TY - THES A1 - Li, Xiaoli T1 - Functional analyses of ES cell pluripotency by inducible knockdown of the Polycomb group protein Pcgf6 T1 - Functionelle Analysen der ES-Zell-Pluripotenz durch induzierbaren Knockdown des Polycomb group Proteins Pcgf6 N2 - Polycomb group (PcG) proteins are chromatin modifiers involved in heritable gene repression. Two main PcG complexes have been characterized: Polycomb repressive complex (PRC) 2 is involved in the initiation of gene silencing, whereas PRC1 participates in the stable maintenance of gene repression. Pcgf4 (Polycomb group protein, Bmi1) is one of the most studied PRC1 members with essential functions for embryonic development and adult stem cell self renewal. In embryonic stem cells (ES cells), Pcgf4 is poorly expressed while its paralogs (Pcgf1, Pcgf2, Pcgf3, Pcgf5 and Pcgf6) are expressed at higher levels. The relevance of the Pcgf paralog Pcgf6 for the maintenance of ESC pluripotency has not been addressed so far. My analyses revealed that Pcgf6 was the most expressed Pcgf paralog in undifferentiated ES cells. When ES cells differentiated, gene expression of Pcgf6 strongly declined. To investigate the functions of Pcgf6 in ES cells, we established a doxycycline (dox) inducible shRNA-targeted knockdown system according to publications by Seibler et al. (Seibler et al. 2005; Seibler et al. 2007). Following dox-induced knockdown (KD) of Pcgf6, we observed decreased ES cell colony formation. In parallel, gene expression of pluripotency markers Oct4, Nanog and Sox2 was reduced upon dox-treatment, wheras the expression of mesoderm genes such as T (Brachyury) were up-regulated. Further, microarray analysis revealed de-repression of several spermatogenesis-specic genes upon Pcgf6-KD, suggesting that Pcgf6 may play a role during spermatogenesis. Upon in vitro differentiation, Pcgf6-KD ES cells showed increased hemangioblast formation, paralleled by increased hematopoietic development. In summary, results of this study suggest that Pcgf6 is involved in maintaining ES cell identity by repressing lineage-specific gene expression in undifferentiated ES cells. N2 - Polycomb Gruppe (PcG) Proteine sind Chromatin-Modifikatoren, die an der vererbbaren Genrepression beteiligt sind. Primär wurden bisher zwei PcG-Komplexe charakterisiert: Polycomb-repressiv-Komplex (PRC) 2, der die ersten Schritte des Gen-Silencings übernimmt, und PRC1, der an der stabilen Aufrechterhaltung der Genrepression beteiligt ist. Pcgf4 (Bmi1) ist das am besten untersuchte PRC1-Mitglied. Pcgf4 hat wichtige Funktionen in der embryonalen Entwicklung und in der Selbst-Erneuerung adulter Stammzellen. In embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) wird Pcgf4 kaum exprimiert, während seine Paraloge (Pcgf1, Pcgf2, Pcgf3, Pcgf5 und Pcgf6) höher exprimiert sind. Die Bedeutung des Pcgf-Paralogs Pcgf6 für die Aufrechterhaltung der Pluripotenz von ES-Zellen wurde bislang nicht untersucht. Meine Analysen zeigten, dass Pcgf6 der am meisten exprimierter Pcgf-Paralog in undifferenzierten ES-Zellen war. Während der Differenzierung von ES-Zellen wurde die Expression von Pcgf6 stark reduziert. Um die Funktionen von Pcgf6 in ES-Zellen zu untersuchen, habe ich ein Doxycyclin (dox)-induzierbares shRNA-Expressionssystem für den gezielten Knockdown (KD) von Pcgf6 nach Seibler et al. (Seibler et al. 2005; Seibler et al. 2007) etabliert. Nach dox-induziertem KD von Pcgf6 beobachtete ich eine Verringerung der ES-Zell-Kolonie-Bildung. Die Expression der Pluripotenzmarker Oct4, Nanog und Sox2 war nach Dox-Behandlung reduziert, während die Expression mesodermaler Gene, wie z.B. T (Brachyury), hochreguliert wurden. Außerdem zeigten Microarray-Analysen eine De-Repression Spermatogenese-spezifischer Gene nach KD von Pcgf6, was darauf hindeutete, dass