TY  - JOUR
A1  - Matsuda, Yoichi
A1  - Uno, Yoshinobu
A1  - Kondo, Mariko
A1  - Gilchrist, Michael J.
A1  - Zorn, Aaron M.
A1  - Rokhsar, Daniel S.
A1  - Schmid, Michael
A1  - Taira, Masanori
T1  - A New Nomenclature of Xenopus laevis Chromosomes Based on the Phylogenetic Relationship to Silurana/Xenopus tropicalis
JF  - Cytogenetic and Genome Research
N2  - Xenopus laevis (XLA) is an allotetraploid species which appears to have undergone whole-genome duplication after the interspecific hybridization of 2 diploid species closely related to Silurana/Xenopus tropicalis (XTR). Previous cDNA fluorescence in situ hybridization (FISH) experiments have identified 9 sets of homoeologous chromosomes in X. laevis, in which 8 sets correspond to chromosomes 1-8 of X. tropicalis (XTR1-XTR8), and the last set corresponds to a fusion of XTR9 and XTR10. In addition, recent X. laevis genome sequencing and BAC-FISH experiments support this physiological relationship and show no gross chromosome translocation in the X. laevis karyotype. Therefore, for the benefit of both comparative cytogenetics and genome research, we here propose a new chromosome nomenclature for X. laevis based on the phylogenetic relationship and chromosome length, i.e. XLA1L, XLA1S, XLA2L, XLA2S, and so on, in which the numbering of XLA chromosomes corresponds to that in X. tropicalis and the postfixes ‘L' and ‘S' stand for ‘long' and ‘short' chromosomes in the homoeologous pairs, which can be distinguished cytologically by their relative size. The last chromosome set is named XLA9L and XLA9S, in which XLA9 corresponds to both XTR9 and XTR10, and hence, to emphasize the phylogenetic relationship to X. tropicalis, XLA9_10L and XLA9_10S are also used as synonyms.
KW  - BrdU replication banding pattern
KW  - homoeologous chromosomes
KW  - nomenclature
KW  - Xenopus laevis
KW  - Xenopus tropicalis
Y1  - 2015
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-196748
SN  - 1424-8581
SN  - 1424-859X
N1  - This publication is with permission of the rights owner freely accessible due to an Alliance licence and a national licence (funded by the DFG, German Research Foundation) respectively.
VL  - 145
IS  - 3-4
ER  - 
TY  - THES
A1  - Hacker, Christian
T1  - Beteiligung des Major Vault Proteins an der Kernporenkomplexbildung
T1  - Involvement of the Major Vault Protein in nuclear pore complex formation
N2  - In die Kernmembran von Eukaryoten sind Kernporenkomplexe eingelagert. Diese stellen die einzige Verbindung zwischen dem Nukleo- und Zytoplasma dar und vermitteln den gerichteten Transport von Proteinen und Ribonukleoproteinpartikeln über die Kernhülle. Durch vorangehende Versuche unserer Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass es experimentell möglich ist, die Bildung einer kontinuierlichen Doppelmembran von der Insertion der Kernporenkomplexe zu trennen (Ewald et al., 1997). Dabei spielen verschiedene im Extrakt enthaltene Membranfraktionen eine Rolle. Erst kürzlich wurden in unserer Arbeitsgruppe zwei unterschiedliche Membranfraktionen aus Xenopus Extrakt isoliert, die aufgrund ihrer Dichte als 40% und 30% Membranfraktion benannt wurden. Massenspektrometrische Untersuchungen zeigten, dass sich in der 30% Membranfraktion, welche für die Kernporenkomplexbildung verantwortlich zu sein scheint, das Major Vault Protein (MVP) befindet. MVP ist Hauptbestandteil der Vault-Komplexe, großer tonnenförmiger Ribonukleoproteinpartikel, denen bislang eine Vielzahl von zellulären Funktionen zugeordnet wurden, die meisten davon jedoch noch stark debattiert. Vaults könnten womöglich eine Rolle als Transporter über die Kernporenkomplexe spielen und wurden schon mehrfach mit dem Aufbau einer multiplen Arzneimittelresistenz in Verbindung gebracht. Die Beteiligung von MVP bei der Bildung der Kernporenkomplexe ist eine neue zelluläre Funktion und sollte deshalb in dieser Arbeit näher untersucht werden. In dieser Arbeit wurden zunächst die 40% und 30% Membranfraktionen auf ihr unterschiedliches Verhalten bei der Bildung der Kernhülle separat und in Kombination genauer untersucht. Dabei zeigte sich, dass die 40% Membranfraktion an Chromatin bindet und eine kontinuierliche Doppelmembran aufbaut. Die 30% Membranfraktion konnte alleine nicht an Chromatin binden, induzierte aber in der durch die 40% Membranfraktion gebildeten Doppelmembran den Aufbau von Kernporenkomplexen. Durch Immunfluoreszenzaufnahmen und ultrastrukturelle Untersuchungen wurde belegt, dass das an der 30% Membranfraktion assoziierte MVP für die Bildung von Kernporenkomplexen verantwortlich war. Ferner konnten wir zeigen, dass sowohl MVP als auch Vault-Partikel die de novo Insertion von Kernporenkomplexen in kontinuierliche Doppelmembranen induzieren konnten. Die molekularen Mechanismen der Kernporenkomplexbildung durch MVP wurden mit Hilfe von artifiziellen Lipidmembranen analysiert. Anhand von unilamellaren Liposomen und elektronenmikroskopischen Aufnahmen konnte gezeigt werden, dass MVP die Lipidstruktur beeinflussen und perforieren kann. Zudem löste MVP die Bildung von Poren in schwarzen Lipidmembranen aus und führte zur Messung von Strömen durch Einzelkanalmessungen über die entstandenen Poren. Um die bei dem Prozess der Kernporenkomplexbildung beteiligten Bindungspartner von MVP zu identifizieren, wurden mehrere Protein-Protein-Bindungsstudien durchgeführt. Unter den ermittelten MVP-Bindungspartnern ließen sich keine Nukleoporine mit dem Sequenzmotiv FXFG identifizieren, es ist jedoch nicht auszuschließen, dass MVP bei der Bildung der Kernporenkomplexe mit anderen Nukleoporinen interagiert. Da eine frühere Arbeit die Bedeutung von Mikrotubuli bei der Bildung der Kernporenkomplexe aufzeigte (Ewald et al., 2001), wurden in dieser Arbeit die Interaktionen der isolierten 40% und 30% Membranfraktionen und von MVP mit dem Mikrotubulinetzwerk näher analysiert. Dabei zeigte sich, dass nur die 30% Membranfraktion mit