TY - THES A1 - Büchold, Christian T1 - Synthese und Testung cis-konfigurierter Aziridine als pseudo-irreversible Inhibitoren der sekretorischen Aspartatproteasen von Candida albicans T1 - Synthesis and testing of cis-configured aziridines as pseudo-irreversible inhibitors of Candida albicans secreted aspartic proteases N2 - Candida albicans gehört zu den für den Menschen fakultativ pathogenen Hefepilzen. Der normalerweise harmlose Begleiter der humanen Mikroflora findet sich hauptsächlich auf Schleimhäuten der Mundhöhle und des Magen-Darm-Trakt sowie in der vaginalen Flora. Menschen, deren Immunsystem geschwächt ist, sind jedoch besonders anfällig für Infektionen, die durch den Pilz hervorgerufen werden können. Neben oberflächlichen kann es dabei auch zu lebensbedrohlichen systemischen Infektionen kommen, die nicht selten zum Tod des Patienten führen. Durch ein zunehmendes Auftreten von Resistenzen gegen gebräuchliche Pharmaka besteht aktuell ein dringender Bedarf an neuen Wirkstoffen gegen Candida. Die zehn vom Hefepilz exprimierten sekretorischen Aspartatproteasen (SAP1-10), die als wichtige Virulenzfaktoren gelten, stellten sich dabei zunehmend als vielversprechende Targets heraus. Das Ziel dieser Arbeit war die Weiterentwicklung der literaturbekannten cis-konfigurierten 3-Phenylaziridin-2-carboxylate A-07 und A-08 als irreversible Inhibitoren der SAP-Isoenzyme. Die Variation der Substituenten am Aziridinstickstoff für die Adressierung der S3-Tasche im Enzym erfolgte durch Alkyl-, Aryl- und Acylreste. Die Aminosäureester wurden in Konfiguration und Art der Seitenkette modifiziert, um eine Verbesserung der Anpassung an die S1‘-Tasche zu ermöglichen. Die cis-3-Phenylaziridin-2-carboxylate wurden durch Cromwell-Synthese als Racemate erhalten. Aminosäure- und Peptidkupplungen erfolgten mit gängigen Kupplungsreagenzien (PPA, DPPA). Die stereoselektive Synthese des methylenverbrückten Aziridin-2-carboxylats A-10 erfolgte durch Redoxkondensation nach Mukaiyama. Die synthetisierten Verbindungen wurden in einem fluorimetrischen FRET-Assay auf ihre inhibitorische Wirkung gegen SAP2 getestet. Dabei war das im FRET-Assay bislang an SAP2 verwendete Substrat Dabcyl-Arg-Lys-Pro-Ala-Leu-Phe-Phe-Arg-Leu-Glu(EDANS)-ArgOH auch für Testungen an SAP1, 3 & 8 sowie Cathepsin D geeignet. Neben den jeweiligen Km-Werten konnten für diese Enzyme auch die zugehörigen kcat-Werte bestimmt werden. Zur Bestimmung der Hemmkonstanten wurde für die aktiven Verbindungen ein Verdünnungsassay nach Kitz und Wilson durchgeführt. 20 der 46 Aziridin-2-carboxylate erreichten SAP2 k2nd-Werte von mindestens 7880 M-1min-1. Die mit k2nd-Werten von 60608 bis 118582 M-1min-1 potentesten Verbindungen wurden durch (R)-Aminosäuresubstitution (A-28, A-31) bzw. durch Cyclohexylmethyl-Verknüpfung am Aziridinstickstoff (A-43, A-45) erhalten. Für die einzelnen Diastereomere von A-31, A-31a und A-31b, wurde eine signifikant unterschiedliche Hemmwirkung festgestellt. Die Inhibitoren zeigten eine zeitabhängige Hemmung, die nach ca. 30 min Inkubationszeit jedoch wieder schwächer wurde. LC-MS- und NMR-Studien lassen einen pseudo-irreversiblen Hemmmechanismus vermuten: Der Inhibitor bindet zunächst irreversibel unter Ringöffnung des Aziridins an das Enzym. Der entstehende Ester wird danach unter den sauren Assaybedingungen wieder hydrolysiert. Der resultierende Aminoalkohol bindet anschließend als Übergangszustandsanalogon reversibel an das Enzym. Selektivitätsstudien an Cathepsin D zeigten für 36 der 46 Aziridin-2-carboxylate k2nd-Werte von 10350 bis 936544 M-1min-1. Damit sind die Verbindungen an CathD aktiver als an SAP2. Die 1-Cyclohexylmethyl-verknüpften Aziridine wiesen auch an CathD die höchsten k2nd-Werte auf, wenngleich sich dabei die (R)-Konfiguration der Aminosäurereste (A-57, A-59) als die aktivere Variante herausstellte. Mit dem (R)-Phe-substituierten 1-tert-Butylaziridin A-58 erreichte der potenteste Vertreter der Reihe bereits einen Ki-Wert im dreistelligen nano-molaren Bereich. Ebenso wurden für die (R)-Aminosäure-Analoga von A-07 und A-08 (A-28, A-31) erhöhte Hemmkonstanten erhalten. Wie SAP2 wird auch CathD durch die (an)getrennten Diastereomere A-31a und A-31b