TY  - THES
A1  - Kotzsch, Alexander
T1  - BMP Ligand-Rezeptor-Komplexe: Molekulare Erkennung am Beispiel der Spezifischen Interaktion zwischen GDF-5 und BMPR-IB
T1  - BMP ligand receptor complexes: Molecular recognition exemplified by the specific interaction between GDF-5 and BMPR-IB
N2  - Knochenwachstumsfaktoren (Bone Morphogenetic Proteins, BMPs) sind ubiquitäre, sekretierte Proteine mit vielfältigen biologischen Funktionen. Die Vielfalt an zellulären Prozessen, die durch BMPs reguliert werden, von der Knochenentwicklung und Organhomöostase bis hin zur Neurogenese, erstaunt – und wirft angesichts von teils redundanten, teils spezifischen Funktionen der BMPs Fragen zu den Mechanismen ihrer Signalübermittlung auf. Die Signaltransduktion von BMPs erfolgt wie bei den strukturell verwandten TGF-βs und Activinen durch die ligandeninduzierte Oligomerisierung von transmembranen Serin/Threonin-Kinaserezeptoren, von denen zwei Typen – Typ I und Typ II – existieren. Einer Vielzahl von mehr als 18 BMP-Liganden stehen nach derzeitigem Erkenntnisstand nur vier Typ I und drei Typ II Rezeptorsubtypen für die Bildung von heteromeren Rezeptorkomplexen zur Verfügung. Ein BMP-Ligand kann hochspezifisch nur einen bestimmten Rezeptorsubtyp oder in einer promisken Art und Weise mehrere Rezeptorsubtypen binden. Trotz dieser Bindungspromiskuität üben BMPs ihre biologische Funktion überwiegend hochspezifisch aus, d.h. abhängig vom Liganden werden spezifische zelluläre Prozesse reguliert. Somit stellt sich die Frage, wie die Bildung von heteromeren Ligand-Rezeptor-Komplexen und die Aktivierung definierter intrazellulärer Signalkaskaden zusammenhängen und wie letztlich ein bestimmtes BMP-Signal durch einen „Flaschenhals“, repräsentiert durch die begrenzte Anzahl an Rezeptorsubtypen, in das Zellinnere übermittelt wird. Die Interaktionen zwischen BMP-2 / GDF-5 und den Typ I Rezeptoren BMPR-IA / BMPR-IB sind ein Paradebeispiel für Bindungspromiskuität und -spezifität. Während BMP-2 beide Rezeptoren BMPR-IA und BMPR-IB mit gleicher Bindungsaffinität bindet („promiske Interaktion“), zeigt GDF-5 eine 15-20fach höhere Bindungsaffinität zu BMPR-IB („spezifische“ Interaktion). Dieser Unterschied ist scheinbar gering, aber physiologisch überaus relevant. Um Einblick in die Mechanismen der molekularen Erkennung zwischen den Bindungspartnern zu gewinnen, wurden binäre und ternäre Komplexe aus den Liganden BMP-2 oder GDF-5, den extrazellulären Domänen der Typ I Rezeptoren BMPR-IA oder BMPR-IB sowie der extrazellulären Domäne des Typ II Rezeptors ActR-IIB untersucht. Die hier vorliegende Arbeit beschreibt die strukturelle und funktionelle Analyse dieser Ligand-Rezeptor-Komplexe. Um den Einfluss struktureller Flexibilität auf die BMP Typ I Rezeptor Erkennung näher zu analysieren, wurde zudem die Struktur von BMPRIA in freiem Zustand mittels NMR-Spektroskopie aufgeklärt. Aus Mutagenesedaten