TY - THES A1 - Bergner, Annina T1 - Charakterisierung der Mikrostruktur und der Permeationseigenschaften von Polysiloxan-Netzwerken T1 - Permeation Properties of Polysiloxane Networks N2 - Ziel dieser Arbeit war es, die Permeationseigenschaften von Polysiloxan-Membranen im Hinblick auf ihre definierte Mikrostruktur näher zu analysieren. Es konnte gezeigt werden, dass die Mikrostruktur der Membranen einen statistisch signifikanten Einfluss auf die Permeationsgeschwindigkeit der untersuchten Substanzen hat. Zum besseren Verständnis der Permeation wurden auch die Diffusionsvorgänge innerhalb der Membran untersucht. Durch den Einsatz der Konfokalen Raman-Spektroskopie ist es gelungen, den Aufbau eines Konzentrationsgradienten innerhalb der Membran zu zeigen. Weiterhin konnte der Einfluss der Mikrostruktur der Membranen auf die Geschwindigkeit des Aufbaus dieses Gradienten nachgewiesen werden. N2 - It was the aim of this project to find out how the permeability of a given molecule through a polysiloxane membrane with defined microstructure is determined by its physico-chemical properties. It turned out that the network chain length takes a statistically significant influence on the permeability of the tested compounds. Confocal Raman-spectroscopy was taken as a pioneering method to investigate the kinetics of diffusion within a membrane before the steady state has been reached. It was able to show the formation of the concentration gradient of ß-carotene in polysiloxane membranes. Additionally the influence of the microstructure before reaching steady state conditions could be observed. KW - Siloxane KW - Membran KW - Permeabilität KW - Raman-Spektroskopie KW - Konfokale Mikroskopie KW - Polysiloxan-Membranen KW - Diffusion KW - Therapeutische Systeme KW - Konfokale Raman-Spektroskopie KW - Polysiloxane-Membranes KW - Diffusion KW - Therapeutic Systems KW - Confocal Raman-Spectroscopy Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-13302 ER - TY - THES A1 - Kleefeldt, Florian T1 - Einfluss von CEACAM1 auf die endotheliale Funktion T1 - Influence of CEACAM1 on endothelial function N2 - Dem Endothel, welches die luminale Oberfläche aller Blutgefäße auskleidet, kommt eine wichtige Barrierefunktion zwischen Blut und Gewebe zu. Nur durch eine bedarfsgerechte Justierung dieser Barriere, die den Durchtritt von Molekülen und Zellen reguliert, kann die Gewebehomöostase aufrechterhalten werden. Dabei ist das Endothel nicht nur passive Barriere, sondern auch an dieser dynamischen Regulation aktiv beteiligt. Störungen oder Fehlregulationen dieser Prozesse führen zu Pathologien, z.B. Arteriosklerose. Es ist seit längerem bekannt, dass Carcinoembryonic antigen–related cell adhesion molecule-1 (CEACAM1), ein Mitglied der Immunglobulin-Superfamilie, die Bildung und Morphogenese neuer Blutgefäße beeinflusst. Die spontane Entwicklung kleiner Arteriosklerose-ähnlicher Läsionen in CEACAM1 knockout (Cc1-/-) Mäusen zeigt, dass CEACAM1 auch für die Homöostase ausgereifter Blutgefäße von Bedeutung ist. Ziel dieser Dissertationsarbeit war daher, den Einfluss von CEACAM1 auf wesentliche Aspekte der Endothelfunktion in Aorten in situ bzw. in Endothelzellkulturen in vitro zu analysieren. Es konnte zunächst gezeigt werden, dass CEACAM1-defiziente Endothelzellen im Vergleich zu Wildtyp (WT) Endothelzellen eine rundlichere Zellmorphologie mit meanderförmigen Zellgrenzen und interzellulären Lücken aufweisen. Diese morphologischen Unterschiede stimmen mit Befunden in situ an Aorten von WT und Cc1-/- Mäusen überein. Weiterhin wurde eine Translokation der endothelialen NO-Synthase (eNOS) von der Zellmembran in den peri-nukleären Bereich bei CEACAM1-Defizienz festgestellt. Die erhobenen Daten bieten zwei mögliche Erklärungen dafür. Einerseits könnte CEACAM1 durch Interaktion mit eNOS als Membrananker fungieren. Daneben wiesen CEACAM1-defiziente Endothelzellen eine erhöhte Expression des Enzyms APT1 auf, welches eNOS depalmitoyliert. Die daraus resultierende, ebenfalls nachgewiesene geringere Palmitoylierung könnte auch zur verminderten Membran-lokalisation von eNOS beitragen. Zur endothelialen Funktion gehört, die Adhäsion von Blutzellen an die Gefäßwand weitestgehend zu beschränken. CEACAM1-defiziente Endothelzellen zeigten im Vergleich zu WT Endothelzellen eine verstärkte Adhäsivität gegenüber murinen und humanen Monozyten. Ähnliche Unterschiede wurden für Aortenexplantate aus WT und Cc1-/- Mäusen festgestellt. Dies ist einerseits mit einer verstärkten Expression des Zelladhäsionsmoleküls ICAM-1 bei CEACAM1-Defizienz erklärbar. Darüber hinaus vermittelt die Glykokalyx anti-adhäsive Eigenschaften. Aus Vorbefunden war bekannt, dass die endotheliale Glykokalyx in der Aorta von Cc1-/- Mäuse reduziert ist. Im Rahmen dieser Arbeit konnte dies auf eine verstärkte Expression der Glykokalyx-degradierenden Enzyme MMP9, Chondroitinase sowie Hyaluronidase-2 in Cc1-/- Endothelzellen zurückgeführt werden. Eine erhöhte Permeabilität stellt einen Indikator für ein dysfunktionales Endothel, eines der initialen Schritte in der Pathogenese der Arteriosklerose, dar. Zur Analyse der aortalen Permeabilität wurde ein modifizierter Miles-Assay etabliert. Unter Verwendung etablierter muriner Arteriosklerosemodelle konnte gezeigt werden, dass dieser Assay eine Störung der vaskulären Permeabilität bereits vor Auftreten makroskopischer Veränderungen zuverlässig detektiert. Im Rahmen der folgenden Analysen an WT und Cc1-/- Mäusen zeigte sich ein altersabhängiger Effekt von CEACAM1 auf die Gefäßpermeabilität: Aorten von 3 Monate alten Cc1-/- Mäuse wiesen eine im Vergleich zum WT erhöhte Gefäßpermeabilität auf, welche wahrscheinlich Folge einer verzögerten Gefäßreifung ist. Im Alter von 9 Monaten zeigte sich dagegen ein entgegengesetztes Bild. Dies wurde auf eine verstärkte Expression des die Barriere schädigenden Inflammationsmediators TNF-α in 9 Monate alten WT Mäusen zurückgeführt. Außerdem modulierte CEACAM1 die TNF-α-vermittelte Lockerung der endothelialen Barriere, indem es die Phosphorylierung von Adherens Junction Proteinen beeinflusste. Basal stabilisierte CEACAM1 die endotheliale Barriere durch Hemmung der Phosphorylierung von Caveolin-1, welches Adherens Junctions destabilisiert. Unter Einfluss von TNF-α war CEACAM1 verstärkt im Bereich von Adherens Junctions lokalisiert und rekrutierte dort Src-Kinase. Src-Kinase wiederum destabilisierte Adherens Junctions durch Phosphorylierung von β-Catenin, was in verstärkter Gefäßpermeabilität resultierte. Dagegen führte TNF-α in CEACAM1-defizienten Endothelzellen zu einer Dephosphorylierung von Caveolin-1 und β-Catenin, wodurch Adherens Junctions und damit die endotheliale Barriere stabilisiert wurden. Diese CEACAM1-abhängige differenzielle Regulation der Stabilität von Adherens Junctions unter TNF-α trägt wahrscheinlich maßgeblich zu den Unterschieden der vaskulären Permeabilität in 3 bzw. 9 Monate alten WT und Cc1-/- Mäusen bei. Zusammenfassend konnte im Rahmen dieser Arbeit nachgewiesen werden, dass CEACAM1 zentrale Funktionen des Endothels und hierüber die Homöostase reifer Gefäße beeinflusst. Da eine Expression von CEACAM1 auch in arteriosklerotischen Plaques nachgewiesen werden konnte, soll in weiteren Untersuchungen auch der Beitrag von CEACAM1 zur arteriosklerotischen Plaquebildung analysiert werden. N2 - The endothelium forms the inner surface of blood vessels and therefore is critically involved in forming a barrier between the intraluminal blood and the surrounding tissue. Adequate regulation of this barrier regarding extravasation of molecules and cells is mandatory to maintain tissue homeostasis. Thereby the endothelium is not only a passive barrier but regulates barrier function in an active and dynamic manner. Malfunction and dysregulation of these processes promote pathologies, i.e. atherosclerosis. It is known, that Carcinoembryonic antigen–related cell adhesion molecule-1 (CEACAM1), a member of the immunoglobulin superfamily, modulates the formation and morphogenesis of new blood vessels. In addition, spontaneous development of small atherosclerosis-like lesions within the aorta of CEACAM1-deficient (Cc1-/-) mice indicates the involvement of CEACAM1 in homeostasis of mature blood vessels. Therefore, the aim of this study was to analyze the effect of CEACAM1 on central aspects of endothelial function in situ (aortic tissue) and in vitro (endothelial cell cultures). First it was shown, that CEACAM1-deficient endothelial cells display a rather round cellular morphology with meandering cell boundaries and inter-cellular gaps compared to CEACAM1-expressing cells. These morphologic differences are in agreement with in situ observations in WT and Cc1-/- mice. Furthermore, CEACAM1 deficiency resulted in translocation of endothelial NO-Synthase (eNOS) from the cell membrane towards the peri-nuclear compartment within endothelial cells. Analysis of the underlying mechanisms suggests two scenarios. On the one hand, CEACAM1 might serve as a membrane anchor due to physical interaction with eNOS. On the other hand, expression of the de-palmitoylating enzyme APT1 is upregulated and eNOS palmitoylation is reduced in CEACAM1-deficient endothelial cells. This might also contribute to its reduced location at the cell membrane. Under physiological conditions the endothelium limits adhesion of blood cells to the vascular wall. However, adhesion of murine and human monocytes to cultured endothelial cells was increased when endothelial CEACAM1 was absent. Similar results were obtained using aortic explants of WT and Cc1-/- mice. This was attributed to the increased expression of cell adhesion molecule ICAM-1 in Cc1-/- endothelial cells. Furthermore, the glycocalyx of endothelial cells greatly contributes to anti- adhesive properties. Based on preliminary results which showed a reduced endothelial glycocalyx in aortae from Cc1-/- mice compared to WT mice, we found a higher expression of the glycocalyx-degrading enzymes MMP-9, chondroitinase and hyaluronidase-2 in Cc1-/- compared to WT endothelial cells. Enhanced vascular permeability indicates a dysfunctional endothelium, which is the initial step in the pathogenesis of atherosclerosis. To analyze aortic permeability a modified Miles-assay was established. Using