signifikant unterschiedlich stark inhibiert. Mit den (R)-Valin-verknüpften Aziridinen A-81, A-82 und A-85 fanden sich aktive verzweigt-Alkyl-substituierte CathD-Inhibitoren. N2 - Candida albicans is one of the most common fungal pathogens of human beings. Usually, Candida species reside as commensal organisms as part of the normal microflora, predomi-nantly colonizing the mucosal surfaces of the oral cavity, the gastrointestinal tract or the va-ginal flora. However, notably in immunosuppressed individuals, C. albicans can evolve into an opportunistic pathogen, causing superficial as well as life-threatening systemic infections with high mortality. Increasing resistances to current drug therapies demand research for new antifungal phar-maceuticals. The secreted aspartic proteases (SAP1-10), encoded by ten different sap genes, were discovered as key virulence factors and hence are considered to be potential targets for new antimycotic drugs. The goal of the present work was the improvement of the known cis-configured 3 phenyl-aziridine-2-carboxylates A-07 und A-08 as irreversible inhibitors of the SAP isoenzymes. In order to address their S3 pocket, the substituent at the aziridine-nitrogen was modified (alkyl, aryl and acyl residues). Furthermore, various amino acid esters (D, L) were included in order to improve their fit into the S1’ pocket. The cis-3-phenylaziridine-2-carboxylates were obtained as racemates via Cromwell synthesis. Amino acid and peptide coupling reactions were performed with common coupling reagents (PPA, DPPA). The stereoselective synthesis of the methylene-bridged aziridine-2-carboxylate A-10 was achieved via redox condensation according to Mukaiyama. The synthesized compounds were tested for inhibition of SAP2 by using a fluorometric FRET assay using Dabcyl-Arg-Lys-Pro-Ala-Leu-Phe-Phe-Arg-Leu-Glu(EDANS)-ArgOH as sub-strate. This substrate, designed for SAP2, was found to be also suitable for assays with SAP1, 3 & 8 and Cathepsin D. Additionally, the corresponding Km- and kcat values were determined. For the determination of the inhibition constants of the active compounds a dilution assay according to Kitz and Wilson was performed. 20 of the 46 aziridine-2-carboxylates yielded k2nd values of at least 7880 M-1min-1 against SAP2. With k2nd values between 60608 and 118582 M-1min-1, the most potent compounds were achieved with (R)-amino acids (A-28, A-31) and by cyclohexylmethyl substitution of the aziridine-nitrogen (A-43, A-45). Significantly different inhibition potencies were found for the single diastereomers of A-31, A-31a and A-31b. The inhibitors showed a time-dependent inhibition that decreased after 30 min incubation time. LC-MS and NMR studies suppose a pseudo-irreversible mechanism of inhibition: First, the inhibitor irreversibly binds to the enzyme under ring opening of the aziridine. Then the generated ester is hydrolyzed under the acidic assay conditions. The resulting amino alcohol subsequently could bind as a transition-state mimetic inhibitor to the enzyme. In selectivity studies on CathD 36 of the 46 aziridine-2-carboxylates showed k2nd values be-tween 10350 and 936544 M-1min-1. Thus, the compounds show higher activity against CathD than against SAP2. Again, the 1-cyclohexylmethyl-substituted aziridines show the highest k2nd values. However, in these cases the compounds with (R)-configured amino acid residues are the more active ones (A-57, A-59). With the (R)-Phe-substituted 1-tert-butylaziridine A-58, the most active compound reached a Ki value in the nanomolar region. Similarly to the results obtained for SAP2, the (R)-amino acid analogues to A-07 und A-08 (A-28, A-31) show higher inhibition constants. Again, the separated diastereomers A-31a and A-31b display significantly different inhibition potencies. With the (R) valin linked aziridines A-81, A-82 and A-85 a highly active group of alkyl-substituted inhibitors with branched side-chains was found. KW - Candida albicans KW - Aspartatproteasen KW - Enzymkinetik KW - Enzyminhibitor KW - Plasmodium falciparum KW - Malaria KW - Würzburg / Sonderforschungsbereich Erkennung KW - Gewinnung und Funktionale Analyse von Wirkstoffen gegen