TY  - THES
A1  - Trinks, Nora Isabel
T1  - Super-resolution fluorescence microscopic visualization and analysis of interactions between human immune cells and \(Aspergillus\) \(fumigatus\)
T1  - Hochaufgelöste, fluoreszenzmikroskopische Visualisierung und Analyse der Interaktionen zwischen humanen Immunzellen und \(Aspergillus\) \(fumigatus\)
N2  - The mold Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) is known as human pathogen and can cause life-threatening infections in humans with a weakened immune system. This is a known complication in patients receiving glucocorticoids, e.g. after hematopoietic stem cell transplantation or solid organ transplantation. Although research in the field of immune cell/fungus interaction has discovered key strategies how immune cells fight against infectious fungi, our knowledge is still incomplete. In order to develop effective treatment options against fungal infections, a detailed understanding of their interactions is crucial. Thus, visualization of immune cell and fungus is an excellent approach to gain further knowledge. For a detailed view of such interaction processes, a high optical resolution on nanometer scale is required. There is a variety of super resolution microscopy techniques, enabling fluorescence imaging beyond the diffraction limit. This work combines the use of three complementary super resolution microscopy techniques, in order to study immune cell/fungus interaction from different points of view.
Aim of this work is the introduction of the recently invented imaging technique named expansion microscopy (ExM) for the study of immune cell/fungus interactions. The core aspect of this method is the physical magnification of the specimen, which increases the distance between protein structures that are close to each other and which can therefore be imaged separately.
The simultaneous magnification of primary human natural killer (NK) cells and A. fumigatus hyphae was established in this work using ExM. Reorganization of cytoskeletal components of interacting NK cells was demonstrated here, by expansion of the immunological synapse (IS), formed between NK cells and A. fumigatus. In addition, reorganization of the microtubule-organizing center (MTOC) towards fungal hyphae and an accumulation of actin at the IS has been observed. Furthermore, ExM has been used to visualize lytic granules of NK cells after degranulation. After magnification of the specimen, lysosome associated protein 1 (LAMP1) was shown to surround perforin. In absence of the plasma membrane-exposed degranulation marker LAMP1, a “ring-shaped” structure was often observed for fluorescently labeled perforin. Volume calculation of lytic granules demonstrated the benefit of ExM. Compared to pre-expansion images, analyses of post-expansion images showed two volume distributions for degranulated and non-degranulated NK cells. In addition, this work emphasizes the importance of determining the expansion factor for a structure in each species, as variations of expansion factors have been observed. This factor, as well as possible sample distortions should be considered, when ExM is used in order to analyze the interaction between two species.
A second focus of this work is the visualization of a chimeric antigen receptor (CAR), targeting an epitope on the cell wall of A. fumigatus. Structured illumination microscopy (SIM) revealed that the CAR is part of the immunological synapse of primary human CAR T cells and CAR-NK-92 cells. At the interaction site, an accumulation of the CAR was observed, as well as the presence of perforin. CAR accumulation at fungal hyphae was further demonstrated by automated live cell imaging of interacting CAR-NK-92 cells, expressing a fluorescent fusion protein.
Additionally, the use of direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) gave first insights in CAR expression levels on the basal membrane of CAR-NK-92 cells, with single molecule sensitivity. CAR cluster analyses displayed a heterogeneous CAR density on the basal membrane of transfected NK 92 cells.
In summary, this work provides insights into the application of ExM for studying the interaction of primary human NK cells and A. fumigatus for the first time. Furthermore, this thesis presents first insights regarding the characterization of an A. fumigatus-targeting CAR, by applying super-resolution fluorescence microscopy, like SIM and dSTORM.
N2  - Der Schimmelpilz Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) ist bekannt als Humanpathogen und kann lebensbedrohliche Infektionen bei Menschen mit einem geschwächten Immunsystem verursachen. Dies ist eine bekannte Komplikation bei Patienten die Glucocorticoide erhalten, z.B. nach einer hämatopoetischen Stammzelltransplantation oder soliden Organtransplantation. Obwohl die Forschung im Bereich der Immunzelle/Pilz Interaktion Schlüsselstrategien entdeckt hat, wie Immunzellen infektiöse Pilze bekämpfen, ist unser Wissen immer noch unvollständig. Um effektive Therapieoptionen gegen Pilzinfektionen zu entwickeln, ist ein detailliertes Verständnis ihrer Interaktionen äußerst wichtig. Die Visualisierung von Immunzelle und Pilz ist daher ein exzellenter Ansatz um weitere Erkenntnisse zu gewinnen. Für einen detaillierten Einblick in solche Interaktionsprozesse ist eine hohe optische Auflösung im Nanometerbereich erforderlich. Hierzu gibt es eine Vielzahl an hochauflösenden Mikroskopietechniken, die es ermöglichen, Fluoreszenzbildgebung jenseits der Beugungsbegrenzung zu erzielen. Diese Arbeit kombiniert die Nutzung von drei sich ergänzenden hochauflösenden Mikroskopietechniken, um die Interaktion von Immunzelle/Pilz aus verschiedenen Blickwinkeln zu studieren.
Ziel dieser Arbeit ist das Einführen der kürzlich entwickelten Bildgebungsmethode, namens Expansions-Mikroskopie (engl. expansion microscopy, kurz: ExM), um Immunzelle/Pilz Interaktionen zu studieren. Kernaspekt dieser Methode ist die physische Vergrößerung der Probe, wodurch der Abstand zwischen nahe beieinanderliegenden Proteinstrukturen vergrößert wird und diese daher separiert aufgenommen werden können.
Die simultane Vergrößerung von primären humanen Natürlichen Killerzellen (engl. Natural Killer, kurz: NK) und A. fumigatus Hyphen wurde in dieser Arbeit mittels ExM etabliert. Durch Expansion der Immunologischen Synapse (engl. immunological synapse, kurz: IS), ausgebildet zwischen NK Zellen und A. fumigatus, konnte hier die Reorganisation von Bestandteilen des Zytoskeletts interagierender NK Zellen gezeigt werden. Darüber hinaus konnte eine Reorganisation des Mikrotubuli-organisierenden Zentrums (engl. microtubule-organizing center, kurz: MTOC) in Richtung Pilzhyphen, sowie eine Anreicherung von Aktin an der IS beobachtet werden. Außerdem konnte ExM genutzt werden, um lytische Granula von NK Zellen nach Degranulation zu visualisieren. Für das Lysosom-assoziierte Membranprotein 1 (engl. lysosome-associated protein 1, kurz: LAMP1) konnte nach Vergrößerung der Probe gezeigt werden, dass es Perforin umgibt. Unter Abwesenheit des Plasmamembran-exponierten Degranulations-Markers LAMP1 wurde oft eine „ringförmige“ Struktur für fluoreszenzmarkiertes Perforin beobachtet. Die Volumen Berechnung von lytischen Granula demonstrierte den Nutzen der ExM. Im Vergleich zu Analysen von Bildern vor Expansion, zeigten Analysen von Bildern nach Expansion zwei Verteilungen für die Volumengröße degranulierter und nicht-degranulierter NK Zellen. Zusätzlich unterstreicht diese Arbeit die Wichtigkeit, den Expansionsfaktor für eine Struktur aus jeder Spezies zu bestimmen, da Variationen für Expansionsfaktoren beobachtet wurden. Dieser Faktor sollte ebenso wie mögliche Proben-Deformationen in Betracht gezogen werden, wenn ExM genutzt wird, um die Interaktion zwischen zwei Spezies zu analysieren.
