TY - THES A1 - Spitzel, Marlene T1 - The impact of inflammation, hypoxia, and vasculopathy on pain development in the α-galactosidase A mouse model of Morbus Fabry T1 - Der Einfluss von Inflammation, Hypoxie und Vaskulopathie auf die Schmerzentwicklung des Morbus Fabry-spezifischen α-Galaktosidase A Mausmodells N2 - Fabry disease (FD), an X-linked lysosomal storage disorder, is caused by variants in the gene α-galactosidase A (GLA). As a consequence, the encoded homonymous enzyme GLA is not produced in sufficient amount or does not function properly. Subsequently, globotriaosylceradmide (Gb3), the target substrate of GLA, starts accumulating in several cell types, especially neurons and endothelial cells. FD patients suffer from multiorgan symptoms including cardiomyopathy, nephropathy, stroke, and acral burning pain. It is suggested that the impact of pathological Gb3 accumulation, inflammatory and hypoxic processes, and vasculopathy are contributing to the specific FD pain phenotype. Thus, we investigated the role of inflammation, hypoxia, and vasculopathy on molecular level in dorsal root ganglia (DRG) of the GLA knockout (KO) mouse model. Further, we investigated pain-like characteristics of GLA KO mice at baseline (BS), after capsaicin administration, and after repeated enzyme replacement therapy (ERT) administration for a period of 1.5 years. Acquired data showed disturbances in immune response markers represented by downregulated inflammation-associated genes and lower numbers of CD206+ macrophages in DRG of GLA KO mice. Hypoxic mechanisms were active in DRG of GLA KO mice reflected by increased gene expression of hypoxia- and DNA damage-associated targets, higher numbers of hypoxia-inducible factor 1α-positive (HIF1α+) and carbonic anhydrase 9-positive (CA9+) neurons in DRG of GLA KO mice, and DRG neuronal HIF1α cytosolic-nuclear translocation in GLA KO mice. Vascularization in DRG of GLA KO mice was reduced including lower numbers of blood vessel branches and reduced total blood vessel length. Pain-like behavior of the GLA KO mouse model revealed no mechanical hypersensitivity at BS but age-dependent heat hyposensitivity, which developed also age-matched wild type (WT) mice. Capsaicin administration under isoflurane anesthesia did not elicit the development of nocifensive behavior in GLA KO mice after mechanical or heat stimulation. Repeated ERT administration did not show a clear effect in GLA KO mice in terms of restored heat hyposensitivity to BS paw withdrawal latencies. In summary, we demonstrated the impact of disturbed immune response markers, active hypoxic mechanisms, and reduced vascularization on molecular FD pathophysiology. N2 - Morbus Fabry (M. Fabry oder Fabry disease, FD) ist eine X-chromosomal vererbte, lysosomale Speichererkrankung, die durch Varianten im Gen α-Galaktosidase A (GLA) verursacht wird. Das durch GLA kodierte gleichnamige Enzym GLA kann somit nicht in ausreichender Menge produziert werden oder erhält nicht die volle Funktionalität. Als Folge akkumuliert das Glykosphingolipid Globotriaosylceramid (Gb3), welches das Zielsubstrat von GLA ist und durch dieses Enzym normalerweise abgebaut wird. Gb3 Akkumulationen sind in verschiedenen Zelltypen zu finden, jedoch bevorzugt in Neurone und Endothelzellen. FD-Patienten leiden unter Symptome, die verschiedene Organe betreffen, insbesondere Kardiomyopathien, Nephropathien, Schlaganfälle, und brennende Schmerzen in den Extremitäten. Es wird vermutet, dass neben dem pathologischen Einfluss der Gb3 Ablagerungen auch inflammatorische und hypoxische Prozesse und Vaskulopathien zum spezifischen FD-Schmerzphänotyps beitragen. Daher wurde die Rolle der Inflammation, Hypoxie und Vaskulopathie auf molekularer Ebene in Spinalganglien (dorsal root ganglion, DRG) eines FD-spezifischen GLA knockout (KO) Mausmodells untersucht. Des Weiteren wurde der Schmerz-ähnliche Phänotyp in GLA KO Mäusen