TY  - THES
A1  - Hettwer, Anette
T1  - Entwicklung und Charakterisierung einer löslichen und funktionalen BMP-2-Variante
T1  - Development and characterization of a soluble BMP-2-variant
N2  - Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) sind potente Differenzierungs- und Wachstumsfaktoren, die strukturell der Transforming Growth Factor-β (TGF-β) - Superfamilie zugeordnet werden.  Sie spielen eine Schlüsselrolle in einer Vielzahl an zellulären Prozessen ab den frühen Stadien der Embryogenese. Dadurch sind BMPs nicht nur für die korrekte Festlegung der embryonalen Körperachse verantwortlich, sondern regulieren als multifunktionale Mediatoren neben der Morphogenese auch Proliferation, Differenzierung und Apoptose unterschiedlicher Zelltypen. Bone Morphogenetic Proteins sind somit für die Aufrechthaltung der Homöostase im adulten Körper mitverantwortlich. Ihre Funktionalität vermitteln die BMPs über eine Signalkaskade, indem sie als dimeres Protein spezifische transmembrane Serin/Threonin-Kinaserezeptoren von Typ I und Typ II in einem heteromeren Komplex assemblieren. Die intrazelluläre Signalweiterleitung verläuft über verschiedene Signalkaskaden (Smad-Proteine oder MAPKs), wodurch final im Zellkern Änderungen auf der Ebene der Gentranskription ausgelöst werden. Laut der namensgebenden Eigenschaft fungieren einige Wachstumsfaktoren als aktive Induktoren der Knochenbiosynthese. Ihre Anwesenheit ist essentiell für die vielen zellulären Prozesse, die während einer Frakturheilung auftreten, wobei eine Knochenneubildung ebenso stark abhängig ist vom Zusammenspiel verschiedener Stimulatoren und Inhibitoren, die die BMPs in ihrer Aktivität regulieren. Bedingt durch ihr großes Potential fanden die erstmals durch Marshal Urist 1965 aus Knochenmaterial isolierten BMP-Proteine ihren Einsatz in der regenerativen Medizin. Kommerziell erhältlich und bereits seit vielen Jahren in der klinischen Anwendung befindet sich derzeit das rhBMP-2 und rhBMP-7. Diese beiden Wachstumsfaktoren werden u.a. verwendet, um die Heilungsprozesse von langwierigen Schienbeinfrakturen zu verbessern, aber auch bei degenerativen Wirbelsäulenerkrankungen und in der Kieferchirurgie. Jedoch führt die schlechte Löslichkeit des BMPs aufgrund der ausgeprägten Aggregationstendenz zu gravierenden Problemen, nicht nur während der biotechnologischen Herstellung, sondern auch bei der klinischen Anwendung. 
Der Schwerpunkt des Optimierungsbedarfs der BMP-2 Herstellung im Rahmen dieser Doktorarbeit lag daher auf der Etablierung eines prokaryotischen Expressionssystems für die lösliche Produktion von BMP-2. Dafür wurde zunächst der Fokus auf die ungünstigen Löslichkeitseigenschaften des Wachstumsfaktors gelegt. Um die hohe Aggregationsneigung des BMP-2 während der Produktion in Escherichia coli zu minimieren, wurden anhand einer Algorithmus-basierten Analyse BMP-2-Varianten entworfen, in denen Aminosäuren mit stark hydrophoben Eigenschaften gegen solche mit hydrophilem Charakter ausgetauscht wurden. Hierdurch konnten die zur Aggregation neigenden Bereiche des BMP-2 weitestgehend eliminiert werden. Es wurden für die bezüglich ihrer Löslichkeit optimierten Proteinvarianten unterschiedliche Expressionsstrategien etabliert, wodurch dimere BMP-2-Muteine in angepassten chromatographischen Profilen mit einem Aufreinigungsschritt und ohne jegliche Renaturierungsmaßnahmen gewonnen wurden. Allerdings verbleiben hierbei Restmengen an bakteriellen Kontaminationen, die vorwiegend aus endogenen ribosomalen E. coli-Proteinen stammen und nicht vollständig entfernt werden konnten. Während der umfassenden in vitro Charakterisierung der BMP-2-Varianten konnte durch massenspektroskopische Analysen die Gesamtmasse beider Zielproteine bestätigt werden, wobei sequenzspezifische Fragmente eine eindeutige Identifikation der eingebrachten Mutationen ermöglichten. CD-spektroskopische Analysen erweitert um Auswertealgorithmen konnten die wesentlichen Wt-BMP-2-typischen Sekundärstrukturelemente identifizieren. Die neu generierten BMP-2-Varianten zeigen in der dynamischen Lichtstreuungsanalyse stark verminderte Aggregationstendenz im Vergleich zum Wildtyp-BMP-2. Dessen Aggregationsverhalten wurde durch die kombinierte Analytik seiner mikrofluidischen Diffusion und der dynamischen Lichtstreuung zum ersten Mal über den Konzentrationsbereich von 0.5 µM bis 100 mM genau charakterisiert. Erste zellbiologische Versuche verliefen ohne Erfolg, wodurch die biologische Aktivität der BMP-Varianten nicht abschließend geklärt werden konnte.  
Die simple Methode zur Expression und Aufreinigung der hydrophilisierte BMP-2-Muteine aus dieser Dissertation kann leicht in einen größeren Produktionsmaßstab überführt werden. BMP 2 kann dadurch schneller und kostengünstiger hergestellt werden. Final bleibt es jedoch erforderlich, die biologische Aktivität der neuen löslichen BMP-2-Varianten vollständig zu charakterisieren, um deren ganzes Funktionsspektrum zu entdecken. Der Fokus weiterer Forschung sollte zudem auf die verbleibende Oligomerisierungstendenz und die bestehende Kontamination mit Fremdproteinen gelegt werden, da diese beiden Faktoren letztendlich die Ausbeute an dimeren BMP-2 Varianten aus diesem System derzeit minimieren.
N2  - Bone morphogenetic proteins (BMPs) are potent differentiation and growth factors that are structurally assigned to the transforming growth factor-β (TGF-β)-superfamily. They play key roles in a variety of cellular processes from the early stages of embryogenesis. Thereby, BMPs are not only responsible for the correct definition of the embryonic body axis, but also regulate proliferation, differentiation and apoptosis of different cell types as multifunctional mediators in addition to morphogenesis. Bone morphogenetic proteins are therefore jointly responsible for maintaining homeostasis in the adult body. The BMPs mediate their functionality via a signaling cascade by assembling specific transmembrane serine/threonine kinase receptors of type I and type II as a dimeric protein in a heteromeric complex. Intracellular signaling occurs via various signaling cascades (Smad proteins or MAPKs), which ultimately trigger changes in the cell nucleus at the level of gene transcription. According to the eponymous property, some growth factors act as active inducers of bone biosynthesis. Their presence is essential for many cellular processes that occur during fracture healing, while new bone formation is also heavily dependent on the interaction of various stimulators and inhibitors that regulate the activity of BMP’s. Due to their great potential, BMP proteins, which were first isolated from bone material by Marshal Urist in 1965, were used in regenerative medicine. The rhBMP-2 and rhBMP-7 are currently commercially available and have been in clinical use for many years. Among others, these two growth factors are used to improve the healing processes of lengthy tibia fractures, but also in degenerative spinal diseases and in jaw surgery. Due to the pronounced tendency to aggregate, the decreased solubility of BMP’s leads to serious problems, not only during biotechnological production but also in clinical use. The main focus of the need for optimization of BMP-2 production in the context of this doctoral thesis was the establishment of a prokaryotic expression system for the soluble production of BMP-2. For this purpose, the focus was initially placed on unfavorable solubility properties of the growth factor. In order to minimize the high aggregation tendency of BMP-2 during production in E. coli, BMP-2 variants were designed using an algorithm-based analysis, in which amino acids with strongly hydrophobic properties were exchanged for those with hydrophilic properties. Thereby, the areas of BMP-2 that tend to aggregate could mostly be eliminated. Different expression strategies were established for the protein variants optimized with regard to their solubility, whereby dimeric BMP-2 muteins were obtained in adapted chromatographic profiles with one purification step and without any renaturation measures. However, residual amounts of bacterial contamination remain, which originate mainly from endogenous ribosomal E. coli proteins and could not be completely removed. During the comprehensive in vitro characterization of the BMP-2 variants, the total mass of both target proteins could be confirmed by mass spectroscopic analysis, where sequence-specific fragments enabled unambiguous identification of the introduced mutations. CD spectroscopic analyzes extended by evaluation algorithms were able to identify the basic wt-BMP-2 typical secondary structure elements. In dynamic light scattering analysis, the newly generated BMP-2 variants show a greatly reduced aggregation tendency compared to wildtype-BMP-2. Its aggregation behavior was characterized for the first time over the concentration range from 0.5 µM to 100 mM by the combined analysis of its microfluidic diffusion sizing and dynamic light scattering. Initial cell biological experiments were not successful, whereby the biological activity of the BMP variants could not be conclusively clarified. The simple method for expression and purification of the hydrophilized BMP-2 muteins from this dissertation can easily be scaled up. However, it remains necessary to fully characterize the biological activity of the new soluble BMP-2 variants in order to discover their full range of functions. Further research should also focus on the remaining oligomerization tendency and the existing contamination with foreign proteins, as these two factors ultimately minimize the yield of dimeric BMP-2 variants from this system at present.