well-characterized murine atherosclerosis models, it was shown that this assay reliably detects alterations in vascular permeability prior to macroscopically visible morphological alterations. CEACAM1 had an age-dependent effect on vascular permeability: aortae from 3 months old Cc1-/- mice showed increased vascular permeability for Evans blue compared to aortae from age-matched WT mice most likely due to delayed vascular maturation. Interestingly, this situation was completely reversed at the age of 9 months. This was attributed to enhanced aortic expression of the permeability promoting inflammatory mediator TNF-α in 9 month old WT mice compared to age-matched Cc1-/- mice. Moreover, CEACAM1 modulated the TNF-α-dependent increase in vascular permeability by affecting adherens junction phosphorylation. Under basal conditions CEACAM1 stabilizes endothelial barrier by inhibition of caveolin-1 phosphorylation known to destabilize adherens junctions. In the presence of TNF-α, CEACAM1 translocate to endothelial adherens junctions and recruits Src kinase which destabilizes adherens junctions by phosphorylation of β-catenin resulting in enhanced vascular permeability. In contrast, in CEACAM1-deficient endothelial cells TNF-α promotes dephosphorylation of caveolin-1 and β-catenin thus stabilizing adherens junction complexes and endothelial barrier. This CEACAM1-dependent differential regulation of adherens junction complex stability presumably contributes substantially to the differences in vascular permeability observed in WT and Cc1-/- mice at the age of 3 and 9 months, respectively. In summary, this study shows that CEACAM1 influences central aspects of endothelial functions and thereby affects homeostasis of mature blood vessels. Since expression of CEACAM1 was observed in endothelium covering atherosclerotic plaques, further studies will investigate the contribution of CEACAM1 to atherosclerotic plaque formation. KW - Endothel KW - Permeabilität Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-201726 ER - TY - THES A1 - Lang, Florian T1 - Analyse des Einflusses ausgewählter Polyphenole auf Funktionalität und Genexpression von p-Glykoprotein im CaCo-II-Zellkulturmodell T1 - Analysis of the influence of selected polyphenols on functionality and gene expression of P-glycoprotein in Caco-2 cell culture model N2 - Die Permeabilität von Substanzen über Biomembranen erfolgt auf Basis ihrer Größe und Lipophilie, wird jedoch auch zu einem großen Anteil vom aktiven Transport bestimmt. Speziell im menschlichen Verdauungstrakt ist dieser Transportmechanismus neben seinen essentiellen physiologischen Aufgaben, wie den Transport von Nährstoffen, an einer Resistenz gegen exogene Stoffe und Xenobiotika beteiligt, der die Aufnahme in den Organismus über einen Rücktransport in das Darmlumen limitiert. Dabei hat die membranständige Effluxpumpe p-Glykoprotein (p-GP) als ein Baustein dieses Schutzmechanismus auch einen großen Einfluss auf die Arzneimitteltherapie. Über eine Modulierung der Pharmakokinetik von Arzneistoffen beschränkt sie die Aufnahme von Medikamenten und senkt dadurch deren Bioverfügbarkeit. Es wird auch für pflanzliche Inhaltsstoffe aus der Gruppe der Polyphenole ein möglicher Einfluss auf dieses Transportprotein diskutiert. Diese Beeinflussung kann sich entweder in einer Induktion oder einer Inhibition des Proteins äußern, was positive wie negative Effekte haben kann. Eine Hemmung des Transportproteins führt zu einer erhöhten Aufnahme einiger Arzneistoffe, die mit einer erhöhten Bioverfügbarkeit und einer potentiellen Dosissenkung einhergeht. Induziert man p-GP dagegen, so wird es beispielsweise ermöglicht, potentiell schädliche Xenobiotika noch intensiver auszuscheiden und nachteilige Plasmaspiegel zu verhindern. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte daher der Einfluss ausgewählter Polyphenole auf die Funktionalität und die Genexpression im CaCo-II-Zellkulturmodell näher untersucht, sowie vorab charakteristische Eigenschaften der pflanzlichen Inhaltsstoffe - Taxifolin, Silibinin, M1, Urolithin A, Urolithin B, Urolithin C, Isourolithin A, racemisches Hydnocarpin D, (+)-Hydnocarpin D, (-)-Hydnocarpin D - vergleichend bestimmt werden. Diese stoffspezifischen Charakteristika umfassten die Zytotoxizität, die Stabilität und die antioxidative Kapazität. Vor allem die Zytotoxizität und die Stabilität sind essentielle Parameter für aussagekräftige Resultate. Die Substanzen waren in der eingesetzten Konzentration von 50 µM mehrheitlich, mit Ausnahme des Hydnocarpins D, nicht-toxisch innerhalb der relevanten Versuchszeiträume, 4 h und 24 h, und den verwendeten Kulturmedien, DMEM-Pest und HBSS. Vor allem im Hinblick auf die Genexpressionsversuche war es die Basis für valide Ergebnisse, den Zeitraum bis 24 h als nicht-toxisch sicherstellen zu können. Hinsichtlich der Stabilität waren nur Taxifolin (27 % Restkonzentration) und der M1 (0 % Restkonzentration) nach 24 h in Zellkulturmedium kritisch. Auf Basis ihrer antioxidativen Kapazität werden pflanzlichen Inhaltsstoffen eine Reihe von gesundheitsförderlichen Merkmalen nachgesagt, weswegen dieser Aspekt für die Testsubstanzen zusätzlich vergleichend evaluiert wurde. Der Eintritt von Pathogenen kann Zusammenfassung 377 zum Beispiel durch oxidative Schädigung des Darmepithels erleichtert werden, was zusätzlich zu einem Effekt auf p-GP durch die Polyphenole unter Umständen positiv beeinflusst werden kann. Taxifolin, der M1 sowie die Urolithine A und C konnten so als antioxidativ aktive Stoffe erstmals vergleichend analysiert und die Resultate sinnvoll zu bestehenden Daten in Relation gesetzt werden. Sie konnten nach antioxidativer Potenz in der Reihenfolge Urolithin C > M1 > Taxifolin > Urolithin A geordnet werden. Zur Analyse des Einflusses der ausgewählten Polyphenole auf die Funktionalität von p-GP sollten Transportversuche über einen CaCo-II-Monolayer mit Rhodamin 123 als Markersubstanz durchgeführt werden. Diese Untersuchungen benötigen typischerweise eine vorbereitende Kulturzeit der Zellen von insgesamt drei Wochen, sodass sich eine Verkürzung dieser Zeitspanne aus Zeitersparnis- und Kostengründen positiv auf den Durchsatz der Versuche auswirken würde. In einem umfassenden Ansatz mit kombinierter Bestimmung der Qualifizierung der Zellschichten im Hinblick auf Qualität des Monolayers (TEER-Messung, Lucifer-Yellow-Transportrate, Fluoreszenzfärbung der Tight-junctions) sowie der Funktionalität und Expression von p-GP gelang der Nachweis, dass 14 Tage hinreichend und sinnvoll waren. Zentraler Bestandteil war in der vorliegenden Arbeit die Identifizierung der Effekte der Urolithine auf sowohl p-GP direkt, als auch auf die Genexpression dieses Transportproteins. Diese Polyphenole werden im menschlichen Verdauungstrakt über einen bakteriellen Metabolismus aus Ellagtanninen und Ellagsäure hergestellt und sind aufgrund ihrer vielfältigen gesundheitsförderlichen Charakteristiken in der Forschung von steigendem Interesse. Hierfür konnten nach unserem Kenntnisstand mit den gewählten Versuchsansätzen neue Erkenntnisse gewonnen werden. In den Transportversuchen mit Rhodamin 123 als Modellsubstrat von p-GP konnten die Urolithine den p-GP-vermittelten Transport positiv beeinflussen. Die Urolithine B (Papp-Ratio 1,98), C (Papp-Ratio 2,15) und das Isourolithin A (Papp-Ratio 1,63) steigerten den Rhodamintransport signifikant und lediglich für Urolithin A (Papp-Ratio 1,45) konnte keine Signifikanz belegt werden. Der Einfluss der Urolithine lag jeweils im Bereich des Modellinduktors Dexamethason. Ebenso konnte eine positive Modulierung der Genexpression nach 24 h detektiert werden. Die Hochregulierungen durch die Urolithine A (zwei- bis dreifach), B (1,4-fach) und C (1,8-fach) waren konsistent und statistisch signifikant. Urolithin A konnte hierbei als potentester Induktor charakterisiert werden, wohingegen sein Isomer Isourolithin A keinerlei signifikante Beeinflussung der Expression zeigte. In diesen Inkubationsversuchen wurde die Eigenschaft zur Erhöhung der Genexpression über den Einfluss auf den p-GP-vermittelten Rhodamintransport bestätigt. Die Urolithine A, B, C und Isourolithin A konnten nach einer Vorinkubation über 24 h und 48 h auch den Transport von Rhodamin 123 nochmals signifikanter zu den klassischen E Zusammenfassung 378 Transportversuchen ohne Vorinkubation steigern. Relevanz hierfür hatte der erste Zeitraum über 24 h, da hier ein deutlicher Anstieg der Rhodamintransportrate zu erkennen war. Nach 48 h stieg der Rhodamintransport nur noch geringfügig an oder ging sogar leicht zurück (Urolithin B). Hinsichtlich der Genexpression konnte nach 48 h nur noch Urolithin C p-GP signifikant hochregulieren, allerdings sind diese Erkenntnisse auf Basis der Zytotoxizität der Substanzen über diesen Zeitraum kritisch zu betrachten. In der Analyse des Effektes der weiteren Polyphenole auf die Genexpression von p-GP konnten für die meisten Stoffe nur zufällige Zusammenhänge hinsichtlich Hoch- und Herunterregulierung bestimmt werden. In den Transportversuchen konnte jedoch (+)-Hydnocarpin (Papp-Ratio 0,48) den Transport in gleichem Ausmaß wie der Modellinhibitor Verapamil (Papp-Ratio 0,48) hemmen. Durch Modifizierung des Versuchsmediums zur Annäherung an physiologischeren Bedingungen (Gallensäuren, pH 6) konnte für manche Substanzen ein deutlich verändertes Verhalten beobachtet werden. Die Rhodamintransportrate nahm unter Einfluss von Urolithin B, Isourolithin A und dem M1 signifikant nun ab und bei Urolithin C signifikant zu. Dies legt nahe, dass mit dem klassischen Transportversuchsmodell lediglich Tendenzen für die Substanzen bestimmt werden können. Weitere Untersuchungen näher an der Physiologie des Verdauungstraktes sind nötig, um ein genaueres Bild des Stoffeinflusses zu gewinnen. Die Frage nach zeitlichem Einsetzen beziehungsweise der Kontinuität des Effektes auf p� GP konnte mit den Urolithinen A, B und C sowie Dexamethason geklärt werden. Eine Substanzexposition von lediglich fünf Minuten war nicht ausreichend, um in den nachfolgenden zwei Stunden einen Effekt zu beobachten. Dies legt eine Reversibilität der zugrundeliegenden Mechanismen und eine notwendige dauerhafte Anwesenheit der Substanzen über die Versuchszeit nahe. Neben Rhodamin 123 wurden noch