TY - THES A1 - Emmerich, Christoph T1 - Die Rolle der clathrin- und dynaminabhängigen Endozytose bei der Internalisation von anti-Amphiphysin-Autoantikörpern im Falle des Stiff-Person-Syndroms, untersucht am Zellkulturmodell hippocampaler Neurone T1 - The role of clathrin- and dynamin dependent endocytosis in internalisation of anti-amphiphysin-autoantibodies in case of Stiff-Person-Syndrom N2 - In dieser Arbeit wurde mit Hilfe von small-molecule Inhibitoren die Rolle von clathrin- und dynaminabhängigen Endozytosemechanismen bei der Aufnahme von anti-Amphiphysin-Autoantikörpern am Zellkulturmodell primärer hippocampaler Neurone untersucht. Hierbei konnte eine Beeinflussung der Autoaantikörperaufnahme durch die Intervention gezeigt werden. Außerdem erfolgte der Versuch der Etablierung eines siRNA knockdowns unter Zuhilfenahme unterschiedlicher Traansfektionsreaaagenzien. N2 - This thesis investigated the role of clathrin and dynamin dependent endocytosis in internalisation of anti-amphiphysin-autoantibodies in primary mouse hippocampal neurons by using small molecule inhibitors. An influence in the uptake due to small molecule treatment can be shown. Furthermore an attempt of siRNA knockdown establishment was performed using different transfection reagents. KW - siRNA KW - small molecule KW - Stiff-Person-Syndrom KW - anti-Amphiphysin Antikörper KW - siRNA KW - small-molecule Inhibitoren KW - Stiff-Person-Syndrom KW - anti-amphiphysin antibodies KW - small-molecule inhibitors Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-209360 ER - TY - THES A1 - Mourad, Caroline T1 - RNA-Interferenz humaner Natürlicher Killer-Zellen unter Einführung von siRNA mittels Lipofektion und Elektroporation T1 - RNA interference in human natural killer cells by introduction of siRNA by lipofection and electroporation N2 - Als Teil des angeborenen Immunsystems spielen Natürliche Killer(NK)- Zellen eine entscheidende Rolle in der Interaktion mit Pathogenen und Tumorzellen. Mithilfe der RNA-Interferenz bestimmter Gene wie beispielsweise CD56 könnten Hinweise auf die genaue Funktionsweise der NK-Zellen gewonnen werden. Ziel dieser Arbeit war es eine geeignete Transfektionsmethode zum Einführen von siRNA in NK-Zellen zu finden, welche eine hohe Transfektionseffizienz bei gleichzeitig hoher Zellviabilität aufweist. Hierfür wurden drei verschiedene Lipofektionsreagenzien und sechs verschiedene Elektroporationsprogramme verglichen. Zunächst wurde die Transfektionseffizienz mit an AF488 gekoppelter negativer siRNA per Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie evaluiert und jeweils das effizienteste Lipofektionsreagenz bzw. Elektroporationsprogramm ausgewählt. Mit diesen wurde anschließend eine Herunterregulation des CD56-Gens mit CD56-siRNA per RNA-Interferenz versucht. Die CD56-Gen-Expression wurde auf Proteinebene per Durchflusszytometrie und auf mRNA-Ebene per PCR (Polymerase-Ketten-Reaktion) evaluiert. N2 - As a part of the innate immune system Natural Killer (NK) cells play a crucial role in the interaction with pathogens and tumor cells. Using RNA interference of special genes like CD56 may lead to a better understanding of the function of NK cells. The aim of this work was to find a suitable transfection method to introduce siRNA into NK cells which shows a high transfection efficiency and at the same time a high cell viability. Three different lipofection reagents and six different electroporation programs were compared. Initially, the transfection efficiency was evaluated with AF488-tagged negative siRNA by fluorescence microscopy and flow cytometry and the most efficient lipofection reagent and electroporation program were chosen. Using these a knockdown of the CD56 gene was tried by RNA interference with CD56 siRNA. The CD56 gene expression was evaluated on the protein level by flow cytometry and on the mRNA level by PCR (polymerase chain reaction). KW - RNS-Interferenz KW - Transfektion KW - Natürliche Killer-Zellen KW - natural killer cells KW - RNA interference KW - Elektroporation KW - electroporation KW - Lipofektion KW - lipofection KW - transfection KW - siRNA Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-185458 ER - TY - THES A1 - Frank, Benjamin T1 - Untersuchungen zur Autophagieinduktion in Leishmania major-infizierten Knochenmarksmakrophagen