TY - JOUR A1 - Vogl, Silvia A1 - Lutz, Roman W. A1 - Schönfelder, Gilbert A1 - Lutz, Werner K. T1 - CYP2C9 genotype vs. metabolic phenotype for individual drug dosing - a correlation analysis using flurbiprofen as probe drug JF - PLoS ONE N2 - Currently, genotyping of patients for polymorphic enzymes responsible for metabolic elimination is considered a possibility to adjust drug dose levels. For a patient to profit from this procedure, the interindividual differences in drug metabolism within one genotype should be smaller than those between different genotypes. We studied a large cohort of healthy young adults (283 subjects), correlating their CYP2C9 genotype to a simple phenotyping metric, using flurbiprofen as probe drug. Genotyping was conducted for CYP2C9*1, *2, *3. The urinary metabolic ratio MR (concentration of CYP2C9-dependent metabolite divided by concentration of flurbiprofen) determined two hours after flurbiprofen (8.75 mg) administration served as phenotyping metric. Linear statistical models correlating genotype and phenotype provided highly significant allele-specific MR estimates of 0.596 for the wild type allele CYP2C9*1, 0.405 for CYP2C9*2 (68 % of wild type), and 0.113 for CYP2C9*3 (19 % of wild type). If these estimates were used for flurbiprofen dose adjustment, taking 100 % for genotype *1/*1, an average reduction to 84 %, 60 %, 68 %, 43 %, and 19% would result for genotype *1/*2, *1/*3, *2/*2, *2/*3, and *3/*3, respectively. Due to the large individual variation within genotypes with coefficients of variation >= 20% and supposing the normal distribution, one in three individuals would be out of the average optimum dose by more than 20 %, one in 20 would be 40% off. Whether this problem also applies to other CYPs and other drugs has to be investigated case by case. Our data for the given example, however, puts the benefit of individual drug dosing to question, if it is exclusively based on genotype. KW - cytochrome P450 2C9 KW - warfarin polymorphisms KW - tolbutamide substrate KW - impact pharmacogenetics KW - 4'-hydroxylation KW - allelic variant KW - liver microsomes Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-148783 VL - 10 IS - 3 ER - TY - JOUR A1 - Ilin, Alexander A1 - Kulmanov, Murat A1 - Nersesyan, Armen A1 - Stopper, Helga T1 - Genotoxic activity of the new pharmaceutical FS-1 in Salmonella/microsome test and mouse lymphoma L5178Y cells JF - Journal of BUON N2 - Purpose: The purpose of this study was to determine possible genotoxic effects of a new very promising antibacterial/ antiviral drug FS-1. Methods: The drug was tested in TA98, TA100, TA102, TA 1535 and TA1537 strains of Salmonella (Ames test) with and without metabolic activation, and also in mouse lymphoma L5178Y cells by means of micronucleus and comet assays. In microbes the drug was tested at concentrations up to 500 \(\mu\)g/plate and in mouse lymphoma cells up to 2,000 \(\mu\)g/ml. Results: In both test-systems in all experiments completely negative results were obtained although FS-1 was tested at maximum tolerated doses. Conclusions: The drug is not genotoxic. This is advantageous because many antibacterial/antiviral drugs possess such activity. KW - mutagenicity KW - antibacterial/antiviral drug KW - comet assay KW - mouse lymphoma L5178Y KW - Salmonella/microsome assay KW - micronucleus test Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-143769 VL - 20 IS - 2 ER - TY - THES A1 - Spiegel, Silvana T1 - Mikrokernfrequenzanalyse unter dem Einfluss von Methylphenidat und chronischem Stress bei adultem ADHS T1 - Influence of methylphenidate and chronic stress on micronucleus assay in adult ADHD N2 - Einleitung: Methylphenidat (MPH) als Medikament der ersten Wahl bei Patienten mit einem Aufmerksamkeitsdefizit- /Hyperaktivitätssyndrom (ADHS) ist für