TY  - THES
A1  - Raab, Viktoria Maria
T1  - Histologische Charakterisierung Vaccinia-Virus infizierter humaner Tumore im Mausmodell
T1  - Histological charaterization of Vaccinia-Virus infected human tumors in mice
N2  - Onkolytische Viren spielen eine immer bedeutendere Rolle für die Tumorforschung, weil in zahlreichen präklinischen Studien gezeigt werden konnte, dass viral bedingte Onkolyse zu einer Tumorregression führt. Ein äußerst vielversprechender Kandidat der onkolytischen Viren ist das Vaccinia-Virus. In der vorliegenden Arbeit wurde mit dem attenuierten Vaccinia-Virus GLV-1h68 gearbeitet, welches nach systemischer Applikation eine Regression von Tumoren verursacht. Obwohl bereits zahlreiche onkolytische Viren in klinischen Studien Anwendung finden, sind zugrunde liegende Abläufe bei einer Virusinfektion solider Tumore sowie Mechanismen, welche für die Tumorregression verantwortlich sind, immer noch nicht erschlossen. Um Aufschluss über notwendige Parameter für eine effiziente Infektion eines soliden Tumors mit GLV-1h68 zu erlangen, wurden im ersten Teil dieser Arbeit die uninfizierte Tumormikroumgebung sowie stromale Veränderungen in der frühe Phase der Infektion untersucht. Als Tumormodell diente hierbei ein humanes autologes Melanomzellpaar (888-MEL und 1936-MEL). Diese beiden Zelllinien sind Teil einer Reihe von fünf verschiedenen Melanomzelllinien, welche alle aus den widerkehrenden Metastasen eines einzelnen Patienten (Patient 888) isoliert wurden. 888-MEL zeigt nach Virusinfektion mit GLV-1h68 ein regredierendes Verhalten (therapeutischer Index: 88,0) und ist somit respondierend nach GLV-1h68-Infektion. 1936-MEL hingegen zeigte mit einem therapeutischen Index von 13,7 ein nur schwach verlangsamtes Wachstum solider Tumore, und ist somit schwach-respondierend nach GLV-1h68-Infektion. Als ein Grund, weshalb diese beiden autologen Melanomzelllinien unterschiedlich auf GLV-1h68-Infektion reagieren, wurde die Anzahl der Viruspartikel vermutet, welche 1 dpi im soliden Tumor vorliegt. Eine mögliche Korrelation zwischen initialem viralen Titer 1 dpi und späterer Tumorregression konnte experimentell aber nicht nachgewiesen werden. Zwei voneinander unabhängige Experimentreihen zeigten, dass bei identischer systemischer Applikation in den beiden soliden Tumoren kein Unterschied des viralen Titers vorlag. Weiterhin wurden die Komponenten der Tumormikroumgebung und ihr möglicher Einfluss auf die Effizienz der Virusinfektion untersucht. Immunhistologische Studien zeigten, dass es im uninfizierten Zustand bei soliden 888-MEL Tumoren zu einer massiven Infiltration CD45-positiver Zellen kam, die bei 1936-MEL-Tumoren jedoch nicht zu finden war. Die Beobachtung steht in Übereinstimmung mit Ergebnissen einer vergleichenden Microarray-Analyse, die das Infiltrat CD45-positiver Zellen in 888-MEL Tumoren genauer charakterisierte. Es wurde mit Microarray-Analyse eine erhöhte Expression chemotaktischer Moleküle in soliden 888-MEL Tumoren nachgewiesen. Unter anderem wird CCL8 (MCP-2) erhöht exprimiert. Als chemotaktisches Molekül hat CCL8 eine erhöhte Monozyteninfiltration zur Folge. Weiterhin wurde eine erhöhte