TY - THES A1 - Neumann, Arne T1 - Aktivierung phagozytierender Zellen durch "Advanced Glycation Endproducts" und beta-Amyloid-Implikationen für die Pathogenese der Alzheimer'schen Demenz T1 - Activation of phagocytic cells by "Advanced Glycation Endproducts" and beta-Amyloid Implications for Alzheimer's Disease pathogenesis N2 - Typisch für die Alzheimer' schen Erkrankung ist die Bildung unlöslicher Ablagerungen im Gehirn, sogenannter "seniler Plaques". Diese Plaques bestehen im Wesentlichen aus fibrillärem beta-Amyloid, das durch Glykierungen verändert vorliegen kann. Außerdem beinhalten die Plaques, sogenannte AGEs "Advanced Glycation Endproducts", die aus nichtenzymatisch glykierten Proteinen entstehen. Diese AGE-modifizierten Proteine sowie das fibrilläre beta-Amyloid sind in der Lage Mikrogliazellen zu aktivieren. Die sessilen Gehirnmakrophagen wirken in aktiviertem Zustand neurotoxisch, wobei es verschiedene Hypothesen gibt, wie die Mikrogliazellen zu dem neuronalen Zelltod führen. Um dieses zu untersuchen wurden murine Mikrogliazellen herangezogen, die als Merkmal ihrer Aktivierung auf die Translokation des Transkriptionsfaktors NF-kappa-B in den Zellkern überprüft wurden. In der vorliegenden Arbeit wurden die Rahmenbedingungen näher untersucht, die zu der AGE vermittelten Mikrogliaaktivierung führen. Es wurde in vitro gezeigt, daß die Mikrogliaaktivierung zunächst durch eine hochmolekulare Hyaluronsäure, wie sie nativ in der extrazellulären Matrix vorliegt, verhindert wird. Im Gegensatz dazu konnte NF-kappa-B in Mikrogliazellen aktiviert werden, die in Gegenwart von Hyaluronsäurefragmenten mit AGE behandelt wurden. In der vorliegenden Arbeit wurde festgestellt, daß die Mikrogliaaktivierbarkeit umgekehrt proportional zu der durchschnittlichen Hyaluronsäuremolekülgröße ist. Andere Glykosaminoglykane aus der extrazellulären Matrix, wie D-Glukuronsäure, N-Azetylglukosamin oder Chondroitin-4-sulfat reduzierten die Aktivierbarkeit der Mikrogliazellen nur geringfügig. Sowohl beta-Amyloid, als auch AGEs setzen während ihres Entstehungsprozesses reaktive Sauerstoffspezies frei, die Hyaluronsäure in kleinere Bruchstücke zerschneiden können. Die Signaltransduktion der AGE-aktivierten Mikrogliazellen wurde mittels unterschiedlicher Inhibitoren gehemmt und die Auswirkung auf die NF-kappa-B Aktivierung untersucht. Hier zeigte sich ein komplexes Netzwerk an aktivierten Signalwegen, so daß kein Rückschluß auf einen bestimmten Rezeptor möglich war. Daher wurde ein "in vitro Modell" entwickelt, um die ausschlaggebende neurotoxischen Komponenten der Mikrogliareaktion aufzufinden. Darin wurden die Signalkaskaden der aktivierten Mikroglia erneut durch pharmakologische Inhibierung unterbrochen, das zellfreie Medium das von diesen Mikrogliazellen sezerniert wurde, wurde als "konditioniertes Medium" für die Kultur muriner Neuronen eingesetzt. Diese wurden bezüglich ihrer Überlebensrate in diesem konditionierten Medium untersucht. Die Hemmung der Transkription oder der Translation in den Mikrogliazellen zeigte keine Reduktion der neurotoxischen Wirkung des konditionierten Mediums. Ebensowenig wirkten Inhibitoren der mitochondrialen Atmungskette, der Radikalquellen Xanthin Oxidase, Lipoxygenase oder Cyclooxygenase. Die Hemmung der NADPH Oxidase reduzierte die Neurotoxizität des konditionierten Mediums auf etwa 30 Prozent. Die NADPH Oxidase ist ein Enzymkomplex, der im Rahmen des "oxidativen bursts" große Mengen Superoxidanionen freisetzt. Um die Bedeutung der NADPH Oxidase Aktivierung für die neurotoxische Wirkung nachzuweisen, wurde eine Untereinheit der NADPH Oxidase, das membranständige gp91phox in den Mikrogliazellen deaktiviert. Dies führte dazu, daß diese Zellen kein Superoxid auf die Stimulation mit beta-Amyloid oder AGE hin abgaben, im Gegensatz zu den