unter nativen Bedingungen, nach Capsaicingabe und unter Enzymersatztherapie (enzyme replacement therapy, ERT) während einer Dauer von 1,5 Jahren untersucht. Unsere erhobenen Daten zeigten eine Beeinträchtigung von Faktoren der Immunantwort, die sich durch herunterregulierter Genexpression Inflammations-assoziierter Gene und einer geringeren Anzahl an CD206+ Makrophagen in DRG von GLA KO Mäusen nachweisen ließ. Zu aktiven Hypoxiemechanismen trugen eine hochregulierte Genexpression Hypoxie- und DNA-Schäden-assoziierter Gene, eine höhere Anzahl an hypoxia-inducible factor 1α-positiver (HIF1α+) und carbonic anhydrase 9-positiver (CA9+) Neurone in DRG von GLA KO Mäusen, und die DRG neuronale HIF1α Translokation zwischen Zytosol und Nukleus bei. Die Vaskularisierung der DRG in GLA KO Mäusen war reduziert zusätzlich zu der geringeren Anzahl an Blutgefäßverzweigungen und einer Reduzierung der gesamten Blutgefäßlänge. Die Untersuchungen des nativen Schmerz-ähnlichen Verhaltens der GLA KO Mäuse zeigte keine Entwicklung mechanischer Hypersensitivität, während sich eine Hitzehyposensitivität mit steigendem Alter der Tiere entwickelte, die sich auch in altersangepassten Wildtyp (WT) Mäusen zeigte. Eine Capsaicingabe unter Isoflurannarkose zeigte keine erhöhte Sensitivität der GLA KO Mäuse nach mechanischer oder Hitzestimulation. Wiederholte ERT-Gaben zeigten keine Verbesserung der Hitzehyposensitivität auf ein natives Niveau der Pfotenrückzuglatenz. Wir konnten den Einfluss beeinträchtigter Faktoren der Immunantwort, aktiver Hypoxieprozesse und reduzierter Vaskularisierung in DRG von GLA KO Mäusen auf die molekulare FD-Pathophysiologie zeigen. KW - Fabry disease KW - GLA KO mouse model KW - molecular mechanism KW - Fabry-Krankheit KW - Morbus Fabry Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-345794 ER - TY - THES A1 - Hofmann, Lukas T1 - The α-galactosidase A deficient mouse as a model for Fabry disease and the effect of Gb3 depositions on peripheral nociceptive ion channel function T1 - Die α-Galaktosidase A defiziente Maus als Modell für M. Fabry und der Effekt von Gb3-Ablagerungen auf die Funktion von peripheren nozizeptiven Ionenkanälen N2 - Fabry disease (FD) is an X-linked lysosomal storage disorder with intracellular accumulation of globotriaosylceramide (Gb3) due to α-galactosidase A deficiency. We studied α-galactosidase A knockout mice (GLA KO) as a model for sensory disturbance and pain in FD. Pain associated behavior of young (3 months) and old (≥18 months) GLA KO mice and wildtype (WT) littermates in an inflammatory and a neuropathic pain model was investigated. Furthermore, affective and cognitive behavior was assessed in the naïve state and in an inflammatory pain model. Gene and protein expression of pain associated ion channels and Gb3 accumulation in dorsal root ganglion (DRG) neurons was determined. We also performed patch clamp analysis on cultivated DRG neurons and human embryonic kidney 293 (HEK) cells expressing voltage-gated-sodium channel 1.7 (Nav1.7) as an in vitro model of FD. Intracellular Gb3 deposits were modulated using shRNA silencing of α-galactosidase A. After intraplantar injection of complete Freund`s adjuvant (CFA) and chronic constriction injury (CCI) of the right sciatic nerve, old GLA KO mice did not develop heat and mechanical hypersensitivity in contrast to young GLA KO and old WT mice. Additionally, we found no relevant differences between genotypes and age-groups in affective and cognitive behavior in the naïve state and after CFA injection. Gene and protein expression analysis provided no explanation for the observed sensory impairment. However, cultured DRG neurons of old GLA KO mice revealed a marked decrease of sodium and Ih-currents compared to young GLA KO and old WT mice. DRG neurons of old GLA KO mice displayed substantial intracellular accumulation of Gb3 compared to young GLA KO and old WT mice. Similar to cultured