T1 - Analyses of autophagy induction in Leishmania major-infected bone marrow-derived macrophages N2 - Die von der WHO zu den 17 wichtigsten NTDs gezählte Leishmaniose wird durch intrazelluläre Parasiten der Gattung Leishmania hervorgerufen. Der Lebenszyklus der Parasiten besteht aus zwei Phasen. Die länglichen und beweglichen Promastigoten kennzeichnen die Phase in der Sandmücke – der Vektor der Leishmaniose. Hingegen ist die Phase im Säugerwirt durch runde unbewegliche Amastigoten charakterisiert. Aufgrund des Mangels an potenten antileishmanialen Therapien wurde in der vorliegenden Arbeit die Interaktion zwischen L. m. Parasiten und der Hauptwirtszelle, der Makrophage, v. a. in Hinblick auf autophage Prozesse in den infizierten Makrophagen näher untersucht, um demgemäß neue Erkenntnisse zu gewinnen, welche bei der Herstellung zukünftiger anti-leishmanialer Medikamente helfen könnten. Bei der Autophagie handelt es sich um einen katabolen Prozess, wodurch Zellen bei Nahrungsmangel oder zellulärem Stress ihre Homöostase erhalten können. Durch diesen Prozess können überflüssige oder beschädigte Organellen recycelt werden, um die Funktionen der Zelle aufrechtzuerhalten. Daneben übernimmt Autophagie auch eine essenzielle Rolle bei der Abwehr von ins Zytosol eindringenden Pathogenen. Mittels des neu etablierten totalen Autophagiescore konnte festgestellt werden, dass Autophagie in L. m.-infizierten BMDM induziert wird. Die intrazellulären Amastigoten werden durch Autophagie in den BMDM verdaut. Die erhöhte autophage Aktivität konnte zudem durch Western-Blot-Analysen der autophagierelevanten Proteine ATG5, LC3B und UB bestätigt werden. Die molekulargenetischen Untersuchungen von L. m.-infizier-ten BMDM mithilfe von Affymetrix Microarrays führten zu einem Netzwerk aus autophagierelevanten und infektionsspezifischen Genen, welches als LISA bezeichnet worden ist. Hier hat sich ebenfalls eine starke Verknüpfung von autophagierelevanten Genen und den Genen der Glykolyse, einem zweiten katabolen Prozess, gezeigt. Zudem konnten zwei weitere autophagierelevante und infektionsspezifische Gene außerhalb von LISA identifiziert werden, nämlich Bnip3 und Ctse, welche im Anschluss genauer untersucht worden sind. Bei beiden Genen konnte auf Proteinebene gezeigt werden, dass sie in L. m.-infizierten BMDM signifikant erhöht sind. Durch siRNA-Analysen konnte überdies beobachtet werden, dass beide für die erfolgreiche Elimination der Amastigoten essenziell sind. Somit konnte mit den Proteinen BNIP3 und CTSE zwei potenzielle neue Ansatzpunkte für mögliche zukünftige antileishmaniale Therapien gefunden werden. Auch die in LISA enthaltenen Gene stellen prinzipiell vielversprechende Ziele für künftige Medikamente gegen Leishmaniose dar. Durch all diese Untersuchungen kommt man dem Ziel einer neuen, gezielten und nebenwirkungsärmeren Behandlung der Leishmaniose einen Schritt näher. N2 - Leishmaniasis, listed by the WHO to be one of the 17 most important NTDs, is caused by intracellular parasites of the genus Leishmania. The life cycle of the parasites consists of two stages. The oblong and motile promastigotes characterize the stage in the sand fly, the vector of leishmaniasis. However, the stage in the vertebrate host is characterized by round immotile amastigotes. Due to a lack of capable antileishmanial therapies, the interaction between L. m. parasites and their main host cell, the macrophage, was investigated in the present work, huge focus on autophagic processes in infected macrophages. Our goal was to get new insights for the future production of antileishmanial drugs. Autophagy is a catabolic process whereby cells are able to maintain their homeostasis in times of starvation or cellular stress. During to this process, redundant or damaged organelles are recycled in order to sustain cellular viability. Furthermore, autophagy has an essential role in the defense of pathogens invading the cytosol. The newly established total autophagy score showed an autophagy induction in L. m.-infected BMDM. Intracellular amastigotes are digested by autophagy in BMDM. The increased autophagic activity could also be confirmed by western-blot analyses of the autophagy-relevant proteins ATG5, LC3B, and UB. Molecular genetic investigations of L. m.