Mikrogliazellen mit funktioneller NADPH Oxidase. Das konditionierte Medium der NADPH Oxidase defizienten Zellen war nicht mehr neurotoxisch. Die freien Sauerstoffradikale die aufgrund der NADPH Oxidase Aktivierung entstehen, können zu einer NF-kappa-B Aktivierung führen. NF-kappa-B wurde erfolgreich in den Mikroglia durch exogenes Wasserstoffperoxid stimuliert, wobei aber keine neurotoxische Wirkung im Modellsystem festgestellt wurde. NF-kappa-B scheint damit nicht für die mikrogliavermittelte Neurotoxizität verantwortlich zu sein, im Gegensatz zu der NADPH Oxidase, deren Aktivität unmittelbar mit der Neurotoxizität korreliert ist. N2 - Senile plaques are a hallmark in Alzheimer's Disease progression. These plaques consist mainly of fibrillar beta-amyloid, which can be modified by glycation. In addition these plaques contain so called AGEs "Advanced Glycation Endproducts", emerging from nonenzymatic glycated proteins. Subsequent dehydration, condensation and oxidation produces a heterogenous group of heterocyclic, coloured and fluorescent compounds. These AGE modified proteins are resistant to proteases and their formation is irreversible. AGEs and beta-amyloid are able to activate Microglia cells, resulting in a neurotoxic effect, with several hypothesis of how microglia contribute to neuronal cell death. To investigate the neurotoxic effect murine microglia cells were used. The NF-kappa-B translocation into the nucleus was taken as an indicator of microglial activation. In this work conditions were investigated, that are necessary to activate murine microglia cells by AGE stimulation. High molecular weight hyaluronic acid from extracellular matrix, in its native form, is inhibiting activation of microglia cells in vitro. In contrast NF-kappa-B was activated in AGE stimulated microglia cells in the presence of low molecular weight hyaluronic acid fragments. Here it was shown that the ability to activate microglia cells is inversly proportional to the average size of the hyaluronic acid. The ability for activation of microglia cells was reduced only in parts by other extracellular matrix glycosaminoglycans, like D-glucuronic acid, N-acetylglucosaminoglycane or chondroitine-4-sulfate. Ab and AGEs release reactive oxyen species during their develompent, which were shown to be able to cleave hyaluronic acid into small fragments. The signal transduction of AGE activated microglia cells was examined by measurement of NF-kappa-B activation reduced by different inhibitors. A complex network of signaling pathways was detected, without revealing a certain receptor. Therefore an "in vitro model" was established, to find out the main neurotoxic component in the reaction of microglia cells. Again the signaling pathways were inhibited pharmacologically, using the cell free medium produced by these microglia cells as "conditioned medium" in neuronal cell culture. The murine neuronal cells were tested for their surviving in the conditioned medium, to correlate activated signal pathways with neurotoxicity. Inhibition of translation or transcription in microglia cells led to no reduction of the neurotoxic effect of the conditioned medium, nor did the inhibition of the mitochochondrial respiratory chain or the radical sources xanthine oxidase, lipoxygenase or cyclooxygenase. Inhibition of NADPH oxidse was able to reduce the neurotoxicity of the conditioned medium down to 30 per cent. The NADPH oxidase is an enzyme complex , releasing huge numbers of superoxide anion radicals during the "oxidative burst". The neurotoxic component was released 30 min after activation of microglia cells into the conditioned medium, was bigger than 50 kDa and was removed out of the conditioned medium by EDTA chelation followed by dialysis. To proof the importance of NADPH oxidase