die Therapie von Kindern aber auch von Erwachsenen weit verbreitet. Weil es immer noch Sicherheitsbedenken gegen dieses Medikament gibt, wurde in der vorliegenden Studie untersucht, ob die Langzeiteinnahme von MPH unschädlich hinsichtlich eines zytogenetischen Effektes ist. Ein weiteres Ziel war die Beurteilung von chronischer psychosozialer Stressbelastung von Patienten im Vergleich zu Kontrollprobanden und zu beurteilen ob die Medikation einen Einfluss auf die Höhe des Stresses hat. Nicht zuletzt war das dritte Ziel der Studie zu untersuchen, ob Stress selbst zu zytogenetischen Schäden führt. Material und Methoden: Lymphozyten von 72 (42 ADHS- und 28 gesunde Kontrollprobanden) geschlechts- und altersgematchte Probanden im Alter von 18-28 Jahren, wurden aus venösem Blut für den Mikronukleusassay isoliert. Hauptendpunkt der Studie war die Mikrokernanzahl in binukleären Zellen. Die psychosoziale Stressbelastung der letzten drei Monate wurde mit dem Trier Inventar zum chronischen Stress (TICS) gemessen. Zusätzlich wurden Speichelproben für eine Cortisolmessung gesammelt. Ergebnisse: Ein Einfluss der MPH-Einnahme auf die Mikrokernfrequenz konnte nicht gefunden. ADHS-Patienten wiesen eine signifikant höhere Stressbelastung im Vergleich zu den Kontrollprobanden auf. Ein signifikanter positiver Einfluss auf das chronische Stresserleben unter MPH-Einnahme konnte bei Einnahme von mehr als 1 Jahr beobachtet werden. Die Stressbelastung der ADHS-Patienten und Kontrollprobanden zeigte keine Korrelation zu zytogenetischen Endpunkten. Eine kleine Untergruppe, ADHS-Patienten mit Komorbidität Depression, zeigte jedoch signifikante erhöhte Mikrokernfrequenzanzahlen unter stark erhöhtem chronischen Stress. Aussichten: Aus unserer Sicht kann MPH auch in der Langzeittherapie sicher hinsichtlich eines Krebsrisikos in gewichts- und symptomadaptierter Dosis eingesetzt werden. Weitere Studien sind nötig um das Krebsrisiko bei chronischer erhöhter Stressbelastung abzuschätzen. N2 - Introduction: Methylphenidate (MPH) as first line treatment for patients with attention deficit hyperactivity disorder (ADHD) is widely used not only for therapy in children but also in adults. Because there are still safety concerns for this medication this study investigated if the long term treatment of MPH is harmless regarding to cytogenetic effects. A further aim was to compare the psychosocial stress levels of ADHD patients to those in control subjects and to investigate if MPH medication has an influence on self-perceived stress levels in ADHD. The third aim of this study was to explore if psychosocial stress leads to cytogenetic damage. Materials and methods: Lymphocytes of 72 subjects (42 ADHD and 28 healthy control subjects), matched in age and gender(aged 18-28 years) were isolated from venous blood for micronucleus assay. Main endpoint was the micronucleus frequency in binucleated cells. Psychosocial stress exposure of the last three month was measured by Trier Inventory for Chronic Stress (TICS). Additionally saliva samples were collected for cortisol measurement. Results: An influence of MPH intake on cytogenetic markers could not be found. ADHD patients showed significantly higher stress levels in comparison to control subjects. Patients taking MPH for more than one year displayed significantly lower chronic psychosocial stress levels than patients taking it less than one year or not-treated patients. Stress exposure of ADHD patients and control subjects showed no correlations to cytogenetic endpoints. A small subgroup of ADHD patients with comorbid depression showed significantly higher micronuclei frequencies and reported greater increased chronic stress. Views: We conclude that MPH in weight - and symptom - adjusted dose can be safely used also for long term treatment regarding to cancer