TY - THES A1 - Goschenhofer, Ulrich T1 - Auswirkungen von FGF23 und Klotho auf lokale Mineralisierungsprozesse von Knochenzellen in 3D-Zellkulturen T1 - Effects of FGF23 and Klotho on local mineralisation processes of bone cells in 3D cell cultures N2 - Osteozyten stehen vermehrt im Fokus als wesentliche Regulatoren der Knochenmineralisierung. Das ähnlich einem neuronalen Netzwerk aufgebaute lakunokanalikuläre Netzwerk der Osteozyten breitet sich im Knochen in drei Ebenen aus. Es wurde in dieser Arbeit ein 3D-Kollagengel-Modell verwendet und dort die Osteoblasten- bzw. Osteozytenzelllinien MLO-A5 und MLO-Y4, sowie humane mesenchymale Stammzellen aus Hüftköpfen eingebettet. Es wurden die optimalen Kulturbedingungen entwickelt und die Zellen über mehrere Wochen kultiviert, beobachtet und mit dem herkömmlichen 2D-Kulturmodell verglichen. MLO-A5 und MLO-Y4 bilden die zelltypischen Zellfortsätze. Die Gele kontrahieren, wenn hMSC und MLO-A5 eingebettet sind, mit MLO-Y4 zeigt sich über den gesamten Kultivierungszeitraum keinerlei Kontraktion der Kollagengele. Die Zellen wurden zudem osteogen differenziert und mit FGF23 und Klotho stimuliert. Es ergaben sich erste Hinweise auf eine FGF23 / Klotho-abhängige Inhibierung der lokalen Mineralisierung in osteogen differenzierten MLO-A5. Es konnten einige osteogene Marker durch PCR und in den histologischen Schnitten mittels Antikörperfärbungen nachgewiesen werden, eindeutige Expressionsmuster und deren zeitliche Verläufe im Vergleich der osteogenen Differenzierungen und Zugabe von FGF23 und Klotho sind allerdings noch nicht identifizierbar und bedürfen womöglich höherer Fallzahlen und weiterer Untersuchungsmethoden. Insgesamt gesehen erweist sich das System aber als einfach und mit niederschwellig erreichbaren Methoden und Materialien durchzuführen. N2 - Osteocytes increasingly establish as the key regulators of bone mineralisation. The network of osteocytes - similar to the neuronal network - is spreaded in three dimensions in bone. In this work the osteoblast/osteocyte cell lines MLO-A5 and MLO-Y4 were embedded in a 3D collagen gel model and compared to human MSCs. Optimal culture conditions were developed, cells cultivated and observed over several weeks and compared to 2D cell culture models. MLO-A5 and MLO-Y4 build the typical cell dendrites. Gels contract with MSCs and MLO-A5 whereas MLO-Y4 do not contract the gels. Cells were differentiated in osteogenetic pathway and stimulated with FGF23 and Klotho. First results suggest that FGF23 and Klotho can inhibit local mineralisation in MLO-A5 but more reproductions need to be made. Osteogenetic markers were identified by mRNA-PCR and antibody stainings of paraffin slices. Clear demarcation throughout osteogenetic differentiation and stimulation with FGF23 and Klotho could not be identified. Reproductions of the model prove to be easy and with low-threshold resources. KW - Osteozyt KW - 3D-Zellkultur KW - Mineralisation KW - MLO-A5 KW - collagen gel KW - MLO-Y4 KW - hMSC KW - Kollagengel KW - Osteogene Differenzierung KW - osteocytes KW - osteogenetic differentiation KW - FGF23 KW - Klotho Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-200455 ER - TY - THES A1 - Reichert, Johannes Christian T1 - Osteogene Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen in Kollagen I Hydrogelen und Herstellung eines stammzellbasierten Polycaprolacton-Hydrogel Konstrukts für die Rekonstruktion segmentaler Knochendefekte T1 - Osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells in collagen type I hydrogels and fabrication of a stem cell based polycaprolactone-hydrogel construct for the reconstruction of segmetnal bone defects N2 - Segmentale Knochendefekte, stellen ein bedeutendes, klinisches Problem mit bisher limitierten, therapeutischen Möglichkeiten dar. Sie schränken nicht nur die Gesundheit und Lebensqualität des Betroffenen ein sondern bringen bei steigender Inzidenz und kostenintensiver Behandlung auch eine gewaltige sozioökonomische Problematik mit sich. Die bisher zur Verfügung stehenden, therapeutischen Mittel wie die Entnahme von autologer Spongiosa aus dem Beckenkamm bergen das Problem der Morbidität an der Entnahmestelle, von persistierender Schmerzsyndromen, von Hypersensitivität, Instabilität des Beckens und Infektionen. Zudem ist die Menge an Knochen, die gewonnen werden kann, limitiert. Allografts sind von