Mikrotubuli interagierte und eine Inhibition der Mikrotubulipolymerisation durch Colchizin den Einbau von Kernporenkomplexen verhinderte. Im Gegensatz dazu interagierten die 40% Membranvesikel nicht mit Mikrotubuli und daher hat eine Colchizin-induzierte Inhibition der Mikrotubulipolymerisation keinen Effekt auf den Aufbau einer kontinuierlichen Doppelmembran. Durch immunfluoreszenzmikroskopische Untersuchungen konnte zudem gezeigt werden, dass die Lokalisation von MVP an der Kernhülle ebenfalls Abhängig von Mikrotubuli ist. Um zu demonstrieren, dass die MVP-induzierte Kernporenkomplexbildung im zellfreien System abhängig vom Transport von MVP zur Kernhülle ist, wurde die Zugabe von MVP zu porenlosen Kernen nach einer Colchizin-Behandlung analysiert. Hierbei konnte belegt werden, dass MVP Mikrotubuli auch benötigt, um die Bildung von Kernporenkomplexen in der Kernmembran zu initiieren. Da Mikrotubulifilamente im zellfreien System mit ihren Plus-Enden gegen die Chromatinoberfläche gerichtet sind, sollten für den gerichteten Transport zum Chromatin Motorproteine der Kinesin-Familie eine Rolle spielen. Durch die Inhibition von Mklp2, einem mitotischen Kinesin, konnte der Aufbau der Kernporenkomplexe durch MVP in porenlosen Kernen blockiert werden.
N2  - In eukaryotes, the nuclear envelope is normally interspersed with numerous nuclear pore complexes, which act as the only gateway between the nucleo- and cytoplasm. Nuclear pore complexes mediate the directed transport of proteins and ribonucleoproteinparticles through the nuclear envelope. Little is known about the assembly of these structures out of various subcomplexes. Interestingly, our group recently linked the Major Vault Protein (MVP) with the assembly of nuclear pore complexes. MVP is the main part of Vault-complexes, huge barrel-shaped ribonucleoproteinparticles with many cellular functions attached, many of them still in debate. Vaults possibly play a role as nuclear transporters and several works exist that connect them with the origin of multiple drug resistance. The involvement in the assembly of nuclear pore complexes depicts a novel cellular function of MVP and should therefore be analyzed in this project. Preceding work with the cell-free system based on Xenopus laevis egg extract showed that the building of a continuous double membrane could be separated from the insertion of nuclear pore complexes and could be assigned to different membrane fractions of the egg extract. (Ewald et al., 1997). Two different membrane fractions were isolated out of Xenopus egg extract and named 40% and 30% membrane fraction according to their density. Mass spectrometric analysis showed that the pore-inducing 30% membrane fraction contained MVP (Dissertation Friederike Vollmar). The first step in this project was the particularly examination of the different behaviour of the 40% and 30% membrane fraction during the formation of the nuclear envelope. Thereby, it could be demonstrated that the 40% membrane fraction binds to chromatin where it builds up a continuous double membrane. The 30% membrane fraction was not able to independently bind to chromatin, but induced the formation of nuclear pore complexes when added to the pore-free nuclei. Immunofluorescent and ultrastructural studies proved that the MVP-associated 30% membrane fraction is responsible in this process. MVP, as well as Vault-particles have the ability to induce the de novo insertion of nuclear pore complexes in continuous double membranes. Artificial lipid membranes were used to study the molecular mechanisms involving MVP during the process of nuclear pore complex assembly. By using unilamellar liposomes and electron microscopy it could be demonstrated that MVP affects and perforates the lipid structure. Furthermore, MVP induced the formation of pores in black lipid membranes and lead to the detection currents by single channel measurement. To identify MVP-binding partners that are involved in the process of nuclear pore complex formation, several protein-protein-interaction studies were performed. The studies showed that no nucleoporins with the sequence motive FXFG could be detected among the MVP-binding partners, but it cannot be ruled out that MVP interacts with other nucleoporins during the formation of nuclear pore complexes. As a previous study showed the importance of microtubules during the assembly of nuclear pore complexes (Ewald et al., 2001), this work analyzed the interactions of the isolated 40% and 30% membrane fraction and of MVP concerning the microtubule network. Thereby, it could be shown that only the 30% membrane fraction was able to interact with microtubules and the colchicines-induced inhibition of microtubule polymerisation prevented the insertion of nuclear pore complexes. In contrast, the 40% membrane vesicles did not interact with microtubules and the colchicine-induced inhibition of microtubule assembly had no effect on the constitution of a continuous double membrane. In the next step, immunofluorescence studies demonstrated that the nuclear localisation of MVP is also dependent on microtubules. To demonstrate that the MVP-induced formation of nuclear pore complexes also depends on the microtubule-driven transport of MVP towards the nuclear membrane, the addition of MVP to pore-free nuclei was monitored after colchicine treatment. Hereby, it could be shown that MVP also needed microtubules to initiate the assembly of nuclear pore complexes. As the plus-ends of microtubules are directed towards the chromatin surface in the cell-free system, the directed transport in the direction of chromatin should be mediated by motor proteins of the Kinesin family. The inhibition of Mklp2, a mitotic Kinesin, prevented the assembly of nuclear pore complexes in Xenopus egg extract. The MVP-mediated de novo assembly of nuclear pore complex therefore is accomplished by the microtubule-transport of MVP via Mklp2.