Ein zweiter Fokus dieser Arbeit ist die Visualisierung eines chimärischen Antigenrezeptors (engl. chimeric antigen receptor, kurz: CAR), der ein Epitop auf der Zellwand von A. fumigatus erkennt. Strukturierte Beleuchtungs-Mikroskopie (engl. structured illumination microscopy, kurz: SIM) zeigte, dass der CAR Teil der Immunologischen Synapse von primären CAR-T Zellen und CAR-NK-92 Zellen ist. Eine Anreicherung des CARs, an der Interaktionsseite wurde beobachtet, so wie das Vorhandensein von Perforin. Die Anreicherung vom CAR an der Pilz-Hyphe wurde ferner durch automatisierte Lebend-Zell-Bildgebung interagierender CAR-NK-92 Zellen demonstriert, die ein fluoreszierendes Fusionsprotein exprimieren.
Zusätzlich lieferte das Nutzen von direkter stochastischer optischer Rekonstruktions-Mikroskopie (engl. direct stochastic optical reconstruction microscopy, kurz: dSTORM) erste Einblicke in CAR Expressionslevel auf der basalen Membran von CAR-NK-92 Zellen, mit Einzelmolekül Empfindlichkeit. CAR Cluster Analysen zeigten eine heterogene CAR Dichte auf der basalen Membran transfizierter NK-92 Zellen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Arbeit erstmals Einblicke in die Anwendung von ExM für die Untersuchung der Interaktion von primären humanen NK Zellen und A. fumigatus liefert. Zudem präsentiert die Thesis erste Einblicke hinsichtlich der Charakterisierung eines A. fumigatus-erkennenden CARs, unter Anwendung von hochauflösender Fluoreszenzmikroskopie, wie SIM oder dSTORM.
KW  - Mikroskopie
KW  - Konfokale Mikroskopie
KW  - Fluoreszenzmikroskopie
KW  - Aspergillus fumigatus
KW  - Natürliche Killerzelle
KW  - Expansion Microscopy
KW  - Structured Illumination Microscopy
Y1  - 2024
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-266407
ER  - 
TY  - THES
A1  - Niehörster, Thomas
T1  - Spektral aufgelöste Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie mit vielen Farben
T1  - Spectrally resolved fluorescence lifetime imaging microscopy with many colours
N2  - Die Fluoreszenzmikroskopie ist eine vielseitig einsetzbare Untersuchungsmethode für biologische Proben, bei der Biomoleküle selektiv mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert werden, um sie dann mit sehr gutem Kontrast abzubilden. Dies ist auch mit mehreren verschiedenartigen Zielmolekülen gleichzeitig möglich, wobei üblicherweise verschiedene Farbstoffe eingesetzt werden, die über ihre Spektren unterschieden werden können.

Um die Anzahl gleichzeitig verwendbarer Färbungen zu maximieren, wird in dieser Arbeit zusätzlich zur spektralen Information auch das zeitliche Abklingverhalten der Fluoreszenzfarbstoffe mittels spektral aufgelöster Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie (spectrally resolved fluorescence lifetime imaging microscopy, sFLIM) vermessen. Dazu wird die Probe in einem Konfokalmikroskop von drei abwechselnd gepulsten Lasern mit Wellenlängen von 485 nm, 532nm und 640nm angeregt. Die Detektion des Fluoreszenzlichtes erfolgt mit einer hohen spektralen Auflösung von 32 Kanälen und gleichzeitig mit sehr hoher zeitlicher Auflösung von einigen Picosekunden. Damit wird zu jedem detektierten Fluoreszenzphoton der Anregungslaser, der spektrale Kanal und die Ankunftszeit registriert. Diese detaillierte multidimensionale Information wird von einem Pattern-Matching-Algorithmus ausgewertet, der das Fluoreszenzsignal mit zuvor erstellten Referenzpattern der einzelnen Farbstoffe vergleicht. Der Algorithmus bestimmt so für jedes Pixel die Beiträge der einzelnen Farbstoffe.

Mit dieser Technik konnten pro Anregungslaser fünf verschiedene Färbungen gleichzeitig dargestellt werden, also theoretisch insgesamt 15 Färbungen. In der Praxis konnten mit allen drei Lasern zusammen insgesamt neun Färbungen abgebildet werden, wobei die Anzahl der Farben vor allem durch die anspruchsvolle Probenvorbereitung limitiert war. In anderen Versuchen konnte die sehr hohe Sensitivität des sFLIM-Systems genutzt werden, um verschiedene Zielmoleküle voneinander zu unterscheiden, obwohl sie alle mit demselben Farbstoff markiert waren. Dies war möglich, weil sich die Fluoreszenzeigenschaften eines Farbstoffmoleküls geringfügig in Abhängigkeit von seiner Umgebung ändern. Weiterhin konnte die sFLIM-Technik mit der hochauflösenden STED-Mikroskopie (STED: stimulated emission depletion) kombiniert werden, um so hochaufgelöste zweifarbige Bilder zu erzeugen, wobei nur ein einziger gemeinsamer STED-Laser benötigt wurde.

Die gleichzeitige Erfassung von mehreren photophysikalischen Messgrößen sowie deren Auswertung durch den Pattern-Matching-Algorithmus ermöglichten somit die Entwicklung von neuen Methoden der Fluoreszenzmikroskopie für Mehrfachfärbungen.
N2  - Fluorescence microscopy is an important and near-universal technique to examine biological samples. Typically, biomolecules are selectively labelled with fluorophores and then imaged with high contrast. This can be done for several target molecules simultaneously, using different fluorophores that are usually distinguished by their spectra.

This thesis describes a method to maximize the number of simultaneous stainings. Not only the spectral information but also the temporal information of the fluorescence decay is exploited by means of spectrally resolved fluorescence lifetime imaging microscopy (sFLIM). Using a confocal laser scanning microscope, the sample is excited by three alternatingly pulsed lasers at 485 nm, 532 nm, and 640 nm. Fluorescence light is detected on 32 spectrally separated detection channels with high time resolution of a few picoseconds. Thus, in this setup, we record the excitation laser, the spectral channel, and the time of arrival for each fluorescence photon. This detailed multi-dimensional information is then processed by a pattern-matching algorithm that compares the fluorescence signal with reference patterns of the used fluorophores to determine the contribution of each fluorophore in each pixel.