risk. Further studies are necessary to estimate cancer risk for increased chronic stress exposure. KW - ADHS KW - psychosozialer Stress KW - psychosocial stress KW - adult ADHD KW - micronucleus test KW - chronischer Stress KW - chronical stress KW - Mikrokernfrequenzanalyse Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-139387 ER - TY - JOUR A1 - Federico, Stephanie A1 - Redenti, Sara A1 - Sturlese, Mattia A1 - Ciancetta, Antonella A1 - Kachler, Sonja A1 - Klotz, Karl-Norbert A1 - Cacciari, Barbara A1 - Moro, Stefano A1 - Spalluto, Giampiero T1 - The Influence of the 1-(3-Trifluoromethyl-Benzyl)-1H-Pyrazole-4-yl Moiety on the Adenosine Receptors Affinity Profile of Pyrazolo[4,3-e][1,2,4]Triazolo[1,5-c]Pyrimidine Derivatives JF - PLoS One N2 - A new series of pyrazolo[4,3-e][1,2,4]triazolo[1,5-c]pyrimidine (PTP) derivatives has been developed in order to explore their affinity and selectivity profile at the four adenosine receptor subtypes. In particular, the PTP scaffold was conjugated at the C2 position with the 1-(3-trifluoromethyl-benzyl)-1H-pyrazole, a group believed to confer potency and selectivity toward the human (h) A\(_{2B}\) adenosine receptor (AR) to the xanthine ligand 8-(1-(3-(trifluoromethyl) benzyl)-1H-pyrazol-4-yl)-1,3-dimethyl-1H-purine-2,6(3H, 7H)-dione (CVT 6975). Interestingly, the synthesized compounds turned out to be inactive at the hA\(_{2B}\) AR but they displayed affinity at the hA\(_3\) AR in the nanomolar range. The best compound of the series (6) shows both high affinity (hA\(_3\) AR K\(_i\) = 11 nM) and selectivity (A\(_1\)/A\(_3\) and A\(_{2A}\)/A\(_3\) > 9090; A\(_{2B}\)/A\(_3\) > 909) at the hA\(_3\) AR. To better rationalize these results, a molecular docking study on the four AR subtypes was performed for all the synthesized compounds. In addition, CTV 6975 and two close analogues have been subjected to the same molecular docking protocol to investigate the role of the 1-(3-trifluoromethyl-benzyl)-1H-pyrazole on the binding at the four ARs. KW - drug KW - human A(3) KW - protein-coupled receptors KW - classification KW - subtypes KW - potent KW - antagonists KW - mast cells KW - targets KW - A(2B) receptors KW - international union Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-137133 VL - 10 IS - 12 ER - TY - THES A1 - Leyh, Annekathrin T1 - In vitro Untersuchungen zur Genotoxizität von Insulin T1 - In vitro studies on genotoxicity of insulin N2 - Insulin ist ein essentielles Hormon im menschlichen Körper, welches für die Senkung der Blutglukosekonzentration, die Bildung von Energiespeichern und das Zellwachstum verantwortlich ist. Eine mit der Fehlregulation der Insulinproduktion einhergehenden Krankheit ist der Diabetes mellitus. Für diese Arbeit spielt der Typ 2 dieser Erkrankung eine wichtige Rolle. Es entwickelt sich bei Patienten mit diesem Typ des Diabetes mellitus langsam eine Insulinresistenz, die zunächst durch eine kompensatorische Überproduktion von Insulin charakterisiert ist. Dieser Zustand der Hyperinsulinämie kann Jahre bis Jahrzehnte andauern, ehe es zu einem Versagen der ß-Zellen des Pankreas und somit zu einer Hypoinsulinämie kommt. In dieser Arbeit war es Ziel herauszufinden, ob diese lange Zeit herrschende Hyperinsulinämie einen Einfluss auf die menschliche DNA hat. Die Genotoxizität von hohen Insulinkonzentrationen wurde in Hep-G2 Zellen, HT29 Zellen, sowie primären humanen peripheren Lymphozyten mithilfe des Comet Assays und des Mikrokerntests nachgewiesen. Oxidativer Stress bzw. dessen Reduzierung durch Antioxidantien und Inhibitoren wurde in HT29 Zellen mithilfe der DHE-Färbung detektiert. Diese Arbeit belegt dass sich Insulin schädigend auf das menschliche Genom in vitro auswirken kann. Eine besondere Relevanz haben die durchgeführten Experimente mit primären menschlichen