-infected BMDM by Affymetrix microarrays led to a network of autophagy-relevant and infection-specific genes, which was called LISA. Additionally, it showed a strong connection between autophagy-relevant genes and genes of the glycolysis, a second catabolic process. Moreover, we identified and further characterized two additional autophagy-relevant genes, Bnip3 and Ctse, which were not included in LISA. Both genes were significantly overexpressed on protein level in L. m.-infected BMDM. By siRNA analyses we also demonstrated their importance for successful elimination of amastigotes. Therefore, both proteins, BNIP3 and CTSE, could be new potential targets for possible future antileishmanial therapies. In addition, the genes included in LISA might be promising targets for future drugs against leishmaniasis. Due to all these investigations we are one step closer to our goal of a targeted and safe therapy of leishmaniasis. KW - Autophagie KW - Leishmania major KW - Cathepsin E KW - BNIP3 KW - Elektronenmikroskopie KW - Autophagie KW - Leishmania major KW - Cathepsin E KW - BNIP3 KW - Elektronenmikroskopie KW - Microarray KW - siRNA KW - Autophagiescore Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-137277 ER - TY - THES A1 - Löwe, Tobias T1 - Untersuchung von gene-drive-Strategien als neue Interventionsstrategien zur Eindämmung der Malaria T1 - A refined genome engineering strategy against parasites and vectors: an application for malaria control N2 - In der vorliegenden Arbeit haben wir unter Nutzung bioinformatischer Methoden eine innovative Strategie zur Eindämmung der Malaria entwickelt. Die genetische Modifikationsstrategie beinhaltet sowohl Manipulationen aufseiten des gefährlichsten Erregers, Plasmodium falciparum, als auch des Hauptvektors, Anopheles gambiae. In den Genomen beider Spezies wurden eine Reihe neuer konkreter targets identifiziert. Auch bereits beschriebene targets und Ansätze wurden in die Strategie einbezogen bzw. weiter ausgestaltet. Bezüglich der Vektormoskitos wird die Verbreitung eines gegenüber Plasmodien resistenten Genotyps angestrebt. Es werden einerseits effiziente natürliche und künstliche Resistenzgene diskutiert und andererseits eine bekannte Strategie zur Fixierung natürlicher Resistenzallele in natürlichen Populationen verbessert. Auf der Seite der Plasmodien erweiterten wir einen bereits von A. Burt (2003) beschriebenen Eradikationsansatz um weitere targets. Aus ethischen und evolutionsbiologischen Erwägungen bevorzugen wir jedoch eine alternative Strategie, welche die Etablierung von in ihrer Virulenz gemilderten Parasiten zum Ziel hat. Der attenuierte Genotyp wird unter anderem durch komplexe Pathway-Remodellierungen beschrieben (Löwe, Sauerborn, Schirmer, Dandekar, A refined genome engineering strategy against parasites and vectors, Manuskript beim Journal „Genome Biology“ eingereicht). Da sich Mutanten in der Natur gegen Wildtyp-Organismen kaum durchsetzen können, werden zwei drive-Systeme beschrieben, welche für die Implementierung der genetischen Manipulationsstrategie entwickelt wurden. Beide Konstrukte wurden zur Patentierung angemeldet (Patentanmeldung U30010 DPMA bzw. Aktenzeichen 102006029354.1). Zusätzlich zur deutschen wurde für eines der beiden Konstrukte eine PCT-Anmeldung eingereicht, welche in Zukunft einen internationalen Patentschutz ermöglichen soll. Es werden Kalkulationen vorgelegt, welche die Verbreitungstendenzen der Konstrukte in natürlichen Populationen vorhersagen. Die Beschreibung der entwickelten Konstrukte beschränkt sich nicht auf das primäre Anwendungsgebiet der Arbeit (Malaria), sondern beinhaltet auch andere Anwendungsgebiete, vor allem im Bereich der Medizin und Molekularbiologie. N2 - Background: Gene drive strategies are an important alternative to control tropical diseases such as malaria. Results: Here we introduce a new gene drive strategy based on gene conversion constructs. We identify a gene drive strategy both for plasmodia and for anopheles including design of an inducible modification vector. Our constructs are based on group II introns or homing endonuclease genes. They include besides the intron to modify vector or parasite genome sites inducible promoters for gene activation. We thus separate gene modification from activation of the modified gene. Moreover, we provide a detailed list of suitable