Transportversuche mit dem Fluorchinolonantibiotikum Ciprofloxacin als Modellsubstanz durchgeführt, da es aufgrund dessen Substratcharakters für p-GP von therapeutischer Relevanz sein kann, wenn das Transportverhalten durch Polyphenole beeinflusst wird. Im Gegensatz zu Rhodamin 123 wurde der Transport von Ciprofloxacin durch die vier Urolithine verringert, was für diese Metabolismusprodukte eine zusätzliche Wirkung auf weitere Transportproteine nahelegt, weil Ciprofloxacin unter anderem auch über BRCP transportiert wird. Mittels des bakteriellen Endotoxins LPS konnte eine Schädigung des CaCo-II-Monolayers erzeugt werden, welche sich über erniedrigte TEER-Werte und einen erhöhten Rhodamintransport nachweisen ließ. Eine Vorinkubation der vier Urolithine war nicht in der Lage, diese Schädigung abzumildern, jedoch nicht komplett zu verhindern. Die TEER- Zusammenfassung 379 Werte konnten zwar wieder etwas gesteigert werden, jedoch maskierte die starke Stimulation dieser Pflanzenstoffe auf p-GP und den damit verbundenen Transport von Rhodamin 123 mögliche positive Effekte auf diese oxidative Stresssituation. Zusammenfassend war es mit der vorliegenden Arbeit erstmals durch systematische vergleichende Untersuchung und Kombination von Charakterisierungsansätzen möglich, eine deutliche Beeinflussung der Genexpression und Funktionalität des p-Glykoproteins durch vor allem die Urolithine aufzuzeigen, was eine Relevanz sowohl des Mikrobioms als auch der Ernährung in der Arzneimitteltherapie nahelegt. Zudem gelang es den klassischen Transportassay durch Verkürzung um eine Woche zu verbessern. N2 - The permeability of substances across biomembranes is dependent on their size and lipophilicity, but is also determined to a large extent by active transport. This transport mechanism is involved in resistance to exogenous substances in the human digestive tract. It limits absorption into the organism via a reverse transport into the intestinal lumen. In addition, there are some essential physiological functions, such as the transport of nutrients. In this context, the membrane-bound efflux pump P-glycoprotein (P-gp), as a part of this protective mechanism, also has a major influence on drug therapy. The uptake of drugs is limited and their bioavailability is reduced by modulating the pharmacokinetics. Herbal compounds from the class of polyphenols are discussed to potentially influence this transport. This influence can present itself either in an induction or an inhibition of the protein. Inhibition of the transport protein leads to increased uptake of some drugs, which is associated with increased bioavailability and a potential dose reduction. Inducing P-gp support, excreting potentially harmful xenobiotics and to prevent toxic plasma levels, for example. In the context of the present study, the influence of selected polyphenols on the functionality and gene expression in the CaCo-II cell culture model was to be investigated. Characteristic properties of plant derived compounds - taxifolin, silibinin, M1, urolithin A, urolithin B, urolithin C, isourolithin A, racemic hydnocarpin D, (+)-hydnocarpin D, (-)-hydnocarpin D - were be determined comparatively. The substance-specific characteristics included cytotoxicity, stability and antioxidant capacity. Cytotoxicity and stability are essential prerequisites for meaningful results. With the exception of hydnocarpine D, the compounds were mostly non-toxic within the relevant experimental periods, 4 h and 24 h, and the culture media used, DMEM-Pest and HBSS. The basis for valid results in the gene expression experiments were non-toxic effects over 24 h. In the stability experiments, only taxifolin (27 % residual concentration) and M1 (0 % residual concentration) were critically unstable after 24 h in cell culture medium. Plant constituents are discussed to have a number of health-promoting characteristics based on their antioxidant capacity. An entry of pathogens is facilitated by oxidative damage at the intestinal epithelium, which can possibly be influenced by polyphenols in addition to an effect on P-gp. Taxifolin, M1 and urolithins A and C were analysed indirect comparison for the first time. They were active as antioxidants and the results were consistent with existing data. Their antioxidant potency ranked in the order urolithin C > M1 > taxifolin > urolithin A. Transport experiments via a CaCo-II monolayer with rhodamine 123 as marker substance were to be performed to analyse the influence of the selected polyphenols on the functionality of P-gp. These investigations typically require a preparatory culture time of the cells of three weeks. A reduction of this period would have a positive effect on the throughput and costs of the experiments. In a comprehensive approach with combined determination of the qualification of the cell layers with regard to the quality of the monolayer (TEER measurement, Lucifer yellow transport rate, fluorescence staining of the tight junctions) as well as the functionality and expression of P-gp, it was possible to prove that 14 days of culture time was sufficient and reasonable. A central component of the present work was the identification of the effects of urolithins on the functionality and on the gene expression of P-gp. Urolithins are produced in the human digestive tract via a bacterial metabolism from ellagtannins and ellagic acid and are of increasing interest in research due to their diverse health-promoting characteristics. To the best of our knowledge, new insights were gained with the selected experimental approaches. In transport experiments with rhodamine 123 as a model substrate of P-gp, the urolithins enhanced the P-gp-mediated transport. Urolithins B (Papp ratio 1.98), C (Papp ratio 2.15) and isourolithin A (Papp ratio 1.63) significantly increased rhodamine transport. Only urolithin A (Papp ratio 1.45) failed to show significant effects. The influence of the urolithins was in the range of the model inducer dexamethasone. A positive modulation of gene expression after 24 h was also detected. The upregulations by urolithins A (two- to threefold), B (1.4-fold) and C (1.8-fold) were consistent and statistically significant. Urolithin A was characterised as the most potent inducer, whereas its isomer isourolithin A showed no significant effect on expression. The increase of gene expression was confirmed via the influence on P-gp-mediated rhodamine transport. After a pre-incubation period of 24 h and 48 h, the urolithins A, B, C and isourolithin A also increased the transport of rhodamine 123 even more significantly than in the classical transport experiments without pre-incubation. The first period over 24 h was relevant, as a clear increase in the rhodamine transport rate was seen. After 48 h, the rhodamine transport further increased only slightly or even slightly decreased (urolithin B). Only urolithin C significantly upregulated the gene expression of p-GP after 48 h. However, these findings must be viewed critically on the basis of the cytotoxicity of the substances over this period. In the analysis of the effect of the other polyphenols on the gene expression of P-gp, only random correlations with regard to up- and down-regulation were determined for most compounds. (+)-Hydnocarpine (Papp ratio 0.48) was able to inhibit transport to the same extent as the model inhibitor verapamil (Papp ratio 0.48). KW - p-Glykoprotein KW - Flavonoide KW - Zellkultur KW - Polyphenol KW - p-Glykoprotein KW - CaCo-II-Zellen KW - Permeabilität Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-251866 ER - TY - THES A1 - Merget, Benjamin T1 - Computational methods for assessing drug-target residence times in bacterial enoyl-ACP reductases and predicting small-molecule permeability for the \(Mycobacterium\) \(tuberculosis\) cell wall T1 - Computermethoden zur Bestimmung von Protein-Ligand Verweilzeiten in bakteriellen Enoyl-ACP Reduktasen und Vorhersage der Permeabilitätswahrscheinlichkeit kleiner Moleküle gegenüber der \(Mycobacterium\) \(tuberculosis\) Zellwand N2 - \textbf{Molecular Determinants of Drug-Target Residence Times of Bacterial Enoyl-ACP Reductases.} Whereas optimization processes of early drug discovery campaigns are often affinity-driven, the drug-target residence time $t_R$ should also be considered due to an often strong correlation with \textit{in vivo} efficacy of compounds. However, rational optimization of $t_R$ is not straightforward and generally hampered by the lack of structural information about the transition states of ligand association and dissociation. The enoyl-ACP reductase FabI of the fatty acid synthesis (FAS) type II is an important drug-target in antibiotic research. InhA is the FabI enzyme of \textit{Mycobacterium tuberculosis}, which is known to be inhibited by various compound classes. Slow-onset inhibition of InhA is assumed to be associated with the ordering of the most flexible protein region, the substrate binding loop (SBL). Diphenylethers are one class of InhA inhibitors that can promote such SBL ordering, resulting in long drug-target residence times. Although these inhibitors are energetically and kinetically well characterized, it is still unclear how the structural features of a ligand affect $t_R$. Using classical molecular dynamics (MD) simulations, recurring conformational families of InhA protein-ligand complexes were detected and structural determinants of drug-target residence time of diphenyl\-ethers with different kinetic profiles were described. This information was used to deduce guidelines for efficacy improvement of InhA inhibitors, including 5'-substitution on the diphenylether B-ring. The validity of this suggestion was then analyzed by means of MD simulations. Moreover, Steered MD (SMD) simulations were employed to analyze ligand dissociation of diphenylethers from the FabI enzyme of \textit{Staphylococcus aureus}. This approach resulted in a very accurate and quantitative linear regression model of the experimental $ln(t_R)$ of these inhibitors as a function of the calculated maximum free energy change of induced ligand extraction. This model can be used to predict the residence times of new potential inhibitors from crystal structures or valid docking poses. Since correct structural characterization of the intermediate enzyme-inhibitor state (EI) and the final state (EI*) of two-step slow-onset inhibition is crucial for rational residence time optimization, the current view of the EI and EI* states of InhA was revisited by means of crystal structure analysis, MD and SMD simulations. Overall, the analyses affirmed that the EI* state is a conformation resembling the 2X23 crystal structure (with slow-onset inhibitor \textbf{PT70}), whereas a twist of residues Ile202 and Val203 with a further opened helix $\alpha 6$ corresponds to the EI state. Furthermore, MD simulations emphasized the influence of close contacts to symmetry mates in the SBL region on SBL stability, underlined by the observation that an MD simulation of \textbf{PT155} chain A with chain B' of a symmetry mate in close proximity of the SBL region showed significantly more stable loops, than a simulation of the tetrameric assembly. Closing Part I, SMD simulations were employed which allow the delimitation of slow-onset InhA inhibitors from rapid reversible ligands. \textbf{Prediction of \textit{Mycobacterium tuberculosis} Cell Wall Permeability.