of the incubation buffer and the incubation temperature influence the measured inhibitory activity. Following drugs, selected natural products and about 50 plant extracts were screened for the inhibition of GSTs with human liver cytosol and 1-chloro-2,4-dinitrobenzene, that was conjugated with the highest conversion rate of all substrates. Of the natural products the distinctive inhibition of biflavonoids was noticeable. Nearly all tested plant extracts inhibits GSTs. A strong inhibition of the GSTs showed extracts from Cinnamomum cassia (cinnamomum), which is non-competitive. Furthermore an important inhibition caused by extracts from e. g. Hamamelis virginiana (witch hazel) or Krameria triandra (ratanhia) were observed. Here IC50 values between 5 and 30 µg/ml were obtained. A comparison of different methods for the detection of the metabolite 2,4-dinitrophenyl-S-glutathione demonstrated, that photometry is not suitable for the investigation of the inhibition by plant extracts because of the interference caused by the plant matrix. With HPLC/UV- and the LC/MS/MS methods the metabolite could selectively be determined and reproducible results for the inhibition of GSTs by plant extracts were obtained.
Besides GSTs the influence of glutathione reductase (GR) was also investigated in this work. An HPLC-based assay was developed, where the reduced glutathione has been derivatised with 5,5-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) and the resulted mixed disulfide of glutathione and 5-thio-2-nitrobenzoic acid has been quantified. For the examination of the inhibition by plant extracts, human liver cytosol was applied, which has the highest activity of all human liver tissue fractions. In comparison with GSTs, the GR was hardly inhibited by most of the selected plant extracts. A notable inhibition could only be obtained by extracts of Juglans regia (walnut).
Conclusion
In this work, many in vitro methods for the investigation of the inhibition of CYP enzymes and further xenobiotic metabolising enzymes like CES or GSTs were developed. On the basis of the selective HPLC-based quantification with UV-, fluorescence- or MS detection, samples with a complex matrix can be measured. For all assays the conditions for incubation were optimised and the kinetic parameters of many substrates were determined. In addition important information about the selectivity of isoenzymes was received. The suitability of the developed assays was demonstrated with standard inhibitors. Finally, the inhibitory activity of numerous plant extracts were determined, which effect on xenobiotic metabolising enzymes was previously unknown. The developed methods in this work are routinely applicable for the investigation of drug metabolism and the inhibition of xenobiotic metabolising enzymes, which are required for the marketing authorization.
KW - Cytochrom-P450-Enzyme, Carboxylesterasen, Glutathion-S-Transferasen
KW - In-vitro-Assays
KW - HPLC/UV-, HPLC/Fluoreszenz-, LC/MS/MS-Analyse
KW - ß-Carbolinalkaloide, 7-Alkyloxycumarine, Clopidogrel, Paracetamol
KW - Pflanzenextrakte
KW - cytochrome P450 enzymes, carboxylesterases, glutathione S-transferases
KW - in-vitro-assays
KW - HPLC/UV, HPLC/fluorescence, LC/MS/MS analysis
KW - ß-carboline alkaloids, 7-alkyloxycoumarins, clopidogrel, acetaminophen
KW - plant extracts
KW - Xenobiotikum
KW - Stoffwechsel
KW - Biotransformation
KW - Inhibition
Y1 - 2013
U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-99434
ER -
TY - THES
A1 - Schwab, Steffen
T1 - Die Rolle regulatorischer T-Zellen bei der Masernviruspathogenese
T1 - The role of regulatory T-cells in measles virus pathogenesis
N2 - Tregs dienen zur Aufrechterhaltung der Balance im Immunsystem. Die Infektion, Aktivierung oder Induktion von Tregs durch Pathogene kann diese Balance empfindlich stören, eine Immunsuppression zur Folge haben und zur Ausbildung von Autoimmunerkrankungen oder Persistenzen beitragen. Das MV verfügt nicht nur über vielfältige Mechanismen der Immunsuppression, während einer MV-Infektion herrschen zudem Bedingungen vor, welche die Zahl und Aktivität von Tregs beeinflussen könnten. Aufgrund der Expression von Reifungsmarkern auf Trn ist zudem eine präferenzielle Infektion dieser Zellpopulation denkbar. MV-Infektionen können sowohl die akute MV-Enzephalitis, eine