KW  - Knochen-Morphogenese-Proteine
KW  - BMP-2
Y1  - 2024
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-326800
ER  - 
TY  - THES
A1  - Fiebig, Juliane
T1  - Twisted gastrulation - ein BMP-Modulatorprotein mit dualer Funktionalität
T1  - Twisted gastrulation - a BMP-specific modulator with dual functionality
N2  - Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) sind extrazellulär vorkommende Wachstumsfaktoren und werden der Superfamilie der Transforming Growth Factors β (TGF-β) zugeordnet. Entgegen ihrem Namen spielen sie nicht nur eine Rolle bei der Ausbildung und Regeneration der Knochenmatrix, sondern regulieren bereits während der Embryonalentwicklung zahlreiche Abläufe. Unter anderem sind sie an der Festlegung der Körperachsen und Entwicklung der Organanlagen beteiligt. Später steuern sie das Wachstum von Organen und Geweben und sind schließlich im adulten Organismus für deren Homöostase und Regeneration verantwortlich. Bei fast allen Mitgliedern der TGF-β Superfamilie erfolgt die Signalbildung nach derzeitigem Kenntnisstand durch die Bindung an transmembrane Serin/Threonin-Kinaserezeptoren, die in zwei Untergruppen unterteilt werden können. Dabei werden von einem Liganden jeweils zwei Typ I- und zwei Typ II-Rezeptoren gebunden, wodurch ein aktiver Komplex entsteht, der im Inneren der Zelle eine Signalkaskade auslöst.
Um die vielseitigen Aufgaben der BMPs spezifisch vermitteln zu können, gibt es zahlreiche Mechanismen, die Signalbildung stringent neben der Ligand-Rezeptor-Interaktion zu regulieren. Die Small Mothers Against Decapentaplegic (Smad)-Signalkaskade im Zellinneren wird beispielsweise durch die Interaktion der inhibitorischen Smads mit rezeptor-regulierten Smads oder durch den proteasomalen Abbau der rezeptor-regulierten Smads durch die Bindung von Ubiquitin-Ligasen der Smurf-Familie beeinflusst. Auch auf Membranebene besteht die Möglichkeit der negativen Signalmodulation durch Pseudorezeptoren oder der Verstärkung der Signalbildung durch positive Effektoren wie beispielsweise aktivitätssteigernde Co-Rezeptoren. 
Ein Charakteristikum der TGF-β Superfamilie stellt jedoch die Vielzahl an sekretierten, löslichen Modulatorproteinen dar. Die meist glykosylierten Proteine üben, bis auf wenige Ausnahmen, einen antagonistischen Effekt auf die BMPs aus. Bei dem BMP-spezifischen Modulatorprotein Twisted gastrulation handelt es sich um ein extrazelluläres Glykoprotein, das im Gegensatz zu den meisten anderen BMP-Modulatoren jedoch eine duale Funktion als Besonderheit aufweist. Es zeigt zum einen eine anti-BMP-Wirkung, indem es den BMP-inhibierenden Einfluss von Chordin durch Bildung eines stabilen ternären Komplexes verstärkt; andererseits kann Twisted gastrulation in Gegenwart spezifischer Metalloproteasen eine proteolytische Spaltung von Chordin und die anschließende Freisetzung von aktivem BMP fördern und so eine BMP-Aktivität vermittelnde Wirkung aufweisen. Twisted gastrulation hat keine beziehungsweise nur eine äußerst geringe Homologie zu anderen (Modulator)Proteinen. Um daher den komplexen Wirkmechanismus detailliert molekular beschreiben zu können, ist die Aufklärung der Struktur /Funktions-beziehungen essentiell. 
Im Rahmen dieser Arbeit konnten unterschiedliche Expressionsstrategien für die rekombinante Herstellung von Twisted gastrulation etabliert werden, welche eine umfassende Charakterisierung des Proteins in vitro ermöglichen. Erste Kristallisationsversuche von isoliertem Twisted gastrulation für die Aufklärung der dreidimensionalen Struktur mittels Röntgenbeugung verliefen ohne Erfolg, allerdings gelang die Präparation stabiler ternärer Proteinkomplexe für weiterführende Kristallisationsansätze. Hochdurchsatzverfahren für die Expression und Interaktionsanalyse erlauben zudem die Untersuchung einer Vielzahl von Twisted gastrulation-Proteinvarianten. Auf diese Weise konnten Aminosäuren identifiziert werden, die an der Wechselwirkung von Twisted gastrulation mit seinem Interaktionspartner BMP 2 beteiligt sind. Dies ermöglichte eine detaillierte Lokalisation des Bindeepitops im N-terminalen Bereich von Twisted gastrulation. Dabei konnte auch gezeigt werden, dass die Glykosylierung von Twisted gastrulation für die Wechselwirkung mit BMP-2 von Bedeutung ist. 
Eine experimentelle Strukturanalyse von Twisted gastrulation für die detaillierte Aufklärung des Mechanismus der Interaktion mit BMP-2 und anderen Modulatorproteinen bleibt allerdings weiterhin aufgrund der Einzigartigkeit dieses Modulatorproteins zwingend erforderlich. Für eine Fortsetzung der Untersuchungen bietet der stabile ternäre Komplex eine gute Voraussetzung in Hinblick auf weitere Kristallisationsansätze.
N2  - Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) are secreted growth factors belonging to the superfamily of Transforming Growth Factors β (TGF-β). In contrast to their name they are not only involved in bone morphogenesis and regeneration, but also regulate numerous events during embryonic development. Furthermore, they play a key role in body axis determination, embryonic patterning as well as organogenesis,  later in the adult organism these factors control organ and tissue homeostasis and regeneration. At the current state of research all classical members of the TGF-β family signal through transmembrane serine/threonine kinase receptors, which can be subdivided into type I- and type II-receptors. For receptor activation the ligand induces receptor heteromerisation forming an active complex containing type I- and type II-receptors which subsequently triggers intracellular signaling cascades.