Using this technique we imaged five different stainings per excitation laser, implying that 15 simultaneous stainings should theoretically be achievable. Current constraints in the sample preparation procedure limited the number of simultaneous stainings to nine. In additional experiments, we exploited the sensitivity of the sFLIM system to image several different target molecules simultaneously with the same fluorophore, taking advantage of slight changes in the fluorescence behaviour of the fluorophore due to environmental changes. We also combined sFLIM with stimulated emission depletion (STED) to perform super-resolution multi-target imaging with two stainings that operated with one common STED laser.

Thus, the simultaneous exploitation of several photophysical parameters, in combination with algorythmic evaluation, allowed us to devise novel modes of multi-target imaging in fluorescence microscopy.
KW  - Fluoreszenzmikroskopie
KW  - Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie
KW  - Konfokale Mikroskopie
KW  - STED-Mikroskopie
KW  - Fluoreszenz
KW  - Mustervergleich
KW  - Pattern Matching
KW  - sFLIM
KW  - TCSPC
KW  - Mikroskopie
KW  - Microscopy
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-296573
ER  - 
TY  - THES
A1  - Egenolf, Nadine
T1  - Multidimensionale morphologische und elektrophysiologische Analyse von Patienten mit Small Fiber Neuropathie
T1  - Multidimensional morphological and electrophysiological analysis of patients with small fiber neuropathy
N2  - Die Small Fiber Neuropathie (SFN) bildet eine Untergruppe der sensiblen Neuropathien, bei der die Aδ- und C-Fasern betroffen sind. Die Patienten berichten v.a. von brennenden Schmerzen und Dysästhesien, seltener auch von autonomen Funktionsstörungen. Bei fehlendem Goldstandard und normalen Nervenleitungsstudien ist die Diagnostik erschwert, da selbst nach Spezialuntersuchungen wie Hautstanzbiopsie und quantitativer sensorischer Testung (QST) viele Patienten trotz typischer Anamnese der Diagnosestellung entgehen. Wir rekrutierten 55 Patienten und 31 gesunde Kontrollen. Nach neurologischer Untersuchung und Ausschluss einer Polyneuropathie mittels Elektroneurographie wurden bei allen Studienteilnehmern Hautstanzbiopsien am Ober- und Unterschenkel zur Ermittlung der intraepidermalen Nervenfaserdichte (IENFD) entnommen sowie eine QST zur Funktionsprüfung der kleinen Nervenfasern durchgeführt. Die Studienteilnehmer wurden zudem mit cornealer confocaler Mikroskopie (CCM) und der Ableitung Schmerz-assoziierter evozierter Potentiale (PREP) untersucht. Zur autonomen Testung erfolgte die Messung der Schweißproduktion mittels quantitativem sudomotorischem Axonreflextest (QSART). Die neurologische Untersuchung zeigte in 55% der Patienten Hinweise auf eine Kleinfaserpathologie. Die distale IENFD war bei 62% der Patienten reduziert, die QST bei 22% der Patienten auffällig. Die PREP Latenzen waren in der Patientengruppe länger als bei den Kontrollen, die Amplituden niedriger. Bei der cornealen Innervation zeigte sich eine Reduktion der Nervenfaserdichte, Nervenfaserlänge und Nervenastdichte. Die in QSART gemessenen Parameter zeigten sich zu 86% unauffällig. Während nach klinischer Untersuchung, Hautbiopsie und QST in 53% der Fälle in 2 von 3 Untersuchungen eine Pathologie der kleinen Fasern festgestellt werden konnte, stieg die Rate bei zusätzlicher Anwendung von PREP und CCM auf 80% (ohne Berücksichtigung von QST). Zusammenfassend sollten die klinische Untersuchung und die Hautstanzbiopsie bei allen Patienten mit Verdacht auf SFN erfolgen. PREP und CCM sind unter den verfügbaren zusätzlichen Untersuchungen diagnostisch am wertvollsten. Wichtig ist allerdings, dass bei fehlendem Goldstandard eine SFN auch bei unauffälligen Tests nicht ausgeschlossen werden kann. Zusätzlich können die Mikroneurographie und die genetische Analyse wertvolle Hinweise auf eine Kleinfaserfunktionsstörung und deren Pathophysiologie geben.
N2  - Small fiber neuropathy (SFN) forms a subgroup of sensory neuropathies, in which the Aδ- and C-fibers are impaired. Patients mainly report burning pain and dysesthesia, less frequently also autonomic dysfunctions. In absence of a diagnostic gold standard and under normal nerve conduction studies, the diagnosis is difficult. Even after special examinations such as skin punch biopsy and quantitative sensory testing (QST), many patients are not diagnosed despite a typical pain history. We prospectively recruited 55 patients and 31 healthy controls in our study. After neurological examination and exclusion of a polyneuropathy by means of neurological examination and electroneurography, skin punch biopsies were taken from the upper and lower leg of all study participants to determine the intraepidermal nerve fiber density (IENFD). QST was performed to investigate the function of the small nerve fibers. Study participants were also examined with corneal confocal microscopy (CCM) and derivation of pain-related evoked potentials (PREP). For autonomous testing, the sweat production was measured using quantitative sudomotor axon reflex testing (QSART). Neurological examination showed hints for small fiber pathology in 55% of patients. The distal IENFD was reduced in 62% of patients, while QST was abnormal in 22% of patients. The PREP latencies were longer in the patient group than in the controls, the amplitudes were smaller. Corneal innervation showed a reduction of nerve fiber density, nerve fiber length, and nerve branch density in patients compared to controls. The parameters measured in QSART were 86% unremarkable. While after clinical examination, skin biopsy, and QST a pathology of the small fibers could be detected in 53% of the cases in 2 of 3 examinations, the rate increased to 80% with additional application of PREP and CCM (without consideration of QST). In summary, neurological examination should be performed together with skin biopsy in all patients with suspected SFN. PREP and CCM are diagnostically most valuable among the available additional examinations. However, it is important to note that in the absence of a gold standard, SFN cannot be excluded even with normal test results. In addition, microneurography and genetic analysis can provide valuable information about a small fiber dysfunction and its pathophysiology.