und der Kristallstruktur des GDF-5•BMPR-IB-Komplexes lassen sich im Vergleich zu bekannten Kristallstrukturen Merkmale ableiten, mit denen die Ligand-Rezeptor-Bindung und -Erkennung charakterisiert werden kann: (1) Die Hauptbindungsdeterminanten in Komplexen von BMPR-IA und BMPR-IB mit ihren Liganden sind unterschiedlich. Während in Komplexen mit BMPR-IB ein hydrophobes Motiv die Bindungsaffinität bestimmt, trägt in Komplexen mit BMPR-IA eine polare Interaktion signifikant zur Bindungsenergie bei. Ein Vergleich der Strukturen von freien und gebundenen Liganden und Typ I Rezeptoren zeigt, dass interessanterweise diese Hauptbindemotive erst bei der Ligand-Rezeptor-Interaktion entstehen, sodass ein „induced fit“ vorliegt und die Moleküle entsprechend „aufeinander falten“. (2) Die Bindungsspezifität wird durch periphere Schleifen in den Typ I Rezeptoren bestimmt. Wie Untersuchungen von Punktmutationen in BMPR-IA zeigen, die einer krebsartigen Darmerkrankung (Juvenile Polyposis) zugrunde liegen, führt erst die „richtige“ Kombination aus Flexibilität in den Schleifen und Rigidität des Rezeptorgrundgerüsts zu signalaktiven Typ I Rezeptoren mit einer potentiell den Liganden komplementären Oberfläche. Die mangelnde sterische Komplementarität von Ligand- und Rezeptoroberflächen führt zu der niedrigeren Bindungsaffinität von GDF-5 zu BMPR-IA im Vergleich zu BMPR-IB. Interessanterweise zeigen die hier vorgestellten, hochaufgelösten Strukturdaten, dass die Orientierungen/Positionen der Typ I Rezeptoren BMPR-IA und BMPR-IB in den Bindeepitopen der Liganden BMP-2 und GDF-5 variieren. Unter der Voraussetzung, dass die extrazelluläre Domäne, das Transmembransegment und die intrazelluläre Domäne der Typ I Rezeptoren ein starres Element bilden, sollte sich die unterschiedliche Orientierung der extrazellulären Domänen der Typ I Rezeptoren in der Anordnung der Kinasedomänen widerspiegeln und sich auf die Signaltransduktion auswirken. Möglicherweise ist eine bestimmte Anordnung der Kinasedomänen der Typ I und Typ II Rezeptoren für eine effiziente Phosphorylierung bzw. Signaltransduktion erforderlich. Der Vergleich mehrerer Ligand-Typ I Rezeptor-Komplexe zeigt, dass die unterschiedliche Orientierung dieser Rezeptoren möglicherweise vom Liganden abhängt. Angesichts der Bindungspromiskuität unter BMP-Liganden und -Rezeptoren könnten so spezifische Signale übermittelt und spezifische biologische Funktionen reguliert werden. Die in dieser Arbeit vorgestellten Erkenntnisse tragen wesentlich zur strukturellen Charakterisierung der Ligand-Rezeptor-Erkennung in der BMP-Familie bei. Die Frage, warum trotz strukturell hoch homologer Liganden und Rezeptoren und weitgehend konservierten Bindeepitopen eine teils promiske und teils spezifische Interaktion möglich ist, kann nun für die Liganden BMP-2 und GDF-5 sowie den beiden Typ I Rezeptoren BMPR-IA und BMPR-IB beantwortet werden.