Pcgf6 eine Rolle in der Spermatogenese spielen könnte. In der in-vitro- Differenzierung zeigten Pcgf6-KD-ES-Zellen, neben einer erhöhten Bildung von Hämangioblasten, mehr hämatopoetische Vorläufer. Zusammenfassend zeigten die Daten dieser Studie, dass das Pcgf-Paralog Pcgf6 an der Aufrechterhaltung der ES-Zell-Identität durch Unterdrücken lineage-spezifischer Geneexpression in undifferenzierten ES-Zellen beteiligt ist. KW - Embryonale Stammzelle KW - Pluripotenz KW - ES cells KW - Polycomb KW - Epigenetik KW - ES Zellen Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-84015 ER - TY - THES A1 - Ahmad, Ruhel T1 - Neurogenesis from parthenogenetic human embryonic stem cells T1 - Neurogenese von parthenogenetischen humanen embryonalen Stammzellen N2 - Imprinted genes play important roles in brain development. As the neural developmental capabilities of human parthenogenetic embryonic stem cells (hpESCs) with only a maternal genome were not assessed in great detail, hence here the potential of hpESCs to differentiate into various neural subtypes was determined. In addition DNA methylation and expression of imprinted genes upon neural differentiation was also investigated. The results demonstrated that hpESC-derived neural stem cells (hpNSCs) showed expression of NSC markers Sox1, Nestin, Pax6, and Musashi1 (MS1), the silencing of pluripotency genes (Oct4, Nanog) and the absence of activation of neural crest (Snai2, FoxD3) and mesodermal (Acta1) markers. Moreover, confocal images of hpNSC cultures exhibited ubiquitous expression of NSC markers Nestin, Sox1, Sox2 and Vimentin. Differentiating hpNSCs for 28 days generated neural subtypes with neural cell type-specific morphology and expression of neuronal and glial markers, including Tuj1, NeuN, Map2, GFAP, O4, Tau, Synapsin1 and GABA. hpNSCs also responded to region-specific differentiation signals and differentiated into regional phenotypes such as midbrain dopaminergic- and motoneuron-type cells. hpESC-derived neurons showed typical neuronal Na+/K+ currents in voltage clamp mode, elicited multiple action potentials with a maximum frequency of 30 Hz. Cell depicted a typical neuron-like current pattern that responded to selective pharmacological blockers of sodium (tetrodotoxin) and potassium (tetraethylammonium) channels. Furthermore, in hpESCs and hpNSCs the majority of CpGs of the differentially methylated regions (DMRs) KvDMR1 were methylated whereas DMR1 (H19/Igf2 locus) showed partial or complete absence of CpG methylation, which is consistent with a parthenogenetic (PG) origin. Upon differentiation parent-of-origin-specific gene expression was maintained in hpESCs and hpNSCs as demonstrated by imprinted gene expression analyses. Together this shows that despite the lack of a paternal genome, hpNSCs are proficient in differentiating into glial- and neuron-type cells, which exhibit electrical activity similar to newly formed neurons. Moreover, maternal-specific gene expression and imprinting-specific DNA-methylation are largely maintained upon neural differentiation. hpESCs are a means to generate histocompatible and disease allele-free ESCs. Additionally, hpESCs are a unique model to study the influence of imprinting on neurogenesis. N2 - Imprinted Gene spielen eine wichtige Rolle bei der Gehirnentwicklung. Da das neurale Entwicklungspotenzial von hpESCs bisher noch nicht ausführlich untersucht wurde, war das Ziel dieser Arbeit das Differenzierungspotenzial von hpESCs zu verschiedenen neuralen Subtypen zu untersuchen. Außerdem wurden die DNA-Methylierung und Expression imprinted Gene in hpESCs während der neuralen Differenzierung analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass von hpESCs abgeleitete neurale Stammzellen (hpNSCs) die NSC-Marker Sox1, Nestin, Pax6 und