Autoimmunerkrankung, nach sich ziehen, als auch die Persistenz SSPE ausbilden. Ob diese Komplikationen mit spezifischen Aberrationen in der Menge und Aktivität von Tregs im Zusammenhang stehen, war bisher nicht bekannt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass auf unstimulierten Trn der Reifungsmarker und MV-Rezeptor CD150 exprimiert wird und es in Folge dessen in vitro zu einer präferentiellen nicht produktiven Infektion und Depletion von Trn kommt. Ex vivo ließ sich ein deutlicher Depletionseffekt während der frühen akuten MV-Enzephalitis nachweisen, der nach Vaczinierung eines gesunden Probanden und Challenge eines immunisierten Affen nicht auftrat. Ob dieser Depletionseffekt ursächlich für die Enzephalitis ist, oder es sich um einen Begleiteffekt handelt ließe sich an Modellorganismen durch mitogene Manipulation der Trn während einer MV-Infektion untersuchen. Auch bei SSPE kann es zu einer Depletion von Trn kommen, dies scheint jedoch nicht mit der Progression dieser Erkrankung im Zusammenhang zu stehen. Wahrscheinlich ist dagegen ein Zusammenhang mit der Induktion von Tregs. In MV-stimulierten Proben von SSPE-Patienten wurde im Mittel signifikant mehr IL-10 exprimiert als in den Kontrollen. In Proben seropositiver gesunder Spender wurde IL-10 in den ersten Stunden nach MV-Stimulation fast ausschließlich von induzierten Tregs exprimiert. Weitere Versuche sind nötig, um die Evidenz zu steigern und zu ermitteln, ob auch in Patientenproben die frühe IL-10 Expression nach MV-Stimulation von induzierten Tregs dominiert wird. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass es sowohl bei der MV-Enzephalitis als auch bei SSPE zu signifikanten Wechselwirkungen mit Tregs kommt. Ob sich eine MV-Enzephalitis auch ohne Depletion von Trn ausbilden kann und ob die Ausbildung von SSPE erhöhte IL-10 Expression voraussetzt, werden weitere Untersuchungen ergründen müssen.
N2 - Treg are supposed to keep the balance throughout the immune system. Infection, activation and induction of Treg by pathogens can interrupt with this balance. Immunosuppression autoimmunity and viral persistence can result from this interference. MV does not only cause immunosuppression during infection by multifaceted mechanisms, but also effects circumstances known to interfere with the frequency and activity of Treg. Due to the expression of maturity markers on the surface of Trn a preferential infection of this cell population by MV seems possible. MV-infection can involve both, acute MV-encephalitis, an autoimmune disease, and the virus persistence SSPE. It was not investigated until now, if thous complications are associated to specific aberrations in the frequency and activity of Treg. In this paper it was demonstrated that CD150, which is both a maturity marker and a MV-receptor, is expressed on unstimulated Trn. Due to this expression the Trn are infected preferentially and non productively in vitro leading to apoptosis. Ex vivo a noticeable depletion effect was detected during the early acute MV-encephalitis. This effect did not accure after vaccination of a healthy proband, and the challenge of an immunised monkey. Mitogenic manipulation of Trn in model organisms during MV-infection could give advice, if this depletion effect is causal to MV-Encephalitis or rather a concomitant effect. Depletion of Trn can also arise in the presence of SSPE, but this seems not to interfere with the progression of disease. By contrast there is presumable an interrelation of SSPE with the induction of Tregs. In MV-stimulated probes from SSPE-patients the median IL-10 expression was significantly higher than in controls. Probes from seropositive healthy donators were used to identify the IL-10 expressing cells. During the first hours after MV-stimulation IL-10 was mainly expressed by induced Treg. Subsequent investigations are necessary to enhance the evidence and to determine if induced Treg also dominate the early IL-10 expression after MV-stimulation in patient probes. To give a resume you could claim that there are significant interrelations between MV-encephalitis respectively SSPE and Treg. If a depletion of Trn is necessary for the development of MV-encephalitis and if increased levels of IL-10 expression are required for the formation of SSPE has to be examined in further experiments.