KW  - Neuropathischer Schmerz
KW  - Nervenfaser
KW  - Evoziertes Potenzial
KW  - Konfokale Mikroskopie
KW  - Sensorik <Neurophysiologie>
KW  - Small Fiber Neuropathie
KW  - Hautstanzbiopsie
KW  - Quantitative sensorische Testung
KW  - Mikroneurographie
KW  - Schmerz-assoziierte evozierte Potenziale
KW  - Genetik
KW  - Quantitativer sudomotorischer Axonreflextest
KW  - Corneale confocale Mikroskopie
KW  - Intraepidermale Nervenfaserdichte
KW  - small fiber neuropathy
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-202938
ER  - 
TY  - THES
A1  - Götz, Sebastian Reinhold
T1  - Nonlinear spectroscopy at the diffraction limit: probing ultrafast dynamics with shaped few-cycle laser pulses
T1  - Nichtlineare Spektroskopie am Beugungslimit: Untersuchung ultraschneller Dynamiken mit geformten Laserpulsen
N2  - An experimental setup for probing ultrafast dynamics at the diffraction limit was developed, characterized and demonstrated in the scope of the thesis, aiming for optical investigations while simultaneously approaching the physical limits on the length and timescale.
An overview of this experimental setup was given in Chapter 2, as well as the considerations that led to the selection of the individual components. Broadband laser pulses with a length of 9.3 fs, close to the transform limit of 7.6 fs, were focused in a NA = 1.4 immersion oil objective, to the diffraction limit of below 300 nm (FWHM). 
The spatial focus shape was characterized with off-resonance gold nanorod scatterers scanned through the focal volume. For further insights into the functionality and limitations of the pulse shaper, its calibration procedure was reviewed. The deviations between designed and experimental pulse shapes were attributed to pulse-shaper artifacts, including voltage-dependent inter-layer as well as intra-layer LCD-pixel crosstalk, Fabry-Pérot-type reflections in the LCD layers, and space-time coupling. A pixel-dependent correction was experimentally carried out, which can be seen as an extension of the initial calibration to all possible voltage combinations of the two LCD layers.
The capabilities of the experimental setup were demonstrated in two types of experiments, targeting the nonlinearity of gold (Chapter 3) as well as two-dimensional spectroscopy at micro-structured surfaces (Chapter 4).
Investigating thin films, an upper bound for the absolute value for the imaginary part of the nonlinear refractive index of gold could be set to |n′′ 2 (Au)| < 0.6·10−16 m2/W, together with |n′ 2 (Au)| < 1.2·10−16 m2/W as an upper bound for the absolute value of the real part. Finite-difference time-domain simulations on y-shaped gold nanostructures indicated that a phase change of ∆Φ ≥ 0.07 rad between two plasmonic modes would induce a sufficient change in the spatial contrast of emission to the far-field to be visible in the experiment. As the latter could not be observed, this value of ∆Φ was determined as the upper bound for the experimentally induced phase change. An upper bound of 52 GW/cm2 was found for the damage threshold.
In Chapter 4, a novel method for nonlinear spectroscopy on surfaces was presented. Termed coherent two-dimensional fluorescence micro-spectroscopy, it is capable of exploring ultrafast dynamics in nanostructures and molecular systems at the diffraction limit. Two-dimensional spectra of spatially isolated hotspots in structured thin films of fluorinated zinc phthalocyanine (F16ZnPc) dye were taken with a 27-step phase-cycling scheme. Observed artifacts in the 2D maps were identified as a consequence from deviations between the desired and the experimental pulse shapes. The optimization procedures described in Chapter 2 successfully suppressed the deviations to a level where the separation from the nonlinear sample response was feasible.
The experimental setup and methods developed and presented in the scope of this thesis demonstrate its flexibility and capability to study microscopic systems on surfaces. The systems exemplarily shown are consisting of metal-organic dyes and metallic nanostructures, represent samples currently under research in the growing fields of organic semiconductors and plasmonics.
N2  - Ein experimenteller Aufbau zur Untersuchung von ultraschnellen Dynamiken am Beugungslimit wurde in dieser Arbeit entwickelt, charakterisiert und demonstriert. Sie hatte zum Ziel, im Rahmen von optischen Beobachtungen gleichzeitig an die physikalischen Grenzen von Längen- und Zeitskalen zu gehen
Es wurde ein Überblick über den verwendeten experimentellen Aufbau gegeben, zusammen mit den Überlegungen, die zur Auswahl der einzelnen Komponenten geführt haben. Für die Pulslänge der spektral breitbandigen Laserpulse wurde auf 9.3 fs gemessen, was nahe an der transformlimitierten Dauer von 7.6 fs liegt. Im beugungslimitierten Fokus eines Immersionsölobjektivs mit einer numerischen Apertur von 1.4 konnte das Licht räumlich auf eine Halbwertsbreite von unter 300 nm komprimiert werden.
Der Fokus des Mikroskopobjektivs wurde mit Hilfe der Streuung von nicht resonanten Nanopartikeln aus Gold ausgemessen, indem diese räumlich durch den Fokus gerastert wurden. Zur weiteren Untersuchung des Funktionsumfangs und der Grenzen des benutzten Pulsformers wurde dessen Eichprozedur geprüft. Die Abweichungen zwischen gewünschten und tatsächlich angelegten Pulsformen wurden auf Artefakte des Pulsformers zurückgeführt. Diese Artefakte beinhalten eine spannungsabhängige Beeinflussung der LCD-Pixel sowohl zwischen benachbarten Pixeln einer Schicht als auch zwischen Pixeln unterschiedlicher Schichten. Eine pixelabhängige Korrektur wurde implementiert, die eine Erweiterung der ursprünglichen Kalibrierung auf alle möglichen Spannungskombinationen der LCD-Pixel darstellt.
Die Möglichkeiten experimentellen Aufbaus wurden mit zwei Arten von Experimenten demonstriert: Messungen zur Bestimmung des nichtlinearen Brechungsindexes von Gold (Kapitel 3) sowie zweidimensionale Spektroskopie an mikrostrukturierten Oberflächen (Kapitel 4).
Für den nichtlinearen Brechungsindexes von Gold konnte an Dünnschichten eine obere Grenze von |n′′ 2 (Au)| < 0.6·10−16 m2/W für den Betrag des Imaginärteils und |n′ 2 (Au)| < 1.2·10−16 m2/W für den Betrag des Realteils festgesetzt werden. Simulationen mit der Finite-Differenzen-Methode an Y-förmige Nanostrukturen aus Gold zeigten, dass eine Phasenänderung von ∆Φ ≥ 0.07 rad zwischen zwei plasmonischen Moden ausreichend für eine experimentell sichtbare Kontraständerung der Fernfeldabstrahlung wäre. Da letztere nicht beobachtet werden konnte, wurde dieser Wert für ∆Φ als obere Grenze für die experimentell eingeführte Phasenänderung festgesetzt. Für die Zerstörschwelle wurde eine obere Grenze von 52 GW/cm2 gefunden.
In Kapitel 4, wurde eine neue Methode für nichtlineare Spektroskopie an Oberflächen vorgestellt. Sie trägt den Namen ”Kohärente zweidimensionale Fluoreszenz-Mikrospektroskopie“ und eignet sich zur Untersuchung ultraschneller Dynamiken in Nanostrukturen und molekularen Systemen am Beugungslimit.