To ensure highly specific signaling a complex network of regulatory mechanisms has evolved. The Small Mothers Against Decapentaplegic (Smad) signaling cascade for example is modulated by inhibitory Smads interacting with the receptor-regulated Smads or through proteasomal degradation of the receptor-regulated Smads by binding to ubiquitin-ligases of the Smurf-family. In the membrane, pseudoreceptors such as BAMBI lacking a kinase domain or GPI-anchored co-receptors such as the RGM-receptor family or Cripto can positively or negatively regulate BMP/TGF-β signaling.
A highlight of the TGF-β superfamily is the multitude of different secreted soluble modulator proteins. Most present glycoproteins, which act as BMP-antagonists by interfering with BMP-signaling. The BMP-specific modulator Twisted gastrulation is such an extracellular glycoprotein, which however features an unique dual function. On the one hand, by forming a stable ternary complex it strongly enhances the BMP-antagonizing (anti-BMP) activity of another BMP-modulator Chordin. On the other hand, upon proteolytic processing of Chordin in this ternary complex in the presence of specific metalloproteases such as Tolloid, Twisted gastrulation facilitates the dissociation of the ternary complex releasing active BMP an thereby exerts a pro (moting) BMP-activity. 
Twisted gastrulation exhibits very low if at all any homology to other proteins and seems also unique among the large variety of BMP-modulator proteins. To understand its dual mode of action on a molecular level analysis of the structure/function-relationship is a pre-requisite.
In this project we have established different strategies for recombinant production of Twisted gastrulation for a comprehensive in vitro characterization. Although crystallization of Twisted gastrulation for X-ray diffraction analysis failed, we could successfully prepare stable ternary complexes consisting BMP-2, a type II-receptor and Twisted gastrulation which are ideally suited for protein crystallization. High-throughput expression and interaction-analysis schemes allowed us to study a multitude of single amino acid variants of Twisted gastrulation. This resulted in the identification of several amino acid residues in Twisted gastrulation, which form the binding epitope for BMP-2 confirming its supposed location in the N-terminal half of Twisted gastrulation. We could also show that the N-glycosylation of Twisted gastrulation is involved in high-affinity BMP binding and required for its BMP-modulatory activity in vivo. 
For a full analysis of its molecular mechanism of BMP-2 interaction and its interplay with other modulator proteins, a structure analysis of Twisted gastrulation is required in the near future. Providing efficient recombinant sources and the preparation of stable ternary complexes will likely facilitate this.
KW  - Knochen-Morphogenese-Proteine
KW  - Twisted gastrulation
KW  - Bone Morphogenetic Proteins
KW  - Transforming Growth Factor
KW  - Gastrulation
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-107270
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kottmair, Mathias
T1  - Bambi – Charakterisierung eines inhibitorischen BMP-Pseudorezeptors
T1  - Bambi - characterization of an inhibitoric BMP pseudoreceptor
N2  - Die TGF-β-Proteinfamilie umfasst eine Vielzahl von zumeist homodimeren sezernierten Liganden in höheren Tieren, die viele Vorgänge und Entwicklungen im Embryo wie im adulten Lebewesen über absolute oder graduelle Einflussnahme steuern. Die Signalweiterleitung ins Zytoplasma und den Nukleus erfolgt über promisk paarig rekrutierte Typ-I- und Typ-II-Rezeptoren, ehe vorwiegend rezeptorabhängig verschiedene SMAD-Proteine von Typ-I-Kinasen der Rezeptoren aktiviert werden, in den Kern translozieren und die Transkription induzieren. Zu jedem Zeitpunkt dieser Signalweiterleitung kann mittels verschiedener endogener Inhibitoren regulatorisch eingegriffen werden. Dem bisher einzig bekannten membranständigen Pseudorezeptor Bambi (BMP and Activine membrane bound inhibitor) wurde in vorangegangenen Arbeiten inhibitorisches Potential gegenüber dem BMP- und Activin-vermittelten Signalweg über Bindung an distinkte ligandenadressierte Rezeptoren zugeschrieben, wobei die genaue Wirkweise bislang noch vollkommen unklar war.
In der vorliegenden Arbeit wurde initial ein Homologiemodell der extrazellulären Domäne von hBambi anhand der gelösten Kristallstruktur der extrazellulären Domäne von BR1A im gebundenen Zustand (PDB-ID: 1REW) erstellt. Anhand dieses Modells wurde eine Arbeitshypothese entwickelt und es gelang in der Folge, biologisch aktives rekombinantes Protein zum einen aus transfizierten Insektenzellen sowie aus der Renaturierung aus bakteriellen Einschlusskörpern in hinreichender Menge herzustellen und chromatographisch aufzureinigen. Nach einer vergleichenden Qualitätskontrolle beider Exprimate wurden mittels CD-Spektroskopie und analytischer Gelfiltration der Anteil der Sekundärstrukturelemente sowie der Oligomerisierungsgrad erfolgreich bestimmt. In SPR-Bindestudien wurde der Beweis erbracht, dass hBambi-ECD Affinität zu annähernd allen getesteten Liganden der BMP-/GDF-Gruppe, die den SMAD-1/-5-/-8-Signalweg aktivieren, zeigt. Bekannte Typ-I- und Typ-II-Bindungsmutanten von BMP-2 wurden ebenfalls von hBambi-ECD quasi wildtypisch gebunden. Verschiedene Rezeptorektodomänen sowie ActivinA wurden, wie bisher in der Literatur fälschlich angenommen wurde, hingegen nicht gebunden. Die propagierte Homooligomerisierung von Bambi wird überdies nicht über die extrazelluläre Domäne vermittelt. Eingesetzt in Stimulationsversuche mit BMP-responsiven Zellen wurde eine konzentrationsabhängige inhibierende Wirkung von freier hBambi-ECD auf die BMP-2-vermittelte Signalweiterleitung mit unterschiedlichen Nachweismethoden ermittelt, welche die Ergebnisse aus den SPR-Versuchen erfolgreich bestätigten.
In einem weiteren Teil dieser Arbeit wurden verschiedene chimäre Konstrukte aus für Bambi- und BR1A-Domänen kodierenden Sequenzen kloniert, in HEK Ad293-Zellen zusammen mit BMP- und Activin-responsiven Reportergenkonstrukten transient transfiziert und Stimulationsversuche mit BMP-2 und ActivinA durchgeführt. Wildtypisches Bambi zeigte hierbei ein ambivalentes Verhalten in Bezug auf die Regulation des BMP-2-Signals: geringe Mengen wirken agonistisch, höhere Mengen antagonistisch auf die Ausbildung des Reporters. Im Fall von ActivinA zeigte sich hingegen kein antagonistischer Einfluss von Bambi. In den Experimenten mit chimären Varianten erfolgte durch die erhaltenen Daten die Eingrenzung der Bindestelle von hBambi-ECD an BMP-2 auf den Bereich der Typ-I-Bindestelle. Ein direkter Einfluss der intrazellulären Domäne auf den BMP-2-Signalweg wurde ausgeschlossen. Weiterhin konnte gerade in Versuchen mit einem Antikörper gegen BR1A-ECD eine weitere Eigenheit der Bindung von Bambi an den Liganden offenbart werden: so bildet das Konstrukt aus hBambi-ECD und der intrazellulären BR1A-Domäne mit zugehöriger GS-Box und Typ-I-Kinase einen korrekt in den signalaktiven heterohexameren Komplex rekrutierten funktionellen Typ-I-Rezeptor.
Mit den in dieser Arbeit erzielten Ergebnissen, nämlich der gelungenen Erstellung eines Herstellungsprotokolls der ECD, deren erfolgreich identifizierten Bindepartnern sowie der Charakterisierung der Bindung an BMP-2 ist der Grundstein für die Strukturaufklärung von hBambi-ECD gelegt, welche weitere Klarheit in die Funktionalität dieses Modulators der BMP-/GDF-vermittelten Signalweiterleitung bringen wird. Ebenso sind erste das Verständnis der ICD aufklärende Ergebnisse erzielt worden, die das Fundament für weitere Experimente und darauf folgende Kenntnisgewinne darstellen werden.