KW - Masern
KW - T-Lymphozyt
KW - Pathogenese
KW - Immunsuppression
KW - Inhibition
KW - Encephalitis
KW - Interleukin 2
KW - Interleukin 10
KW - Antigen CD25
KW - Persistenz
KW - FoxP3
KW - induzierte regulatorische T-Zellen
KW - natürliche regulatorische T-Zellen
KW - SSPE
KW - FoxP3
KW - SSPE
KW - regulatory T-cells
KW - immunsuppression
KW - encephalitis
Y1 - 2012
U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72979
ER -
TY - THES
A1 - Melber, Makito Bernhard
T1 - Impulsivität und Antworthemmung bei adulter Aufmerksamkeitsdefizit- und Hyperaktivitätsstörung (ADHS)
T1 - Impulsivity and response inhibition in adult attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD)
N2 - Ziel der vorliegenden, experimentellen Arbeit war die Untersuchung der Persönlichkeitseigenschaft der Impulsivität bei adulten Patienten mit ADHS und vergleichbaren Versuchspersonen. Da die Ätiopathogenese erhöhter Impulsivität bei Patienten mit ADHS bislang ungeklärt ist, eine Beeinflussung des dopaminergen Systems durch vorausgehende Studien allerdings nahe liegt, wurden die verwendeten Impulsivitätsmessungen zusätzlich bezüglich einer möglichen Beeinflussung durch den Val158Met-COMT-Polymorphismus analysiert. Die Untersuchung beinhaltet mit 71 adulten Patienten mit ADHS und 54 gesunden Kontrollpersonen, die nach Alter, Geschlecht, IQ, Kopfumfang und Händigkeit vergleichbar waren, eine der aktuell größten Stichproben adulter Patienten mit ADHS. Während einer Stoppsignal-Aufgabe zur Erfassung der Antworthemmungsfähigkeit als Korrelat der Impulsivität wurden die Verhaltensdaten der Stichproben sowie die hirnphysiologischen Veränderungen mittels funktioneller Nahinfrarotspektroskopie aufgezeichnet und ausgewertet. Die erhobenen experimentellen Daten wurden anschließend mit selbstbewerteter Impulsivität des I7-Impulsivitätsfragebogens nach Eysenck verglichen und auf mögliche Zusammenhänge überprüft. Zudem wurden die beobachteten Ergebnisse der vorliegenden Arbeit auf einen möglichen Einfluss durch den Val158Met-COMT-Polymorphismus untersucht. Auf der Verhaltensebene zeigten Patienten mit ADHS im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen sowohl für die SSRZ als auch für die Go-RZ signifikant langsamere Reaktionszeiten. Im Vergleich der funktionellen Daten konnten für Patienten mit ADHS während der erfolgreichen Stopp-Trials signifikant bzw. tendenziell verminderte Aktivierungen im Bereich des IFC und DLPFC in beiden Hemisphären festgestellt werden. Die Untersuchung der selbstbewerteten Impulsivität anhand des I7-Fragebogens ergab ebenfalls einen signifikanten Unterschied zwischen den beiden Stichproben. Bezüglich der Zusammenhänge zwischen den einzelnen Impulsivitätsmessungen konnten für Patienten mit ADHS signifikant bzw. tendenziell negative Zusammenhänge zwischen SSRZ und Oxygenierung im rechten IFC sowie zwischen SSRZ bzw. Go-RZ und I7-Impulsivitätswerten festgestellt werden. In der Untersuchung des Einflusses durch den Val158Met-COMT-Polymorphismus ergab sich ein sehr heterogenes Bild, in dem sich keine eindeutig systematischen Genotyp- oder Interaktionseffekte zeigten. Während die beobachteten Befunde auf Verhaltensebene auf eine generelle Verlangsamung adulter Patienten mit ADHS im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen hindeuten, könnte das verminderte Aktivierungsmuster im Bereich des IFC und DLPFC während der erfolgreichen Stopp-Trials bei Patienten mit ADHS möglicherweise das zugrundeliegende funktionelle Korrelat zu den beobachteten Reaktionsunterschieden zwischen den beiden Stichproben darstellen. Obwohl Patienten mit ADHS im Vergleich zu gesunden Kontrollen aufgrund ihrer erhöhten Impulsivität defizitär erscheinen, deuten die Befunde bezüglich des Zusammenhangs zwischen selbstbewerteter und experimentell erhobener Impulsivität innerhalb der Patientengruppe einen möglichen Vorteil erhöhter I7-Impulsivitätswerte für die Reaktionsfähigkeit in der Stoppsignal-Aufgabe an. Bezüglich der Beeinflussung der erhobenen Daten durch den Val158Met-COMT-Polymorphismus lassen sich anhand der Befunde dieser Arbeit keine klaren Schlussfolgerungen ziehen.