KW  - Ribonucleoproteine
KW  - Kernhülle
KW  - Kernpore
KW  - Kernporenkomplex
KW  - Major Vault Protein
KW  - Vault
KW  - Kernhüllenbildung
KW  - Xenopus laevis
KW  - Nuclear pore complex
KW  - Major Vault Protein
KW  - Vault
KW  - Nuclear envelope assembly
KW  - Xenopus laevis
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51279
ER  - 
TY  - THES
A1  - Vollmar, Friederike Lara Veronika
T1  - Analyse der Kernhüllenbildung am Modellsystem Xenopus laevis
T1  - Studying nuclear envelope assembly in the cell-free system derived from Xenopus laevis eggs
N2  - Die Kernhülle ist eine hoch spezialisierte Membran, die den eukaryotischen Zellkern umgibt. Sie besteht aus der äußeren und der inneren Kernmembran, die über die Kernporenkomplexe miteinander verbunden werden. Die Kernhülle reguliert nicht nur den Transport von Makromolekülen zwischen dem Nukleoplasma und dem Zytoplasma, sie dient auch der Verankerung des Chromatins und des Zytoskeletts. Durch diese Interaktionen hilft die Kernhülle, den Zellkern innerhalb der Zelle und die Chromosomen innerhalb des Zellkerns zu positionieren, und reguliert dadurch die Expression bestimmter Gene. In höheren Eukaryoten durchlaufen sowohl die Kernhülle, als auch die Kernporenkomplexe während der Zellteilung strukturelle Veränderungen. Zu Beginn der Mitose werden sie abgebaut, um sich am Ende der Mitose in den Tochterzellen erneut zu bilden. Die molekularen Mechanismen, die zum Wiederaufbau der Kernhülle führen, sind kaum geklärt. Ein geeignetes System, um bestimmte Ereignisse bei der Kernhüllenbildung zu untersuchen, liefert das zellfreie System aus Xenopus Eiern und Spermienchromatin (Lohka 1998). Es konnte bereits früher gezeigt werden, dass es im Eiextrakt von Xenopus laevis mindestens zwei verschiedene Vesikelpopulationen gibt, die zur Bildung der Kernhülle beitragen. Eine der Vesikelpopulationen bindet an Chromatin, fusioniert dort und bildet eine Doppelmembran. Die andere Vesikelpopulation bindet an die bereits vorhandene Doppelmembran und sorgt für die Ausbildung der Kernporenkomplexe. Ziel dieser Arbeit war es, diese beiden Membranfraktionen zu isolieren und zu charakterisieren, wobei das Hauptinteresse in der porenbildenden Membranfraktion lag. Durch Zentrifugation über einen diskontinuierlichen Zuckergradienten konnten die Membranvesikel in zwei verschiedene Vesikelfraktionen aufgetrennt werden. Eine Membranfraktion konnte aus der 40%igen Zuckerfraktion („40% Membranfraktion“) isoliert werden, die andere aus der 30%igen Zuckerfraktion („30% Membranfraktion“). Die verschiedenen Membranfraktionen wurden zu in vitro Kernen gegeben, in denen die Kernporen durch vorausgegangene Bildung von Annulate Lamellae depletiert worden waren. Nach Zugabe der 30% Membranfraktion konnte die Bildung von funktionalen Kernporen beobachtet werden. Im Gegensatz dazu zeigte die 40% Membranfraktion keine porenbildenden Eigenschaften. Unter Verwendung eines vereinfachten Systems, bestehend aus Zytosol, Spermienchromatin und den Membranen, wurde gezeigt, dass die 40% Membranfraktion an Chromatin bindet und ausreichend ist, um eine kontinuierliche Doppelmembran ohne Kernporen zu bilden. Die 30% Membranfraktion besitzt keine Chromatinbindungseigenschaften und wird aktiv entlang von Mikrotubuli zu den porenlosen Kernen transportiert. Dort interagiert sie mit der chromatingebundenen 40% Membranfraktion und induziert die Porenbildung. Nach dem Vergleich der Proteinzusammensetzung der beiden Membranfraktionen, konnte das Major Vault Protein (MVP) nur in der porenbildenden Membranfraktion gefunden werden. MVP ist die Hauptstrukturkomponente der Vault-Komplexe, einem Ribonukleo-proteinpartikel, der in den meisten eukaryotischen Zellen vorhanden ist (Kedersha et al., 1991). Bemerkenswerterweise wird über die Funktion der Vault-Komplexe, trotz ihrer übiquitären Expression und ihrem Vorkommen in fast allen eukaryotischen Zellen, immer noch diskutiert. Um mehr über die Funktion und die Lokalisation der Vaults/MVP zu lernen, wurden die Vaults in Anlehnung an die Methode von Kedersha und Rome (1986) aus Xenopus Eiern isoliert. Zusätzlich wurde rekombinantes Xenopus MVP hergestellt, das unter anderem für die Produktion von Antikörpern in Meerschweinchen verwendet wurde. Um herauszufinden, ob die Anwesenheit von MVP in der 30% Membranfraktion in direktem Zusammenhang mit deren porenbildender Eigenschaft steht, wurden gereinigte Vault-Komplexe oder rekombinantes MVP, das alleine ausreichend ist, um in sich zu den charakteristischen Vault-Strukturen zusammenzulagern, zu porenlosen Kernen gegeben. Sowohl gereinigte Vault-Komplexe, als auch rekombinantes MVP waren in der Lage in den porenlosen Kernen die Bildung von funktionalen Kernporen zu induzieren. Untersuchungen zur Lokalisation von MVP zeigten, dass MVP teilweise an der Kernhülle und den Kernporenkomplexen lokalisiert, während der Großteil an MVP zytoplasmatisch vorliegt. Dies sind die ersten Daten, die Vaults/MVP mit der Kernporenbildung in Verbindung bringen. Deshalb bietet diese Arbeit die Grundlage, um diese unerwartete Rolle der Vaults in Zukunft genauer zu charakterisieren.