N2  - The protein family of TGF-β-proteins consists of a huge number of predominantly homodimeric secreted ligands in higher animals, regulating many processes and developmental procedures in embryonic and adult forms via absolute or gradual influence. Signal transduction to cytoplasm and nucleus occurs by the aid of promiscuous, pairwisely recruited type-I- and type-II-receptors, usually activating a variety of receptor-dependent nucleus-permissive SMAD-proteins by an intracellular kinase-phosphorylation-cascade. After translocation they induce transcription of bre-promoted genes. Every signal transduction step may be interfered by endogenous inhibitors. So far the known membrane-bound pseudoreceptor Bambi (BMP and activine membrane-bound inhibitor) is hypothesized to have inhibitory potential against BMP- and activin-mediated signaling pathway via binding of distinct ligand-dependent receptors. However, its proper function still remains unclear.
At the beginning of this work a homology model of the extracellular domain of hBambi was built based on a solved 3D-structure of BR1A-ECD bound to its ligand (PDB-ID: 1REW). Upon this model a work hypothesis was issued and biologically active recombinant protein was obtained successfully, both from transfected insect cells and from refolding ex bacterial inclusion bodies in sufficient amount and purified by chromatography, respectively. After comparative quality control of both samples the degree of oligomerisation and secondary structure composition was analyzed via CD spectroscopy and analytical gelfiltration runs. Binding affinity towards nearly all ligands of BMP-/GDF-group assigned to SMAD-1/-5-/-8-signaling was shown for hBambi-ECD by SPR experiments. Known BMP-2-mutants lacking affinity for type-I- or type-II-receptors exhibited wildtype-like binding to hBambi-ECD, respectively. Contrary to the current opinion, neither various ectodomains of receptors nor ActivinA did show any specific binding. Moreover, proposed homooligomerisation of Bambi is not mediated via ECD. Introduction of hBambi-ECD into stimulation experiments on several BMP-responsive cells with differing detection modes yielded in concentration-dependent inhibition of BMP-2-signalling, confirming the results of SPR-attempts well.
In a further part of this work various chimeric constructs consisting of Bambi- and BR1A-coding sequence were cloned and effectively co-transfected into HEK Ad293 cells together with plasmids coding for BMP- and Activin-dependent reporters. Stimulation experiments with BMP-2 and ActivinA provided insights into Bambi participation within cellular processes. Full length Bambi exhibited ambivalent behaviour with respect to BMP-2-signaling: small amounts have an agonistic effect, while increasing levels revert it into an antagonistic one with respect to reporter formation. Regarding ActivinA no antagonistic effect was observed. Assays with chimeric constructs led to a containment for Bambi-epitope to the type-I-binding-site of BMP-2. Direct impact of Bambi-ICD on BMP-2-signaling could be blackballed. Furthermore, attempts with an antibody against BR1A-epitope revealed another feature of Bambi-binding to the ligand: a construct of Bambi-ECD fused to intracellular BR1A-domain including kinase and GS-Box forms a functional type-I-receptor correctly orientated and incorporated into heterohexameric signaling-complex.
Upon gained results within this work, namely the successful establishment of a purification protocol for the extracellular domain of hBambi, the identification of its binding partners as well as the characterization of a prominent binding partner the basis for successful structure determination of hBambi-ECD aiming to unravel the function of this modulator of BMP-/GDF-signaling is laid. Likewise, first knowledge of the ICD was acquired that will be the basis for further experiments leading to continuative scientific findings.
KW  - Knochen-Morphogenese-Proteine
KW  - BMP
KW  - Rezeptor
KW  - Inhibitor
KW  - Activin
KW  - Transforming Growth Factor
KW  - Bambi
KW  - Inhibitor
KW  - Activin
KW  - TGF
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-103530
ER  - 
TY  - THES
A1  - Hellmann, Tina Verena
T1  - Einfluss des Corezeptors Repulsive Guidance Molecule b (RGMb) auf den Signalweg der Knochenwachstumsfaktoren
T1  - Influence of the coreceptor Repulsive Guidance Molecule b (RGMb) on the Bone Morphogenetic Protein signaling pathway
N2  - Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) bilden die größte Untergruppe der Transforming Growth Factor-β (TGF-β) Superfamilie sekretierter Wachstumsfaktoren. Sie haben Schlüsselfunktionen während der frühen Embryogenese inne und regulieren darüber hinaus die Organogenese sowie die Homöostase zahlreicher Organe und Gewebe. BMPs vermitteln ihre Signale über zwei Typen transmembranärer Serin-/Threoninkinaserezeptoren, die als Typ I und Typ II Rezeptoren bezeichnet werden. Den etwa zwanzig BMP-Liganden stehen dabei nach aktuellem Kenntnisstand nur fünf Typ I und drei Typ II Rezeptorkinasen gegenüber, wodurch sich insbesondere die BMP-Familie durch eine hohe Promiskuität der Ligand-Rezeptor-Interaktion auszeichnet. Damit dennoch Liganden-spezifische Signale vermittelt werden können, müssen die Signaleigenschaften dieser Faktoren komplex reguliert werden. Die Mehrzahl der Regulationsmechanismen beeinflusst die Signaltransduktion negativ. Kürzlich wurden jedoch die ersten, spezifisch auf die BMP-Familie wirkenden membranassoziierten Agonisten beschrieben – die Corezeptoren der Repulsive Guidance Molecule (RGM) Familie bestehend aus RGMa, RGMb und RGMc. Für das Familienmitglied RGMb werden neben pro-BMP-Prozessen allerdings auch hemmende Wirkungen auf die BMP-abhängige Signaltransduktion diskutiert. Um diese teils widersprüchlichen Funktionen zu beleuchten, wurde RGMb im Rahmen dieser Arbeit umfangreich biochemisch und biophysikalisch charakterisiert. Zunächst konnte erfolgreich ein Verfahren zur Herstellung und Isolierung von hochreinem rekombinanten RGMb Corezeptorprotein etabliert werden. Dies ermöglichte die Entwicklung umfangreicher in vitro Interaktionsstudien mit verschiedenen Liganden sowie Rezeptorektodomänen der TGF-β Superfamilie basierend auf dem Verfahren der Oberflächen-Plasmonresonanz (Surface Plasmon Resonance, SPR). Dadurch konnte gezeigt werden, dass RGMb spezifisch und hochaffin mit Wachstumsfaktoren der BMP-Familie, nicht aber mit Vertretern anderer Untergruppen der TGF-β Superfamilie wechselwirkt. Im Widerspruch zu Literaturdaten konnten darüber hinaus keine direkten Interaktionen zwischen RGMb und den analysierten Typ I und Typ II Rezeptorektodomänen nachgewiesen werden. Zellbasierte Kompetitionsanalysen ergaben, dass der lösliche RGMb Corezeptor BMP-induzierte Signale dosisabhängig inhibiert, während die membranverankerte RGMb-Variante eine Verstärkung des BMP-Signals durch eine Erniedrigung der halbmaximalen Ligandenkonzentration hervorruft. Mittels Oberflächen-Plasmonresonanz konnte im Rahmen von Coinjektionsstudien außerdem beobachtet werden, dass RGMb die Bindung der untersuchten BMP-Liganden an die Typ I Rezeptorektodomänen hemmt. Daraus kann geschlossen werden, dass RGMb an das Typ I Rezeptorbindeepitop der BMP-Liganden bindet und dadurch deren Signalaktivität neutralisiert. Ein abweichendes Bild zeigt sich für die Beeinflussung der BMP/Typ II Rezeptorinteraktion durch RGMb. So wurde im Rahmen von SPR-basierten Coinjektionsstudien beobachtet, dass BMP-Liganden in Gegenwart des Corezeptors RGMb ausschließlich mit der Ektodomäne des Typ II Rezeptors ActR IIB, nicht aber mit den Rezeptoren ActR-II oder BMPR-II interagieren können. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass zwar der Kernbereich des Typ II Rezeptorepitops durch die Interaktion des Liganden mit RGMb unbeeinflusst bleibt, jedoch eine partielle periphere Überlagerung bei gleichzeitiger Bindung von RGMb und den Typ II Rezeptoren für die Ausbildung der beobachteten Selektivität verantwortlich sein muss. Um diese Wechselwirkungen auch auf zellulärer Ebene analysieren zu können, wurden fluoreszenzbasierte Fusionskonstrukte für BMP-Rezeptoren sowie für RGMb synthetisiert und ein funktionelles Färbeprotokoll für die konfokale Mikroskopie etabliert. Die biochemischen Analysen sowie die in dieser Arbeit präsentierten umfassenden Charakterisierungen der Corezeptorinteraktionen mit einer Vielzahl an BMP-Liganden sowie deren Rezeptoren grenzen das RGMb-Bindeepitop ein und bilden so einen idealen Ausgangspunkt für die genaue Identifizierung und Charakterisierung dieses Epitops mittels gerichteter Mutagenese. Darüber hinaus weisen die vorliegenden in vitro Bindungsstudien auf einen deutlich komplexeren als bisher in der Literatur angenommenen, möglicherweise völlig neuartigen Modulationsmechanismus des BMP-Signalweges durch den Corezeptor RGMb hin. So wird in Anwesenheit von RGMb die Typ II Rezeptorspezifität und vermutlich auch die Lokalisierung der BMP-Liganden in bestimmten Membrankompartimenten - etwa Lipid Rafts - selektiv reguliert, wodurch BMP-induzierte Signale fein moduliert werden könnten. Die in dieser Arbeit synthetisierten fluoreszenzbasierten Fusionskonstrukte stellen zudem zusammen mit den etablierten Protokollen zur konfokalen Mikroskopie effektive Werkzeuge für eine zukünftige detaillierte Aufklärung (z. B. durch FRET-Studien) der komplexen RGMb-abhängigen Regulation des BMP-Signalweges auf zellulärer Ebene dar.
N2  - Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) comprise the largest subgroup of the Transforming Growth Factor-β (TGF-β) superfamily of secreted growth factors. They are key regulators of early embryogenesis and orchestrate the development as well as the homeostasis of several tissues and organs in adult organisms. BMPs transduce their signals through two types of transmembrane serine/threonine kinase receptors termed type I and type II receptors. An imbalance in BMP-ligand and receptor numbers - about twenty different BMP-ligands face only five type I and three type II receptors - causes a pronounced promiscuity in ligand/receptor interactions. Therefore, a complex regulatory network is necessary to enable specific signaling of each BMP ligand despite a temperospatial expression overlap. Most of the discovered regulatory processes inhibit BMP-signal transduction. Recently, the first membrane-associated BMP-specific agonists - the Repulsive Guidance Molecule (RGM) family of coreceptors comprised of RGMa, RGMb and RGMc - have been discovered. Aside from stimulatory effects, evidence for a potential inhibitory activity of the RGM family member RGMb on BMP-induced signal transduction has previously been described. To clarify these contradictory RGMb functions, extensive biochemical and biophysical characterizations were carried out. In the course of this work, an efficient expression and purification strategy was established resulting in great yields of highly pure recombinant RGMb coreceptor protein. Subsequent in vitro binding assays based on surface plasmon resonance (SPR) showed that RGMb specifically interacts with BMP ligands, while no binding to other subfamily members could be detected. Contradicting published data, no direct interactions of the RGMb coreceptor with type I and type II receptor ectodomains were determined. Furthermore, cell-based competition assays revealed that soluble RGMb protein lacking the glycosylphosphatidylinositol anchor dose-dependently inhibits BMP-induced signal transduction. Characterizing the influence of the membrane anchored RGMb coreceptor on BMP signaling pointed to a more complex situation. Hence, only minor deviations of the BMP-dependent signal transduction in RGMb-transfected compared to control cells could be detected. These differences could possibly indicate a sensitizing activity of the RGMb coreceptor on BMP-signaling as it has been described before. SPR-based co-injection experiments revealed that BMP ligands bound to RGMb lose their ability to interact with type I receptor ectodomains. Thus, the coreceptor blocks the type I receptor binding epitope, thereby neutralizing the signaling activity of BMP ligands. However, comparative experiments using BMP variants pointed out that the coreceptor/ligand interface involves other binding hot spot residues than the type I receptor/ligand interaction. Analyzing the influence of RGMb on the BMP/type II receptor interaction based on SPR measurements led to a different outcome: In the presence of the RGMb coreceptor, BMP ligands were solely able to interact with the extracellular domain of the type II receptor ActR IIB, while no binding could be detected with neither ActR II nor BMPR II ectodomains. Hence, binding of the coreceptor does not directly interfere with the BMP ligand/type II receptor core interface, whereas a partial peripheral overlap of RGMb with the type II receptor epitope may evoke the observed selectivity for ActR IIB. In order to clarify the observed interactions in the cellular context, RGMb and BMP receptor fusion constructs based on the SNAP-/CLIP-tag® technology as well as efficient labeling protocols and confocal microscopic procedures were established. The biochemical characterization of RGMb along with the extensive interaction studies of this coreceptor with a multiplicity of BMP-ligands and their receptors presented in this work, narrow down the location of the RGMb binding epitope, thus providing an ideal starting point for the subsequent determination of the coreceptor binding domain by site directed mutagenesis. Moreover, the presented in vitro binding studies point to a more complex and possibly novel regulatory mechanism of the BMP signal transduction by RGMb than previously assumed. Thus, the presence of the coreceptor selectively regulates the type II receptor specificity and potentially also the recruitment of BMP-ligands into certain membrane compartments (e.g. lipid raft-domains), herewith fine-tuning BMP-induced signals. The SNAP- and CLIP tag® fusion constructs produced in this work together with the established protocols for confocal microscopy analyses provide efficient tools for subsequent extensive examinations of theses regulatory processes in living cells (e.g. by FRET measurements).
KW  - Knochen-Morphogenese-Proteine
KW  - Rezeptor
KW  - Transforming Growth Factor
KW  - Bone morphogenetic protein
KW  - Transforming Growth Factor
KW  - coreceptor
KW  - BMP
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85568
ER  - 
TY  - THES
A1  - Fuchs, Andreas Rudolf
T1  - 3D-Pulverdruck von Zellkulturträgern mit Magnesium-Phosphat-Chemie
T1  - 3d powder printing of scaffolds with a magnesium phosphate chemistry
N2  - In der vorliegenden Arbeit wurden erstmals im 3D-Pulerdruckverfahren hergestellte Struvit-Matrizes auf ihre Eignung als Trägermaterial für Knochenzellen in vitro untersucht. Hierzu wurde die Zytokompatibilität sowie die chemische Löslichkeit von gedruckten Struvit-Strukturen betrachtet. In einem zweiten Schritt wurde untersucht, ob die biologische Funktion von BMP-2-Lösungen nach Durchlaufen des Druckprozesses erhalten bleibt und ob es möglich ist, BMP-2 unter Beibehaltung seiner biologischen Wirksamkeit direkt in Struvit-Matrizes zu drucken. Als Reaktanten zur Herstellung der Struvit-Matrizes wurde modifiziertes Farringtonit-Pulver mit definierter Körnung und eine äquimolare Binder-Lösung aus DAHP und ADHP verwendet. Die untersuchten Zellkulturträger mit Magnesiumammoniumphosphatchemie zeigten eine ausreichende Zytokompatibilität in vitro. Außerdem wurde gezeigt, dass thermolabile Proteine wie BMP-2 im 3D-Pulverdruckverfahren unter weitgehender Beibehaltung ihrer biologischen Wirksamkeit in vitro grundsätzlich prozessierbar sind. Die Freisetzung direkt eingedruckter Proteine aus den Struvit-Matrizes blieb jedoch hinter den Erwartungen zurück. Mit Struvit steht ein alternatives Zementsystem für den 3D-Pulverdruck zur Verfügung, welches spezifische Vorteile gegenüber den etablierten Calciumphosphaten bietet. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um die Ursache für die geringe BMP-Freisetzung aus den Struvit-Matrizes zu ermitteln und die Vorteile der neutralen Abbindereaktion voll nutzen zu können.