neurons, sodium currents were also decreased in HEK cells treated with shRNA and consecutively increased intracellular Gb3 deposits compared to the control condition, but could be rescued by treatment with agalsidase-alpha. Our study unveils that, similar to patients with FD, GLA KO mice display age-dependent sensory deficits. However, contrary to patients, GLA KO mice are also protected from hypersensitivity induced by inflammation and nerve lesion due to Gb3-dependent and reversible reduction of neuronal sodium- and Ih-currents. Our data provide evidence for direct Gb3-dependent ion channel impairment in sensory DRG neurons as a potential contributor to sensory dysfunction and pain in FD. N2 - Bei Morbus Fabry (M. Fabry) handelt es sich um eine X-chromosomal vererbte, lysosomale Speichererkrankung mit intrazellulärer Akkumulation von Globo-triaosylceramid (Gb3) aufgrund eines α-Galaktosidase-A Mangels. Um die Pathophysiologie des M. Fabry aufzuklären, untersuchten wir die α-Galaktosidase-A defiziente Maus (GLA KO) als Modell für sensible Wahrnehmungsstörungen und Schmerz. Das schmerzassoziierte Verhalten von jungen (3 Monate) und alten (≥18 Monate) GLA KO Mäusen und Wildtyp (WT) Wurfgeschwistern wurde in einem Entzündungs- und einem neuropathischen Schmerzmodell untersucht. Zudem wurde das affektive und kognitive Verhalten im naiven Zustand und in einem Entzündungsschmerzmodell betrachtet. Auf molekularer Ebene wurden die Gen- und Proteinexpression von schmerzassoziierten Ionenkanälen und die Gb3-Akkumulation in Spinalganglionneuronen (dorsal root ganglion, DRG) bestimmt. Darüber hinaus wurden kultivierte DRG Neurone und humane embryonale Nierenzellen 293 (HEK) mittels Patch-clamp-Analyse elektrophysiologisch untersucht. Die HEK Zellen dienten als in vitro Modell für M. Fabry und exprimierten stabil den spannungsgesteuerten Natriumkanal 1.7 (Nav1.7). Intrazelluläre Gb3 Ablagerungen wurden unter Verwendung von shRNA-Silencing der α-Galaktosidase A induziert. Nach intraplantarer Injektion von complete Freund‘s Adjuvans (CFA) und chronic constriction injury (CCI) des rechten N. ischiadicus entwickelten alte GLA KO Mäuse, im Gegensatz zu jungen GLA KO und alten WT Mäusen, keine Überempfindlichkeit gegenüber Hitze und mechanischen Reizen. Darüber hinaus fanden wir keine relevanten Unterschiede zwischen Genotypen und Altersgruppen im affektiven und kognitiven Verhalten im naiven Zustand und nach Injektion von CFA. Gen- und Proteinexpressionsanalysen lieferten keine Erklärung für die sensible Beeinträchtigung. Jedoch zeigten kultivierte DRG Neurone von alten GLA KO Mäusen eine deutliche Abnahme der Natriumströme und der Ih Ströme im Vergleich zu jungen GLA KO und alten WT Mäusen. Außerdem wiesen DRG Neurone von alten GLA KO Mäusen eine verstärkte intrazelluläre Akkumulation von Gb3 im Vergleich zu jungen GLA KO und alten WT Mäusen auf. Ähnlich wie bei kultivierten Neuronen waren die Natriumströme in, mit shRNA behandelten HEK-Zellen, im Vergleich zu den Kontrollzellen ebenfalls verringert, konnten aber durch die Behandlung mit Agalsidase-alpha wiederhergestellt werden. Unsere Studie zeigt, dass GLA KO Mäuse ähnlich wie Patienten mit M. Fabry altersabhängige sensible Veränderungen aufweisen. Im Gegensatz zu Patienten sind GLA KO Mäuse jedoch auch vor der Überempfindlichkeit geschützt, die durch eine Entzündung und Nervenläsion hervorgerufen wird. Unsere elektrophysiologischen Ergebnisse jedoch, deuten darauf hin, dass die Reduktion der Natrium- und Ih Ströme mit den veränderten Antworten auf die sensiblen Reize zusammenhängt. Diese Daten lassen auf eine Gb3 abhängige Ionenkanaldysfunktion in DRG Neuronen als potentiellen Faktor für sensible Fehlfunktion und Schmerz bei M. Fabry schließen. KW - Fabry-Krankheit KW - Gb3 accumulation KW - Ion channel function KW - Galactosidase KW - Ionenkanal KW - Maus Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-158513 ER -