N2  - The nuclear envelope (NE) is a highly specialized membrane that delineates the eukaryotic cell nucleus. It is composed of the inner and outer nuclear membranes that are connected by the nuclear pore complexes (NPCs). The NE not only regulates the trafficking of macromolecules between nucleoplasm and cytosol but also provides anchoring sites for chromatin and cytoskeleton. Through these interactions, the NE helps position the nucleus within the cell and chromosomes within the nucleus, thereby regulating the expression of certain genes. In higher eukaryotic cells, both NE and NPCs undergo structural changes during cell division as they disassemble at the onset of mitosis and need to reform in the daughter cells at the end of mitosis. The molecular mechanisms governing the reassembly of the NE are only poorly understood. A particular suitable system to analyze specific events involved in NE assembly is provided by the cell-free system based on Xenopus egg extract and sperm chromatin (Lohka 1998). Previously it could be shown that in Xenopus egg extract there exist at least two different vesicle populations that are involved in nuclear envelope assembly. One type of vesicle binds to chromatin where it fuses and forms a bilayered nuclear envelope. The other vesicle population binds to the double nuclear membrane and is required for nuclear pore complex formation. Aim of this study was to isolate and characterize these two membrane fractions with special regard to the pore-forming membrane fraction. By centrifugation on a discontinuous sucrose gradient the membrane vesicles could be separated into two different vesicle fractions. One membrane fraction was recovered from the 40% sucrose fraction (“40% membrane fraction”) and the other one from the 30% sucrose fraction (“30% membrane fraction”). The different membrane fractions were added to in vitro nuclei, where nuclear pores were depleted by formation of annulate lamellae. After addition of the 30% membrane fraction formation of functional nuclear pores could be observed. In contrast the 40% membrane fraction had no pore-forming property. Using a simplified system consisting of cytosol, spermchromatin an membranes it was demonstrated that the 40% membrane fraction binds to chromatin and is sufficient to form a continuous double membrane without NPCs. The 30% membrane fraction lacks chromatin targeting signals and is actively transported along microtubules to the pore-free nuclei. There it interacts with the chromatin-bound 40% membranes and induces formation of NPCs. Comparing the protein composition of both membrane fractions, the major vault protein (MVP) was found to be exclusively in the pore-inducing membrane fraction. MVP is the major structural component of vaults, a ribonucleoprotein particle found in most eukaryotic cells (Kedersha et al., 1991). Remarkably, despite their ubiquitous expression and abundance in nearly all eukaryotic cells, the functional role of vaults is still being debated. To learn more about the functional role and localization of vaults/MVP, vaults were isolated from Xenopus eggs following the procedure of Kedersha and Rome (1986). In addition recombinant Xenopus MVP was prepared and used to generate antibodies in guinea pigs. To find out whether the presence of MVP in the 30% membrane fraction is related to its pore-forming capacity, purified vault complexes or recombinant MVP, which alone is sufficient to selfassemble into the characteristic vault structure, were added to poreless nuclei. Both purified vaults and recombinant MVP induce the formation of functional NPCs in the pore-free nuclei. Studying the localization of MVP it was demonstrated, that MVP localizes in part at the nuclear envelope and the nuclear pore complexes, whereas most MVP is cytoplasmically. These are the first data that link vaults/MVP to NPC assembly. Therefore this work displays fundamental features to study this unexpected role of vaults in more detail.