N2  - The purpose of the present study was the investigation of 3d powder printed struvite-scaffolds as a carrier material for osteoblastic cells in vitro. For this purpose, their cytocompatibility and their chemical solubility were observed. In a second step we analysed, if BMP-2 could pass through the whole printing process without losing its biological function and furthermore if it is possible to print BMP-2 directly into struvite-scaffolds without a significant loss of biological activity. As reactants for the fabrication of the struvite-scaffolds, we used a modified farringtonite-powder and a binder solution consisting of an equimolar mixture of DAHP and ADHP. The investigated struvite-scaffolds showed a sufficient cytocompatibility. It was also shown, that thermolabile proteins, such as BMP-2, could be processed in 3d powder printing without losing much of their biological activity in vitro. The release of directly imprinted proteins out of the struvite scaffolds remained unsatisfying. Struvite is an alternative hydraulic-setting cement for 3d powder printing with certain advantages over the established calcium phosphate cements. Further investigations are necessary to identify the reasons for the low BMP-release out of the struvite-scaffolds and to take full advantage of the neutral setting reaction of struvite-cements.
KW  - Struvit
KW  - Rapid Prototyping
KW  - Knochen-Morphogenese-Proteine
KW  - 3D-Pulverdruck
KW  - BMP
KW  - Scaffold
KW  - 3d powder printing
KW  - scaffold
KW  - BMP
KW  - struvite
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-77415
ER  - 
TY  - THES
A1  - Koerdt, Steffen Christian Alexander
T1  - Immunhistochemische Untersuchungen zur Expression von Wachstumsfaktoren im Rahmen der Vaskularisation knöcherner Kieferkammaugmentate im Schafmodell
T1  - Expression of growth factors of the vascularization in alveolar ridge augmentation procedures using autogenous bone grafts : An immunhistochemical study in the sheep
N2  - In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression unterschiedlicher Marker für die Vaskularisation in verschiedenen Modifikationen zur Unterkieferaugmentation mit autologem kortikospongiösen Beckenkammtransplantaten in-vivo am Schafmodell untersucht. Wie schon aus Voruntersuchungen bekannt, zeigte vor allem die Modifikation des Transplantatlagers in der Kombination einer resorbierbaren Bio-Gide® Membran mit dem Knochenersatzmaterial (KEM) Bio-Oss® und einem kortikospongiösen Transplantat die geringsten Resorptionsraten. Dieser Konditionierung wurden verschiedene andere Modikifationen des Transplantatlagers gegenübergestellt und jeweils die Expression der Vaskularisationsmarker untersucht und verglichen. Sowohl die Untersuchungen zur Expression von Bone Morphogenetic Protein-2 (BMP-2), Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) und seinen Rezeptor-Isoformen VEGF-Rezeptor 1 und VEGF-Rezeptor 2, sowie den NOS-Isoformen eNOS und iNOS zeigen alle eine signifikant vermehrte Expression in der Konditionierung mit Bio-Oss® als KEM und einer resorbierbaren Bio-Gide® Membran. Lediglich die Expression des von-Willebrand-Faktors (vWF) als Marker des Endothels zeigte keine signifikant vermehrte Expression in der mit Bio-Oss® und Bio-Gide® modifizierten Gruppe. Hier wäre die Tatsache, dass der vWF auch als Marker der endothelialen Dysfunktion beschrieben wird und in den klinisch stärker atrophierten Modifikation vermehrt exprimiert wird, eine Erklärungsmöglichkeit. Die Untersuchungen zur Expression der Vaskularisationsmarker hinsichtlich der Regionen im Augmentat zeigen sowohl bei BMP-2 wie auch bei VEGF und seinen Rezeptorisoformen VEGF-R1 und VEGF-R2 eine signifikant vermehrte Expression im Bereich des Transplantates in der Bio-Oss® Modifikation. Diese Ergebnisse stützen den klinischen Aspekt der guten Vaskularisierung des Transplantates und unterstreichen die Bedeutung der Wachstumsfaktoren für die Vaskularisierung im Transplantat. Bei den Färbungen auf NOS findet sich eine signifikant vermehrte Expression im Transplantatlager. Diese Ergebnisse stellen die Bedeutung von NOS für die Regulation der Osteogenese und die direkten Wirkungen auf Osteoblasten und Osteoklasten. Die Tatsache, dass gerade in der Bio-Oss® Modifikation, in der klinisch die geringste Resorption zu beobachten war, signifikant mehr Vaskularisationsmarker exprimiert wurden, ist Nachweis der besseren Vaskularisation dieser Konditionierung und unterstreicht sowohl den Nutzen von KEM wie Bio-Oss® bei Transplantationen autologen Knochens, wie auch die Möglichkeiten der therapeutischen Verwendung einzelner Wachstumsfaktoren wie z. B. BMP-2.
N2  - In this study the expression of various markers for vascularization in different modifications of alveolar ridge augmentation procedures on the mandible with autogenous bone grafts from the iliac crest was analyzed with the help of an in-vivo sheep model. As preliminary investigations suggested, especially the modification of the host side as a combination of a resorbable Bio-Gide® membrane according to the concept of Guided Bone Regeneration (GBR) with Bio-Oss® as a bovine bone substitute, showed the least resorption in clinical findings. This modification of the host side was compared with a control group, in which other modifications of the host side were being used and which showed a way higher rate of resorption during the surveillance period and until the euthanasia of the sheep after 16 weeks. The expression of different vascularization markers was compared between these two groups. The data concerning the expression of Bone Morphogenetic Protein-2 (BMP-2), Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) and its receptor-isoforms VEGF-Receptor 1 and VEGF-Receptor 2, as well as the Nitric Oxide Synthase (NOS) isoforms, the endothelial NOS (eNOS) and the inducible NOS (iNOS) all showed a significantly higher expression within the modification of the host side using GBR and Bio-Oss®. Only the expression of the von-Willebrand-Factor (vWF) as a marker of the endothelium showed no significantly higher expression within this modification but a higher expression within the control group. Hypothetically, the fact that vWF is also a marker of endothelial dysfunction could explain the higher expression within the control group. Taking the different regions of the graft in consideration, BMP-2, VEGF, VEGFR-1 and VEGFR-2 all showed a significantly higher expression within the bone graft of the modification using GBR and Bio-Oss®. These results underline the clinical aspect of the good vascularization of the graft within this modification. NOS showed a significantly higher expression in the region of the host side and could explain the importance of NOS for osteogenesis and its effect on osteoblasts and osteoclasts. In summary, the significantly higher expression of vascularization markers and clincally the lowest rate of atrophy and resorption within the modification of the host side using GBR and Bio-Oss®, underlines the better vascularization of this modification and emphasizes the use of GBR and bone substitues during the transplantation of autogenous bone grafts and suggests the therapeutical use of certain growth factors such as BMP-2 within this modification.
