TY  - THES
A1  - Kretzschmar, Benedikt
T1  - AZT-Resistenz bei Foamyviren
T1  - AZT-resistant foamyvirus
N2  - Azidothymidin (AZT) ist ein nukleosidischer Reverse-Transkriptase-Inhibitor (NRTI), der bei HIV-Infektionen in Kombination mit anderen antiretroviralen Substanzen eingesetzt wird. AZT zeigt darüberhinaus auch eine gute Wirksamkeit gegen Foamyviren, eine Subfamilie der Retroviren mit charakteristischen Besonderheiten in ihrer Molekularbiologie und ihrem Replikationszyklus, deren Vertreter verschiedene Affenarten und andere Säugetiere infizieren, wobei sie sich sowohl im jeweils natürlichen Wirt als auch bei seltener zufälliger Infektion des Menschen apathogen zeigen. In der vorliegenden Arbeit wurde das AZT-resistente Foamyvirus SFVmacAZTres untersucht, das in Anwesenheit steigender AZT-Konzentrationen in Zellkultur selektiert worden war. Hierzu wurde SFVmacAZTres zunächst einer genotypischen Analyse unterzogen, wobei im Vergleich mit der wildtypischen Ausgangssequenz zwei Mutationen in gag und vier Mutationen in pol nachgewiesen wurden, die zu Änderungen auf Aminosäureebene führten. Mittels PCR wurden Fragmente, die alle sechs Mutationen oder nur die vier pol-Mutationen enthielten, aus der Sequenz von SFVmacAZTres amplifiziert und jeweils in einen SFVmac-Klon eingefügt. Im weiteren Verlauf zeigte sich dabei kein Unterschied zwischen diesen beiden Konstrukten bezüglich der Replikation in Abwesenheit oder Anwesenheit von AZT, so dass gefolgert werden konnte, dass die gag-Mutationen keinen Beitrag zur AZT-Resistenz leisten. Die pol-Mutationen befanden sich sämtlich im für die Reverse Transkriptase kodierenden Bereich und führten zu den Aminosäuresubstitutionen K211I, I224T, S345T und E350K. An Position 224 fand sich dabei in einer veröffentlichten Sequenz bereits ein Threonin, so dass hier unabhängig von der Selektion in Anwesenheit von AZT möglicherweise ein Polymorphismus vorliegt. Der Vergleich der vier Mutationen der RT von SFVmacAZTres mit den bei HIV bekannten Mustern an Mutationen wie den TAMs und dem Q151M-Komplex zeigte keine Übereinstimmungen. Um den jeweiligen Beitrag der vier nachgewiesenen pol-Mutationen zur AZT-Resistenz zu untersuchen, wurden sie einzeln und in Kombinationen mittels zielgerichteter Mutagenese in einen SFVmac-Klon eingefügt und die entsprechenden Konstrukte auf ihre Replikation in Abwesenheit und Anwesenheit von 0,5 µM, 5µM und 50 µM AZT untersucht. Hierfür wurden 293T-Zellen mit dem jeweiligen Plasmid transfiziert und nach Überprüfung der gleichmäßigen Expression von Gag und Pol mittels Western Blot der virushaltige Überstand auf Zielzellen gegeben und der Titer ausgezählt. Es konnte gezeigt werden, dass keines der Konstrukte mit Einzel , Doppel- und Dreifachmutationen eine ähnlich ausgeprägte AZT-Resistenz wie die Vierfachmutante aufwies, allerdings einige in unterschiedlichen Ausmaß teilresistent waren, während andere weder ohne noch mit AZT gut replizierten. S345T erwies sich vor E350K als die Mutation mit dem größten Beitrag zur AZT-Resistenz, I224T erhöhte den Titer in Abwesenheit und Anwesenheit um etwa den gleichen Faktor, wohingegen sich K211I in den meisten Kombinationen eher negativ auswirkte. Der Klon, in den alle vier Mutationen mittels zielgerichteter Mutagenese eingeführt worden waren, zeigte die gleiche AZT-Resistenz wie das in Zellkultur