einer bedeutend niedrigeren Zellularität, besitzen eine geringere Revaskularisierungsrate sowie eine höhere Resorptionsrate, führen zu einer niedrigeren Knochenformationsrate und gehen mit der Gefahr einer Abstoßungsreaktion einher. Zukünftig könnte das Tissue Engineering als interdisziplinäres Forschungskonzept hier eine entscheidende Rolle spielen. Insbesondere MSZ wird ein großes therapeutisches Potential für die Rekonstruktion von Knochengewebe zugeschrieben. Die vorliegende Studie beschäftigte sich einerseits mit der Frage, ob unter dem Einfluss entsprechender Wachstumsfaktoren humane MSZ aus dem Knochenmark in Kollagen I Hydrogelen zu einer osteogenen Differenzierung und der Produktion mineralisierter, extrazellulärer Matrix angeregt werden können. Zum andern wurde untersucht, ob es möglich ist, ein Konstrukt aus MSZ, einem Kollagen Gel und einem geeigneten Scaffold herzustellen, das sich zur Rekonstruktion segmentaler Knochendefekte eignet. Zunächst wurden MSZ aus dem Knochenmark isoliert und in Monolayerkulturen osteogen differenziert. Die histochemischen Untersuchungen zeigten, dass in osteogenem Differenzierungsmedium kultivierte MSZ in der primären Zellkultur vermehrt mineralisierte Matrix bildeten und ALP exprimierten. In den RT-PCR Analysen konnte eine deutliche Mehrexpression später osteogener Markergene wie Osteokalzin nachgewiesen werden. MSZ, die leicht zu isolieren und zu 53 kultivieren sind, eignen sich demnach gut als Zellen zur Herstellung eines Konstruktes für die Rekonstruktion von segmentalen Knochendefekten. Eingebracht in Kollagen I Hydrogele zeigten die Zellen unter dem Einfluss verschiedener osteogener Differenzierungsbedingungen unterschiedliche Genexpressionsmuster. Nach 42 Tagen Kultur in SZM (Kontrollgruppe) konnte sowohl die Expression osteogener Markergene als auch eine chondrogene Differenzierung nachgewiesen werden. Es konnte eine deutliche Mehrexpression von AGN, Col II und SOX-9, gleichfalls der osteogenen Marker ALP und Cbfa1 gezeigt werden. Ein entsprechendes Bild hatte auch die histologische Aufarbeitung ergeben. Dies könnte auf die Eigenschaften des Kollagen Hydrogels zurückzuführen sein, dem aufgrund seiner Zusammensetzung und biologisch-induktiven Merkmale eine chondrogene Induktion, sogar ohne Wachstumsfaktoren, zugeschrieben wird. In der mit BMP- 2 differenzierten Gruppe zeigte sich eine deutliche Zunahme der Expression der chondrogenen Markergene, wie Col II und SOX-9. Auch die osteogenen Marker wie ALP, Cbfa1 und OC waren etwas stärker exprimiert. Den Ergebnissen nach zu schließen begünstigte BMP-2 bei der Kultivierung von MSZ in Kollagen I Hydrogelen in vitro eine eher chondrogene Differenzierung. Zumindest in Kombination mit Kollagen I Hydrogelen scheint daher BMP-2 als osteogener Wachstumsfaktor bei der Herstellung stammzellbasierter Konstrukte für den Knochenersatz weniger geeignet. Nach Kultur in osteogenem Medium konnte gegenüber der SZM Gruppe eine deutliche Mehrexpression aller getesteten, osteogenen Marker, insbesondere auch von Cbfa1 und OC, nachgewiesen werden. Allerdings zeigte sich auch bei den chondrogenen Markergenen wie Col II eine geringe Zunahme der Genexpression. Das osteogene Medium induzierte demnach MSZ in Kollagen I Gelen vorwiegend eine osteogene Differenzierung. Entsprechend konnte in den histologischen Untersuchungen die Bildung einer mineralisierten, extrazellulären Matrix nachgewiesen werden. Weiterhin konnte im Rahmen dieser Arbeit in vitro aus einem Kollagen I Gel, MSZ und einem PCL-Scaffold ein Konstrukt hergestellt werden, das die Regeneration segmentaler Knochendefekte positiv beeinflussen könnte. Es zeigte sich ein gutes Bonding an der Grenzfläche zwischen Kollagen Gel und 54 PCL-Scaffold. Das Kollagen Gel hatte die makroporösen und mikroporösen Freiräume des Scaffolds komplett ausgefüllt, wodurch eine homogene Verteilung der MSZ innerhalb des Scaffolds erreicht werden konnte. N2 - Osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells in collagen type I hydrogels and fabrication of a stem cell base polycaprolactone-hydrogel construct for the reconstruction of segmetnal bone defects KW - Osteogene Differenzierung KW - mesenchymale Stammzelle KW - Polycaprolacton KW - Knochendefekt KW - osteogenic differentiation KW - stem cell KW - polycaprolactone KW - bone defect Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-23274 ER -