activation for neurotoxicity, a part of the NADPH oxidase, the membranebound gp91phox was disrupted by gene targeting. As a consequence these cells did not react with superoxide release, when treated with beta-amyloid or AGE. Conditioned medium of these cells was not neurotoxic, in contrast to that of the microglia cells with a functional NADPH oxidase. The reactive oxygen species resulting from the NADPH oxidase activity are able to activate NF-kappa-B. Because of the wide range of gene activation performed by NF-kappa-B, there are various potential neurotoxic gene products to consider. For that reason NF-kappa-B was stimulated sucessfully in microglia cells with exogenous hydrogen stimulation, without a neurotoxic result in the model system. Activated NF-kappa-B seems not to be responsible for the microglia mediated neurotoxicity, whereas there is a direct correlation of NADPH oxidase activity and neurotoxicity. KW - Alzheimer-Krankheit KW - Amyloid KW - Glykolisierung KW - Mikroglia KW - Zelltod KW - Alzheimer' schen Erkrankung KW - seniler Plaques KW - AGEs KW - Advanced Glycation Endproducts KW - Mikroglia KW - Hyaluronsäure KW - NF-kappa-B KW - Glykosaminoglykane KW - Alzheimer' Disease KW - senile plaque KW - AGEs KW - advanced glycation endproducts KW - hyaluronic acid KW - NF-kappa-B KW - glucosaminoglycane KW - ECM KW - amyloid Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1796 ER - TY - THES A1 - Neukirchen, Sebastian T1 - Borrelienneuropathie - eine histologische und immunhistochemische Charakterisierung T1 - Borrelianeuropathy - a histologic and immunhistochemical characterization N2 - Die Pathomechanismen der Neuropathie bei Neuroborreliose sind noch immer unklar. In der vorliegenden Studie untersuchten wir 22 Patienten mit einer Neuropathie bei Neuroborreliose (BN) (3 Patienten in Stadium 2, 19 Patienten in Stadium 3) und verglichen diese mit 9 Patienten einer vaskulitischen Neuropathie (VN) und 14 Patienten einer idiopathisch axonalen Neuropathie (AN). Histologische und immunhistochemische Färbungen wurden mit Antikörpern gegen Leu4, CD68, 27E10 (frühzeitig aktivierte Makrophagen) und 25F9 (späte Makrophagen), Membrane-Attack-Komplex C5b-9, Adhäsionsmolekül ICAM sowie inflammatorische Zytokine Tumor Nekrose-Faktor-alpha (TNF-alpha), Interleukin-1ß (IL-1ß) und Interleukin-6 (IL-6), als auch Metalloproteinase MMP-9 durchgeführt, ferner mit Antikörpern gegen das membranassoziierte Glykoprotein HLA-DR3. Zusätzlich wurden Semi-Dünn-Schnitte angefertigt. Klinisch wiesen die meisten BN Patienten eine distal symmetrische sensomotorische Neuropathie auf, nur 6/22 Patienten waren schmerzfrei. Die Mehrzahl (18/22) der BN Neuropathien waren primär axonal mit perivaskulären (6/22), in 8 Fällen vaskulitischen Infiltraten. Das Perineurium war schwerpunktmäßig im Rahmen einer Borrelien-assoziierten Neuropathie betroffen. Das lies sich aus dem gegenüber den Kontrollgruppen signifikant verdickten Perineurium, der vermehrten Vaskularisation des Perineuriums und der starken IR für das Zytokin TNF-α schliessen, in geringerem Ausmaß für IL-1β, und für die terminale Komplementkomponente C5b9. Perivaskuläre und vaskuläre Infiltrate sowie die betont perineurale Expression bestimmter inflammatorischer Zytokine und Adhäsionsmoleküle erschienen charakteristisch für eine Neuropathie bei Neuroborreliose. Autoimmune Reaktionen mit Angriff am Perineurium können für die Pathogenese der Neuropathie bei Neuroborreliose bedeutsam sein. N2 - The pathologic mechanisms in Lyme Borreliosis are still unknown. In this study we examinated 22 patients with neuropathy in Neuroborreliosis (3 patients in stadium 2, 19 patients in stadium 3) and compared them to 9 patients with vasculitic neuropathy (VN) and to 14 patients with idiopathic axonal neuropathy (AN). Histologic