KW  - Unterkiefer
KW  - Transplantat
KW  - Immuncytochemie
KW  - Knochenzement
KW  - Knochen-Morphogenese-Proteine
KW  - Augmentation
KW  - Vascular endothelial Growth Factor
KW  - Knochenersatzmaterial
KW  - VEGF-Rezeptor 1
KW  - VEGF-Rezeptor 2
KW  - eNOS
KW  - iNOS
KW  - alveolar crest augmentation
KW  - autgenous bone graft
KW  - immunhistchemistry
KW  - bovine bone substitute
KW  - mandible
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69798
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TY  - THES
A1  - Heinecke, Kai
T1  - Die Dynamik der primären Erkennungsschritte von BMP-Rezeptoren
T1  - Dynamics of the primary recognition steps of BMP receptors
N2  - Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) bilden zusammen mit den Activinen, Growth and Differentiation Factors (GDFs) und Transforming Growth Factor β (TGF-β) die Transforming Growth Factor β-Superfamilie von sekretierten Signalproteinen. Sie spielen eine wichtige Rolle in der Entwicklung, Erhaltung und Regeneration von Geweben und Organen. Die Signalvermittlung dieser Proteine erfolgt durch die Bindung von zwei verschiedenen Typen von Serin-/Threonin-Kinaserezeptoren, die als Typ-I- und Typ-II-Rezeptoren bezeichnet werden. Im ersten Schritt erfolgt die Bindung an den hochaffinen Rezeptor (im Fall von BMP-2 der Typ-I-Rezeptor), im nächsten Schritt wird der niederaffine Rezeptor in den Komplex rekrutiert. Bis heute sind lediglich sieben Typ-I- und fünf Typ-II-Rezeptoren bekannt, was auf eine Promiskuität in der Liganden-Rezeptor-Interaktion schließen lässt. Die Architektur beider Rezeptorsubtypen ist dabei relativ ähnlich. Beide bestehen aus einer ligandenbindenden extrazellulären Domäne, einer Transmembrandomäne sowie einer intrazellulären Kinasedomäne. Eine nacheinander ablaufende Transphosphorylierung der intrazellulären Domänen führt zu einer Phosphorylierung von SMAD-Proteinen, die dann als nachgeschaltete Vermittler fungieren und die Transkription regulierter Gene auslösen. Im Hauptteil dieser Arbeit wurden die initialen Schritte der Rezeptorkomplexformierung sowie die Mobilität der Rezeptoren mit Hilfe von fluoreszenzmikroskopischen Methoden untersucht. Dabei konnte festgestellt werden, dass für die Bildung eines Signalkomplexes eine bestimmte Schwellenkonzentration des Liganden nötig ist und dass der Mechanismus nach einem Alles-oder-Nichts-Prinzip wie ein Schalter funktioniert. Außerdem konnten Unterschiede in der Nutzung der gleichen Rezeptoren durch verschiedene Liganden festgestellt werden. Die anderen Teile der Arbeit befassen sich mit der Funktionalität der verschiedenen Rezeptordomänen in der Signalübermittlung, der Analyse von hoch- und niederaffinen Ligandenbindestellen auf ganzen Zellen sowie dem Einfluss des SMAD- und des MAPK-Signalwegs auf die Induktion der Alkalischen Phosphatase. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Art der SMAD-Phosphorylierung allein vom Typ der Kinasedomäne abhängig ist, dass auf einer Zelle verschiedene Rezeptorpopulationen existieren, welche von unterschiedlichen Ligandenkonzentrationen angesprochen werden, und dass die Induktion der Alkalischen Phosphatase stark vom zeitlichen Verlauf der SMAD- und MAPK-Aktivierung abhängig ist.
N2  - Bone Morphogenetic Proteins (BMPs), together with Activins, Growth and Differentiation Factors (GDFs) and Transforming Growth Factor β (TGFβ), are secreted signalling proteins that belong to the Transforming Growth Factor β superfamily. They play an important role in regulating the development, maintenance and regeneration of tissues and organs. Signalling of TGFβ superfamily members occurs by binding to two types of serine-/threonine kinase receptors termed type I and type II. First, the high affinity receptor (in case of BMP2 the type I receptor) is bound, and then the low affinity receptor is recruited into the signalling complex. The fact that there are only seven type-I and five type-II receptors are known implies a limited promiscuity in ligand-receptor interaction. The architecture of both receptor subtypes is quite similar, with a small extracellular ligand-binding domain, a single transmembrane domain and an intracellular kinase domain. Subsequent transphosphorylation of the intracellular receptor domains leads to phosphorylation of SMAD proteins, which then act as downstream mediators and activate gene transcription. The main part of this work was to analyze the initial steps in receptor complex formation and the mobility of TGFβ-superfamily receptors with fluorescence microscopy techniques. It could be shown that complex formation requires a certain ligand threshold concentration and shows an all-or-nothing switch-like behaviour. Furthermore, differences between different ligands using the same receptors could be visualized. The other parts of this work deal with the functionality of the different receptor domains in signal transduction, the analysis of high- and low-affinity binding sites on whole cells and the influence of the SMAD- and MAPK-pathways on alkaline phosphatase induction. It could be shown that the type of SMAD phosphorylation ist solely dependent on the type of the kinase domain, that there exist different receptor populations on a cell that are addressed by different ligand concentrations and that alkaline phosphatase induction is highly dependent on the time course of SMAD- and MAPK-pathway activation.
KW  - Knochen-Morphogenese-Proteine
KW  - Wirkstoff-Rezeptor-Bindung
KW  - Signaltransduktion
KW  - Signalkomplex
KW  - Rezeptormobilität
KW  - Rezeptor-Liganden-Interaktion
KW  - Physiologische Chemie
KW  - Molekulare Biophysik
KW  - Molekularbiologie
KW  - Signaling complex
KW  - receptor mobility
KW  - receptor-ligand-interaction
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-49257
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TY  - THES
A1  - Ulbrich, Jannes
T1  - Integrierung und biochemische Charakterisierung ektoper BMP Rezeptoren in Zellmembranen
T1  - The integration and biochemical characterization of ectopic BMP receptors in cell membranes
N2  - BMPs vermitteln ihre zellulären Effekte durch Rekrutierung und Aktivierung von zwei Typen spezifischer, membranständiger Rezeptoren. Die genauen Mechanismen der Rezeptorakivierung und die Komposition eines funktionellen, signalvermittelnden Komplexes auf der Zelloberfläche sind in den letzten Jahren genau untersucht worden. Die dimere Natur aller BMPs, die Promiskuitivität der BMPs sowie der entsprechenden Rezeptoren und die unterschiedlichen Rezeptorkonformationen (PFC, BISC) erschweren jedoch die experimentelle Zugänglichkeit dieser Proteinfamilie. Um den Einfluss der Membranverankerung der Rezeptoren auf deren Affinität zu einzelnen Liganden zu untersuchen, wurden verschiedene Methoden evaluiert, die eine quantitative Kopplung an Plasmamembranen ermöglichten. Die BMP Rezeptorektodomänen wurden u.a. mittels einer lysin-spezifischen Kopplung lipidiert, oder aber als His6-Ektodomänen an membranintegrierte Chelatlipide gekoppelt.
N2  - BMPs elicit their cellular functions via recruitment and activation of specific receptor serin/threonine receptor kinases. The precise mechanisms leading to receptor activation and the composition of a functional signal transducing complex on the cell surface has been investigated intensively over the last decades. The dimeric nature of all BMPs, the promiscuity of both, the ligands and the receptors and the different receptor conformations on the cell surface (PFC, BISC) hamper the experimental accessibility of this protein family. To study the membrane anchorage's influence of the receptors on their affinity towards single ligands, different methods were evaluated that enabled us to couple the receptor ectodomains in a quantitative manner to plasma membranes. The BMP receptor ectodomains were, among other techniques, lipidated in a lysine specific way or coupled as hexahistidine fusion proteins to membrane integrated chelating lipids.