N2  - Bone morphogenetic proteins (BMPs) are ubiquitous, secreted cytokines involved in a manifold of biological functions. The diversity of cellular processes regulated by BMPs, from bone development to tissue homeostasis and neuronal processes, is amazing – and raises questions about the mechanisms of signal transduction in the light of redundant functions on the one hand, and specific functions on the other hand. Similar to structurally related activins and TGF-βs, the signal transduction of BMPs is accomplished by ligand-induced oligomerization of transmembrane BMP type I and type II serine/threonine receptor kinases. According to current knowledge, only four type I and three type II receptor subtypes are available for BMP signal transduction, facing a multitude of more than 18 BMP ligands. Binding of BMP ligands to their receptors can be highly specific meaning that only one specific receptor of either subtype is used for signaling. In contrast, many BMP ligands can recruit more than one receptor subtype, which results in binding promiscuity. However, even though receptor subtypes are bound in a promiscuous manner, only certain biological functions are triggered. Dependent on the BMP ligand, specific cellular processes are activated and regulated. This discrepancy between unspecific binding and specific signaling events and the biological response raises the question how the formation of heteromeric ligand-receptor complexes is linked to the activation of defined intracellular signaling cascades, and finally, how a certain BMP signal is transduced into the interior of the cell through a „bottleneck“ represented by the limited number of receptor subtypes. The interaction between BMP-2 / GDF-5 and the BMP type I receptors BMPR-IA / BMPR-IB is a prime example for binding promiscuity and binding specificity. BMP-2 binds BMPR-IA and BMPRIB with almost equal binding affinity („promiscuous interaction“) while GDF-5 exhibits a 15-20fold higher binding affinity to BMPR-IB („specific interaction“). Although this difference is seemingly small, it is however of considerable relevance for the physiological role of these ligands. To gain insight into the mechanisms of molecular recognition between the binding partners, binary and ternary ligand-receptor complexes consisting of BMP-2 or GDF-5, the extracellular domains of the type I receptors BMPR-IA or BMPR-IB, and the extracellular domain of the type II receptor ActRIIB were investigated. The thesis presented here describes the structural and functional analysis of these ligand-receptor complexes. To analyse the effect of structural flexibility on BMP type I receptor recognition in more detail, the structure of free BMPR-IA was determined using NMR spectroscopy. Based on data from a limited mutagenesis and the crystal structure of the GDF-5•BMPR-IB complex several characteristics concerning ligand-receptor binding and recognition can be deduced: (1) The main binding determinants in complexes of BMPR-IA and BMPR-IB with their ligands BMP-2 and GDF-5 differ. A hydrophobic binding motif determines binding affinity in complexes of BMPR-IB, whereas a polar interaction significantly contributes to binding energy in complexes of BMPR-IA. These main binding motifs are only formed during complex formation as demonstrated by a comparison between structures of free and bound ligands as well as type I receptors. Both ligand and receptor fold „onto each other“ which suggests an induced fit mechanism. (2) Binding specificity is encoded on loops at the periphery of the binding epitope of the type I receptors. Only the „appropriate“ combination between structural flexibility in the receptor loops and structural rigidity of the receptor backbone results in signal active type I receptors, as shown by analysis of single polymorphisms in BMPR-IA causing juvenile polyposis syndrome, a cancerous disease of the intestine. A lack of steric surface complementarity between GDF-5 and BMPR-IA, that cannot be overcome by structural flexibility, leads to the lower binding affinity in comparison to BMPR-IB. Interestingly, the high resolution structure of the GDF-5•BMPR-IB complex shows that the orientations/positions of BMPR-IA in the binding epitope of BMP-2 and of BMPR-IB in the binding epitope of GDF-5 vary. Assuming that the extracellular domain, the transmembrane segment, and the intracellular domain of the type I receptors form a rigid element, the different orientations of the extracellular domains should also reflect the assembly of the kinase domains and therefore, affect signal transduction. One can assume that a defined arrangement of the kinase domains of type I and type II receptors is required to allow for efficient phosphorylation and signal transduction, respectively. The comparison of several BMP ligand-type I receptor complexes suggests that the different orientations of these receptors are likely dependent on the ligand. Considering the binding promiscuity among BMP ligands and receptors such a mechanism would represent a possible way for the transmission of specific signals and regulation of specific biological functions. The insights into molecular structure and function of BMP ligands and receptors presented in this thesis contribute significantly to a more detailed understanding of their binding properties. The question why the interaction of BMP ligands and receptors is promiscuous on the one hand and specific on the other hand in spite of structurally highly homologous molecules can now be answered for BMP-2 and GDF-5 as well as BMPR-IA and BMPR-IB.