Infektionskrankheiten KW - Hefeartige Pilze KW - sekretorische Aspartatproteasen KW - Aziridine KW - irreversible Inhibitoren KW - secreted aspartic proteases KW - aziridines KW - irreversible inhibitors Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-39358 ER - TY - THES A1 - Dudaczek, Jürgen T1 - Oktapeptide als neue Organokatalysatoren zur Hydrolyse von Phosphaten und Estern T1 - Octapeptides as new organocatalysts for hydrolysis of phosphates and ester N2 - Ziel der Dissertation „Oktapeptide als neue Organokatalysatoren zur Hydrolyse von Phosphaten und Estern“ war es neue Oktapeptide zu finden, die die Fähigkeit besitzen Phosphate und Ester zu Hydrolysieren. In der Natur ist bei den Katalysereaktionen die Sekundärstruktur von entscheidender Bedeutung. Aus diesem Grunde wurde im Rahmen dieser Arbeit zunächst ein Modellsystem entwickelt, mit dem gezeigt werden konnte, dass es möglich ist mit einfachen Bausteinen wie Diaminobutan und dem in der Gruppe von Schmuck entwickelten Guanidiniocarbonylpyrrol ein Molekül zu entwickeln, welches eine stabile intramolekulare Schleife in polaren Lösungsmitteln ausbildet. Aufgrund der geringen Größe des Moleküls, konnte kein β-Faltblatt gebildet werden. Dennoch konnte mit Hilfe der NMR-Spektroskopie gezeigt werden, dass in dem polaren Lösungsmittel Methanol eine stabile Schleifenbildung mit einer intramolekularen Komplexierung stattfindet. Nach erfolgreicher Synthese des oben beschriebenen Testsystems wurde als nächster Schritt eine kombinatorische Organokatalysatorbibliothek mit 625 Mitgliedern aufgebaut. Die Struktur der Peptide kann man in drei Teile untergliedern. Der erste Teil ist die feste Phase, das Amino-TentaGel, an das nacheinander die einzelnen Aminosäuren gekuppelt wurden. An Stelle der Butylgruppe als Schleifenelement wurde Aib-D-Pro als β-Turn Element eingesetzt. Den dritten Teil bilden die bei der Synthese der Oktapeptide eingesetzten Aminosäuren AA1, AA3, AA6, AA8, die ein β-Faltblatt ausbilden sollten. Die kombinatorische Synthese der Bibliothek erfolgte nach der „Split and Mix“ Methode. Zum Unterscheiden der einzelnen Mitglieder untereinander, wurde die feste Phase zusammen mit einem Radiofrequenzchip in IRORI MikroKans gegeben. Durch die unterschiedlichen Aminosäuren ist die Bibliothek für die Katalyse in polaren Lösungsmitteln wie Wasser konzipiert worden. Als exemplarische Katalysereaktionen wurden dabei zwei Hydrolysereaktionen (Phosphatspaltung und Esterspaltung) ausgesucht. Zunächst wurde für beide Reaktionen ein Screening mit unterschiedlichen Bedingungen durchgeführt. Dabei hat sich gezeigt, dass bei der Phosphatspaltung nur dann die Reaktion katalysiert wurde, wenn das künstliche Argininanalogon, welches in unserer Arbeitsgruppe synthetisiert wurde, vorhanden war. Der beste Katalysator hat die Reaktion 175-mal schneller katalysiert als die unkatalysierte Reaktion. Bei dem Screening der Esterspaltung hat sich herausgestellt, dass die Aminosäure Histidin essentiell für die katalytische Aktivität ist. Der beste Katalysator bei der Esterspaltung hat die Hydrolyse des Esters 345-mal schneller katalysiert als die unkatalysierte Reaktion. Bei beiden Reaktionen hat sich gezeigt, dass die Sequenz der Katalysatoren sehr wichtig für die Katalyse ist. So verringert z.B. bei der Esterhydrolyse der Austausch zweier Aminosäuren eine Verringerung der Aktivität von dem Faktor 294 auf den Beschleunigungsfaktor 35. Auch konnten beide Katalysereaktionen in wässrigem gepufferten Lösung durchgeführt werden. Damit ist es möglich gewesen neue Oktapeptide für die Katalyse von Phosphat- und Esterspaltung zu finden und diese erfolgreich im Screening als auch in Lösung zu untersuchen. N2 - The main focus of the thesis “Octapeptides as new organocatalysts for hydrolysis of phosphates and esters” was to find new octapeptides with the ability to hydrolyse phosphates and esters. In nature the secondary structure is essential for catalytic reactions. For this reason a model system was developed. With simple devices like diaminobutyl and guanidiniocarbonylpyrrol developed in the group of Schmuck a molecule should be build up, which could form a stable intramolecular loop in polar