targets in vector and plasmodia for the modification strategy. Finally, we discuss the control effect of an eradication strategy versus a mild strategy of the gene construct for vector and parasite populations. Conclusions: A new eukaryotic vector and parasite control strategy using gene drive systems is presented and discussed. KW - Malaria tropica KW - Malaria KW - Gentechnologie KW - Malariamücke KW - Anopheles gambiae KW - Plasmodium KW - Plasmodium falciparum KW - Containment KW - malaria KW - disease control KW - population engineering KW - siRNA KW - evolution Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-28750 ER - TY - THES A1 - Reuter, Thorsten T1 - Untersuchung der Anwendbarkeit von siRNA als antivirales Agens zur Inhibition der Replikation von Masernviren T1 - Usage of diRNA as an antiviral agent to inhibit Measles Virus replication N2 - Im Gegensatz zu genetisch modifizierten Viren ermöglicht der Einsatz von siRNA zur RNA Interferenz (RNAi) die post-transkriptionelle Inhibition der Gen-Expression zur Analyse von Infektionen mit völlig identischen Viren. Mittels RNase-III hergestellter siRNA wurde die Expression der sechs Masernvirus Gene unterbunden. Ist die siRNA gegen das Nukleokapsid (N)-, das Phospho (P)- oder gegen das Large (L)- Protein gerichtet, kommt es zur effektiven Einschränkung der Replikation und der generellen Gen-Expression. Diese drei Proteine sind für Transkription und Replikation essentiell, da die Genprodukte dieser drei Proteine die RNA-abhängige RNA Polymerase und den Ribonukleoproteinkomplex (RNP) bilden. SiRNA gegen das Fusionsprotein (F) und das Hämagglutinin (H) schränken das Ausmaß der Zell-Zell Fusion ein. Interessanterweise führt die Inhibition der Expression des Matrix-Proteins (M) nicht nur zu einer Verstärkung der fusogenen Aktivität, sondern erhöht gleichzeitig die Expression der übrigen viralen mRNA und genomischer RNA um den Faktor 2-2,5, so dass das Verhältnis mRNA:Genom konstant bleibt. Dieser Befund lässt darauf schließen, dass M als negativer Regulator der viralen Polymeraseaktivität wirkt, und sowohl die Produktion von mRNA wie auch die Genom- Replikation in gleichem Maß beeinflusst. Anschließend wurden synthetische siRNAs gegen die L-mRNA gesucht. Effektive Sequenzen wurden dann, in Form einer shRNA Expressionskassette, in einen lentiviralen Vektor einkloniert. Damit sollen dann lentivirale Partikel hergestellt werden, mit denen Zellen infiziert werden können, so dass diese Zellen dann stabil siRNA exprimieren. Dieser Teil der Arbeit war zum Zeitpunkt der Niederschrift noch nicht beendet. N2 - In contrast to studies with genetically modified viruses, RNA interference (RNAi) allows the analysis of virus-infections with identical viruses and posttranscriptional ablation of individual gene functions. Using RNaseIII-generated multiple short interfering RNA (siRNA) against the six measles virus (MV) genes, we found efficient downregulation of viral gene expression in general with siRNAs against the nucleocapsid (N)-, phosphoprotein (P)-, and polymerase (L)-mRNAs, the translation products of which are forming the ribonucleoprotein (RNP) complex. Silencing of the RNP-mRNAs was highly efficient in reducing viral messenger and genomic RNAs. SiRNAs against the mRNAs for the haemagglutinin (H)- and 72 fusion (F) proteins reduced the extent of cell-cell fusion. Interestingly, siRNA-mediated knockdown of the matrix (M) protein not only enhanced cell-cell fusion, but also increased the levels of both, mRNAs and genomic RNA by a factor of 2 to 2.5, so that the genome to mRNA-ratio was constant. These findings indicate that M acts as a negative regulator of the viral polymerase activity, affecting mRNA transcription and genome replication to the same extent. In addition, two synthetic siRNA targetting the L-mRNA, were identified. These two sequences were cloned into a shRNA expressing lentiviral vector, which can then be used to produce pseudotyped lentiviral particels. Cells infected with these viral particles will express the siRNA continousely. This work was not finished when this thesis was written. KW - Masernvirus KW - RNS-Interferenz KW - Viruzid KW - siRNA KW - Masern KW - Matrix Protein KW - siRNA KW - Measles Virus KW - Matrix Protein Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18766 ER -