and immunohistochemical stainings on sural nerve biopsies with antibodies against Leu4, CD68, 27E10 (early macrophages) and 25F9 (late macrophages), membrane-attack-complex C5b9, adhesionmolecule ICAM and inflammatoric cytokines tumor-necrosis-factor-alpha (TNF-alpha), interleukin-1β (IL-1β) and interleukin-6 (IL-6), metalloproteinases-9 (MMP-9) and membrane-associated glykoprotein HLA-DR3 were obtained. Additional semi thin sections were performed. Clinically, most of the patients had distal, symmetric, sensomotoric neuropathy, only 6 (of 22) did not feel any pain. Most of the BN-patients showed a primary axonal neuropathy, in 6 cases (of 22) with pervasculitic and in 8 cases with vasculitic infiltrates. Perineurial tissues play an extraodinary important role for the pathogenesis of neuroborreliosis. This can be claimed because of the significant thickened perineurium, the increased perineurial vascularisation and the intense IR for cytokine TNF alpha. Perivascular and vascular infiltrates as well as the definite perineurial expression of certain inflammatory cytokines and adhesion molecules seemed to be distinguishing for neuropathy in context of Neuroborreliosis. Autoimmune reactions followed by affection of the perineurium may play a role in the pathogenesis of a neuroborreliosis. KW - Borrelien KW - Neuropathie KW - Suralisbiopsien KW - Lyme-Krankheit KW - ECM KW - Borreliosis KW - neuropathy KW - sural nerve KW - Lyme-disease KW - ECM Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-16147 ER - TY - JOUR A1 - Schmidt, Stefanie A1 - Abinzano, Florencia A1 - Mensinga, Anneloes A1 - Teßmar, Jörg A1 - Groll, Jürgen A1 - Malda, Jos A1 - Levato, Riccardo A1 - Blunk, Torsten T1 - Differential production of cartilage ECM in 3D agarose constructs by equine articular cartilage progenitor cells and mesenchymal stromal cells JF - International Journal of Molecular Sciences N2 - Identification of articular cartilage progenitor cells (ACPCs) has opened up new opportunities for cartilage repair. These cells may be used as alternatives for or in combination with mesenchymal stromal cells (MSCs) in cartilage engineering. However, their potential needs to be further investigated, since only a few studies have compared ACPCs and MSCs when cultured in hydrogels. Therefore, in this study, we compared chondrogenic differentiation of equine ACPCs and MSCs in agarose constructs as monocultures and as zonally layered co-cultures under both normoxic and hypoxic conditions. ACPCs and MSCs exhibited distinctly differential production of the cartilaginous extracellular matrix (ECM). For ACPC constructs, markedly higher glycosaminoglycan (GAG) contents were determined by histological and quantitative biochemical evaluation, both in normoxia and hypoxia. Differential GAG production was also reflected in layered co-culture constructs. For both cell types, similar staining for type II collagen was detected. However, distinctly weaker staining for undesired type I collagen was observed in the ACPC constructs. For ACPCs, only very low alkaline phosphatase (ALP) activity, a marker of terminal differentiation, was determined, in stark contrast to what was found for MSCs. This study underscores the potential of ACPCs as a promising cell source for cartilage engineering. KW - ACPC KW - chondroprogenitors KW - tissue engineering KW - MSC KW - agarose KW - hypoxia KW - ECM KW - co-culture KW - zonal KW - cartilage Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-236180 SN - 1422-0067 VL - 21 IS - 19 ER - TY - JOUR A1 - Henke, Erik A1 - Nandigama, Rajender A1 - Ergün, Süleyman T1 - Extracellular matrix in the tumor microenvironment and its impact on cancer therapy JF - Frontiers in Molecular Biosciences N2 - Solid tumors are complex organ-like structures that consist