Es wurden 2D-Spektren von räumlich isolierten Hotspots einer strukturierten Zink-Phthalocyanin (F16ZnPc) Dünnschicht mit 27-fachem Phasecycling aufgenommen. Als Grund für Artefakte in den 2D-Karten wurden Abweichungen zwischen den gewünschten und experimentellen Pulsformen identifiziert. Durch die in Kapitel 2 vorgestellten Optimierungen konnten die Abweichungen allerdings so stark reduziert werden, dass deren Trennung von der nichtlinearen Antwort der Probe möglich wurde.
Die Flexibilität und der Funktionsumfang zur Analyse mikroskopischer Systeme der im Rahmen dieser Arbeit entwickelten experimentellen Aufbauten und Methoden wurde demonstriert. Repräsentativ für die wachsenden Forschungsfelder der organischen Halbleiter und der Plasmonik wurden exemplarisch Systeme bestehend aus metall-organischen Farbstoffen und metallischen Nanostrukturen untersucht.
KW  - Ultrakurzzeitspektroskopie
KW  - Fluoreszenzspektroskopie
KW  - Fourier-Spektroskopie
KW  - Nanostruktur
KW  - Konfokale Mikroskopie
KW  - Coherent Multidimensional Spectroscopy
KW  - Laser Pulse Shaping
KW  - LCD Pulse Shaper
KW  - Surface Plasmon
KW  - Kohärente Multidimensionale Spektroskopie
KW  - Laserpulsformung
KW  - LCD Pulsformer
KW  - Oberflächenplasmon
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192138
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TY  - THES
A1  - Stender, Benedikt
T1  - Einzelphotonenemitter und ihre Wechselwirkung mit Ladungsträgern in organischen Leuchtdioden
T1  - Single Photon Emitters and their Interaction with Charge Carriers inside Organic Light Emitting Eiodes
N2  - In dieser Arbeit wird die Photophysik von Einzelphotonenemittern unterschiedlicher Materialklassen, wie Fehlstellen in Diamant und Siliziumcarbid sowie organischer Moleküle bei Raumtemperatur untersucht. Zu diesem Zweck wurde ein hochauflösendes konfokales Mikroskop konzipiert und konstruiert, welches die optische Detektion einzelner Quantensysteme ermöglicht. Zusätzlich werden verschiedene Methoden wie die Rotationsbeschichtung, das Inkjet-Printing und das Inkjet-Etching in Bezug auf die Reproduzierbarkeit und Strukturierbarkeit von organischen Leuchtdioden (OLEDs) verglichen. Im weiteren Verlauf werden die optoelektronischen Prozesse in dotierten OLEDs untersucht, ausgehend von hohen Dotierkonzentrationen bis hin zur Dotierung mit einzelnen Molekülen. Dadurch kann die Exzitonen-Ladungsträger Wechselwirkung auf und in der Umgebung von räumlich isolierten Molekülen analysiert werden.
N2  - In this work the room-temperature photophysics of single-photon sources of different material systems such as NV-centers, vacancies in silicon carbide and organic molecules are investigated. A high resolution home-built confocal microscope is used to detect and analyse the isolated single quantum emitters. Additionally, different methods and techniques for production of organic light emitting diodes (OLEDs) such as spin-coating, inkjet-printing and inkjet-etching are compared concerning their reproducibility and feasibility for structured OLED preparation. Subsequently, the opto-electronic processes in dye-doped polymeric OLEDs are examined for various doping concentrations ranging from high concentrations down to the doping by single molecules. This provides access to the investigation of the exciton-charge carrier interaction of single organic molecules in organic matrices.
KW  - Einzelphotonenquelle
KW  - Konfokale Mikroskopie
KW  - OLED
KW  - Single Photon Sources
KW  - confocal microscopy
KW  - Einzelphotonenemission
KW  - Konfokale Mikroskopie
KW  - OLED
KW  - Ladungsträger
Y1  - 2017
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-150913
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TY  - THES
A1  - Rewitz, Christian
T1  - Far-Field Characterization and Control of Propagating Ultrashort Optical Near Fields
T1  - Fernfeld-Charakterisierung und Steuerung von propagierenden ultrakurzen optischen Nahfeldern
N2  - In this work, femtosecond laser pulses are used to launch optical excitations on different nanostructures. The excitations are confined below the diffraction limit and propagate along the nanostructures.
Fundamental properties of these ultrashort optical near fields are determined by characterizing the far-field emission after propagation with a setup developed for this task. Furthermore, control of the nanooptical excitations' spatial and temporal evolution is demonstrated for a designed nanostructure.
N2  - In dieser Arbeit werden Femtosekunden-Laserpulse verwendet, um optische Moden auf verschiedenen Nanostrukturen anzuregen. Die optische Energie ist dabei unterhalb des Beugungslimits lokalisiert und die Anregungen propagieren entlang der Nanostrukturen. 
Grundlegende Eigenschaften dieser ultrakurzen optischen Nahfelder werden durch die Charakterisierung der Fernfeld-Emission nach der Propagation bestimmt. Dabei wird eine Messmethode verwendet die eigens für diese Aufgabe entwickelt wurde. Darüber hinaus wird die Steuerung der räumlichen und zeitlichen Entwicklung der nanooptischen Anregungen auf einer für diesen Zweck entworfenen Nanostruktur demonstriert.