KW  - Kernhülle
KW  - Kernporenkomplex
KW  - Major Vault Protein
KW  - Xenopus laevis
KW  - nuclear envelope assembly
KW  - nuclear pore complexes
KW  - major vault protein
KW  - Xenopus laevis
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-29298
ER  - 
TY  - THES
A1  - Gareiß, Martin
T1  - Molekulare Charakterisierung und entwicklungsspezifische Expression der Kernmembranproteine Emerin und MAN1 im Tiermodell Xenopus laevis
T1  - Molecular characterization and developmental expression of the nuclear membrane proteins ,emerin’ and ,MAN1’ in the model system Xenopus laevis
N2  - Mutationen im humanen Emerin-Gen verursachen beim Menschen eine angeborene Muskelschwäche, die X-gebundene Emery-Dreifuss. Der Phänotyp dieser Störung manifestiert sich in der zweiten und dritten Lebensdekade durch Verkürzungen der Nacken , Ellenbogen- und Achillessehnen, progressiven Muskelschwund am Oberkörper sowie Störung der Reizweiterleitung und eine Kardiomyopathie. Zwar wurden die Funktionen dieses ubiquitären Kernmembranproteins bislang intensiv erforscht, allerdings blieben die krankheitsverursachenden Mechanismen, die für den späten Ausbruch der gewebespezifischen Erkrankung verantwortlich sind, noch weitestgehend unverstanden. Um Erkenntnisse über die pathologische(n) Funktion(en) des integralen Membranproteins Emerin zu gewinnen, wurde dessen spatio-temporäre Transkriptions- und Expressionsmuster während der frühen Embryonalentwicklung im Modellsystem Xenopus laevis charakterisiert. Durch EST-Datenbankanalysen konnten in der pseudotetraploiden Spezies zwei Emerin-Gene (Xemerin1 und -2) identifiziert werden. Im Unterschied zu dem längeren Säuger-Emerin (254 Reste bei Homo sapiens ) konnte allerdings kein Kernlokalisationssignal und auch kein serinreicher Sequenzbereich festgestellt werden. Durch Herstellung monoklonaler Antikörper wurde die subzelluläre und gewebespezifische Lokalisation der Xemerin-Proteine untersucht. Interessanterweise war Xemerin weder in der Immunfluoreszenz noch im Immunblot in Oozyten nachweisbar. Mit dem zweidimensionalen Gelektrophorese-Verfahren NEPHGE konnte gezeigt werden, dass der von uns hergestellte monoklonale Antikörper 59/7 beide Xemerin-Formen erkannte und die Proteine durch unterschiedliche molekulare Massen und isoelektrische Punkte voneinander zu trennen waren. Durch Immunoblotting embryonaler Proteine aus unterschiedlichen Entwicklungsstadien konnte gezeigt werden, dass Xemerin1 und -2 im Laufe der Embryogenese von Xenopus laevis erstmals im Entwicklungsstadium 43 exprimiert werden. Unerwarteterweise konnte durch RT-PCR-Analysen eine Aktivität der Xemerin-Gene während der gesamten Embryogenese belegt werden. Northernblot- und Sequenzanalysen der Xemerin-mRNA zeigten außerordentlich große untranslatierte Bereiche mit snRNP-Bindungsmotiven. Durch zwei voneinander unabhängige Analyseverfahren wurde festgestellt, dass die Xemerin-Genaktivität ab dem Stadium 30 deutlich zunahm. Äußerst interessant war in diesem Zusammenhang die Beobachtung, dass exakt zu diesem Zeitpunkt die Aktivität des XMAN1-Gens, einem weiteren Protein der inneren Kernmembran, signifikant herunterreguliert wurde. Whole-mount in situ Hybridisierungsversuche zeigten einen Xemerin-Expressionsschwerpunkt in neuro-ektodermalen Geweben von Tadpole-Embryonen, wie dies auch von XMAN1 (auch SANE genannt) berichtet wurde. Aufgrund dieser Erkenntnisse wurde angenommen, dass Xemerin und XMAN1 überlappende Funktionen aufweisen. Durch die Herstellung rekombinanter Fusionproteine konnte gezeigt werden, dass XMAN1 eine identische subzelluläre Verteilung wie Xemerin aufwies. In vitro Bindungsassays wiesen eine direkte Wechselwirkung von XMAN1 mit beiden Xemerin-Formen sowie mit Xenopus Lamin A nach. Diese Arbeit konnte durch die Charakterisierung von Xenopus Emerin die Grundlagen für weitere intensive Forschungen legen und zeigt eindeutig, dass das Modellsystem Xenopus laevis mit dem Säugermodell Maus konkurrenzfähig ist, um die krankheitsverursachende Mechanismen der Emery-Dreifuss Muskeldystrophie aufzuklären.