not only of tumor cells but also of vasculature, extracellular matrix (ECM), stromal, and immune cells. Often, this tumor microenvironment (TME) comprises the larger part of the overall tumor mass. Like the other components of the TME, the ECM in solid tumors differs significantly from that in normal organs. Intratumoral signaling, transport mechanisms, metabolisms, oxygenation, and immunogenicity are strongly affected if not controlled by the ECM. Exerting this regulatory control, the ECM does not only influence malignancy and growth of the tumor but also its response toward therapy. Understanding the particularities of the ECM in solid tumor is necessary to develop approaches to interfere with its negative effect. In this review, we will also highlight the current understanding of the physical, cellular, and molecular mechanisms by which the pathological tumor ECM affects the efficiency of radio-, chemo-, and immunotherapy. Finally, we will discuss the various strategies to target and modify the tumor ECM and how they could be utilized to improve response to therapy. KW - extracellular matrix KW - cancer therapy KW - drug transport KW - immunotherapy KW - chemotherapy (CH) KW - radiotherapy KW - tumor microenvironment KW - ECM Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-199341 SN - 2296-889X VL - 6 IS - 160 ER - TY - THES A1 - Varadarajulu, Jeeva T1 - Integrin alpha(v) and Focal adhesion kinase - promising targets to limit smooth muscle cell migration N2 - Die Prävention einer Restenose nach PTCA ist eines der wichtigsten Ziele für Forscher und Kliniker. Etwa 1,5 Millionen Interventionen werden weltweit jährlich durchgeführt und mit Hilfe von Stentimplantationen können die meisten Patienten erfolgreich behandelt werden. Jedoch kommt es in bis zu 60 % der Fälle zu einer Restenosierung des behandelten Gefässes innerhalb von etwa 6 Monaten. Für die Entwicklung der Neointima, Hauptursache der Restenose, sind Wanderung glatter Gefässmuskelzellen (GMZ) und Ablagerungen von Proteinen der extrazellulären Matrix (EZM) verantwortlich. Signalkaskaden, die über Integrin Rezeptoren vermittelt werden, spielen in der Migration von GMZ eine zentrale Rolle. Viele Integrine binden über eine spezifische Aminosäuresequenz, die sogenannte RGD Sequenz, die in verschiedenen EZM Proteinen und in auf Zelloberflächen gebundenen Immunglobulinen vorkommt. Bisher konnte von verschiedenen Integrinantagonisten, wie Antikörpern, zyklischen Peptiden, Peptidomimetika und Nicht-Peptiden, gezeigt werden, dass die die pathologische Reaktion vermindern können, was auf die Bedeutung der Integrin vermittelten Signalkaskaden in der GMZ Migration hinweist. Wir konnten zeigen, dass die Wanderung von GMZ sowohl mit einem pharmakologischen Inhibitor, wie auch durch die endogene Überexpression eines FAK Inhibitors, der über ein AAV Vektorsystem übertragen wurde, gehemmt werden konnte. So stellt die Blockade der Integrin vermittelten Signalkaskaden ein vielversprechendes Ziel für die Inhibition der Restenose nach PTCA dar. Im ersten Teil der Arbeit konnten wir nach Stimulation von humanen GMZ mit Vitronektin (VN) eine verstärkte Tyrosinphosphorylierung (PTyr) verschiedener zellulärer Proteine nachweisen. Dabei zeigte sich eine besonders signifikante Phosphorylierung eines Proteins, das mittels Immunpräzipitation als “focal adhesion kinase” (FAK) identifiziert wurde. Die erhöhte PTyr zeigte sich auch am Tyrosinrest FAK Tyr-397, der Autophosphorylierungsstelle der Kinase. Die erhöhte PTyr von FAK war abhängig von der Stimulation durch VN und nicht zu beobachten, wenn die GMZ auf Poly-L-Lysin ohne spezifische Rezeptor Ligand Interaktion adhärierten. Mit Hilfe eines Integrin V Inhibitors konnte diese rezeptorvermittelte Aktivierung in einer dosisabhängigen Weise verhindert werden. Die