Expression von MIF (macrophage migration inhibitory factor) und dem entsprechendem Rezeptor CD74 in uninfizierten 888-MEL-Tumoren gemessen. MIF induziert als proinflammatorisches Zytokin die Synthese inflammatorischer Mediatoren. Dies erklärt die Anhäufung CD45-positiver Zellen in der Tumormikroumgebung. Durch eine erhöhte Expression MHC II-verwandter Gene in soliden 888-MEL- Tumoren wurden die CD45-positiven Zellen als Monozyten identifiziert. Um die Funktion der Immunzellen zu analysieren, wurde durch eine intraperitoneale Applikation des Zytostatikums Cyclophosphamid eine Monozytendepletion induziert. Diese Immundepletion resultierte in soliden 888-MEL- Tumoren in einer signifikant verringerten Virusreplikation und -Ausbreitung nach Infektion mit GLV-1h68. Diese Ergebnisse implizieren, dass durch eine erhöhte Infiltration CD45-positiver Zellen in die Tumormikroumgebung die GLV-1h68-Infektion und -Replikation erleichtert wird. Nach Ausbreitung der Infektion kommt es in respondierenden Tumoren nach einem ersten Wachtumsarrest zu einer Tumorregression. Um Aufschluss über den beteiligten Mechanismus bei der Tumorregression zu erlangen, wurden GLV-1h68-infizierte-Tumore in der späten Phase der Infektion untersucht. Drei mögliche Mechanismen viral verursachter Onkolyse wurden beschrieben: Tumorzell-spezifische Onkolyse, Zerstörung der Tumorvaskulatur oder anti-tumorale Immunantwort. Für diese Experimente wurden humane Brustkarzinomzellen als Tumormodell verwendet. Mit diesem Tumormodell sollte analysiert werden, welcher der drei bislang diskutierten Mechanismen bei einer GLV-1h68-Infektion vorlag. Als erstes zeigten histologische Studien, dass Virusinfektion und -Replikation zu ausgedehnten Tumornekrosen führen. Dabei blieben die Blutgefäße in uninfizierten und auch in infizierten Bereichen des Tumors intakt und funktionell aktiv. Systemische Perfusion der Vaskulatur mit Lektin zeigte, dass die Tumorvaskulatur an das periphere Blutgefäßsystem angeschlossen war. Nachfolgende Experimente zeigten, dass Endothelzellen nicht durch die Viren infiziert wurden, wohingegen aber Endothelzell-ummantelnde, Gefäß-stabilisierende Perizyten nur in uninfizierten, nicht aber in infizierten Bereichen des Tumors vorkamen. Perizyten wurden möglicherweise durch Virusinfektion lysiert. Morphologische und funktionelle Analyse der Blutgefäße im Tumor zeigte, dass GLV-1h68-Infektion Hyperpermeabilität, Vasodilatation und eine erhöhte Expression des Adhäsionsmoleküls CD31 verursachte. Eine erhöhte CD31-Expression erleichtert eine Infiltration rekrutierter Immunzellen. Das konnte durch immunhistochemische Färbung von CD45 und MHC II besonders in intratumoralen Bereichen gezeigt werden. Durch Cyclophosphamid-vermittelte Immunsuppression wurde nachgewiesen, dass diese rekrutierten Immunzellen keinen ausschlaggebenden Einfluss auf die Tumorregression haben. Nach Immundepletion in soliden GI-101A-Tumoren konnte eine verstärkte Virusinfektion, effektivere Onkolyse und frühzeitigere Tumorregression nachgewiesen werden. Zusammenfassend zeigten diese Ergebnisse, dass der dominierende Mechanismus, welcher zur Tumorregression führt, die Onkolyse ist.