N2  - Mutations in the human emerin gene EMD cause a rare form of an inheritated muscle dysfunction of striated muscle, named Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD1; OMIM 310300). The clinical phenotype of this genetic perturbance is manifested in 2nd-3rd decade by contraction of the cervical, elbow and Achilles tendons, by progressive muscle wasting and disturbance of the conduction system and cardiomyopathy, often leading to sudden death. Extensive investigations were made on the functions of this ubiquitous nuclear membrane protein, but the disease causing mechanisms remain obscure leading to the late onset of this tissue specific disease. To allure insights of the pathological function(s) of emerin this work examines the spatio-temporal transcription and expression patterns of emerin during development of the vertebrate model Xenopus laevis. Sequence analysis of EST-databases identified two emerin genes in the pseudo-tetraploid organism Xenopus laevis, Xemerin1 and Xemerin2, respectively. In comparison to the human and murine orthologues Xenopus emerins exhibit both similarities and differences. Structural analyses revealed an N-terminal conserved LEM-domain in the C-terminus and a unique hydrophobic transmembrane domain in the carboxy tail. Unlike the extended mammalian emerin (Homo sapiens 254 residues, Mus musculus 259 residues) neither a nucleus localization signal nor a serinerich region could be detected. However, comparison of the putative phosphorylation sites showed three equivalent sites as for the human emerin. Synthesis of specific monoclonal antibodies and recombinant fusion proteins elucidate the subcellular and tissue-specific localization of Xemerins. Similar to mammalian emerins immunofluorescence microscopy and immunoblotting showed clearly that both Xemerin1 and Xemerin2 are integral nuclear membrane proteins expressing ubiquitously in differentiated cells. Intriguingly, in oocytes Xemerin was undetectable by immunofluorescence and immunoblotting, respectively. Two-dimensional gel electrophoresis NEPHGE proved that our self-made monoclonal antibody 59/7 recognized both Xemerins highlighting two different molecular masses and isoelectric points. Interestingly, Xemerin2 exhibits an increased isoelectric point in 5-days old larvae than in adult somatic culture cells. Immunoblotting of embryonic proteins derived from different developmental stages showed that Xemerin1 and -2 are expressed in stage 43 (Nieuwkoop and Faber, 1975) during Xenopus embryogenesis for the first time. In this context, it is noteworthy that Xenopus A-type lamins – in contrast to previous reports – are already detectable in stage 28. Unexpectedly, RT-PCR analyses proved activity of the Xemerin genes during entire embryogenesis in all stages examined yet. Northern-blotting and sequence analyses of the Xemerin mRNA revealed exceeding untranslated regions with snRNP binding motives. Two independent techniques (band-quantification and quantitative real-time-PCR) bared a significantly increased activity of the Xemerin-genes upon stage 30. Outstanding interest provided the awareness, that exactly at this moment the activity of XMAN1, another inner nuclear membrane protein, was significantly down regulated. Whole mount in situ hybridizations exhibited stressed Xemerin expression in neuro-ectodermal tadpole tissues, as simultaneously reported for XMAN1 (also known as SANE) by to other groups (Osada et al., 2003; Raju et al., 2003). Congruent expression patterns of Xemerin proteins were provided by indirect immunofluorescence of embryonic thin-sections. These results corroborate the theory that XMAN1 and Xemerin could have overlapping functions. At first, recombinant fusion proteins showed an identical subcellular distribution of XMAN1 in comparison with Xemerin. Hence, in vitro binding assays proved direct interaction between Xemerins and XMAN1 as well as with Xenopus A-type lamins. Unfortunately, there is no functional XMAN1 antibody available up to now. Thus, it remains unclear if XMAN1 has overlapping functions with Xemerins during embryogenesis in vivo. Nevertheless, by characterizing Xenopus emerin this work displayed fundamental features for further studies. This opus definitely showed that the model system Xenopus laevis is competitive to the mammalian model ‘mouse’ elucidating the disease causing mechanisms of Emery-Dreifuss muscular dystrophy.