} The cell wall of \textit{M. tuberculosis} hampers antimycobacterial drug design due to its unique composition, providing intrinsic antibiotic resistance against lipophilic and hydrophilic compounds. To assess the druggability space of this pathogen, a large-scale data mining endeavor was conducted, based on multivariate statistical analysis of differences in the physico-chemical composition of a normally distributed drug-like chemical space and a database of antimycobacterial--and thus very likely permeable--compounds. The approach resulted in the logistic regression model MycPermCheck, which is able to predict the permeability probability of small organic molecules based on their physico-chemical properties. Evaluation of MycPermCheck suggests a high predictive power. The model was implemented as a freely accessible online service and as a local stand-alone command-line version. Methodologies and findings from both parts of this thesis were combined to conduct a virtual screening for antimycobacterial substances. MycPermCheck was employed to screen the chemical permeability space of \textit{M. tuberculosis} from the entire ZINC12 drug-like database. After subsequent filtering steps regarding ADMET properties, InhA was chosen as an exemplary target. Docking to InhA led to a principal hit compound, which was further optimized. The quality of the interaction of selected derivatives with InhA was subsequently evaluated using MD and SMD simulations in terms of protein and ligand stability, as well as maximum free energy change of induced ligand egress. The results of the presented computational experiments suggest that compounds with an indole-3-acethydrazide scaffold might constitute a novel class of InhA inhibitors, worthwhile of further investigation. N2 - \textbf{Molekulare Determinanten von Wirkstoff-Angriffsziel Verweilzeiten bakterieller Enoyl-ACP Reduktasen.} In frühen Phasen der Wirkstoffentwicklung sind Optimierungsprozesse häufig affini\-täts\-geleitet. Darüber hinaus sollte zusätzlich die Wirkstoff-Angriffsziel Verweilzeit $t_R$ berücksichtigt werden, da diese oft eine starke Korrelation zur \textit{in vivo} Wirksamkeit der Substanzen aufweist. Rationale Optimierung von $t_R$ ist jedoch auf Grund eines Mangels an struktureller Information über den Übergangszustand der Ligandbindung und Dissoziierung nicht einfach umsetzbar. Die Enoyl-ACP Reduktase FabI der Fettsäurebio\-synthese (FAS) Typ II ist ein wichtiger Angriffspunkt in der Antibiotikaforschung. InhA ist das FabI Enzym des Organismus \textit{Mycobacterium tuberculosis} und kann durch Substanzen diverser Klassen gehemmt werden. Es wird vermutet, dass Hemmung von InhA durch langsam-bindende (``slow-onset'') Inhibitoren mit der Ordnung der flexibelsten Region des Enzyms assoziiert ist, dem Substratbindungsloop (SBL). Diphenylether sind eine InhA Inhibitorenklasse, die eine solche SBL Ordnung fördern und dadurch lange Verweilzeiten im Angriffsziel aufweisen. Obwohl diese Inhibitoren energetisch und kinetisch gut charakterisiert sind, ist noch immer unklar, wie die strukturellen Eigenschaften eines Liganden $t_R$ beeinflussen. Durch die Verwendung klassischer Molekulardynamik (MD) Simulationen wurden wiederkehrende Konformationsfamilien von InhA Protein-Ligand Komplexen entdeckt und strukturelle Determinanten der Wirkstoff-Angriffsziel Verweilzeit von Diphenylethern mit verschiedenen kinetischen Profilen beschrieben. Anhand dieser Ergebnisse wurden Richtlinien zur Wirksamkeitsoptimierung von InhA Inhibitoren abgeleitet, einschließlich einer 5'-Substitution am Diphenylether B-Ring. Die Validität dieses Vorschlags wurde mittels MD Simulationen nachfolgend analysiert. Darüber hinaus wurden ``Steered MD'' (SMD) Simulationen als MD Technik für umfangreicheres Sampling verwendet um die Liganddissoziation von Diphenylethern aus dem FabI Enzym von \textit{Staphylococcus aureus} zu untersuchen. Dieser Ansatz resultierte in einem sehr akkuraten, quantitativen linearen Regressionsmodell der experimentellen Verweilzeit $ln(t_R)$ dieser Inhibitoren als Funktion der berechneten maximalen freien Energieänderung induzierter Ligandextraktion. Dieses Modell kann genutzt werden um die Verweilzeiten neuer potentieller Inhibitoren aus Kristallstrukturen oder validen Dockingposen vorherzusagen. Die korrekte strukturelle Charakterisierung des intermediären und des finalen Zustandes (EI und EI*-Zustand) eines Enzym-Inhibitor Komplexes bei einem zweistufigen Inhibitionsmechanismus durch langsam-bindende Hemmstoffe ist essentiell für rationale Verweilzeitoptimierung. Daher wurde die gegenwärtige Ansicht des EI und EI*-Zustandes von InhA mittels Kristallstrukturanalyse, MD und SMD Simulationen erneut aufgegriffen. Insgesamt bestätigten die Analysen, dass der EI*-Zustand einer Konformation ähnlich der 2X23 Kristallstruktur (mit langsam-bindenden Inhibitor \textbf{PT70}) gleicht, während eine Drehung der Reste Ile202 und Val203 mit einer weiter geöffneten Helix $\alpha 6$ dem EI-Zustand entspricht. Des Weiteren zeigten MD Simulationen den Einfluss naher Kristallkontakte zu Symmetrie-Nachbarn in der SBL Region auf die SBL Stabilität. Dies wird durch die Beobachtung hervorgehoben, dass die Ketten A und B' eines InhA-\textbf{PT155}-Komplexes und des angrenzenden Symmetrie-Nachbars, welche in engem Kontakt in der SBL Region stehen, signifikant stabilere SBLs aufweisen, als die Ketten A und B in einer Simulation des Tetramers. Zum Abschluss von Teil I wurden SMD Simulationen angewandt, auf deren Basis es möglich war, langsam-bindende InhA Inhibitoren von schnell-reversiblen (``rapid reversible'') Liganden zu unterscheiden. \textbf{Vorhersage von \textit{Mycobacterium tuberculosis} Zellwand Permeabilität.} Die Zellwand von \textit{M.~tuberculosis} erschwert die antimycobakterielle Wirkstofffindung auf Grund ihrer einzigartigen Zusammensetzung und bietet eine intrinsische Antibiotikaresistenz gegenüber lipophilen und hydrophilen Substanzen. Um den chemischen Raum wirkstoffähnlicher Moleküle gegen diesen Erreger (``Druggability Space'') einzugrenzen, wurde eine groß angelegte Dataminingstudie durchgeführt, welche auf multivariater statistischer Analyse der Unterschiede der physikochemischen Zusammensetzung eines normalverteilten wirkstoffähnlichen chemischen Raumes und einer Datenbank von antimycobakteriellen -- und somit höchstwahrscheinlich permeablen -- Substanzen beruht. Dieser Ansatz resultierte in dem logistischen Regressionsmodell MycPermCheck, welches in der Lage ist die Permeabilitätswahrscheinlichkeit kleiner organischer Moleküle anhand ihrer physikochemischen Eigenschaften vorherzusagen. Die Evaluation von MycPermCheck deutet auf eine große Vorhersagekraft hin. Das Modell wurde als frei zugänglicher online Service und als lokale Kommandozeilenversion implementiert. Methodiken und Ergebnisse aus beiden Teilen dieser Dissertation wurden kombiniert um ein virtuelles Screening nach antimycobakteriellen Substanzen durchzuführen. Myc\-PermCheck wurde verwendet um den chemischen Permeabilitätsraum von \textit{M.~tuberculosis} anhand der gesamten ZINC12 Datenbank wirkstoffähnlicher Moleküle abzuschätzen. Nach weiteren Filterschritten mit Bezug auf ADMET Eigenschaften, wurde InhA als exemplarisches Angriffsziel ausgewählt. Docking nach InhA führte schließlich zu einer Treffersubstanz, welche in darauffolgenden Schritten weiter optimiert wurde. Die Interaktionsqualität ausgewählter Derivate mit InhA wurde daraufhin mittels MD und SMD Simulationen in Bezug auf Protein und Ligand Stabilität, sowie auch der maximalen freien Energieänderung induzierter Ligandextraktion, untersucht. Die Ergebnisse der vorgestellten computerbasierten Experimente legen nahe, dass Substanzen mit einem Indol-3-Acethydrazid Gerüst eine neuartige Klasse von InhA Inhibitoren darstellen könnten. Weiterführende Untersuchungen könnten sich somit als lohnenswert erweisen. KW - Computational chemistry KW - Arzneimitteldesign KW - Molekulardynamik KW - Permeabilität KW - Tuberkelbakterium KW - Computational drug-design KW - steered molecular dynamics KW - molecular dynamics KW - residence time KW - mycobacterium tuberculosis KW - staphylococcus aureus KW - permeability KW - InhA KW - FabI KW - Enoyl-acyl-carrier-protein-Reductase KW - Drug design KW - Computational chemistry Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-127386 ER - TY - THES A1 - Schuster, Ann-Christin T1 - Chemical and functional analyses of the plant cuticle as leaf transpiration barrier T1 - Chemie-Funktionsanalysen der pflanzlichen Kutikula als Transpirationsbarriere N2 - Cuticles cover all above-ground primary plant organs and are lipoid in nature consisting of a cutin matrix with cuticular waxes embedded within or deposited on its surface. The foremost function of the plant cuticle is the limitation of transpirational water loss into the surrounding atmosphere. Transpiration of water vapour from plants differs between stomatal and cuticular transpiration. Stomatal closure minimises the stomatal water loss and the remaining, much lower water transpiration occurs through the plant