Musashi1 (MS1) exprimierten, Pluripotenzmarker-Gene (Oct4, Nanog) abschalteten und keine Aktivierung von Markern der Neuralleistenzellen (Snai2, FoxD3) sowie dem mesodermalen Marker Acta1 stattfand. Immunfärbungen zeigten weiterhin, dass aus hpESCs abgeleitete Stammzellen die NSC-Marker Nestin, Sox1, Sox2 und Vimentin auf Proteinebene exprimierten. Durch gerichtete neurale Differenzierung für 28 Tage konnten aus hpESCs neurale Subtypen abgeleitet werden, die eine neurale Zelltyp-spezifische Morphologie aufweisen und positiv für neuronale und gliale Marker wie Tuj1, NeuN, Map2, GFAP, O4, Tau, Synapsin1 und GABA sind. Um aus hpNSCs dopaminerge und Motoneuronen abzuleiten, wurden während der Differenzierung Morphogene und trophische Faktoren zugegeben. Elektrophysiologische Analysen konnten zeigen, dass die in vitro differenzierten Neuronen, die von hpESCs abgeleitet wurden, für Neurone typische Na+/K+ Ströme sowie Aktionspotentiale (30 Hz) vorweisen ausbilden und auf ausgewählte pharmakologische Natrium- (Tetrodotoxin) und Kalium- (Tetraethylammonium) Kanal-Blocker reagierten. Desweiteren war der Großteil der CpGs von differentiell methylierten Regionen (DMRs) KvDMR1 in hpESCs und hpNSCs methyliert, während DMR1 (H19/Igf2 Locus) eine partiell oder komplett abwesende CpG-Methylierung zeigte, was dem parthenogenetischen Ursprung entspricht. Während der Differenzierung wurde die elternabhängige (parent-of-origin) spezifische Genexpression in hpESCs und hpNSCs aufrechterhalten, wie mit Genexpressionsanalysen imprinted Gene gezeigt werden konnte. In der Summe zeigen die hier dargestellten Ergebnisse, dass hpESCs, die kein paternales Genom besitzen, keine Beeinträchtigung im neuralen Differenzierungspotential zeigten und zu Gliazellen und Neurone differenziert werden konnten. Elektrophysiologische Analysen zeigten ferner, dass von hpESCs abgeleitete Neurone funktionell sind. Zudem wird die Expression maternal-spezifischer Gene und die Imprinting-spezifische DNA-Methylierung während der Differenzierung größtenteils aufrechterhalten. In der Summe stellen hpESCs ein einzigartiges Modell dar, um den Einfluss des Imprintings auf die Neurogenese zu untersuchen. KW - Embryonale Stammzelle KW - Neurogenese KW - Zelldifferenzierung KW - Stammzelle KW - human parthenogenetic stem cells KW - in vitro neural differentiation KW - human parthenogenetic neural stem cells KW - PG neurons KW - imprinting. Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-75935 ER - TY - THES A1 - Choi, Soon Won T1 - Analyse des neuralen Differenzierungspotentials androgenetischer muriner embryonaler Stammzellen in vitro und in vivo T1 - Analysis of the neural differentiation potential of androgenetic murine embryonic stem cells in vitro and in vivo N2 - Pluripotente embryonale Stammzellen (ES Zellen) sind aufgrund ihrer Selbsterneuerung- und ihrer Multiliniendifferenzierungs-Fähigkeiten interessante Zelltypen sowohl für die Grundlagenforschung als auch für die regenerative Medizin. Uniparentale Zygoten mit zwei väterlichen (androgenetisch: AG) oder zwei mütterlichen (gynogenetisch: GG; parthenogenetisch: PG) Genomen sind nicht in der Lage, lebensfähige Nachkommen zu entwickeln. Sie entwickeln sich jedoch erfolgreich bis zu Blastozysten, aus denen pluripotente ES Zellen abgeleitet werden können. Mit uniparentalen ES Zellen können zum Einen parent-of-origin-spezifische Einflüsse auf die Gewebeentwicklung untersucht und zum Anderen histokompatible und somit therapeutisch relevante Zellpopulationen generiert werden. Obwohl viele Aspekte des in vitro und in vivo Differenzierungspotenzials von PG ES Zellen aus mehreren Spezies in den zurückliegenden Jahren untersucht worden sind, ist das volle Differenzierungspotenzial von AG ES Zellen bisher nicht erschöpfend analysiert worden. Zellen der Inneren Zellmasse (ICM) von PG und AG Embryonen zeigten nach Blastozysteninjektion ortsspezifische Kontribution zur Gehirnentwicklung, wobei PG Zellen bevorzugt im Cortex und im Striatum lokalisierten, während sich AG Zellen verstärkt im Hypothalamus nachzuweisen waren. Aus AG und GG ES Zellen konnten zudem in vitro hämatopoetische Stammzellen differenziert werden, die nach Transplantation im Mausmodell tumorfrei das gesamte hämatopoetische System repopulierten. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass AG ES Zellen ein mit N ES Zellen vergleichbares in vitro und in vivo Differenzierungspotential in der frühen neuralen Entwicklung besitzen. Das Ziel meiner Arbeit war es zu untersuchen, ob murine AG ES Zellen sich zu verschiedenen neuronalen Subtypen entwickeln können und ob sie tumorfrei neurale Zelltypen nach Transplantation bilden können. In dieser Studie wurden AG ES Zellen im Vergleich zu biparentalen (N) ES Zellen in vitro über Embryoid Bodies (EBs) zunächst zu pan-neuronalen Vorläuferzellen (pNPCs) und weiter zu Neuron- und Glialzell-Marker (ß-III Tubulin (Tuj-1), NeuN, TH und GFAP) positiven Zellen differenziert.. Weiterhin wurde das dopaminerge (DA) Differenzierungspotential von AG ES Zellen näher untersucht, indem sie in einem Ko-Kultursystem mit Stromazellen gerichtet differenziert wurden. Diese DA Neurone wurden durch semiquantitative RT-PCR Analysen und immunhistochemische Färbungen für DA Neuronen-spezifische Marker (TH, PITX3, Nurr1) charakterisiert. Darüber hinaus wurde der Imprinting-Status von neun ausgesuchten Loci in AG und N ES, pNPC und DA Zellkulturen durch real-time RT-PCR Analysen untersucht. Die hier analysierten Gene, die im Gehirn allelspezifisch exprimiert werden, zeigten in pNPCs eine parent-of-origin-spezifische Genexpression mit Ausnahme von Ube3a. Nach Blastozysteninjektion wurde die Bildung von DA Neuronen in AG und N fötalen chimären Gehirnen untersucht. Hier zeigte sich, dass TH- and PITX3-positive AG DA Neurone abgeleitet aus ES Zellen im Mittelhirn von E12.5 und E16.5 Chimären detektiert werden konnten. Diese fötalen chimären Gehirne zeigten eine verbreitete und gleichmäßige Verteilung der AG Donorzellen in den Arealen Cortex, Striatum und Hypothalamus. Stereotaktische Transplantationen von AG und N pNPCs in ein „Traumatic Brain Injury (TBI) Model“ zeigten zudem, dass frühe Differenzierungsstufen von AG und N pNPC-Kulturen häufig Teratome generierten. Durch die Transplantation von langzeitdifferenzierten AG oder N pNPC-Kulturen konnte jedoch ein tumorfreies Anwachsen neuronaler und glialer Zellen erreicht werden. Die immunhistochemische Auswertung von Transplantaten bezüglich der Donorzellkontribution im Gehirn erfolgten bis zu drei Monaten nach der Injektion. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass AG ES Zellen neurales Differenzierungspotential, speziell zur Bildung von DA Neuronen, besitzen. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass langzeitdifferenzierte AG und N pNPCs nach Transplantation im traumatisierte Mausgehirnmodell tumorfrei anwachsen und anschließend zu neuralen Zellen differenzieren können. Trotz unbalancierter Genexpression von imprinted Genen lässt sich feststellen, dass AG ES Zellen therapeutisch relevant für zukünftige zelluläre Ersatzstrategien von Nervengewebe sein können. N2 - Pluripotent embryonic stem (ES) cells are interesting cell types both for basic research and for regenerative medicine because of their enormous self-renewal and multi-lineage differentiation capacity. Uniparental zygotes with two paternal (androgenetic: AG) or two maternal (gynogenetic: GG; parthenogenetic: PG) genomes are not able to develop into viable offsprings but develop successfully up to blastocysts, from which ES cells can be derived. Uniparental