KW  - Knochen-Morphogenese-Proteine
KW  - Transforming Growth Factor
KW  - Transforming Growth Factor beta
KW  - BMPs
KW  - BMP Rezeptoren
KW  - Proteinmodifikationen
KW  - Protein Lipidierungen
KW  - NTA Lipide
KW  - BMP
KW  - BMP receptos
KW  - protein modifications
KW  - protein lipidations
KW  - NTA lipids
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-55462
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TY  - THES
A1  - Weidauer, Stella Elisabeth
T1  - Strukturelle und funktionelle Charakterisierung des Knochenwachstums-Modulators Sclerostin
T1  - Structural and functional characterization of the bone-modulator protein sclerostin
N2  - Die Knochenhomöostase erfolgt durch das Zusammenspiel mehrerer Zelltypen. Während die Osteoblasten für den Knochenaufbau verantwortlich sind, resorbieren die Osteoklasten Knochengewebe. Beide Vorgänge werden durch die Osteozyten streng reguliert. Eine Störung im strikt regulierten Gleichgewicht zwischen Knochenabbau und Knochenaufbau kann daher zu Knochenkrankheiten wie Osteoporose führen. Auf molekularer Ebene erfolgt die Kommunikation zwischen den einzelnen Zelltypen über zwei wichtige Signalwege, den der „Bone Morphogenetic Protein“-Superfamilie (BMPs) und den der Wnt-Proteine. Die Signalübertragung wird hierbei durch sekretierte Faktoren induziert, die an Rezeptoren auf der Zelloberfläche binden. Deren Aktivierung führt zu einem intrazellulären Signal, welches letztlich die Expression von Zielgenen reguliert. Beide Signalwege werden auf mehreren Ebenen, extrazellulär, membranständig und intrazellulär reguliert. Das 2003 identifizierte Sclerostin ist ein Vertreter der extrazellulären Regulatorproteine und wurde aufgrund seiner Zugehörigkeit zur DAN-Familie zunächst fälschlicherweise als direkter Inhibitor des BMP-Signalwegs eingestuft. Mittlerweile wird allerdings davon ausgegangen, dass Sclerostin den Wnt-Signalweg negativ reguliert, indem es die Wnt Ko-Rezeptoren LRP5 und LRP6 bindet, die beide zu der Familie der „Low-density lipoprotein receptors“ gehören. Über den molekularen Inhibitionsmechanismus von Sclerostin war jedoch zum Startpunkt dieser Dissertationsarbeit wenig bekannt. Daher wurde Sclerostin im Rahmen dieser Arbeit biophysikalisch und biochemisch charakterisiert. Die Aufklärung mittels NMR-Spektroskopie ergab für Sclerostin eine Struktur, die sich in drei Regionen gliedert: den Cystinknoten, sowie einen „Loop“-Bereich und die Fingerregion. Vom zentralen Cystinknoten gehen drei Peptid-Schleifen in zwei entgegengesetzte Richtungen aus. Schleife eins und drei bilden eine definierte ß-Faltblattstruktur und ähneln zwei Fingern einer Hand. Die zweite Schleife, welche vom Cystinknoten isoliert in die entgegengesetzte Richtung verläuft („Loop“), ist wie die beiden langen N- und C-Termini flexibel und unstrukturiert. Die in Zusammenarbeit mit der Firma AbD-Serotec entstandenen Fab-Fragmente ermöglichten die Bestimmung des Bindeepitops der Sclerostin/LRP5-Interaktion im Bereich der unstrukturierten dritten Schleife von Sclerostin. Die Struktur von Sclerostin und die Identifikation des Bindeepitops auf Sclerostinseite geben nun erste Einblicke in den molekularen Mechanismus der Sclerostin/LRP5-Interaktion. Diese Kenntnis kann für die Entwicklung von Kleinmolekülinhibitoren mittels rationalem Drugdesign genutzt werden, welche, wie auch der in Kooperation entwickelte die Sclerostinaktivität neutralisierende Antikörper AbD09097, hochinteressante Ansätze für neuartige anabole Therapien von Krankheiten mit Knochenschwund darstellen.
N2  - Different cell types like osteoblasts, osteoclasts and osteocytes maintain bone homeostasis. While osteoblasts build up bone, osteoclasts resorb bone tissue and both actions are tightly regulated by the osteocytes. Imbalance between bone formation and resorption will lead to various bone diseases, e.g. osteoporosis. On a molecular level communication between these cell types occurs through two major signalling pathways, i.e. the bone morphogenetic proteins (BMPs) and the Wnt-factors. In both pathways signal transduction is induced by secreted factors, which bind to cell surface receptors. This activation leads to an intracellular signal that finally regulates expression of target genes. Both pathways are tightly regulated at various cellular levels, extracellular, at the membrane as well as intracellular. Sclerostin, which was identified in 2003, is a member of the extracellular modulator proteins. Initially it was wrongly classified as a direct inhibitor of the BMP-signalling pathway due to its classification as a member of the DAN-family. Meanwhile it became apparent that sclerostin targets the Wnt-pathway by binding to the Wnt co-receptors LRP5 and LRP6, which belong to the family of low-density lipoprotein receptors. At the beginning of this work very little was known about the molecular mechanism how sclerostin inhibits the Wnt-pathway. The structure analysis of sclerostin employing NMR-spectroscopy revealed in a modular architecture, which can be divided into three regions: the central, characteristic cystine knot, the loop-region and the two fingers. From the cystine knot three loops emanate in two opposite directions. Loop one and loop three form defined ß-sheet structures resembling two fingers of a hand. Loop two, which runs into the opposite direction, is unstructured and highly flexible like the long N- and C-termini. Antibody fab-fragments, which were generated in collaboration with AbD-Serotec, facilitated the mapping of the binding-epitop of sclerostin to LRP5/6, highlighting an extended area of the unstructured loop region of sclerostin as the LRP5/6 binding site. The high-resolution structure of sclerostin and the identification of the LRP5-binding-epitop yield first insights into the molecular mechanism of sclerostin-LRP5 interaction. This knowledge can now be used to develop small-molecule inhibitors by rational drug design, which are, like the sclerostin activity neutralising fab-fragment AbD09097, highly interesting targets for new bone-anabolic therapies of diseases characterised by bone loss.
KW  - Cytokine
KW  - Knochen-Morphogenese-Proteine
KW  - Wnt-Proteine
KW  - Transforming Growth Factor beta
KW  - Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
KW  - Struktur-Aktivitäts-B
KW  - LRP5/6
KW  - DAN-Modulatorproteine
KW  - Cystinknotenprotein
KW  - Knochenhomöostase
KW  - LRP5/6
KW  - DAN modulator proteins
KW  - cystin knot protein
KW  - bone homeostasis
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46224
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TY  - THES
A1  - Schröter, Benedikt Markus
T1  - Aufklärung der Funktion von CYR61/ CCN1 in Osteoblasten und Osteoklasten
T1  - Effects of CYR61/CCN1 on osteoblasts and osteoclasts
N2  - No abstract available
KW  - Osteoblast
KW  - Osteoklast
KW  - Osteoporose
KW  - Frakturheilung
KW  - Knochenstoffwechsel
KW  - Knochen-Morphogenese-Proteine
KW  - CCN- Proteine
KW  - CCN1
KW  - hCYR61
KW  - osteoblast
KW  - osteoclast
KW  - CCN1
KW  - hCYR61
KW  - bone metabolism
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-38830
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