Lymphozyten. Denn bei ihnen handelt es sich um Zellen, die im Gegensatz zu der auch genutzten humanen Leberkarzinomzelllinie Hep-G2 und der humanen Kolonkarzinomzelllinie HT29 nicht transformiert sind. Eine weitere wesentliche Erkenntnis dieser Arbeit ist, dass schon pathophysiologisch vorliegende Insulinkonzentrationen in der Lage sind Genomschädigungen in vitro zu induzieren. HT29 Zellen zeigten bei Kurzzeitbehandlung mit nur 1nM Insulin eine signifikante Erhöhung der DNA-Schädigung. Bei Langzeitexposition von 6 Tagen konnten schon 0,5nM signifikante DNA-Schäden hervorrufen. Diese durch Insulin hervorgerufenen Schäden könnten, falls sie so auch in vivo entstehen, bei Versagen von Reparaturmechanismen zur Entstehung von Mutationen und sich daraus entwickelnden Karzinomen beitragen. Aus diesem Grund war ein weiteres Ziel dieser Arbeit herauszufinden, ob bestimmte Antioxidantien oder Inhibitoren in der Lage sind die Insulin-induzierten Genomschädigungen zu verringern. Hierfür wurde Tempol, Apocynin, Plumbagin, VAS2870, Rotenone, PPP, HNMPA-(AM)3 und Wortmannin genutzt. Tatsächlich sind diese Substanzen in der Lage die durch Insulin hervorgerufene Schädigung zu reduzieren. Die positiven Ergebnisse dieser Arbeit könnten einen ersten Hinweis auf eine mögliche pharmakologische Intervention bei Hyperinsulinämie mit dem Ziel der Senkung des erhöhten Krebsrisikos geben. Eine wichtige Erkenntnis aus den Ergebnissen meiner Arbeit ist, dass die Reduzierung des oxidativen Stresses eine Reduzierung der Genomschädigung bewirkt. Die genutzten Substanzen Apocynin, Tempol, VAS2870 und Rotenone bewirkten in HT29 Zellen eine signifikante Reduzierung des durch Insulin ausgelösten oxidativen Stresses. Um aber genauere Aussagen über Möglichkeiten der Therapie bei Hyperinsulinämie zu treffen, sollten Folgestudien auch in vivo folgen, welche die in dieser Arbeit beschriebenen Effekte bestätigen. N2 - Insulin is an essential hormone in the human body, which is responsible for the reduction of blood glucose concentration, the formation of energy holding compounds, and cell growth. A disease associated with the dysregulation of insulin production is diabetes mellitus. For this work, the type 2 of the disease plays an important role. Patients with this type of diabetes mellitus gradually develop an insulin resistance, which is initially characterized by a compensatory overproduction of insulin. This state of hyperinsulinemia may last years or even decades, before it comes to a break-down of the beta cells of the pancreas, and hence to a hypoinsulinemia. The target of this study was to evaluate, whether these long term lasting hyperinsulinemia has an impact on human DNA. The genotoxicity of high insulin concentrations was detected in HepG2 cells, HT29 cells as well as primary human peripheral lymphocytes, using the comet assay and the micronucleus test. Oxidative stress and it´s reduction by antioxidants and inhibitors was detected in HT29 cells using the DHE staining. This work shows that insulin may damage the human genome in vitro. A special relevance show experiments carried out with primary human lymphocytes. Because these are not transformed like the human liver carcinoma cell line HepG2, and the human colon carcinoma cell line HT29, also studied. Another significant finding of this study is, that even pathophysiologically present insulin concentrations are capable to damage the genome in vitro. HT29 cells showed a significant increase in DNA damage when short-term treated with only 1nM insulin. After long-term exposure of 6 days already 0.5nM were capable to significantly damage DNA. This induced insulin damage could, if also occurring in vivo, contribute to the development of mutations and carcinomas, if mechanisms of repairs are failing. A further aim of this study was therefore to