KW  - Cytokine
KW  - Knochen-Morphogenese-Proteine
KW  - Ligand <Biochemie>
KW  - Proteinfaltung
KW  - Molekulare Erkennung
KW  - Rezeptor
KW  - Transforming Growth Factor beta
KW  - Wachstumsfaktor
KW  - Strukturaufklärung
KW  - Dreidimensionale NMR-Spektroskopie
KW  - Protein-Serin-Threonin-Ki
KW  - Proteinkristallographie
KW  - GDF-5
KW  - BMPR-IB
KW  - Signaltransduktion
KW  - protein crystallography
KW  - molecular recognition
KW  - signal transduction
KW  - ligand
KW  - receptor
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-31040
ER  - 
TY  - THES
A1  - Villwock, Andrea
T1  - Bedeutung des Klasse A Scavenger Rezeptors für die Zytokinsekretion von humanen dendritischen Zellen nach Kontakt mit dem humanen Pathogen Neisseria meningitidis
T1  - Influence of the class A scavenger receptor for the cytokine secretion by human dendritic cells after contact with the human pathogen Neisseria meningitidis
N2  - Meningokokken gehören zu den wichtigsten Erregern bakterieller Sepsis und Meningitis. Der Schweregrad des Krankheitsverlaufs bei Meningokokkenerkrankungen korreliert mit der Konzentration an proinflammatorischen Zytokinen im Serum. Dendritische Zellen (DZ) bilden die erste Abwehr am humanen Epithel des Nasopharynx, welches die Eingangspforte von Neisseria meningitidis darstellt und sind eine wichtige Quelle proinflammatorischer Zytokine. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass bekapselte Meningokokken-Stämme bei DZ signifikant weniger proinflammatorische Zytokine als isogene Kapsel-defiziente Stämme oder obligat unbekapselte Stämme induzieren. Dieser Effekt ist unabhängig von der chemischen Zusammensetzung der Kapsel, da aufgereinigtes Kapselpolysaccharid der Serogruppe B nicht den reduzierenden Effekt der Zytokininduktion beeinflusste. Darüber hinaus spielt die Kapsel-O-Acetylierung bei Serogruppe C, W-135 und Y nur eine untergeordnete Rolle bei der Erkennung von Meningokokken durch DZ. Microarray Versuche zum Transkriptionsprofil von DZ, die mit dem konstitutiv unbekapselten Trägerisolat alpha 14, dem bekapselten MC58 oder dem isogenen unbekapselten Stamm MC58siaD durchgeführt wurden, zeigten nach 4 h ein identisches Profil von proinflammatorischen Zytokinen. Nur der phagozytierte unbekapselten Stamm MC58siaD zeigte eine differentielle Regulation von weiteren Zytokinen. Jedoch glich sich das Profil nach 18 h Infektion durch alle drei Stämme an. Der Scavenger Rezeptor der Klasse A (SR-A) wurde als Hauptrezeptor identifiziert, der die Erkennung und Phagozytose von Meningokokken durch DZ initialisiert. Eine Assoziation phagozytierter Meningokokken mit SR-A konnte mittels Elektronenmikroskopie bestätigt werden. Nach Infektion von THP-1 Makrophagen mit bekapselten Serogruppe B und C Stämmen, den isogenen Kapsel-defizienten Stämmen und dem obligat unbekapselten Stamm alpha 14 wurde auf Transkriptionsebene keine differentielle Regulation der SR-A nachgewiesen. Lediglich eine minimale Hochregulation des SR-A auf der zellulären Oberfläche konnte nach einer Stunde Infektion verzeichnet werden. Nach Infektion von DZ oder THP-1 Makrophagen mit MC58siaD kommt es zur Dephosphorylierung des SR-A. Unter Verwendung von globalen Phagozytose-Inhibitoren konnte gezeigt werden, dass für die maximale Induktion der proinflammatorischen Zytokine TNF-alpha, IL-6 und IL-1 Phagozytose von N. meningitidis benötigen wird, dies ist jedoch für die IL 8 Produktion nicht notwendig. Außerdem konnte gezeigt werden, dass mit dem spezifischen SR-A Inhibitor poly G eine Reduktion von TNF-alpha, IL-6, IL-1 und IL-8 zu verzeichnen war. Folglich ist die Phagozytose über SR-A nötig, um TNF-alpha, IL-6 und IL-1 zu induzieren, jedoch nur die Erkennung aber nicht die Phagozytose via SR-A die IL-8 Produktion initiiert. Die Aufnahme von Neisseria meningitidis über den SR-A durch DZ ist damit nicht nur für die Phagozytose und Abtötung verantwortlich sondern auch für die Zytokininduktion wichtig ist. Es gibt jedoch auch Meningokokken Stämme, die nicht vom SR-A erkannt werden. Mit alpha 14 konnte erstmals ein Meningokokken-Stamm identifiziert werden, der nicht an SR-A bindet. Die Induktion von Zytokinfreisetzung durch alpha 14 erfolgt dementsprechend unabhängig von SR-A und nach Kontakt von alpha 14 mit humanen DZ ist keine Veränderung der Phosphorylierungsstatus dieses Rezeptors zu beobachten. Die erhobenen Daten legen eine zentrale Rolle von SR-A in der Induktion von Immunität gegen N. meningitidis nahe.