KW  - Glatter Krallenfrosch
KW  - Emerin
KW  - Oozyte
KW  - Xenopus laevis
KW  - Emerin
KW  - MAN1
KW  - Oozyte
KW  - Embryonalentwicklung
KW  - Xenopus laevis
KW  - emerin
KW  - MAN1
KW  - oocyte
KW  - early development
Y1  - 2006
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-19869
ER  - 
TY  - THES
A1  - Körner, Ulrich
T1  - Funktionelle Rolle von HMGN-Proteinen während der Embryonalentwicklung von Xenopus laevis
T1  - The functional role of the HMGN proteins during embryogenesis of Xenopus laevis
N2  - HMGN Proteine sind Architekturelemente des Chromatins und besitzen die Fähigkeit, Chromatin aufzulockern. Sie ermöglichen anderen Proteinen den Zugang zu Nukleosomen und unterstützen DNA-abhängige Prozesse wie Replikation, Transkription und DNA-Reparatur. In dieser Arbeit wurde die funktionelle Rolle der HMGN Proteine während der Embryogenese am Beispiel des südafrikanischen Krallenfroschs Xenopus laevis untersucht. Dabei wurde entdeckt, dass sowohl die Expression als auch die zelluläre Verteilung der HMGN Proteine entwicklungsspezifisch reguliert ist. Eine Manipulation der HMGN Proteinmengen während der Embryonalentwicklung führte zu schweren Fehlentwicklungen in Postblastula Embryonen. In der Oogenese waren sowohl Xenopus HMGN mRNAs als auch Xenopus HMGN Proteine in allen Oozytenstadien nachweisbar. Interessanterweise waren HMGN Proteine in späteren Oozytenstadien nur im Zytoplasma zu finden und nicht mit Lampenbürstenchromosomen assoziiert. Im Zuge der Maturation der Oozyten zu Eiern verschwinden die Proteine gänzlich. Während der Embryogenese waren HMGN Proteine dann erst wieder ab der Blastula detektierbar, zeitgleich mit der transkriptionellen Aktivierung des embryonalen Genoms. Gleichzeitig wiesen ihre Expressionsmuster, zumindest auf mRNA-Ebene, auf Gewebspezifität hin. Whole mount in situ-Hybridisierungen und RT-PCR-Analysen zeigten eine erhöhte mRNA-Menge in mesodermalen und neuroektodermalen Geweben von Schwanzknospenstadien. Nach Injektion rekombinanter HMGN Proteine (Überexpression) oder Morpholino-Antisense-Oligonukleotiden (knock-down) in die Zygote entwickelten sich Embryonen mit offenen Rücken, stark verkürzten und gebogenen Körperachsen und deformierten Kopfstrukturen als Hauptmerkmale. Histologische Analysen und insbesondere die Magnetresonanz Bildgebung deuteten auf Fehler in der Mesodermdifferenzierung hin. Die Analysen zeigen, dass eine bestimmte kritische zelluläre HMGN Proteinmenge für eine korrekte Embryonalentwicklung von Xenopus laevis notwendig ist. Durch „animal cap assays“ und RT-PCR-Expressionsanalysen Mesoderm-spezifischer Gene konnte schließlich gezeigt werden, dass HMGN Proteine die Regulation Mesoderm-spezifischer Gene beeinflussen. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass auch die HMGN-Genexpression während der Mesodermdifferenzierung reguliert wird. Durch eine Analyse des Expressionsbeginns entwicklungsrelevanter Gene während der Midblastula Transition konnte gezeigt werden, dass veränderte HMGN Proteinmengen den Expressionsbeginn spezifischer Gene wie Xbra und chordin beeinflussen. Damit konnte zum ersten Mal ein Einfluss dieser ubiquitären Chromatinproteine auf die Expression spezifischer Gene gefunden werden. Die durch HMGN Proteine verursachte fehlerhafte Expression von Xbra und chordin als Schlüsselgene der Mesodermdifferenzierung kann die Fehlentwicklungen mesodermaler Strukturen erklären.
N2  - HMGN proteins are architectural chromatin proteins that reduce the compaction of the chromatin fiber, facilitate access to nucleosomes and modulate DNA-dependent processes such as replication, transcription and DNA repair. In this work the functional role of the HMGN proteins during embryogenesis was analyzed using the African clawed frog Xenopus laevis as a model system. The expression and cellular location of the HMGN proteins was found to be developmentally regulated. Experimental manipulations of the HMGN protein amounts led to gross developmental defects in postblastula embryos. HMGN transcripts and proteins were present throughout oogenesis. Interestingly, the HMGN proteins were stored in the cytoplasm of later oocyte stages and excluded from the oocytes nuclei and lampbrush chromosomes. Upon maturation of oocytes into eggs, HMGN proteins were no longer detectable. During embryogenesis, HMGN proteins were first detected in blastula stage embryos, coinciding with the transcriptional activation of the embryonic genome. At least at the mRNA level the expression pattern showed a tissue specific pattern, with relatively high levels of mRNAs in the mesodermal and neuroectodermal regions of early tailbud embryos as shown by whole mount in-situ hybridization and RT-PCR-analyses. After microinjection of recombinant HMGN proteins (overexpression) or morpholino-antisense oligonucleotides (knock-down) the embryos displayed typical phenotypes with imperfect closure of the blastopore, distorted body axis and abnormal head structures. Histological analyses and magnetic resonance imaging indicated that mesoderm differentiation was particularly affected by aberrant HMGN protein levels. The results demonstrate that proper embryonic development of Xenopus laevis requires precisely regulated levels of HMGN proteins. “Animal cap assays” and RT-PCR-analyses of the expression of mesodermal genes indicated that HMGN proteins are involved in the regulation of mesoderm specific genes. These experiments also indicated that the HMGN expression itself is regulated during mesoderm differentiation. Moreover, by studying the expression pattern of developmentally relevant genes during midblastula transition it became evident that altered HMGN protein levels influence the onset of the expression of specific genes such as Xbra and chordin. The results show, for the first time, that these ubiquitous chromatin proteins modulate the expression of specific genes. The HMGN-induced misexpression of Xbra and chordin as key regulatory genes during mesoderm differentiation may explain the observed malformations of mesodermal structures.