cuticle. Temperature influence on the transpiration barrier properties of intact leaves is not yet known, despite the importance of the cuticular transpiration especially under drought and heat conditions. The present study focuses on the temperature-dependent minimum water permeability of whole leaves, in comparison to the temperature effect on the cuticular permeance of isolated, astomatous cuticles (Chapter I - III). The minimum water permeability was determined gravimetrically from leaf drying curves and represents the cuticular water permeability of intact, stomatous leaves under conditions of complete stomatal closure. The temperature effect on the transpiration barrier of the desert plant Rhazya stricta and the Mediterranean sclerophyll Nerium oleander exposed a continuous increase of minimum water permeabilities with an increase in temperature. In contrast to other published studies, no abrupt and steep increase of the water permeability at high temperatures was detected. This steep increase indicates structural changes of the barrier properties of isolated cuticular membranes with a drastic decrease of efficiency. A stabilising impact of the cell wall on the plant cuticle of intact leaves was proposed. This steadying effect was confirmed with different experimental approaches measuring the cuticular water permeability of Prunus laurocerasus intact leaves. Physiological analysis of water transport on isolated, astomatous leaf cuticles indicated a drastic decline of the barrier properties at elevated temperatures for Prunus laurocerasus but not for Nerium oleander. Cuticular components were quantitatively and qualitatively analysed by gas chromatography with a flame ionisation detector and a mass spectrometric detector, respectively. A high accumulation of pentacyclic triterpenoids as cuticular wax components in relation to the cutin monomer coverage was detected for Nerium oleander and for Rhazya stricta leaves, too. Accordingly, reinforcing of the cutin matrix by triterpenoids was proposed to improve the mechanical strength and to reduce the extensibility of plant cuticles. Thus, structural changes of the cuticular barrier properties were potentially suppressed at elevated temperatures. The function of the cuticular wax amount and/or wax composition and its relation with the cuticular water permeability remains to be elucidated. In the second part of this work the cuticular wax quantity and quality as well as its impact on the transpiration barrier properties was analysed in order to deduce a potential relation between chemistry and function of plant cuticles (Chapter IV - V). Chemical analyses of the cuticular wax components of a wide range of plant species, including one tropical (Vanilla planifolia), temperate (Juglans regia, Plantago lanceolata), Mediterranean (Nerium oleander, Olea europaea) and one desert (Rhazya stricta) plant species, were conducted. The cuticular wax compositions of nine characteristic plant species from xeric limestone sites naturally located in Franconia (Southern Germany) were determined for the first time. The corresponding minimum or cuticular water permeabilities of both stomatous and astomatous leaf surfaces were measured to detect a potential relationship between the cuticular wax amount, wax composition and the cuticular barrier properties. It was demonstrated that abundant cuticular wax amounts did not constitute more efficient transpiration barriers. However, 55% of the cuticular barrier function can be attributed to the very-long-chain aliphatic wax coverages. These new findings provide evidence that the acyclic wax constituents play a pivotal role establishing efficient transpiration barriers. Additionally, these findings strengthen the hypothesis that cyclic components, such as pentacyclic triterpenoids, do not hinder the water diffusion through plant cuticles as effectively as acyclic constituents. For the first time a relationship between the cuticular wax composition and the transpiration barrier properties of a wide range of plant species proved insights into the potential relation between chemistry and function of plant cuticles. N2 - Die Kutikula bedeckt die Epidermis aller primären oberirdischen Pflanzenorgane. Diese lipophile Membran besteht aus dem Polymer Kutin und ein- bzw. aufgelagerten kutikulären Wachsen. Die wichtigste Aufgabe der Kutikula ist der Schutz der Pflanze vor Austrocknung, indem der unkontrollierte Wasserverlust in die Atmosphäre reduziert wird. Spaltöffnungen unterbrechen die kontinuierliche Schutzschicht, wobei die stomatäre Transpiration durch Spaltenschluss minimiert wird und die verbleibende, stark reduzierte Transpiration ausschließlich durch die pflanzliche Kutikula erfolgt. Der Temperatureinfluss auf die Transportbarriere intakter Blätter ist bislang unerforscht, obwohl die kutikuläre Transpiration vor allem an trockenen und heißen Standorten eine wichtige Rolle spielt. Im Rahmen dieser Dissertation wurde die temperaturabhängige kutikuläre Wasserpermeabilität ganzer Blätter und isolierter Kutikularmembranen verglichen (Kapitel I - III). Die minimale Wasserpermeabilität wurde gravimetrisch mittels Blattaustrocknungskurven bestimmt. Sie ist ein Maß für die kutikuläre Wasserdurchlässigkeit intakter, stomatärer Blätter bei geschlossenen Spaltöffnungen. Die minimale Wasserpermeabilität intakter Blätter von Rhazya stricta und Nerium oleander zeigte einen kontinuierlichen Anstieg mit zunehmender Temperatur. Im Gegensatz zu anderen Veröffentlichungen wurde kein abrupter, steiler Anstieg der Wasserpermeabilität bei erhöhten Temperaturen detektiert, welcher auf strukturelle Veränderungen der Transpirationsbarriere isolierter Kutikularmembranen und auf eine damit einhergehende, stark verminderte Effizienz hindeutet. Dies kann auf einen stabilisierenden Einfluss der Zellwand auf die pflanzliche Kutikula zurückgeführt werden. Verschiedene experimentelle Ansätze zur Bestimmung der temperaturabhängigen kutikulären Wasserpermeabilität von Prunus laurocerasus Blättern konnten dies bestätigen. Bei erhöhten Temperaturen wiesen die isolierten, astomatären Kutikularmembranen von Prunus laurocerasus Blättern eine starke Abnahme der Barrierefunktion auf, die isolierten Kutikularmembranen von Nerium oleander Blättern jedoch nicht. Die kutikulären Wachs- und Kutinkomponenten wurden quantitativ mittels Gaschromtograph mit Flammenionisationsdetektor und qualitativ mittels Gaschromatograph gekoppelt mit Massenspektrometer analysiert. Ein sehr hoher Gehalt an pentazyklischen Triterpenoiden im kutikulären Wachs in Bezug auf den Kutingehalt wurde sowohl für die Blätter von Nerium oleander als auch für Rhazya stricta bestimmt. Triterpenoide erhöhen möglicherweise die mechanische Festigkeit und reduzieren die Dehnbarkeit der Kutikula, indem sie die Kutinmatrix verstärken. Hierdurch könnten strukturelle Veränderungen der Transpirationsbarriere bei erhöhten Temperaturen herabgesetzt werden. Die weit verbreitete Ansicht, dass die Wasserpermeabilität von der kutikulären Wachsmenge und/oder der Wachszusammensetzung bestimmt wird, konnte bislang nicht bestätigt werden. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden chemisch-analytische Methoden angewandt, um den Einfluss der Wachskomponenten auf die Transpirationsbarriere zu ermitteln, und somit einen potentiellen Zusammenhang zwischen der Chemie und der Funktion der pflanzlichen Kutikula abzuleiten (Kapitel IV - V). Um Hinweise auf die Auswirkung der chemischen Zusammensetzung der Kutikula auf die Transpirationsbarriere zu erhalten, wurden die kutikulären Wachse eines breiten Artenspektrums analysiert, darunter eine tropische Pflanzenart (Vanilla planifolia), mediterrane Arten (Nerium oleander, Olea europaea), Pflanzenarten der gemäßigten Zone (Juglans regia, Plantago lanceolata) und eine Wüstenpflanze (Rhazya stricta). Zusätzlich wurde die kutikuläre Wachszusammensetzung von neun charakteristischen Pflanzenarten des Mainfränkischen Trockenrasens erstmals untersucht. Die entsprechende minimale oder kutikuläre Wasserpermeabilität von stomatären und astomatären Blattoberflächen dieser Pflanzenarten wurde bestimmt, um einen möglichen Zusammenhang zwischen der Wachschemie mit der Barrierefunktion aufzuklären. Es konnte gezeigt werden, dass hohe Wachsmengen keine effizienteren Transpirationsbarrieren bilden. Jedoch konnten rund 55% der Barrierefunktion dem Anteil an langkettigen aliphatischen Komponenten zugeordnet werden. Diese neuen Erkenntnisse erbringen den Nachweis, dass die kutikuläre Transpirationsbarriere entscheidend von azyklischen Wachskomponenten beeinflusst wird. Zudem konnte bestätigt werden, dass zyklische Wachskomponenten die Wasserpermeabilität weniger stark beeinflussen als azyklische Bestandteile. Diese Ergebnisse zeigen zum ersten Mal einen Zusammenhang zwischen der chemischen Zusammensetzung der kutikulären Wachse und der kutikulären Transportbarriere anhand eines breiten Artenspektrums. KW - Kutikula KW - Transpiration KW - Kutikularwachs KW - Temperaturabhängigkeit KW - Permeabilität KW - transpiration barrier KW - cuticular water permeability KW - cuticular leaf wax KW - Transportbarriere KW - kutikuläre Wasserpermeabilität KW - kutikuläres Blattwachs KW - desert plant KW - Wüstenpflanze Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-133475 ER - TY - THES A1 - Schüßler [geb. Hecht], Nina Kristin Petra T1 - Novel formulation principles for bioavailability enhancement of poorly water-soluble and poorly permeable drugs T1 - Neue Formulierungen zur Verbesserung der Bioverfügbarkeit von schlecht wasserlöslichen und schlecht permeablen Arzneistoffen N2 - Since four decades, high-throughput screenings have been conducted in drug discovery, fuelling the identification of potential new drug candidates. This approach, however, often promotes the detection of compounds with undesired physico-chemical properties like poor aqueous solubility or low membrane permeability. Indeed, dissolution and absorption of a drug are prerequisites for systemic exposure and therapeutic effects. Therefore, innovative strategies to optimize unfavourable performance of new drug candidates are in great demand in order to increase drug concentrations at the site of action whilst simultaneously reducing