ES cells can be utilized to study parent-of-origin-specific influences on tissue development and histocompatible, and therapeutically-relevant cell populations could be generated from them. While many aspects of the in vitro and in vivo differentiation potential of PG uniparental ES cells were studied for several species, the capacity of AG ES cells have not been analyzed to the same extent. PG and AG inner cell mass (ICM) cells showed region-specific contribution in brain development following blastocyst injection. While PG cells were preferentially located in the cortex and the striatum, AG cells were most commonly found in the hypothalamus. Hematopoietic cells derived from AG and GG ES cells generated after transplantation long-term repopulating and tumor-free complete hematopoietic engraftments in irradiated transplant recipients. Furthermore, AG and N ES cells also show a comparable in vitro and in vivo neural differentiation potential during early development, The aim of the present study was to investigate whether AG ES cells can develop into specific neuronal subtypes, and whether they can form neural cell types after transplantation, lacking teratoma formation. In this study, AG ES cells and as controls biparental (N) ES cells were differentiated in vitro via embryoid bodies (EBs) into pan-neural progenitor cells (pNPCs) and consequently to cells which expressed a variety of neuron- and glial cell-specific markers, including ß-III tubulin (Tuj-1), NeuN, TH, and GFAP. Furthermore the dopaminergic (DA) differentiation potential of AG ES cells was investigated more closely, by directed neuronal differentiation of AG ES cells in a co-culture system with stromal cells. The resulting neurons were characterized by semi-quantitative RT-PCR analyses and immunohistochemical stainings for DA neuron-specific markers (TH, PITX3, Nurr1). Additionally, the imprinting status of nine selected loci in AG and N ES cell, pNPC and DA cell cultures was studied by real-time RT-PCR analyses. The genes analyzed here, known to be expressed allel-specific in the brain, maintained in pNPCs a parent-of-origin-specific gene expression with the exception of UBE3A.   Following blastocyst injection the formation of DA neurons was studied in the AG and N chimeric fetal brains. TH- and PITX3-positive DA neurons derived from ES AG cells in the midbrain of E12.5 and E16.5 chimeras were detected. These chimeric fetal brains showed a widespread and balanced distribution of AG cells in the brain areas Cortex, Striatum and Hypothalamus. Stereotactic transplantations of AG and N pNPCs in a "Traumatic Brain Injury (TBI) Model" showed that early neural differentiation stages of AG and N pNPC cultures tended to generate teratomas. Importantly, neuronal and glial tumor-free engraftments could be achieved by the transplantation of long-term differentiated AG or N pNPC cultures. The immunohistochemical assessment of the donor cell contribution of individual transplants was performed up to three months post-transplantation. The results presented here show that AG ES cells have DA neuronal differentiation potential, and that long-term differentiated AG and N pNPCs can engraft tumor-free in a brain injury model. In spite of imbalanced imprinted gene expressions my results suggest that AG ES cells could be therapeutically relevant for future cellular replacement strategies of neural tissues. KW - Deutschland / Stammzellgesetz KW - Dopaminerge Nervenzelle KW - Nervenzelle KW - Embryonale Stammzelle KW - Stammzelle KW - Embryonale Stammzelle KW - androgenetisch KW - Differenzierung KW - Imprinting KW - Transplantation KW - embryonic stem cell KW - androgenetic KW - differentiation KW - imprinting KW - transplantation Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48452 ER -