N2  - Meningococci belong to the most important pathogens which cause bacterial sepsis and meningitis. The severity and outcome of meningococcal disease correlates with the concentration of proinflammatory cytokines in the serum. Dendritic cells (DC) build a first line of defence within the nasopharyngeal epithelium, which is the port-of-entry for Neisseria meningitidis and are an important source of proinflammatory cytokines. Infection of DC with encapsulated meningococcal strains induces significantly lower levels of proinflammatory cytokines than isogenic capsule-deficient mutants or constitutively unencapsulated strains. It could be shown that this effect does not depend on the chemical composition of the meningococcal capsule, because purified capsular polysaccharide of serogroup B is unable to modulate cytokine secretion. O-acetylation of serogroup C, W-135 and Y capsules plays a minor role in the recognition of meningococci by DC. Microarray studies on the expression of cytokine genes by DC infected with constitutively unencapsulated carriage isolate alpha 14, encapsulated serogroup B strain MC58 or the isogenic unencapsulated strain MC58siaD showed an identical pattern for proinflammatory cytokines after 4 h of infection. Only the unencapsulated strain MC58siaD which is easily phagocytosed induced additional cytokines. However, the cytokine profile after 18 h of infection was equal for all three strains. Scavenger receptor A (SR-A) was identified as the main receptor mediating recognition and phagocytosis of meningococci by DC. Association of phagocytosed meningococci with SR-A was visualized by electron microscopy. Infection of THP-1 macrophages with encapsulated serogroup B und C strains, their isogentic capsule-deficient muntants or the obligatory unencapsulated strain alpha 14 did not induce differential regulation of SR-A on the transcriptional level and only minor up-regulation of SR-A on cellular surface after one hour of infection. After infection of DC or THP-1 macrophages with MC58siaD dephosphorylation of SR-A can be detected. Using global phagocytosis inhibitors, it could be determined that the induction of the proinflammatory cytokines TNF-alpha, IL-6 and IL-1 require phagocytosis of N. meningitidis, whereas induction of IL-8 does not. In addition, the specific SR-A-inhibitor poly G also leads to a reduction of TNF-alpha, IL-6, IL-1 and IL-8 secretion. Taken together these data indicate that phagocytosis via SR-A is necessary for TNF-alpha, IL-6 and IL-1 secretion, whereas recognition but not phagocytosis via SR-A enhances IL-8 secretion. Therefore, the uptake of Neisseria meningitidis via SR-A is not only important for phagocytosis and killing but also involved in cytokine induction. However, not all meningococcal strains are recognized via SRA. The cytokine induction by DZ infected with alpha 14 is completely independent of SR-A and after contact of human DC with alpha 14 no changes in SR-A phosphorylation can be detected. These data suggest that SR-A plays a central role in the induction of immunity against N. meningitidis.
KW  - Neisseria meningitidis
KW  - Scavenger-Rezeptor
KW  - Cytokine
KW  - Kapsel O-Acetylieung
KW  - capsule O-Acetylation
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-28555
ER  -