drug variability. In chapter I of this research work, hydrophobic ion pairing (HIP) is discussed as a promising strategy to improve the bioavailability of BCS class III compounds, which have high aqueous solubility and low permeability. The review points out the limitations of poorly absorbable drugs and details the approach of pairing these APIs with hydrophobic counterions. Apart from the motivation to tailor physico-chemical, biopharmaceutical and toxicological properties of BCS class III compounds, the hydrophobic ion pairing facilitates their formulation into drug delivery systems. Besides advantageous effects, disadvantages of the ion pair formation, such as the decreased aqueous solubility of the ions pair, are critically outlined. Finally, the review covers an overview of non-invasive administration routes permitted after ion pair formation, including oral/enteral, buccal, nasal, ocular and transdermal drug administration. Overall, the HIP approach offers substantial benefits regarding the bioavailability enhancement of BCS class III compounds. Chapter II concerns GHQ168 developed by Holzgrabe et al., a BCS class II compound characterized by low aqueous solubility and high permeability. GHQ168 was developed for the treatment of human African trypanosomiasis (HAT), a tropical disease for which novel active compounds are urgently needed. This lead compound was found to be very active against trypanosoma brucei brucei and trypanosoma brucei rhodesiense in cell culture assays, however, the low aqueous solubility prevented further preclinical development. To target this drawback, two different approaches were selected, including (I) the chemical modification and (II) the spray drying of GHQ168. The newly synthesized set of derivatives as well as the spray dried GHQ168 were subjected to a physico-chemical and microbiological characterization. It turned out that both approaches successfully improved aqueous solubility, however, for the derivatives of GHQ168 at the expense of activity. Furthermore, the pharmacokinetic parameters of GHQ168 and of the most active derivatives, GHQ242 and GHQ243, were evaluated. Elimination half-lives between 1.5 to 3.5 h after intraperitoneal administration and modest to strong serum albumin binding for GHQ243 (45%) and GHQ168 (80%) and very high binding (> 99%) for GHQ242 were detected. The spray dried formulation of GHQ168, as well as GHQ242 and GHQ243 were investigated in two in vivo studies in mice infected with t. b. rhodesiense (STIB900), referred to as (I) stringent model and (II) early-treatment model. In the stringent model (2 applications/day on day 3-6 after infection) the mean survival duration (MSD) of mice treated with spray dried GHQ168 exceeded the MSD of the untreated control group (17 days versus 9 days), a difference that was statistically significant. In contrast, no statistical difference was observed for GHQ242 (14 days) and GHQ243 (12 days). GHQ168 was further assessed in the early-treatment model (2 applications/day on day 1-4 after infection) and again a statistically significant improvement of MSD (32 days (end of observation period) versus 7 days) was observed. Finally, exciting antitrypanosomal efficacy for the spray dried formulation of GHQ168 was demonstrated. NADPH oxidases (NOX) were found to be the main source of endothelial reactive oxygen species (ROS) formation. Chapter III reports on the formulation studies on triazolopyrimidine derivatives from the VAS library, a set of NADPH oxidase inhibitors. These were developed for the treatment of elevated ROS levels, which contribute to the development of cardiovascular diseases. Although in vitro results from numerous studies indicated promising efficacy and selectivity for the VAS-compounds, the low water solubility impeded the in vivo translation and further preclinical development. For this reason, three derivatives, VAS2870, VAS3947, and VAS4024 were physico-chemically characterized and VAS3947, the most soluble compound, was selected for further formulation studies. These approaches included (I) spray drying, (II) microemulsification and (III) complexation with cyclodextrins in order to develop formulations for oral and parenteral application. Solubility improvement of VAS3947 was successfully demonstrated for all preparations as expressed by supersaturation ratios in comparison to the solubility of the unformulated compound. For seven spray dried formulations, the ratio ranged from 3-9, and the ratio for four microemulsions was 8-19 after 120 min, respectively. The six cyclodextrin formulations achieved the highest supersaturation ratio between 3 and 174 after 20 hours. NMR measurements elucidated the inclusion of VAS3947 within the CD’s cavity as well as the interaction with its outer surface. Ultimately, NOX inhibitors were opened for oral and parenteral administration for the first time. After successful solubility improvement of VAS3947, further investigations towards in vivo studies were conducted including stability studies with a focus on stability in solution and in plasma as presented in chapter IV. Furthermore, permeability and cytotoxicity assays were performed for the first time. It turned out that VAS3947 was instable in buffer and when exposed to light. Moreover, the compound showed decomposition in the presence of mouse microsomes and in human plasma. The VAS compounds contain an oxazol moiety linked to the triazolopyrimidine skeleton via a thioether. This structural element is responsible for the efficacy of the compound class, however it is susceptible to hydrolysis and to further degradation reactions. Moreover, VAS3947 harmed membrane integrity in the cell permeability assays and cytotoxicity investigations in HEK-293 and HEP-G2 cells revealed IC50 values in the same concentration range as reported for efficacy assays. Summarized, it was demonstrated that substances from the VAS library were no appropriate model compounds for ROS investigations nor suitable candidates for further preclinical development. N2 - Seit vier Jahrzehnten werden Hochdurchsatz-Screenings in der Arzneimittelforschung durchgeführt, was die Erkennung von potentiellen Wirkstoffkandidaten vorantreibt. Diese Vorgehensweise begünstigt jedoch häufig die Identifizierung von Substanzen mit unerwünschten physikochemischen Eigenschaften wie geringer Wasserlöslichkeit oder geringer Membranpermeabilität. Der Bioverfügbarkeitstheorie zufolge sind die Auflösung und die Absorption eines Arzneistoffs Voraussetzung für die systemische Verfügbarkeit und die therapeutische Wirkung. Daher werden innovative Strategien, die die ungünstigen Eigenschaften neuer Wirkstoffkandidaten optimieren, dringend benötigt, um die Arzneistoffkonzentration am Wirkort zu erhöhen und gleichzeitig Wirkstoffschwankungen zu reduzieren. In Kapitel I dieser Forschungsarbeit wird die hydrophobe Ionenpaarbildung als vielversprechende Strategie diskutiert, um die Bioverfügbarkeit von BCS Klasse III Substanzen zu verbessern, die sich durch hohe Wasserlöslichkeit und geringe Permeabilität auszeichnen. Der Review zeigt die Grenzen von schlecht absorbierbaren Arzneistoffen auf und stellt den Ansatz vor, diese mit hydrophoben Gegenionen zu kombinieren. Abgesehen von der Motivation, die physikochemischen, biopharma-zeutischen und toxikologischen Eigenschaften von BCS Klasse III Substanzen positiv zu beeinflussen, wird die Formulierung der hydrophoben Ionenpaare in Trägersysteme erleichtert. Neben den Vorteilen werden auch die Nachteile der hydrophoben Ionenpaarbildung, wie beispielsweise die geringere Wasserlöslichkeit der Ionenpaare, kritisch dargestellt. Abschließend gibt der Review eine Übersicht über die verschiedenen nicht-invasiven Applikationsrouten, die nach hydrophober Ionenpaarbildung realisierbar sind, was die orale/enterale, bukkale, nasale, okulare und transdermale Arzneistoffgabe umfasst. Insgesamt bietet dieser Formulierungsansatz wesentliche Vorteile im Hinblick auf die Verbesserung der Bioverfügbarkeit von BCS Klasse III Substanzen. Kapitel II befasst sich mit GHQ168, entwickelt von Holzgrabe et al., einer BCS Klasse II Substanz mit geringer Wasserlöslichkeit und hoher Permeabilität. GHQ168 wurde zur Behandlung der afrikanischen Schlafkrankheit entwickelt, einer tropischen Erkrankung, für die neue Arzneistoffe dringend benötigt werden. Diese Leitsubstanz bewies in Zellkulturversuchen sehr hohe Aktivität gegen Trypanosoma brucei brucei und Trypanosoma brucei rhodesiense, die geringe Wasserlöslichkeit verhinderte jedoch die weitere präklinische Entwicklung. Um diese Herausforderung anzugehen, wurden zwei verschiedene Ansätze gewählt, zum einen (I) die chemische Modifikation und zum anderen (II) die Sprühtrocknung von GHQ168. Die neu synthetisierten Derivate und das sprühgetrocknete GHQ168 wurden physikochemisch und mikrobiologisch charakterisiert. Beide Ansätze verbesserten erfolgreich die Wasserlöslichkeit, im Fall der Derivate von GHQ168 jedoch zu Lasten der Aktivität. Weiterhin wurden die pharmakokinetischen Eigenschaften von GHQ168 und den aktivsten Derivaten, GHQ242 und GHQ243, untersucht. Nach intraperitonealer Applikation resultierten Halbwertszeiten zwischen 1.5 und 3.5 Stunden und eine mittlere bis hohe Plasmaproteinbindung für GHQ243 (45%) und GHQ168 (80%) und eine sehr hohe Plasmaproteinbindung für GHQ242 (> 99%). Die sprühgetrocknete Formulierung von GHQ168 sowie GHQ242 und GHQ243 wurden in zwei in vivo Studien in Mäusen, die mit t. b. rhodesiense (STIB900) infiziert waren, untersucht, die Modelle werden als (I) stringent model und (II) early-treatment model bezeichnet. Im stringent model (2x tägliche Gabe an Tag 3-6 nach Infektion) war die durchschnittliche Überlebensdauer von Mäusen, die mit sprühgetrocknetem GHQ168 behandelt worden waren, statistisch signifikant höher als die der unbehandelten Kontrollgruppe (17 gegenüber 9 Tagen). Im Gegensatz hierzu wurde kein statistisch signifikanter Unterschied für GHQ242 (14 Tage) und GHQ243 (12 Tage) festgestellt. GHQ168 wurde im early-treatment model (2x tägliche Gabe an Tag 1-4 nach Infektion) weiter untersucht und erneut wurde eine statistisch signifikante Verbesserung der durchschnittlichen Überlebensdauer (32 Tage (Ende der Beobachtungsphase) gegenüber 7 