KW  - Glatter Krallenfrosch
KW  - HMG-Proteine
KW  - Genexpression
KW  - Embryonalentwicklung
KW  - HMGN Proteine
KW  - Xenopus laevis
KW  - Genexpression
KW  - Chromatin
KW  - Embryonalentwicklung
KW  - HMGN proteins
KW  - Xenopus laevis
KW  - chromatin
KW  - gene expression
KW  - early development
Y1  - 2004
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9166
ER  - 
TY  - THES
A1  - Arndt, Petra
T1  - Klonierung und funktionelle Charakterisierung von organischen Kationentransportern aus der Rattenniere
T1  - Cloning and functional characterization of organic cation transporters from rat kidney
N2  - Der organische Kationentransport im proximalen Tubulus der Niere spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase der Körperflüssigkeiten und der Ausschleusung von toxischen organischen Kationen. Der Transport von organischen Kationen wird an der Bürstensaummembran durch den H+/organische Kationen-Austauscher vermittelt, während bei dem Transport von organischen Kationen an der basolateralen Membran das nach innen gerichtete negative Membranpotential eine treibende Kraft darstellt. Durch Expressionsklonierung wurde der erste organische Kationentransporter, rOCT1, aus der Rattenniere isoliert. Kurz darauf wurde im Rahmen dieser Arbeit ein zweiter organischer Kationentransporter ebenfalls aus der Ratenniere kloniert. rOCT2 besteht aus 593 Aminosäuren und besitzt 12 putative Transmembrandomänen. Zum funktionellen Vergleich zwischen rOCT1 und rOCT2 wurde das Oozytenexpressionssystem verwendet. In der vorliegenden Arbeit wurde ein pharmakologisches Profil von rOCT2 erstellt. Das Substratsprektrum von rOCT2 ist dem von rOCT1 sehr ähnlich. Die Affinitäten von rOCT2 gegenüber verschiedenen Substanzen wurden direkt mit denen von rOCT1 verglichen. Einerseits fanden wir bei einigen Substraten Unterschiede in den Km- und Vmax-Werten, aber andererseits auch viele Ähnlichkeiten zwischen beiden Transportern. Anionen (z. B. p-Aminohippurat) wurden als neue Gruppe von Inhibitoren für den durch rOCT1- und rOCT2-vermittelten Transport identifiziert. Die Potentialdifferenz ist die treibende Kraft des rOCT1- und rOCT2-vermittelten Transportes. Wir konnten potentialabhängige Veränderungen der Km-Werte von Cholin-induzierten Einwärtsströmen zeigen. Bei dem Austausch von Na+-Ionen gegen K+-Ionen im Reaktionspuffer wurde die Aufnahme von Cholin und MPP durch rOCT2 erniedrigt. Der bidirektionale Transport von MPP wurde gezeigt und trans-Stimulationsexperimente für MPP-Influx und MPP-Efflux durchgeführt, um die Asymmetrie des Transporters zu studieren. Darüberhinaus wurde in der vorliegenden Arbeit die Interaktion von verschiedenen Substraten mit rOCT1 und rOCT2 untersucht und ein kompetitver und nicht-kompetitiver Hemmtyp bei der TEA-Aufnahme gefunden.
N2  - Organic cation transport in the renal tubule is an important physiological function for the maintenance of body fluid homeostasis and detoxification of harmful organic cations. In general, transport of organic cations in brush-border membranes is mediated by the H+/organic cation antiporter, whereas transport of organic cations in basolateral membranes is stimulated by the inside-negative membrane potential. By the expression cloning method, the organic cation transporter rOCT1, which is expressed in rat liver and kidney, was isolated. In 1996 another organic cation transporter from rat kidney, rOCT2, was isolated by homology cloning. rOCT2 was deduced to be a glycoprotein comprised of 593 amino acid residues with 12 putative transmembrane domains. To analyse the functional characteristics of rOCT2 in comparison with rOCT1 we utilized the Xenopus expression system. During this dissertation a pharmacological profile was made for rOCT2. The apparent substrate spectrum of rOCT2 was similar to that of rOCT1. Affinities of rOCT2 against several compounds were directly compared with those of rOCT1. We found differences in Km- and IC50-values for distinct substrates but also a lot of similarities between both transporters. Anions like p-aminohippuric acid were identified as a new group of inhibitors for rOCT1- and rOCT2-mediated transport. The potential difference is the driving force of transport mediated by rOCT1 and rOCT2. We showed the potential-dependent changes of Km-values of choline induced inward currents. Further when extracellular Na+ ions were replaced with K+ ions, the uptake of MPP and choline by rOCT2 was decreased. The bidirectional transport of MPP was shown and trans-sitmulation experiments for MPP influx and efflux were performed to study asymmetry of the transporter. The mechanism of interaction of several substrates with rOCT1 and rOCT2 were investigated and we found competitive and non-competitive inhibition of TEA uptake.
KW  - Ratte
KW  - Niere
KW  - Kation
KW  - Stofftransport <Biologie>
KW  - Molekularbiologie
KW  - rOCT1
KW  - rOCT2
KW  - proximaler Tubulus
KW  - Niere
KW  - Sekretion
KW  - Xenopus laevis
KW  - Oozyte
KW  - Transport
KW  - Inhibition
KW  - Homologieklonierung
KW  - rOCT1
KW  - rOCT2
KW  - proximal tubule
KW  - kidney
KW  - secretion
KW  - Xenopus laevis
KW  - oocyte
KW  - transport
KW  - inhibition
KW  - homology cloning
Y1  - 2000
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-793
ER  -