KW  - Nahfeldoptik
KW  - Ultrakurzer Lichtimpuls
KW  - Nanooptics
KW  - Surface plasmons
KW  - Ultrafast spectroscopy
KW  - Interference microscopy
KW  - Scanning microscopy
KW  - Ultrafast information processing
KW  - Plasmonics
KW  - Plasmon propagation
KW  - plasmon group velocity
KW  - plasmonic waveguides
KW  - Oberflächenplasmonresonanz
KW  - Optische Spektroskopie
KW  - Konfokale Mikroskopie
KW  - Spektrale Interferenz
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-94887
ER  - 
TY  - THES
A1  - Nuber, Susanne
T1  - ß-Arrestin/Rezeptor-Interaktionen - Ein endogenes "Werkzeug" ligandenspezifischer Signaltransduktion
T1  - ß-Arrestin/receptor-interactions - An endogenous "tool" of ligand-specific signal transduction
N2  - Die Bedeutung der β-Arrestine als multifunktionelle Adapterproteine GPCR-vermittelter Signaltransduktion hat in den letzten Jahren immer mehr zugenommen. In der vorliegenden Arbeit lag der Schwerpunkt auf der Untersuchung der molekularen Basis und der Ligandenabhängigkeit sowohl der β-Arrestin/Rezeptor-Interaktion als auch β-Arrestin- (un-)abhängiger Signaltransduktionsmechanismen. Im ersten Teil wurde der Einfluß potentieller Phosphorylierungsstellen im C-Terminus des β2AR bzw. im C-Terminus und der TM3 des P2Y1R auf die agonisteninduzierte β-Arrestin/Rezeptor-Interaktion, Internalisierung und Desensibilisierung untersucht. Durch Mutationsanalysen konnten Ser 352/Thr 358 im distalen C-Terminus des P2Y1R als Schlüsselstellen der β-Arrestin-Translokation und Internalisierung identifiziert werden, während ein oder mehrere Phosphorylierungsstellen im proximalen P2Y1R C-Terminus die molekulare Grundlage der Rezeptordesensibilisierung darstellen. Darüber hinaus machte die Anwendung verschiedener PKC- oder CaMK-Inhibitoren sowie der Einsatz des PKC-Aktivators PMA deutlich, dass die P2Y1R-Desensibilisierung und β-Arrestin-Translokation durch unterschiedliche Kinasen kontrolliert werden. Zudem konnte mit Hilfe der FRET-Technik gezeigt werden, dass die Phosphorylierungsstellen zwischen den Positionen 355 und 364 im proximalen β2AR C-Terminus essentielle Bereiche der β-Arrestin-Translokation darstellen. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden Agonisten am β2-adrenergen Rezeptor bzw. dem P2Y2R auf ihre Fähigkeit hin untersucht verschiedene mit dem jeweiligen Rezeptor verknüpfte G-Protein- bzw. β-Arrestin-Funktionen in unterschiedlichem Ausmaß zu aktivieren („biased agonism“). Da eine solche ligandenselektive Aktivierung rezeptorvermittelter Signalwege bis dato nur mit synthetischen Liganden detailliert untersucht wurde, galt das besondere Interesse der Analyse der durch die endogenen Substanzen induzierten Signalmuster. Die Betrachtung der Noradrenalin- bzw. Adrenalin-induzierten β-Arrestin/Rezeptor-Interaktion, β-Arrestin2-Translokation, Rezeptorinternalisierung, G-Protein-Aktivierung sowie cAMP-Produktion am β2AR machte deutlich, dass es sich beim Phänomen des „biased agonism“ um einen endogenen Mechanismus handelt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass auch zur Tokolyse eingesetzte β2AR-Agonisten spezifische Signalmuster induzieren. Die Beobachtung, dass UTP und ATP sowohl unterschiedliche β-Arrestin1/2-Translokationsals auch ERK-Aktivierungsmuster am P2Y2R induzieren bestärkte das Konzept des „biased agonism“ als endogenes Phänomen. Das ligandenabhängige β-Arrestin-Translokationsverhalten des P2Y2R ließ zudem die agonistenbedingte Zuteilung des Rezeptors zu den „Klasse A“ oder „Klasse B“ Rezeptoren zu. Die detaillierte Untersuchung agonisteninduzierter Rezeptor/Effektor-Interaktionen und Signalmuster dürfte helfen die Anwendung klinisch relevanter Substanzen zu optimieren.
N2  - In recent years, the significance of β-arrestins as multifunctional adapter proteins of GPCR mediated signal transduction has steadily been increasing. In this thesis the main focus is to research the molecular basis and the ligand dependence of the β-arrestin recruitment as well as β-arrestin-(in-)dependent signal transduction mechanisms. In the first part, the influence of potential phosphorylation sites in the C-terminus of the β2AR or the C-terminus and the TM3 of the P2Y1R, respectively, on the agonist-induced β-arrestin2/receptor-interaction, receptor internalization and desensitization was examined. Using mutation analysis, Ser 352 and Thr 358 were identified as key points of the β-arrestin2 translocation and receptor internalization in the distal C-terminus of the P2Y1R. In contrast, one or more phosphorylation sites in the proximal P2Y1R C-terminus represent the molecular basis of receptor desensitization. In addition, the use of different PKC- or CaMK inhibitors and the application of the PKC activator PMA made it clear that the P2Y1R desensitization and β-arrestin translocation are controlled by different kinases. Using the FRET technique we were able to show that the phosphorylation sites between position 355 and 364 in the proximal C-terminus of the β2AR represent essential areas of the β-arrestin2 translocation. In the second part of the study at hand, agonists of the β2AR or the P2Y2R were examined with respect to their ability to activate distinct receptor associated G-protein or β-arrestin functions to varying degrees (“biased agonism”). Since this kind of ligandselective activation of receptor-mediated signaling pathways has only been studied in detail with synthetic ligands to this day, special interest in the analysis of the signaling pattern induced by the endogenous substances was taken. The analysis of norepinephrine- or epinephrine-induced β-arrestin/receptor interaction, β-arrestin translocation, receptor internalization, G-protein activation and cAMP production at the β2AR made clear that “biased agonism” is an endogenous phenomenon. Moreover, it has also been shown that β2AR agonists used for tocolysis induced a specific signaling pattern. The observation that UTP and ATP both induce different β-arrestin translocation as well as ERK activation patterns at the P2Y2R confirmed the concept of “biased agonism” as an endogenous phenomenon. The ligand dependent β-arrestin behavior of the P2Y2R also allowed the allocation of the receptor to the “class A” or “class B” receptors depending on the agonist used for stimulation. The detailed testing of agonist induced receptor/effector interactions and signaling pattern could help to optimize the application of clinically relevant substances.
KW  - G-Protein gekoppelte Rezeptoren
KW  - Adaptorproteine
KW  - Beta-Rezeptor
KW  - Noradrenalin
KW  - Adrenalin
KW  - Purinozeptor
KW  - ADP
KW  - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer
KW  - Konfokale Mikroskopie
KW  - biased agonism
KW  - functional selectivity
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-53188
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TY  - THES
A1  - Mischkowsky, Julia
T1  - Analyse von Sickerkissen nach Trabekulektomie mit In-vivo-konfokaler Mikroskopie und mit optischer Kohärenztomographie
T1  - Analysis of filtering blebs after trabeculectomy with in-vivo confocal microscopy and optical coherence tomography
N2  - Die internen Strukturen von Sickerkissen in verschiedenen postoperativen Phasen konnten sowohl mit dem Vorderabschnitts-OCT als auch in-vivo konfokalmikroskopisch am Patienten dargestellt und analysiert werden. Hierbei konnte bei beiden Verfahren festgestellt werden, dass bestimmte Parameter prognostische Relevanz für die Funktion des Sickerkissens haben. Eine gute Sickerkissenfunktion korrelierte in der IVKM frühpostoperativ mit einem geringen Rundzellinfiltrat und einem geringem Gefäßdurchmesser und spät-postoperativ mit einer hohen Zahl epithelialer Zysten. Bei der optischen Kohärenztomographie ließ sich frühpostoperativ ein signifikanter Zusammenhang zwischen der Anwesenheit supraskleraler Flüssigkeitsräume sowie dem Nachweis des „striping“- Phänomens und einer guten Sickerkissen-Funktion nachweisen. Eine Kombination dieser Verfahren mit dem klinischen Befund können in Zukunft dazu beitragen, die unterschiedlichen postoperativen Ergebnisse nach Trabekulektomie auf histopathologischer Ebene besser zu verstehen. Dadurch könnte das chirurgische Vorgehen sowie die adjuvante Medikamentengabe optimiert werden, das postoperative Sickerkissen-Management erleichtert werden und somit gegebenenfalls rechtzeitig interveniert werden. Somit könnte die Erfolgsrate nach filtrierenden Glaukomoperationen zukünftig gesteigert werden.