Tagen) bewiesen. Letztendlich konnte für die sprühgetrocknete Formulierung von GHQ168 eine erstaunliche Aktivität gegenüber Trypanosomen gezeigt werden. NADPH-Oxidasen (NOX) wurden als Hauptproduzenten von endothelialem reaktivem Sauerstoff erkannt. Kapitel III befasst sich mit Formulierungsstudien von Triazolopyrimidinderivaten aus der VAS-Substanzbibliothek, einer Reihe von NADPH-Oxidase-Inhibitoren. Diese Substanzen wurden zur Behandlung erhöhter reaktiver Sauerstoffspezies Werte entwickelt, denn diese tragen zur Entstehung von kardiovaskulären Erkrankungen bei. Obwohl die in vitro Ergebnisse zahlreicher Studien auf die vielversprechende Wirksamkeit und Selektivität der VAS-Substanzen hinweisen, verhinderte die geringe Wasserlöslichkeit den Übertrag auf in vivo Studien sowie die weitere präklinische Entwicklung. Daher wurden drei Derivate, VAS2870, VAS3947 und VAS4024, physikochemisch charakterisiert und VAS3947, die wasserlöslichste Substanz, wurde für weitere Formulierungsentwicklungen ausgewählt. Die Formulierungsansätze umfassten (I) die Sprühtrocknung, (II) die Herstellung von Mikroemulsionen und (III) die Komplexierung mit Cyclodextrinen, um Formulierungen für die orale und parenterale Verabreichung zu entwickeln. Die Löslichkeitsverbesserung von VAS3947 konnte für alle Ansätze erfolgreich gezeigt werden und wurde als Übersättigungsrate im Vergleich zur Löslichkeit der unformulierten Substanz dargestellt. Für sieben sprühgetrocknete Formulierungen und für vier Mikroemulsionen ergab sich eine Übersättigungsrate von 3-9, beziehungsweise von 8-19 nach 120 Minuten. Die sechs Cyclodextrin-Formulierungen erreichten mit 3-174 nach 20 Stunden die höchste Übersättigungsrate. Der Einschluss von VAS3947 in die Kavität der Cyclodextrine sowie die Interaktion mit deren Außenseite wurde mittels NMR aufgeklärt. Schließlich wurde erstmals die Möglichkeit der oralen und parenteralen Gabe der NOX-Inhibitoren eröffnet. Nach erfolgreicher Löslichkeitsverbesserung von VAS3947 wurden weitere Untersuchungen mit dem Ziel von in vivo Studien durchgeführt, was Stabilitätsuntersuchungen mit besonderem Schwerpunkt auf Stabilität in Lösung und in Plasma einschließt, wie im Kapitel IV aufgezeigt. Weiterhin wurden erstmals Permeabilitäts- und Zytotoxizitätsstudien durchgeführt. Es stellte sich heraus, dass VAS3947 in Puffer und bei Lichtexposition instabil war. Zudem wurde die Substanz in Gegenwart von Maus-Mikrosomen und in menschlichem Plasma abgebaut. Die VAS-Substanzen enthalten eine Oxazol-Ringstruktur, die über einen Thioether mit dem Triazolopyrimidin-Gerüst verbunden ist. Diese Strukturelemente sind für die Wirksamkeit der Substanzklasse verantwortlich, sind jedoch auch hydrolyseempfindlich und anfällig für weitere Abbaureaktionen. Zudem schädigte VAS3947 die Membranintegrität in den Permeabilitätsversuchen und die Zytotoxizitätsuntersuchungen in HEK-293 und HEP-G2 Zellen ergaben IC50-Werte im gleichen Konzentrationsbereich wie in Aktivitätsuntersuchungen berichtet. Zusammenfassend wurde aufgezeigt, dass die VAS-Substanzen weder ein geeignetes Modell für die Untersuchung reaktiver Sauerstoffspezies sind, noch geeignet für die weitere präklinische Entwicklung. KW - Löslichkeit KW - Permeabilität KW - Bioverfügbarkeit KW - Chinolonderivate KW - Formulierungsentwicklung KW - NOX-Inhibitoren Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-162766 ER - TY - THES A1 - Weh, Barbara T1 - Permeationseigenschaften von Polydimethylsiloxan-Membranen in Abhängigkeit von der Netzbogenlänge T1 - Permeation properties of polydimethylsiloxane-membranes in dependence of the network chain length N2 - Für die definierte und konstante Wirkstofffreigabe aus therapeutischen Systemen sind Kenntnisse der Mikrostruktur vonKontrollmembranen von großer Bedeutung. Durch eine Additionsreaktion können Polydimethylsiloxan-Membranen ausvinylendgestoppten linearen Polydimethylsiloxanen und niedermolekularen Si-H-funktionalisierten Polydimethylsiloxanen unterEinfluss eines Platin- Katalysators hergestellt werden. Hierbei ist es durch den Einsatz genau charakterisierterAusgangspolymere möglich, Membranen mit einer statistisch definierten Mikrostruktur zu erhalten. Die Mikrostruktur kanndurch die Netzbogenlänge charakterisiert werden. Der Abschnitt zwischen zwei Verknüpfungspunkten in einem Netzwerk wirdals Netzbogenlänge (NBL) bezeichnet. Diese beschreibt die Anzahl der Dimethyl-siloxan-Einheiten zwischen zweiVerknüpfungen. Die Permeationseigenschaften wurden mit Hilfe des standardisierten Permeationskoeffizienten untersucht. Derstandardisierte Permeationskoeffizient ist von der mittleren Netzbogenlänge der Polydimethylsiloxan-Membranen abhängig. Dieser Zusammenhang wurde an elf Benzoesäure- und Naphthalinderivaten als Modellsubstanzen untersucht und bestätigt.Hierbei wurden Membranen mit den mittleren Netzbogenlängen 65, 99 und 122 Siloxan-Einheiten für die Untersuchungeneingesetzt. Bei allen untersuchten Substanzen stieg der Permeationskoeffizient mit größer werdender Netzbogenlänge derMembranen geringfügig an. Die Permeationskoeffizienten von Membranen mit der Netzbogenlänge 122 waren dabei - mitlediglich vier Ausnahmen - stets statistisch signifikant größer als von Membranen mit der Netzbogenlänge 65. Als mögliche weitere Einflussfaktoren auf die Permeationsgeschwindigkeit wurden der Membran/Wasser-Verteilungskoeffizient, dasDipolmoment und das van der Waals-Volumen der elf Modellsubstanzen untersucht. Es konnte ein Zusammenhang zwischendem Membran/Wasser-Verteilungskoeffizienten und dem Permeationskoeffizienten aufgezeigt werden. Das Volumen deruntersuchten permeierenden Moleküle hat jedoch nur bei Netzbogenlängen kleiner als 122 einen Einfluss auf diePermeationsgeschwindigkeit. Als neue Möglichkeit zur Untersuchung der Diffusionskinetik vor Erreichen des stationärenZustands in Polydimethylsiloxan-Membranen wurde die konfokale Raman-Spektroskopie eingesetzt. Bei derRaman-Spektroskopie wird das Probensystem während der Messung weder zerstört noch verändert. Weiterhin ist es möglich,durch das gekoppelte konfokale Mikroskop gezielt an einem bestimmten Punkt innerhalb der Membran zu messen. Damitkönnen nun dynamische Vorgänge wie der Aufbau eines Konzentrationsgradienten vor Erreichen des stationären Zustandes aneinem bestimmten Punkt in einer Membran über einen längeren Zeitraum gemessen werden. Anhand von Intensitätsänderungencharakteristischer Peaks oder der Verschiebung von Banden werden Konzentrations- und Strukturänderungen der Membranund der permeierenden Moleküle sichtbar. Die Untersuchungen mit der konfokalen Raman-Spektroskopie zeigten, dass dieseMethode geeignet ist, Diffusionskinetiken im nicht stationären Zustand innerhalb der Membranen zu beobachten. N2 - The knowledge of the microstructure of controlling membranes is very important in order to achieve a defined and constantdrug release from therapeutic systems. Poly(dimethylsiloxane) membranes can be prepared by an addition reaction of linearpoly(dimethylsiloxanes) with terminal vinyl groups and low molecular poly(dimethylsiloxanes) with Si-H functional groups. Forthis reaction a Platinum catalyst is used. By using well characterized starting polymers it is possible to get membranes with astatistically defined microstructure. The network chain length can characterize the microstructure. The distance between twopoints of cross-linking within the network is called network chain length (NCL). The network chain length describes the numberof the dimethyl- siloxane-units between two cross-linking points. The properties of permeation were investigated by using the stadardized permeation coefficient. The permeation coefficient is dependent on the average network chain length of thepoly(dimethylsiloxane) membranes. This relationship was confirmed for 11 benzoic acid and hydroxynaphthalene derivates.Membranes with network chain lengths of 65, 99 and 122 were used for these investigations. The permeation coefficient P*increases slightly with rising network chain length for all 11 model substances. The permeation coefficient of the membraneswith network chain length of 122 was found to be higher by a statistically significant amount than those of membranes with anetwork chain length of 65 - having only 4 exceptions. In order to find other factors which influence the permeation rate, the membrane/water-partition coefficient, the dipole moment and the van der Waals volume were investigated. There was amathematically relationship between the membrane/water-partition coefficient and the permeation coefficient. The volume of themoleculeshad only with membranes with a network chain length of 122 an influence on the permeation. ConfocalRaman-spectroscopy was taken as a pioneering method to investigate the kinetics of diffusion before reaching the steady statein poly(dimethylsiloxane) membranes. Up to now it was only possible to investigate the diffusion process in the steady state. The membrane was always taken as a whole. Raman-spectroscopic measurements do not destroy or change the probe system.Because of the coupled confocal microscope it is possible to measure selectively at a defined point in the membrane. Thereforedynamic processes e.g. can be investigated before reaching the steady state flux. The investigations with confocalRaman-spectroscopy show the possibility to observe diffusion processes in and before the steady state flux with this method. KW - Polydimethylsiloxane KW - Membran KW - Permeabilität KW - Polydimethylsiloxan KW - Membran KW - Permeation KW - Netzbogenlänge KW - konfokale Raman-Spektroskopie KW - poly(dimethylsiloxane) KW - membrane KW - permeation KW - network chain length KW - confocal Raman-spectroscopy Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-2927 ER - TY - THES A1 - Xavier de Souza, Aline T1 - Ecophysiological adaptations of the cuticular water permeability within the Solanaceae family T1 - Ökophysiologische Anpassungen der kutikulären Wasserpermeabilität innerhalb der Solanaceae Familie N2 - The cuticle, a complex lipidic layer synthesized by epidermal cells, covers and protects primary organs of all land plants. Its main function is to avoid plant desiccation by limiting non-stomatal water loss. The cuticular properties vary widely among plant species. So