N2  - Preclinical application of oncolytic viruses to induce virus-mediated tumor rejection revealed promising results in the past few years. Vaccinia virus GLV-1h68, used in this study, was shown to induce complete tumor disappearance upon infection. However the exact underlying mechanisms of viral infection and virus-mediated tumor regression are still not well understood. This study describes the characterization of the early phase of a GLV-1h68 infection and the role of stromal components as well as the mechanisms involved in tumor regression. To address the question, which components are necessary for an effective GLV-1h68 infection, followed by successive rounds of viral replication, the first part of this study focused on the characterization of the early phase of Vaccinia virus infection in a human autologous melanoma system. Five different cell lines were previously generated from a melanoma patient experiencing several reoccurrences in a 12 year span. The melanoma cell line expanded from a metastasis at an early time point (888-MEL) retained responsiveness to GLV-1h68 treatment, while the subsequent cell line 1936-MEL (studied here), became non-responsive to the same treatment. To address the influence of the amount of viral particles homing to the tumor within initial 24 hpi, 888-MEL and 1936-MEL tumors were compared. It could clearly be demonstrated, that the initial homing of viral particles is not the reason for further effective viral replication and spreading. The comparative viral titers were measured in 888-MEL and 1936-MEL tumors 1 dpi and found similar. Immuno-histological comparison of xenografts generated with 888-MEL or 1936-MEL revealed a massive infiltration of CD45-positive cells in 888-MEL tumors, but not in 1936-MEL tumors. Comparative microarray analysis of uninfected 888-MEL and 1936-MEL solid tumors supported these findings. Beside a significant up-regulation of CCL8 in 888-MEL tumors, an increased expression of CD74/MIF suggests an increased monocyte infiltration in 888-MEL uninfected tumors, which is not apparent in 1936-MEL tumors. To gain better understanding of an immune cell infiltration into solid 888-MEL tumors, a monocyte depletion study using the immunosuppressive agent cyclophosphamide (CPA) was carried out. This treatment resulted in a highly significant reduction of viral replication and spreading in 888-MEL tumors following infection with GLV-1h68. These results demonstrated that the replication efficiency of GLV-1h68 is higher in 888-MEL xenografts compared to 1936-MEL. The enhanced replication is in direct correlation with a higher number of CD45-positive cells, which infiltrated the tumor site prior to virus injection. Through successive rounds of viral replication the virus can spread throughout the tumor and induces tumor regression. To gain insights into mechanisms involved in tumor regression, late stages of a GLV-1h68 infection were characterized in human breast tumor xenografts (GI-101A). Theoretically oncolytic virus therapy could be based on three different mechanisms: by tumor cell specific oncolysis, by destruction of the tumor vasculature or by an anti-tumoral immunological response. Here the contribution of the three factors was analyzed. Histological examination showed that viral infection of GI-101A tumors led to broad tumor necrosis. However, the tumor vasculature in infected tumor areas remained functional and endothelial cells were not infected neither in tumors nor in cultured cells. It was further demonstrated, that viral tumor colonization activated the tumor endothelium leading to vascular hyperpermeability, vessel dilatation and an increased expression of the adhesion molecule CD31, which in a next step facilitated infiltration of inflammatory cell. This could be visualized by immunohistochemical staining of MHCII- and CD45-positive cells. The stainings revealed increased intratumoral infiltration of immune cells within infected tumor xenografts. The recruited immune cells however, do not seem to be causative for the tumorregression, since immunosuppression of GLV-1h68-infected animals led to increased viral replication and broader distribution in the tumor tissue, resulting in more efficient oncolysis and earlier start of the tumor regression phase. In summary, these results indicate that GLV-1h68 mediated oncolysis is the primary mechanism of tumor regression. Therefore, enhancing the viral replication and distribution within the tumor microenvironment should lead to improved therapeutic results in preclinical studies and clinical applications.
KW  - Vaccinia-Virus
KW  - Leukozyt
KW  - Allgemeine Entzündungsreaktion
KW  - Immunstimulation
KW  - Immunsuppression
KW  - Vaccinia-Virus
KW  - inflammation
KW  - leukocyte
KW  - innate immunity
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-49024
ER  - 
TY  - THES
A1  - Müller, Nora
T1  - Masern Virus Interferenz mit T-Zell-Aktivierung : Einfluß auf Zytoskelettdynamik, Mobilität und Interaktion mit Dendritischen Zellen