N2  - The internal structures of filtering blebs in different postoperative phase could be detected and analyzed with the Visante-OCT and in vivo confocal microscopy. Both methods could show that certain parameters have prognostic relevance for the function of the blebs. A good function of the bleb correlated early postoperatively with a small roundcell infiltrate and a small vessel diameter, and late postoperatively with a high number of epithelial cysts in in-vivo microscopy. Optical coherence tomography showed a significant correlation between the presence of suprascleral fluid spaces and evidence of the "striping"-phenomenon and a good bleb function early postoperativly. A combination of these methods to the clinical findings may contribute to better postoperative results. Thus, the surgical procedure and adjuvant medication could be optimized and the postoperative bleb management could become easier. This would increase the success rate of glaucoma filtering operations.
KW  - Glaukom
KW  - Konfokale Mikroskopie
KW  - Wundheilung
KW  - Sickerkissen
KW  - Trabekulektomie
KW  - Optische Kohärenztomographie
KW  - filtering blebs
KW  - trabeculectomy
KW  - optical coherence tomography
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51721
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TY  - THES
A1  - Eulert, Stephan
T1  - Analyse diverser Matrixproteine im Einheilgewebe um medizinische Implantatwerkstoffe mittels Konfokaler Laserscanning Mikroskopie - Eine tierexperimentelle Untersuchung
T1  - Analysis of different matrixproteins in the surrounding tissue of medical implant materials by confocal laserscanning microscopy
N2  - Ziel der vorliegenden tierexperimentellen Studie war es, Unterschiede im Einheilverhalten der Werkstoffe Titan und VA-Stahl (316L) anhand der Matrixproteine Kollagen Typ I (C1), Kollagen Typ III (C3) und Fibronektin im implantatumgebenden Interface zu untersuchen und darzustellen. Hierzu wurden die Einheilkapseln der Implantate nach subkutaner, intramuskulärer und intraossärer Implantation nach den Bewertungskriterien Kapselqualität, Kapseldicke und Verteilungsmuster der Matrixproteine mittels konventioneller Mikroskopie und Konfokaler Laserscanning Mikroskopie (CLSM) analysiert. Nach subkutaner Implantation zeigten beide Werkstoffe in Übereinstimmung mit den Ergebnissen von SHANNON et al. (1997) vermehrt locker angeordnete, teils parallel orientierte Kollagenfasern mit erhöhtem Zellaufkommen an Fibroblasten und Makrophagen. Nach intramuskulärer Implantation jedoch fanden sich vorwiegend parallel angeordnete, teils dicht gepackte Kollagenfasern mit nur mäßig erhöhtem Zellaufkommen. Intramuskulär eingebrachte Implantate heilten in dünneren Kapseln ein, als subkutan eingebrachte Implantate. Es ergab sich keine Korrelation zu den ermittelten Kapselqualitäten. Dies erstaunt umso mehr, da unter der fortwährenden funktionellen Beanspruchung der intramuskulären Implantate im Bereich der Bauchmuskulatur gegenüber der statischeren Platzierung im subkutanen Rückenfett eine erhöhte Zell- und Matrixreaktion erwartet worden war. Im Lokalisationsvergleich zeigte sich intramuskulär für beide Werkstoffe ein erhöhtes Aufkommen an Fibronektin. Dies könnte auf die erhöhte Stoffwechselaktivität und funktionelle Belastung im Muskelgewebe zurückgeführt werden (ROSENGREN et al. 1994). Nach intraossärer Implantation konnten dünnere Kallusformationen für VA-Stahl gegenüber Titan in allen Proteinfluoreszenzen nachgewiesen werden. Die Qualität der Kallusformation und die histologische Kallusstruktur glichen sich mit zunehmender Implantationsdauer der regulären Knochenstruktur an. Die semiquantitativ beurteilte Verteilung der Matrixproteine mittels CLSM zeigte bei deutlichen Standardabweichungen für beide Werkstoffe erhöhte Fluoreszenz-Intensitäten nur in den implantatnahen Kapselanteilen. In den mittleren und den implantatfernen Kapselabschnitten waren für beide Werkstoffe inkonstant höhere Fluoreszenzwerte gegenüber den Vergleichskollektiven messbar. Der intraossäre Materialvergleich ergab implantatnahe und implantatferne Fluoreszenzmaxima für alle Matrixproteine, die mit zunehmender Implantationsdauer abfielen. Reproduzierbare, materialspezifische Unterschiede waren in Analogie zu BERGER-GORBET et al. (1996) nicht zu finden. In den mittleren Kallusabschnitten konnten reproduzierbare Fluoreszenzunterschiede nur bei Detektion von Kollagen Typ I (C1) in allen Zeitintervallen gesehen werden. Im Vergleich zur Literatur konnte die von VIROLAINEN et al. (1997) beschriebene biphasische Proteinanhäufung, wie auch ein wechselndes Proteinaufkommen (LINDHOLM et al. 1996) nach intraossärer Implantation nicht nachvollzogen werden. Ergänzende Beobachtungen der hier vorgestellten Studie verdeutlichen, dass die lokale, intraossäre Anreicherung von Matrixproteinen, unabhängig von Implantatinsertion oder gar Werkstoffeigenschaften, nach jeglicher Traumatisierung von Knochengewebe den knöchernen Reparationsprozess begleitet. Unter dem Aspekt der Restitutio ad Integrum von Knochenwunden können diese Beobachtungen auf das implantatnahe und das implantatferne Restitutionszentrum übertragen werden. Die Aktivität dieser Restitutionszentren hält bis zum Abschluss der knöchernen Remodellierung über 12 Wochen hinaus an. Dies deckt sich mit Aussagen von STEFLIK et al. (1998), wonach der periimplantäre Knochenumbau langfristig dynamisch bestehen bleibt. Um der zunehmenden Verbreitung nicht nur dentaler Implantate gerecht zu werden, muss auch zukünftig ein besseres Verständnis der Komunikationswege zwischen Implantaten und Biosystemen gewonnen werden. Dies bedeutet für die Herstellung und Weiterentwicklung von Implantaten, dass nicht nur die Werkstoff- und Oberflächenauswahl wichtig ist, sondern auch die funktionell erforderliche Oberflächenstrukturierung auf die gewünschte Wechselwirkung mit Bestandteilen der EZM und den Zellen angepasst sein sollte (THULL 2005). Die CLSM kann hierbei aufgrund der Möglichkeit der 3-dimensionalen in-situ-Darstellung des Implantatinterface biologisch-strukturelle und molekularbiologisch-immunologische Fragestellungen beantworten.