N2 - The aim of this study was to investigate impulsivity in adult patients with Attention Deficit-/Hyperactivity Disorder (ADHD) and healthy controls, on the one hand self-rated impulsivity operationalized by the I7 questionnaire of Eysenck and on the other the executive function response inhibition as an objective correlate of impulsivity operationalized by a stop signal task. During the stop signal task the changes of oxygenated (O2Hb) and desoxygenated haemoglobin (HHb) in prefrontal cortical areas were recorded by functional near-infrared spectroscopy (fNIRS). Because the pathophysiology of ADHD seems to involve alterations in the dopaminergic neurotransmitter system, this study also investigated the possible influence of the catechol-O-methyltransferase (COMT) Val158Met polymorphism, which modulates the degradation of prefrontal dopamine. Compared to the healthy controls, patients with ADHD showed both SSRT as well as Go-RT significantly slower reaction times during the stop signal task and significantly higher values for impulsivity and empathy in the I7 questionnaire. They also showed significantly reduced increases in O2Hb in bilateral IFC for successful stop trials and a statistical trend for a reduced increase in bilateral DLPFC. For patients with ADHD the investigation of the relationship between behavioral data and self-rated impulsivity showed a significant negative association, concerning the relationship of behavioral data and functional brain data a significant negative association between SSRT and the right IFC. The investigation of the influence of the COMT Val158Met polymorphism showed no systematic genotype or interaction effects.
KW - Aufmerksamkeits-Defizit-Syndrom
KW - Kandidatengen
KW - NIR-Spektroskopie
KW - Präfrontaler Cortex
KW - Impulsivität
KW - Dopamin
KW - Erwachsener
KW - Inhibition
KW - Polymo
KW - ADHS
KW - fNIRS
KW - Antworthemmung
KW - Stoppsignal
KW - Val158Met-COMT-Polymorphismus
KW - ADHD
KW - fNIRS
KW - response inhibition
KW - stop signal
KW - COMT Val 158Met Polymorphism
Y1 - 2012
U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-78862
ER -
TY - THES
A1 - Müller, Alexandra
T1 - Einfluss des COMT Val108/158Met Polymorphismus auf Aktivierung und Funktion des präfrontalen Kortex
T1 - Influence of COMT Val108/158Met Polymorphism on Prefrontal Activity and Function
N2 - Der präfrontale Kortex wird im Allgemeinen mit exekutiven Funktionen in Verbindung gebracht, die unter anderem Aufmerksamkeitskontrolle, Inhibition, Arbeitsgedächtnis oder die Erkennung und Bewertung neuartiger Reize beinhalten. Für die situationsgerechte Anpassung der verschiedenen Kontrollmechanismen ist in dieser Hirnregion, wie sich in zahlreichen Studien gezeigt hat, der Neurotransmitter Dopamin entscheidend. Dieser liegt, u.a. bedingt durch den Val108/158Met-Polymorphismus der Catechol-O-Methyl-Transferase, interindividuell in verschiedenem Ausmaß vor und sollte dadurch Unterschiede in präfrontalen Funktionen zwischen einzelnen Individuen maßgeblich beeinflussen. Ziel dieser Arbeit war es, diesen Einfluss mittels EEG und ereigniskorrelierten Potenzialen genauer zu bestimmen und zusätzlich herauszuarbeiten, welche kognitiven Prozesse genau durch den COMT-Genotyp beeinflusst werden. 