Inhibition der durch VN stimulierten Migration (Haptotaxis) mit Hilfe des V Inhibitors korrelierte mit der Reduktion der Aktivierung Integrin vermittelter Signalwege, im Besonderen der PTyr von FAK. Interessanterweise konnte die Blockade von Integrin V nicht nur die durch VN stimulierte Haptotaxis, sondern auch die durch Wachstumsfaktoren induzierte Chemotaxis hemmen. Die Migrationsrate wurde mit Hilfe eines modifizierten Boyden-Migrationskammer Experiments ermittelt, das ein in vitro Modell zur Untersuchung von Zellwanderung darstellt. Der V Inhibitor hemmte auch die Invasion der GMZ in eine Matrigel Matrix und die Sekretion der Matrixmetalloproteinase 2. Eine Apoptose wurde bei den verwendeten Konzentrationen nicht induziert. FAK stellt ein wichtiges Schlüsselprotein in vielen zellulären Mechanismen dar. So konnte die Beteiligung von FAK in der Regulation der Zellmigration an verschiedenen Zellarten gezeigt werden. Die Überexpression von FRNK, der C-terminalen Domäne von FAK, ist in der Lage die in vitro Migration von GMZ wie auch die Neointimabildung in einem Schweinemodell zur Entwicklung der Restenose zu verhindern. FAK stellt somit ein vielversprechendes Ziel für die Inhibition der Restenoseentwicklung nach PTCA dar. Der letzte Teil der Arbeit konzentrierte sich auf die Identifikation von Bindungspartnern der N-terminalen Domäne von FAK mit Hilfe eines bakteriellen „two hybrid“ Systems. Es wurde als ein möglicher Bindungspartner ein 17,9 kDa grosses Protein gefunden. Das humane Homolog ist als AGS4 bezeichnet und stellt einen GTPase Aktivator dar. Es zeigte sich, dass es in der Lage ist, mit der N-terminalen Domäne von FAK zu interagieren, und dass es stark in hämatopoetischen Zellen exprimiert wird. Zusammenfassend kann man sagen, dass unsere Ergebnisse FAK als ein vielversprechendes Ziel für die Inhibition der GMZ Migration erscheinen lassen. Das Vorliegen verschiedener induzierter Signalwege kann durch die Rolle der EZM Proteine und der Wachstumsfaktoren in der Zellmigration erklärt werden. Das Ziel dieser Studie war die Signalkaskaden, die zu einer GMZ Migration und somit zu einer Restenose führen, zu unterbrechen. Die Ergebnisse zeigen, dass V Integrine und Signalkaskaden, die FAK vermittelt sind, wichtig für die Zellmigration sind. Die Unterbrechung dieser FAK vermittelten Signalwege, sei es durch einen pharmakologischen Inhibitor oder durch die Überexpression von FRNK führte zu einer Inhibition der Migration. N2 - The prevention of restenosis after percutaneous coronary intervention is a major task for researchers and clinicians in cardiovascular pharmacology. Nearly 1.5 million PTCA are performed every year worldwide and, due to the implantation of stents, most of the cases can be treated successfully. 60% of those patients develop restenosis within 6 months. SMC migration and ECM deposition are known to be responsible for neointima formation. Among many processes, integrin initiated signalling events play a central role in SMC migration. Many integrins recognize a specific RGD sequence which is present in several ECM proteins and cell surface immunoglobulin super family molecules. Until now, there are various integrin antagonists such as antibodies, cyclic peptides, peptidomimetics, and non-peptides have been shown to interfere with such pathological situations indicating the importance of integrin initiated signalling pathways in SMC migration. Therefore, in this study SMC migration induced by ECM proteins was inhibited either using pharmacological inhibitor or by overexpressing the endogenous inhibitor of FAK by AAV vector system. In the first part of the thesis, the effect of integrin-ligand stimulation on hCASMCs was studied. The tyrosine phosphorylation of many cellular proteins was observed from serum starved hCASMCs