selektierte Virus. Damit war gezeigt, dass diese vier Mutationen sowohl notwendig als auch hinreichend für die AZT-Resistenz von SFVmacAZTres sind. Die pol-Mutationen von SFVmacAZTres wurden weiterhin soweit möglich an entsprechenden Stellen in Klon des prototypischen Foamyvirus PFV eingeführt, bei dem es zuvor nicht gelungen war, ein resistentes Isolat in Zellkultur zu generieren. Das PFV-Konstrukt mit den Mutationen aus SFVmacAZTres zeigte sich jedoch nicht AZT-resistent, sondern wies einen Replikationsdefekt auf. Einige HIV-Mutationen, die in den PFV-Klon eingefügt wurden, führten ebenfalls zu keiner AZT-Resistenz. Es bestehen also bezüglich AZT-Resistenz und damit gewisser Eigenschaften der Reversen Transkriptase deutliche Unterschiede zwischen PFV und SFVmac. Die durchgeführten Arbeiten stellen die Grundlage für weitere Untersuchungen dar, in denen beispielsweise dem biochemischen Mechanismus der AZT-Resistenz von SFVmacAZTres nachgegangen werden kann. Die gewonnenen Erkenntnisse können zum Verständnis allgemeiner Mechanismen der NRTI-Resistenz bei Retroviren ebenso beitragen wie zur weiteren Charakterisierung der foamyviralen Reversen Transkriptase an sich.
N2  - Zidovudine or azidothymidine (AZT) is a nucleoside analog reverse transcriptase inhibitor (NRTI) which is used together with other substances for therapy of HIV infections. AZT can also be used to suppress foamy virus replication, a subfamily of retroviruses with distinct molecular biology and replication. AZT resistant foamy virus (SFVmacAZTres) which was generated in cell culture in presence of increasing AZT concentrations was analyzed in this study. First, a genotypic analysis was conducted, which showed 2 mutations in gag and 4 mutations in pol of this resistant virus when compared to the wildtype sequence. Infectious clones harbouring all 6 mutations or only the pol-mutations were constructed by amplifying the corresponding sequence of the resistant virus and cloning them into the wildtype sequence. There was no difference regarding virus replication in absence or presence of AZT between the virus with gag- and pol-mutations and the virus only harbouring the pol-mutations. Using site directed mutagenesis, the four pol mutations, namely K211I, I224T, S345T and E350K and double and triple combinations thereof were inserted into the infectious clone of SFVmac. These mutants, as well as the wildtype clone and the clone with all 4 mutations were compared in absence of AZT and at AZT concentrations of 0,5, 5, and 50 µM, using these concentrations in the virusproducing 293T-cell as well as in the target cells, BHKLTRlacZ. By counting of blue, and thereby, virus infected cells, it was demonstrated that no single, double or triple mutant displayed the same AZT resistance as the original resistant virus with all 4 mutations. Some combinations displayed deleterious effects, others partial resistance. S345T was identified as the most important mutation regarding AZT-resistance, while E350K and K211I only showed effects in combinations with other mutations and at high AZT concentrations. I224T raised the viral titre, which is reduced in absence of AZT by the other mutations, in absence or presence of AZT by the same factor. The mutations identified in SFVmac were also cloned in PFV. However, a AZT resistant PFV could not be generated.