solvents. Due to the small size of the molecule no β-sheet could be formed. Nevertheless it could be demonstrated with the help of the NMR spectroscopy that in the polar solvent methanol a stable loop formation with an intramolekular complexation took place. After successfully producing and testing of the above test system the next step was to synthesize a combinatorial library with 625 organocatalysts members. The structure of the peptides can be broken down into three parts. The first part is the solid phase, the amino-TentaGel. To this the amino acids where coupled. Instead of a butyl group the literature known β-turn element Aib-D-Pro was used. Third part of the octapeptides was the varying amino acids in the position AA1, AA3, AA6 and AA8. Between amino acid AA1 and AA3 and AA6 and AA8 a glycine was used. These amino acids should build a β-sheet. The combinatorial synthesis of the library took place after the “split and mix” method.[90-93] To distinguish the individual members the resin was put in the IRORI MikroKans and a radio frequency chip was added to the resin. Due to the different amino acids the members of the library were designed for use in polar solvents as water. Two hydrolysis reactions were used as exemplary catalysis reactions. For both reactions a screening followed by catalysis in solution were performed under different conditions. Thereby it was found that for the cleavage of phosphate the artificial arginine analogue is essential for the catalysis. The best found catalyst for this reaction catalysed the reaction 175-times faster than without catalyst. For the screening of ester cleavage it was found that the amino acid histidine is essential for the catalytic activity. For that it is not surprising that the best catalyst has four histidine and catalysed the reaction 345-times faster compared with the uncatalysed reaction. For both reactions it could be shown that the sequence of the amino acids is of great importance for the catalytic activity. So for example reduced the exchange of two amino acids the activity from the accelerating factor 294 to 35 for the ester cleavage. Also one aim of these thesis was to carry out the hydrolysis under aqueous conditions and this was possible. All reactions were carried out in water with buffer. So it was possible to synthesis new octapeptides which show catalytic activity for the hydrolysis of phosphates and esters and to investigate this octapeptides successfully in the screening as well as in solution. KW - Organokatalyse KW - Kombinatorische Synthese KW - Esterasen KW - Phosphatasen KW - Enzymkinetik KW - Screening KW - Fluoreszenz KW - Ultraviolettspektroskopie KW - organocatalysis KW - combinatorial chemistry KW - esterase KW - phosphatase KW - enzym kinetic KW - screening KW - fluorescence KW - UV-spectroscopy Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-35175 ER - TY - THES A1 - Poppe, Heiko Anton T1 - Bestimmung der Substrat- und Inhibitorspezifität von Phosphodiesterasen mittels Mikrokaloriemetrie T1 - Phosphodiesterase activity and specificity measured using microcalorimetry N2 - Neben den cAMP- und cGMP-abhängigen Proteinkinasen (PKA bzw. PKG) sind als zyklonukleotid-regulierte Effektorproteine die Ionenkanäle CNG1-4, der "guanine nucleotide exhange factor“ Epac sowie die zyklonukleotid-spaltende Familie der Phosphodiesterasen (PDEs) von Bedeutung. Industriell synthetisierte cGMP- und cAMP-Analoga besitzen zwar meist eine hohe Affinität für ihr Zielprotein, über ihre Hydrolysestabilität gegenüber PDEs in der Zelle ist jedoch wenig bekannt. In dieser Arbeit wurden die kinetischen Konstanten von elf der am häufigsten genutzten cAMP-und cGMP-Analoga an verschiedenen Vertretern der PDE-Familien mittels Mikrokaloriemetrie bestimmt. Zudem konnte in den Messungen der inhibitorisch Effekt hydrolysestabiler Derivate auf die PDEs qualitativ und quantitativ ermittelt werden kann. Die Ergebnisse zeigen, dass Phosphodiesterasen in der Lage sind, auch chemisch modifizierte Analogsubstanzen der Cyclonukleotide cAMP und cGMP zu hydrolysieren. Hydrolysestabile Derivate dagegen entwickeln häufig inhibitorische Wirkung auf die PDEs und verursachen dadurch Veränderungen