T1  - Measles Virus interference with T cell activation: effect on cytoskeleton dynamics, mobility and interaction with dendritic cell
N2  - Der Kontakt humaner T-Zellen mit dem MV Glykoproteinkomplex interferiert mit der CD3/CD28 stimulierten Aktivierung von PI3/Akt-Kinase Signalwegen. Damit verbunden ist der ineffiziente Transport PH-Domänen-enthaltender Proteine in Membran-rafts, wie der Akt-Kinase und Vav, den Guaninnukleotid-Austauschfaktor von Rho GTPasen. Es konnte gezeigt werden, dass infolge des MV-Kontaktes die CD3/CD28 stimulierte Aktivität der Rho GTPasen Cdc42 und Rac1 inhibiert ist. Dagegen war in MV-behandelten Zellen eine leichte RhoA Aktivierung festzustellen. Rho GTPasen spielen eine kritische Rolle in der Regulation von Zytoskelettorganisation von T-Lymphozyten. Übereinstimmend damit wurde gezeigt, dass der Kontakt mit MV die CD3/CD28 costimulierte Aktivierung und Polymerisation des F-Aktins inhibiert. Damit verbunden ist die reduzierte Fähigkeit MV-behandelter T-Zellen auf Fibronektin- und mit CD3/CD28 Antikörpern-beschichteten Objektträgern zu polarisieren. Die Ausbildung F-Aktin-getriebener morphologischer Veränderungen, wie Filopodien, Lamellipodien und Uropodien, ist drastisch reduziert. Rasterelektronenmikroskopische Auf-nahmen zeigten in nicht-stimulierten und CD3/CD28 costimulierten MV-behandelten T-Zellen einen nahezu kompletten Verlust an Mikrovilli und Lamellipodien. Die Bindung von MV induziert die Dephosphorylierung des F-Aktin–bindenden Proteins Cofilin und der ERM-Proteine. Es konnte demonstriert werden, dass der MV-Kontakt die Ausbildung einer reifen immunologischen Synapse stört. Trotz der morphologischen Veränderungen konjugieren MV-behandelte T-Zellen mit DCs. Die Anzahl MV-behandelter T-Zellen, die mit DCs inter-agieren, ist vergleichbar mit der mock-behandelter T-Zellen. Allerdings zeigt die 3-dimensionale Rekonstruktion der DC/T-Zell-Kontaktzone, dass in MV-behandelten T-Zellen die zentrale Akkumulation und Clusterbildung des CD3-Moleküls gestört ist und keine monozentrische Synapse ausbildet wird. Desweiteren erfolgt die Relokalisation des MTOC in T-Zellen in Richtung der DC unvollständig. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass der MV Glykoproteinkomplex mit essentiellen Schritten einer erfolgreichen T-Zell-Aktivierung während der APC/T-Zell-Interaktion interferiert.
N2  - It was previously shown, that CD3/CD28-induced activation of PI3/Akt kinase pathway and proliferation are impaired in T cells after contact with the MV glycoprotein complex. As a result of PI3 kinase inactivation, membrane recruitment of PH domain containing proteins such as Akt kinase and the Rho GEF Vav, was abolished after CD3/CD28 coligation. The binding of MV interferes with CD3/CD28 coligation induced GTP-loading of the Rho GTPases, Cdc42 and Rac1. GTP-loading of RhoA was not impaired after MV treatment. Rather, RhoA was slightly activated by MV alone and this was enhanced upon CD3/CD28 ligation. Consisting with the failure of CD3/CD28 ligation to induce GTP-loading of Cdc42 and Rac1, polymerization of F-actin and morphological changes required for the formation of a contact plane such relaxation, flattening did not occur in MV treated T cells. MV treatment also efficiently interfered with the ability of T cells to adhere to ECM components. In contrast to mock treated, the majority of MV exposed T cells failed to aquire a polar front-rear organization. Thus, MV induced signaling efficiently impairs stimulation dependent reorganisation of the F-actin cytoskeleton and adhesion in T cells. As revealed by scanning electron microscopy, exposure of T cells to MV induced an almost complete breakdown of microvillar structures which could also not be restored upon CD3/CD28 costimulation. The almost complete collapse of membrane protrusions in MV treated cells was associated with reduced phosphorylation levels of cofilin and ERM proteins. The ability of MV exposed T cells to interact with DCs and form DC/T-cells conjugates is not affected. MV signaling to T cells interfered with clustering and recruitment of CD3 into the central supramolecular activation cluster of the IS. MV also prevents the redistribution of the MTOC in T cells towards the synapse. In summary, MV interferes with stimulated cytoskeleton remodeling, and this disturbes the ability of T cells to adhere, spread and cluster receptors essential for sustained activation. The signal given by the MV glycoprotein complex apparently prevents essential steps in APC/T cells interactions which are required for migration and successful activation.
KW  - Masernvirus
KW  - T-Lymphozyt
KW  - Immunsuppression
KW  - Zellskelett
KW  - Dendritische Zelle
KW  - Masern Virus
KW  - Immunsuppression
KW  - Costimulation
KW  - Zytoskelett
KW  - Dendritische Zellen
KW  - measles virus
KW  - immunosuppression
KW  - costimulation
KW  - cytoskeleton
KW  - dendritic cells
Y1  - 2006
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17953
ER  -