replated on VN but not on PL coated plates. The major tyrosine phosphorylated protein was identified as FAK by immunoprecipitation and also phosphorylation was found at Tyr 397, the autophosphorylation site of FAK. Further, VN induced the dose dependent migration of hCASMCs in haptotaxis assay. The integrin v inhibitor was used to block those ECM stimulated integrin signalling pathways and cell migration. It inhibited the ECM stimulated tyrosine phosphorylation in a dose dependent manner. Interestingly, specific potent antagonism of integrin v abrogated both ECM induced haptotaxis and growth factor induced chemotaxis. The inhibition of migration is consistent with the replating assay results that show interference with integrin induced signalling pathways particularly the FAK tyrosine phosphorylation. The integrin v inhibitor also is able to interfere with hCASMC invasion through matrigel by reducing MMP-2 secretion. Importantly, integrin v inhibitor did not induce the apoptosis in hCASMCs. FAK is a key player in many cellular events and its involvement in cell migration was extensively studied in various cell types. The present study explored the function of FAK in hCASMC migration by overexpression of FRNK, the C-terminal domain of FAK. Overexpression of FRNK inhibited the in vitro SMC migration as well as the neointima formation in a porcine restenosis model in vivo. The last part of this thesis focused on the identification of putative binding partners for the N-terminal domain of FAK by bacterial two-hybrid screen. One of the interesting binding partners was a putative protein of 17.9 kDa. Its human homolog is AGS4, which acts as a GTPase activator. The preliminary results revealed that it is able to interact with N-FAK domain and its expression is high in haematopoietic cells. Taken together the above results suggest that integrin v and FAK are promising targets for inhibition of SMC migration. Disruption of FAK-mediated signalling pathways by a pharmacological inhibitor or by overexpression of FRNK, which acts as dominant-negative regulator, resulted in decreased migration of SMCs and thus can lead to reduction of neointima formation. KW - Restenose KW - Blutgefäß KW - Glatte Muskulatur KW - Integrine KW - Signalkette KW - Integrin KW - AAV vector KW - restenosis KW - FAK KW - ECM KW - Integrin KW - AAV vector KW - restenosis KW - FAK KW - EZM Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17484 ER - TY - THES A1 - Wu, Rongxue T1 - Treatment with integrin alpha v inhibitor abolishes compensatory cardiac hypertrophy due to altered signal transduction and ECM gene expression T1 - xxx N2 - Integrine sind Transmembranrezeptoren, welche mechanische Signale von der extrazellulären Matrix (ECM) zum Zytoskelett übermitteln ("outside-in-signaling"). Viele molekulare Defekte in der Verbindung zwischen Zytoskelett und ECM erzeugen bekanntermaßen Kardiomyopathien. alpha v Integrin scheint eine Hauptrolle in verschiedenen Prozessen der kardialen Reorganisation zu spielen, wie z.B. Regulation der Zellproliferation, -migration und -differenzierung. Unsere Hypothese war, dass alpha v -Integrin-vermittelte Signale notwendig für die kompensatorische Hypertrophie nach Aortenkonstriktion sind und assoziiert mit der Modulation der Expression von ECM-Proteinen. Dazu wurden Mäuse mit einem spezifischen alpha v Integrin-Inhibitor behandelt und einer Aortenkonstriktion (AB) unterzogen. Nach zwei Tagen und nach sieben Tagen wurden die Mäuse echokardiographisch untersucht und eingehende hämodynamische Untersuchungen wurden durchgeführt. Die Behandlung mit dem alpha v -Integrin-Inhibitor führte zu einer dilatativen Kardiomyopathie und Herzinsuffizienz in den AB-Mäusen, gekennzeichnet durch einen dilatierten linken Ventrikel, schlechte linksventrikuläre Funktion und einer Lungenstauung, wohingegen die scheinbehandelten Tiere eine kompensatorische Hypertrophie des linken Ventrikels zeigten. Untersuchungen der beteiligten Signalwege zeigten eine Aktivierung des p38 MAP-Kinase-Signalwegs, von ERK 1 und -2, der Focal Adhesion Kinase FAK und Tyrosin-Phosphorylierung von c-Src in den Kontrollherzen, was in den Inhibitor-behandelten Herzen fehlte. mRNA-Expressionsanalysen für 96 Gene mittels "Micro-Arrays" ermittelten verschiedene genomische Ziele des alpha v -Integrin-aktivierten Signalwegs. 