der intrazellulären cAMP und cGMP Konzentrationen. So vermag z. B. die Epac-spezifische Substanz Sp-8-pCPT-2’-O-Me-cAMPS in den in vitro Experimenten die PDEs mit ki-Werten im einstelligen mikromolaren Bereich zu inhibieren. In mit Sp-8-pCPT-2’-O-Me-cAMPS stimulierten Thrombozyten steigt als Folge dieser PDE-Hemmung die cGMP Konzentration in der Zelle an und man beobachtet eine als Folge eine PKG-vermittelte Phosphorylierung des Substratproteins VASP – eine unerwünschte Nebenreaktion. Die erhobenen Daten lassen außerdem Rückschlüsse auf den Inhibitionsmechanismus zu. Einige Analoga inhibieren die cGMP-bindenden GAF-Domänen in den PDEs 2A, 5A, 6cone und 10A sowie die PDE 4D3 nach dem linear-mixed-Typ und beeinflussen daher, neben der katalytischen Aktivität, vermutlich auch regulatorische Zentren dieser Enzyme. Zusammenfassend erleichtern die erhobenen Daten Wissenschaftlern die Auswahl des für ihre Fragestellung am besten geeigneten Derivates. N2 - cAMP and cGMP are critical second messengers that regulate multiple targets including different cAMP/cGMP-dependent protein kinases (PKA/PKGs), exchange proteins directly activated by cAMP (Epacs), phosphodiesterases (PDEs) and cyclic nucleotide-gated ion channels (CNGs). Second and third generation cyclic nucleotide analogs are widely used to elucidate specificity of cellular signaling, mediated by these target proteins. However, the selectivity and stability of these analogs need to be fully understood in order to properly interpret results and rigorously assess the mechanisms by which these analogs work in the cell. To better understand the selectivity and cross-reactivity of these analogs I measured the activation or inhibitory activity of 13 commonly-used cyclic nucleotide analogs 8 different PDEs. To measure their stability to hydrolysis I utilized isothermal microcalorimetry, a method that allows to evaluate whether or not an analog can function as a substrate or inhibitor for PDEs. I demonstrate that indeed some of these analogs can be hydrolyzed by multiple PDEs and others are competitive inhibitors. Herein I provide Ki data for all of the non-hydrolyzable analogs and Km and Vmax values for all of the hydrolyzable analogs. Each of these values, as well as their mode of inhibition can be determined in a single experiment. The data strongly implied that several of these analogs might, in addition to their primary effects, also cause elevation of cAMP or cGMP indirectly by inhibiting PDEs in the cell. Such an effect could of course cloud interpretation of the use of these analogs. Similarly, those that are PDE substrates also might have their duration of action substantially reduced. To illustrate this point we show that Sp-8-pCPT-2’-O-Me-cAMPS, a highly specific non-hydrolyzable Epac activator in vitro, can under certain conditions enhance cGMP/PKG and cAMP/PKA signaling pathways in intact platelets. Specifically we found enhanced VASP phosphorylation at both PKA and PKG phosphorylation sites after the addition of Sp-8-pCPT-2’-O-Me-cAMPS. These data indicate that this “selective Epac activator” is able to indirectly activate the cAMP/PKA and cGMP/PKG signalling pathways presumably through inhibition of platelet PDE5 and/or PDE3. The data together allow to provide recommendations for how best to probe the different cyclic nucleotide signalling pathways using cyclic nucleotide analogs. In summary, the data provide evidence that most cAMP and cGMP analogs have multiple targets. Therefore, interpretation of any effects these analogs have in cells should take into consideration their possible cross-target reactivities. KW - Cyclisches Nucleotid Phosphodiesterase <3 KW - 5-> KW - Proteinkinase A KW - Hydrolyse KW - Mikrokalorimetrie KW - Cyclo-GMP KW - Cyclo-GMP-Derivate KW - Dissoziationskonstante KW - Enzymkinetik KW - Inhibition KW - Cyclo-AMP KW - Signaltransduktion KW - Thrombozyt KW - Immunoblot KW - Stickst KW - Proteinkinase G KW - Adenylatcyclase KW - Epac KW - Linear Mixed Inhibition KW - GAF Domaine KW - Proteinkinase G KW - Adenylylcyclase KW - Epac KW - Linear mixed inhibition KW - Gaf domaine Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-34477 ER -