KW  - Spumaviren
KW  - Reverse Transkriptase
KW  - Zidovudin
KW  - Resistenz
KW  - SFVmac
KW  - azidothymidine
KW  - foamy virus
KW  - reverse transcriptase
KW  - resistance
KW  - SFVmac
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-30272
ER  - 
TY  - THES
A1  - Gärtner, Kathleen
T1  - Abschätzung der Genauigkeit der foamyviralen Genomreplikation
T1  - Accuracy estimation of foamy virus genome copying
N2  - Foamyviren (FVs) sind die genetisch stabilsten Viren der Retrovirus-Familie. Dies steht im Gegensatz zur Fehlerrate, die für die rekombinante FV Reverse Transkriptase (RT) gefunden wurde. Um die Genauigkeit der FV Genomreplikation in vivo zu ermitteln, analysierten wir das Auftreten von Mutationen nach FV-Vektortransfer in einer einzigen Replikationsrunde. Die Sequenzanalyse von mehr als 90000 Nukleotiden ergab 39 Mutationen. Dies entspricht einer Fehlerrate von ungefähr 4 x 10-4 pro Base und Replikationszyklus, wobei alle Mutationen Transitionen von G zu A waren. Eine schwache Expression von APOBEC-Enzymen in den vektorproduzierenden Zellen konnte als wahrscheinlichste Ursache für diesen Typ an Mutationen nachgewiesen werden. Das akzessorische FV Bet Protein wirkt APOBEC entgegen. Kotransfektion von Zellen mit einem bet-Expressionsplasmid resultierte in einer signifikanten Reduktion an Mutationen bei über 170000 zusätzlich sequenzierten Basen. Zwei Mutationen konnten nicht der APOBEC-Aktivität zugeschrieben werden, deshalb postulieren wir eine idealisierte FV-Mutationsrate von angenähert 7,5 x 10-6 pro Base und Replikationszyklus. Im Gegensatz zu in vitro-Analysen wurde nur eine einzige Deletion und keine Insertion bei mehr als 260000 sequenzierten Basen identifiziert. Die Analyse der Rekombinationsrate von FV-Vektorgenomen ergab mehr als ein zusätzliches Template-Switching-Ereignis pro reverser Transkription. Wir konnten auch zeigen, dass ein bestimmtes FV-Partikel in der Lage zum Crosstransfer eines heterologen FV-Genoms ist, jedoch mit einer reduzierten Effizienz als bei Verwendung des homologen Vektors. Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse einerseits, dass das Kopieren des FV-Genoms mit höherer Genauigkeit geschieht als bisher angenommen, auf der anderen Seite ist Rekombination bei FV-Genomen wahrscheinlich.
N2  - Foamy viruses (FVs) are the genetically most stable viruses of the retrovirus family. This contrasts to the error rate found for recombinant FV reverse transcriptase (RT). To investigate the accuracy of FV genome copying in vivo we analyzed the occurrence of mutations after a single round of FV vector transfer. Sequence analysis of more than 90,000 nts revealed 39 mutations. This corresponds to an error rate of approx. 4 x 10-4 per site and replication cycle. All mutations were transitions from G to A. A residual expression of APOBEC enzymes in vector producer cells was found to be likely responsible for this type of mutation. The accessory FV Bet protein is implicated to counteract APOBEC. Cotransfection of cells with a bet expression plasmid resulted in a significant drop of mutations among over 170,000 additional sequenced bases. Since two mutations were not correlated to APOBEC activity, we postulate an idealized FV mutation rate of close to 7.5 x 10-6 per site and replication cycle. In contrast to in vitro studies only one deletion and no insertion was identified among the more than 260,000 sequenced bases. Analysis of the recombination frequency of FV vector genomes revealed more than one additional template-switching event per reverse transcription. We also show that a given FV particle is able to cross-transfer a heterologous FV genome, although at reduced efficiency than the homologous vector. Taken together, our results indicate that FV genome copying is of higher accuracy than thought previously. On the other hand recombination among FV genomes appears to be likely.
KW  - Retroviren
KW  - Spumaviren
KW  - Reverse Transkriptase
KW  - Mutationsrate
KW  - Template Switching
KW  - Retroviruses
KW  - Spumaviruses
KW  - reverse transcriptase
KW  - mutationrate
KW  - template switching
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-29252
ER  -