18 für ECM-Proteine codierende Gene wurden mehr als 2-fach hochreguliert, z.B. Kollagen (8,11-fach ± 2,2), Fibronectin (2,32 ± 094), SPARC (3,78 ± 0,12), ADAMTS-1 (3,51 ± 0,81) und TIMP2 (2,23 ± 0,98), wohingegen die Aktivierung dieser Gene in Inhibitor-behandelten Tieren aufgehoben war. Wir folgern daraus, dass Signalwege unterhalb von alpha v -Integrin, mediiert durch MAP-Kinasen, FAK und c-Src, zu einer verstärkten Expression von ECM-Komponenten führt, welche für die kompensatorische Antwort auf Druckbelastung nötig sind. N2 - Integrins are transmembrane receptors transmitting mechanical signals from the extracellular matrix (ECM) to the cytoskeleton (outside-in-signaling). Many molecular defects in the link between cytoskeleton and ECM are known to induce cardiomyopathies. alpha v integrin appears to play a major role in several processes relevant to remodeling, such as binding and activation of matrix metalloproteinases as well as regulation of cell proliferation, migration, and differentiation. We hypothesized that alpha v integrin-mediated signaling is required for the compensatory hypertrophy after aortic banding (AB) and associated with the modulation of ECM protein expression. Mice were treated in vivo with a specific integrin alpha v inhibitor or vehicle via osmotic minipumps starting 1 day prior to aortic banding (AB). At day 2 and day 7 following AB or sham-operation, the mice were examined by echocardiography and hemodynamic analyses were performed. Treatment of alpha v Integrin inhibitor led to a dilated cardiomyopathy and congestive heart failure in AB mice (dilated left ventricle, depressed LV function, and pulmonary congestion), but not to hypertrophy as observed in mice without inhibitor treatment. Investigation of downstream signaling revealed significant activation of the p38 Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK), the Extracellular signal-Regulated Kinases 1 and 2 (Erk 1/2), Focal Adhesion Kinase (FAK) and tyrosine-phosphorylation of c-Src in mice 7 days after AB. This response was blunted in mice treated with integrin alpha v inhibitor. Microarrays probing for a total of 96 cell adhesion and ECM genes identified various genomic targets of integrin alpha v mediated signalling. 7 days after AB 18 ECM genes were up-regulated more than 2-fold (n=6), e.g. collagen (8.11 ± 2.2), fibronectin (2.32 ± 0.94), secreted protein, acidic and rich in cysteine (SPARC, 3.78 ± 0.12), A disintegrin-like and metalloprotease (reprolysin type) with trombospondin type 1 (Adamts-1, 3.51 ± 0.81) and Tissue inhibitor of metalloproteinase 2 (TIMP2, 2.23 ± 0.98), whereas this up-regulation was abolished in mice that were treatd by integrin alpha v inhibitor via mini pumps. We conclude that signaling downstream of integrin alpha v is mediated by the MAPK, FAK and c-Src pathways leading to an up-regulation of extracelluar matrix components necessary for the compensatory response of the heart under a condition of pressure overload. KW - Antigen KW - integrin alpha v KW - cardiac hypertrophy KW - signal transduction KW - ECM KW - gene expression KW - integrin alpha v KW - cardiac hypertrophy KW - signal transduction KW - ECM KW - gene expression Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-21339 ER -