60 gesunde Probanden absolvierten hierzu unter EEG-Ableitung eine Aufgabe mit variablem Aufmerksamkeitsbedarf. Es wurde zunächst der Zusammenhang zwischen den ereigniskorrelierten Potenzialen N200 und P300 mit präfrontalen Funktionen wie Aufmerksamkeitskontrolle, Inhibition und Konfliktdetektion bzw. –verarbeitung untersucht. Zusätzlich wurden sowohl das Verhalten als auch die elektrophysiologische Aktivität zwischen den sorgfältig gematchten Genotyp-Gruppen Val/Val, Val/Met und Met/Met (je 11 Probanden) verglichen. Es zeigte sich, dass die N200 v.a. durch eine Veränderung der Aufmerksamkeitsrichtung zwischen globalen und lokalen Stimuluseigenschaften beeinflusst wurde. Die P300 wurde dagegen sowohl von der Aufmerksamkeitsrichtung als auch der Konfliktstärke (lokale im Vergleich zu globalen Stimuluseigenschaften sowie erhöhter Konflikt mit vermehrter Beanspruchung von Aufmerksamkeitsressourcen) beeinflusst. Wir konnten keine Auswirkungen der COMT-Ausprägung auf die Performanz (Korrektheit und Reaktionsgeschwindigkeit) im VAC-Test feststellen. Die hirnelektrische Aktivität (N200 und P300) unterlag dagegen einem deutlichen Einfluss des COMT-Genotyps: Met-Allel-Homozygote zeigten ein effizienteres Arbeiten - es lag eine bessere Aktivierung des Kortex (höhere P300) sowie ein geringerer Bedarf an Inhibition bei gleicher Leistung wie bei Val-Allel-Trägern vor (niedrigere N200- Amplitude). Es zeigte sich zudem bei den Met-Allel-Homozygoten kaum Variabilität der Hirnaktivierung über alle Schwierigkeitsstufen hinweg, was möglicherweise Ausdruck einer geringeren kognitiven Flexibilität im Vergleich zu Val-Allel-Trägern ist.
N2 - The prefrontal cortex is reported to be associated with executive functions such as attentional control, inhibition, working memory or recognition and evaluation of new stimuli. To the aim of appropriate adaptation of the variable control mechanisms in this brain region, the neurotransmitter dopamine is crucial, as reported in numerous studies. Due to the Val108/158Met polymorphism (amongst others) the neurotransmitter is available in a varying amount and should therefore effect prefrontal functions amongst individuals importantly. The aim of this study was to define this influence using EEG and event related potentials and to identify in addition the cognitive processes influenced by the COMT genotype. 60 healthy individuals therefore passed a variable attentional control task during the recording of an EEG. The association of the event-related potentials N200 and P300 with prefrontal functions (attentional control, inhibition and conflict detection) was analyzed. Additionally performance and electrophysiological activity of the carefully matched genotype groups Val/Val, Val/Met and Met/Met were compared. We found N200 mainly being influenced by an attentional shift between global and local stimulus characteristics - in contrast to P300, which was affected both by attentional focus and amount of conflict (local in comparison to global stimulus characteristics as well as an increased amount of conflict with a higher demand for attentional resources). We found no influence of COMT genotype on performance (reaction time and correctness) in our task whereas electric brain activity is subject to a considerable impact of the COMT genotype: Met allele homozygotes showed more efficient working expressed by a better cortical activation (higher P300) and less inhibitory demand (lower N200) for equal performance compared to Val allele carriers. Furthermore Met allele homozygotes showed only very little variability in cortical activation throughout all conditions – maybe a sign of less cognitive flexibility compared to Val allele carriers.
KW - Catecholmethyltransferase
KW - Aufmerksamkeit
KW - Elektroencephalogramm
KW - Ereigniskorreliertes Potenzial
KW - Inhibition
KW - präfrontal
KW - Aufmerksamkeitskontrolle
KW - prefrontal
KW - attentional control
Y1 - 2010
U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-55554
ER -