N2  - Aim of the study was to investigate the differences in woundhealing of extracellular matrixproteins in the surrounding tissue of metallic implants. Therefore the proteins collagen type I, type III and fibronectin were detected by confocal laserscanning microscopy after subcutaneous, intramuscular and enossal insertion of titanium and stainless-steel implants. Intramuscular periimplant capsules showed denser orientated kollagen fibres than subcutaneous capsules. No correlation could be shown between the capsuleformation and the implant material. After enossal implantation stainless-steel implants healed in thinner capsules than titanium implants. The semiquantitative evaluation of the proteindistribution by confocal laserscanning microscopy showed higher intensity closer to the implant-interface in all localizations and materials. Reproducable differences or correlations to the implantmetrial could not be seen. Better understanding and further investigations of material surface and tissue interactions are necessary to elaborate highly developed implants with perfectioned surfaces.
KW  - Implantat
KW  - Metallischer Werkstoff
KW  - Extrazelluläre Matrix
KW  - Proteine
KW  - Konfokale Mikroskopie
KW  - implant
KW  - extracellular matrix
KW  - proteins
KW  - confocal lasersacnning microscopy
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-29103
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TY  - THES
A1  - von Saint André - von Arnim, Amélie
T1  - The Role of Endosymbiotic Wolbachia Bacteria in the Pathogenesis of River Blindness
T1  - Die Rolle des endosymbiontischen Wolbachia Bakteriums in der Pathogenese der Flußblindheit
N2  - Introduction: This study investigates the role of Wolbachia bacteria in the pathogenesis of O. volvulus keratitis in a mouse model. Wolbachia bacteria are essential symbionts of most filarial nematodes of importance for mankind. Methods: Using a mouse model for river blindness in which soluble extracts of filarial nematodes are injected in the corneal stroma, changes in stromal thickness and haze of the cornea are observed by in vivo confocal microscopy, followed by immunohistochemical staining for neutrophils and PECAM-1, as well as ELISA of corneal chemokines. Reactions to filarial extracts containing Wolbachia are compared to those without the endosymbiont. Results: The approach of characterizing Wolbachia’s role in river blindness in this study is threefold. Firstly, Wolbachia-depleted extracts from doxycycline treated onchocerciasis patients led to a diminished inflammatory response in corneas of C57BL/6 mice compared to untreated, i.e. Wolbachia containing antigen. The decreased cell recruitment observed with doxycycline treated extracts involved neutrophils, but not eosinophils. This finding demonstrated that the presence of Wolbachia increases neutrophil recruitment. Secondly, extracts from Wolbachia-containing B. malayi revealed markedly more pathology than endosymbiont-free A. viteae antigen. This again pointed at the role of Wolbachia in development of disease. Thirdly, Toll-like Receptor 4 (TLR4) dependence was shown to exist for the inflammatory response to Wolbachia harboring O. volvulus antigen by looking at the corneal pathology in TLR4-mutant C3H/HeJ mice, compared to the wild-type C3H/HeN strain. Investigating further Wolbachia mediated mechanisms of neutrophil recruitment to the cornea, this study also showed that expression of the adhesion molecule PECAM-1 in limbal vessels, as well as upregulation of the CXC chemokines KC and MIP-2 were dependent on the presence of functional TLR4 and Wolbachia respectively. Conclusions: This study indicates that the innate immune system and Wolbachia endobacteria play an important role in the inflammatory response associated with the pathogenesis of onchocerca keratitis, suggesting a complete alteration in our understanding of the immunopathology of filariasis.
N2  - Einleitung: Diese Arbeit untersucht die Rolle des Bakteriums Wolbachia in der Pathogenese der Onchozerka volvulus Keratitis anhand eines Mausmodels. Wolbachia sind essentielle endosymbiontische Bakterien, die in den meisten Filariosen, die für die Menschheit von Bedeutung sind, existieren. Methoden: Mit Hilfe eines Mausmodels für die Flußblindheit, in dem lösliche Filarienextrakte in das korneale Stroma von Mäusen injiziert werden, lassen sich Veränderungen in der Stromadicke und –durchsichtigkeit mit in vivo konfokaler Mikroskopie beobachten, gefolgt von immunhistochemischer Färbung von Neutrophilen und PECAM-1, wie auch ELISA von kornealen Chemokinen. Dabei werden Entzündungsreaktionen nach Injektion von Filarienmaterial mit oder ohne Wolbachia verglichen. Resultate: Die Untersuchung von Wolbachia's Rolle in der Flußblindheit erfolgte in drei Schritten. Zunächst führte Antigenmaterial von Wolbachia-freien, mit Doxyzyklin behandelten Onchozerkosepatienten zu geringerer Entzündungsreaktion in der Kornea von C57BL/6 Mäusen verglichen mit Wolbachia-enthaltendem Material. Die verminderte Enzündungszellzahl bei Doxyzyklin-behandelten Extrakten umfasste Neutrophile, aber nicht Eosinophile Granulozyten. Die Anwesenheit von Wolbachia führt daher zu verstärkter Neutrophileneinwanderung. Zweitens erwiesen Wolbachia-enthaltende B. malayi Extrakte eine signifikant verstärkte korneale Pathologie verglichen mit Endosymbiont-freiem A. viteae Antigen. Dieses Ergebnis deutete erneut auf die Rolle von Wolbachia in der Krankheitsentstehung. Drittens wurde anhand von Toll-like Rezeptor 4 (TLR4) mutanten C3H/HeJ Mäusen gezeigt, dass die Entzündungsreaktion, die von Wolbachia-enthaltenden O. volvulus Extrakten hervorgerufen wird, von TLR4 abhängig ist. Weitere Untersuchungen Wolbachia-abhängiger Mechanismen der Neutrophileneinwanderung in die Kornea erwiesen, dass die Expression des Adhäsionsmoleküls PECAM-1 in limbischen Gefäßen, wie auch die Hochregulation der CXC Chemokine KC und MIP-2 von TLR4 und der Anwesenheit von Wolbachia abhängig sind. Konklusion: Diese Arbeit zeigt, dass das angeborene Immunsystem und Wolbachia eine wichtige Rolle in der Pathogenese der O. volvulus Keratitis spielen, was auf eine neue Verstehensweise der Filariosenimmunpathologie hinweist.
KW  - Onchozerkose
KW  - Wolbachia
KW  - Endosymbiont
KW  - Filariose
KW  - Konfokale Mikroskopie
KW  - Doxyzyklin
KW  - Toll like Rezeptor 4
KW  - Doxycycline
KW  - Toll like receptor 4
Y1  - 2007
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-31560
ER  -