far, most of the cuticle-related studies have focused on a limited number of species, and studies addressing phylogenetically related plant species are rare. Moreover, comparative studies among organs from the same plant species are still scarce. Thus, this study focus on organ-specificities of the cuticle within and between plant species of the Solanaceae family. Twenty-seven plant species of ten genera, including cultivated and non- cultivated species, were investigated to identify potential cuticular similarities. Structural, chemical and functional traits of fully expanded leaves, inflated fruiting calyces, and ripe fruits were analyzed. The surface morphology was investigated by scanning electron microscopy. Leaves were mainly amphistomatic and covered by an epicuticular wax film. The diversity and distribution of trichomes varied among species. Only the leaves of S. grandiflora were glabrous. Plant species of the Leptostemonum subgenus had numerous prickles and non-glandular stellate trichomes. Fruits were stomata-free, except for S. muricatum, and a wax film covered their surface. Last, lenticel- like structures and remaining scars of broken trichomes were found on the surface of some Solanum fruits. Cuticular water permeability was used as indicators of the cuticular transpiration barrier efficiency. The water permeability differed among plant species, organs and fruit types with values ranging up to one hundred-fold. The minimum leaf conductance ranged from 0.35 × 10-5 m s-1 in S. grandiflora to 31.54 × 10-5 m s-1 in S. muricatum. Cuticular permeability of fruits ranged from 0.64 × 10-5 m s-1 in S. dulcamara (fleshy berry) to 34.98 × 10-5 m s-1 in N. tabacum (capsule). Generally, the cuticular water loss of dry fruits was about to 5-fold higher than that of fleshy fruits. Interestingly, comparisons between cultivated and non-cultivated species showed that wild species have the most efficient cuticular transpiration barrier in leaves and fruits. The average permeability of leaves and fruits of wild plant species was up to three-fold lower in comparison to the cultivated ones. Moreover, ripe fruits of P. ixocarpa and P. peruviana showed two-times lower cuticular transpiration when enclosed by the inflated fruiting calyx. The cuticular chemical composition was examined using gas chromatography. Very-long-chain aliphatic compounds primarily composed the cuticular waxes, being mostly dominated by n- alkanes (up to 80% of the total wax load). Primary alkanols, alkanoic acids, alkyl esters and branched iso- and anteiso-alkanes were also frequently found. Although in minor amounts, sterols, pentacyclic triterpenoids, phenylmethyl esters, coumaric acid esters, and tocopherols were identified in the cuticular waxes. Cuticular wax coverages highly varied in solanaceous (62- fold variation). The cuticular wax load of fruits ranged from 0.55 μg cm−2 (Nicandra physalodes) to 33.99 μg cm−2 (S. pennellii), whereas the wax amount of leaves varied from 0.90 μg cm−2 (N. physalodes) to 28.42 μg cm−2 (S. burchellii). Finally, the wax load of inflated fruiting calyces ranged from 0.56 μg cm−2 in P. peruviana to 2.00 μg cm−2 in N. physalodes. For the first time, a comparative study on the efficiency of the cuticular transpiration barrier in different plant organs of closely related plant species was conducted. Altogether, the cuticular chemical variability found in solanaceous species highlight species-, and organ-specific wax biosynthesis. These chemical variabilities might relate to the waterproofing properties of the plant cuticle, thereby influencing leaf and fruit performances. Additionally, the high cuticular water permeabilities of cultivated plant species suggest a potential existence of a trade-off between fruit organoleptic properties and the efficiency of the cuticular transpiration barrier. Last, the high cuticular water loss of the solanaceous dry fruits might be a physiological adaptation favouring seed dispersion. N2 - Die Kutikula, eine von Epidermiszellen gebildete, komplexe Lipidschicht, bedeckt und schützt die primären Organe niederer und höherer Landpflanzen. Ihre Hauptfunktion besteht darin, die Austrocknung der Pflanzen zu vermeiden, indem der nicht-stomatäre Wasserverlust an die Atmosphäre begrenzt wird. Ihre Eigenschaften können je nach Pflanzenart stark variieren, dennoch wurden kutikuläre Charakteristika unter phylogenetisch nah verwandten Pflanzenarten bisher wenig diskutiert. Die meisten Studien im Zusammenhang mit der Kutikula fokussierten sich auf eine begrenzte Anzahl von Pflanzenarten. Vergleichsstudien zwischen Organen derselben Pflanzenart sind kaum vorhanden. Die vorliegende Studie konzentriert sich daher auf die Kutikula von Pflanzenarten aus der Familie der Solanaceae und deren Organe. Die kutikulären Eigenschaften von 27 Pflanzenarten aus zehn verschiedenen Pflanzengattungen wurden untersucht, einschließlich Wild- und Kulturarten. Strukturelle, chemische und funktionelle Merkmale wurden für vollständig entwickelte Blätter, vergrößerte Blütenkelche und reife Früchte vergleichend analysiert. Die Oberflächenmorphologie wurde mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie untersucht. Strukturell wiesen die meisten Blätter eine amphistomatische Oberfläche auf, die mit einem epikutikulären Wachsfilm bedeckt war, wobei einfache Trichome und Trichome mit Drüsen eine artspezifische Verteilung und Vielfalt aufzeigten. Bei den meisten Blättern der Untergattung Leptostemonum wurden Stacheln und zahlreiche sternenförmige Trichome beobachtet. Allein Solandra grandiflora hatte eine Blattoberfläche ohne Trichome. Früchte zeichneten sich hauptsächlich durch einen epikutikulären Wachsfilm aus, der ihre Oberfläche bedeckte. Als einzige Pflanzenart besaß Solanum muricatum auf der Fruchtoberfläche Stomata, dennoch wurden Lentizellen und Fragmente von Trichomen auf der Fruchtoberfläche von Solanum tuberosum, Solanum quitoense und Solanum lycopersicum gefunden. Für die Effizienzbestimmung der kutikulären Transpirationsbarriere von Oberflächen mit und ohne Stomata wurden die minimale Wasserleitfähigkeit unter Bedingungen des maximalen Stomaschlusses beziehungsweise die kutikuläre Wasserpermeabilität untersucht. Dieses ergab ein art-, organ- und fruchttypspezifisches Muster. Die Werte variierten zwischen den Pflanzenarten bis zu hundertfach und lagen zwischen 10-6 m s-1 und 10-4 m s-1. Im Gegensatz zu den Ergebnissen früherer Studien zeigte der Vergleich der Wasserpermeabilität von verschiedenen Organen derselben Pflanzenarten, dass eine höhere Wasserpermeabilität für Blätter oder für Früchte gefunden werden kann oder dass sie für beide Organe nahezu gleich sein kann. Die minimale Wasserleitfähigkeit der Blätter lag im Bereich von 0.35 × 10–5 m s–1 für S. grandiflora bis 31.54 × 10–5 m s–1 für S. muricatum. Die kutikuläre Wasserpermeabilität lag im Bereich von 0.64 × 10–5 m s –1 für fleischige Früchte von Solanum dulcamara bis 34.98 × 10–5 m s–1 für Kapselfrüchte von Nicotiana tabacum. Allgemein zeigte sich, dass trockene Früchte eine etwa fünffach höhere kutikuläre Wasserpermeabilität als fleischige Früchte besaßen. Interessanterweise zeigten Vergleiche zwischen Wild- und Kulturarten, dass Wildarten eine wirksamere kutikuläre Transpirationsbarriere der Blätter und Früchte aufwiesen, da ihre Wasserpermeabilität etwa zwei- bis dreifach niedriger war als die der kultivierten Pflanzenarten. Des Weiteren zeigten Physalis ixocarpa und Physalis peruviana, deren Früchte von einem vergrößerten Blütenkelch umschlossen waren, einen schützenden Einfluss dieses Blütenkelches auf die reife Frucht. Eine Reduktion der kutikulären Wasserpermeabilität um den Faktor zwei wurde nachgewiesen. Die chemische Zusammensetzung der kutikulären Transpirationsbarriere wurde mit Hilfe der Gaschromatographie detektiert. Die Analysen ergaben art- und organspezifische Mengen und Zusammensetzungen der kutikulären Wachse, die vor allem aus sehr langkettigen aliphatischen Verbindungen bestanden. Bis zu 80% der kutikulären Wachszusammensetzung bildete die Stoffklasse der n-Alkane. Andere häufig identifizierte Stoffklassen waren primäre Alkanole, Alkansäuren, Alkylester sowie iso- und anteiso-Alkane. Obwohl in geringen Mengen, wurden in den meisten kutikulären Wachsen auch alicyclische und aromatische Stoffklassen gefunden. Hauptsächlich handelte es sich um Phytosterole, pentacyclische Triterpenoide, Phenylmethylester, Cumarsäureester, Tocopherole und Flavonoide. Die kutikuläre Wachsschicht variierte zwischen den Pflanzenarten bis zu 62-fach und betrug zwischen 0.55 μg cm-2 für Nicandra physalodes und 33.99 μg cm-2 für Solanum pennellii, wobei sowohl niedrigste als auch höchste kutikuläre Wachsmenge für Früchte gefunden wurde. Die kutikulären Wachse der Blätter reichten von 0.90 μg cm-2 für N. physalodes bis 28.42 μg cm-2 für Solanum burchellii. Die kutikuläre Wachsmenge der vergrößerten Blütenkelche lag zwischen 0.56 μg cm-2 für P. peruviana und 2.00 μg cm-2 für N. physalodes. Zum ersten Mal wurde eine umfangreiche Studie zur Effizienz der kutikulären Transpirationsbarriere verschiedener Pflanzenorgane von phylogenetisch nah verwandten Pflanzenarten durchgeführt. Insgesamt zeigt die vergleichende Untersuchung innerhalb der Familie der Solanaceae die funktionelle und chemische Variabilität der kutikulären Wasserpermeabilität und der kutikulären Wachsbiosynthese. Die art- und organspezifische Divergenz kann dabei einen Einfluss auf die hydrophoben Eigenschaften der Kutikula haben und wichtige Konsequenzen für die Blatt- und Fruchtleistung mit sich führen. Darüber hinaus deuten diese Ergebnisse auf einen Kompromiss zwischen Fruchteigenschaften und Oberflächenschutz bei den Kulturarten hin. Es wird auch vermutet, dass die verringerte kutikuläre Barriereleistung der trockenen Früchte eine physiologische Anpassung an die Samenausbreitung dieser Pflanzenarten ist. KW - Kutikula KW - Transpiration KW - Kutikularwachs KW - Permeabilität KW - Nachtschattengewächse KW - permeability KW - water loss KW - permeance KW - cuticular waxes KW - minimum leaf conductance KW - fruit cuticle KW - leaf cuticle KW - Solanaceae KW - Solanum species KW - cuticular transpiration barrier Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-225395 ER -