check whether certain antioxidants or inhibitors would be capable of reducing insulin-induced genome damages. For this Tempol, Apocynin, Plumbagin, VAS2870, Rotenone, PPP, HNMPA-(AM)3 and Wortmannin were used. In fact, these substances are capable to reduce the damage caused by insulin. The positive results of this work could be a first indication of a possible pharmacological intervention against hyperinsulinemia with the aim of lowering stringent cancer risk. An important conclusion of the results of my work is that reduction of oxidative stress results in a reduction of genome damage. The substances used, Apocynin, Tempol, VAS2870 and Rotenone, caused a significant reduction of insulin-induced oxidative stress, in HT29 cells. In order to make more detailed statements about possibilities of hyperinsulinemia therapy, follow-up studies in vivo are required which would back-up the findings of this study. KW - Insulin KW - Genotoxizität KW - Hyperinsulinämie Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-131986 ER - TY - THES A1 - Zink [geb. Sondergeld], Thomas Gerd T1 - Der Cofilin-Signalweg im Glioblastoma multiforme - Ursachen für den Verlust von Chronophin und Einfluss von LIM-Kinase-Inhibitoren T1 - The cofilin pathway in glioblastoma multiforme - Reasons for chronophin loss and effect of LIM-kinase inhibitors N2 - Das invasive Potential maligner Gliome beeinflusst maßgeblich die schlechte Prognose dieser Tumorentität. Migration und Invasion von Tumorzellen werden entscheidend durch die Cofilin-vermittelte Umstrukturierung des Aktin-Zytoskeletts geprägt, die durch die Aktivität antagonistischer Cofilin-Kinasen und -Phosphatasen reguliert wird. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte ein progressiver Expressionsverlust der Cofilin-Phosphatase Chronophin mit ansteigendem Malignitätsgrad astrozytärer Gliome aufgezeigt werden, der mit einer Zunahme der Phosphorylierung von Cofilin einhergeht. In den entsprechenden Gewebeproben gelang gleichzeitig der Nachweis einer gesteigerten Expression der Cofilin-Kinase LIMK-2. Genetische und epigenetische Analysen des Chronophin-Locus konnten eine Hypermethylierung im Bereich der Promotorregion der Phosphatase identifizieren, die möglicherweise dem Verlust von Chronophin in Glioblastom-Gewebeproben zugrunde liegt. In Glioblastom-Zelllinien, die unterschiedliche Expressionsmuster von Chronophin aufwiesen, konnten hingegen keine molekularen Alterationen festgestellt werden. Untersuchungen des Einflusses von ROCK- und LIMK-Inhibitoren auf Glioblastomzellen konnten ausgeprägte Veränderungen der Zellmorphologie dokumentieren, wobei erstmals die Induktion eines stellate cell-Phänotyps unter Einfluss des LIMK-Inhibitors BMS-5 beschrieben wird. Während ROCK- und LIMK-Inhibitoren keinen Einfluss auf die 2D-Motilität der Tumorzellen hatten, wiesen die Glioblastomzellen in Abhängigkeit ihrer basalen Cofilin-Aktivität eine verstärkte bzw. verminderte 3D-Invasivität auf. Die Erkenntnisse dieser Arbeit unterstreichen die Bedeutung des Cofilin-Signalweges für die Migration und Invasion von Gliomzellen, zeigen neue Angriffspunkte in der Therapie maligner Gliome auf und warnen zugleich vor einem unkritischen Einsatz neuer Wirkstoffe. N2 - The invasive potential of malignant gliomas is the main reason for the dismal prognosis of this tumor entity. Migration and invasion of tumor cells is crucially determined by the cofilin dependent reorganization of the actin cytoskeleton regulated by the activity of antagonistic cofilin kinases and phosphatases. This study revealed a progressive loss of expression of the cofilin phosphatase chronophin with increasing malignancy grade of astrocytic glioma, accompanied by an increase of cofilin phosphorylation. Moreover, the analyzed glioma specimens were characterized by a simultaneous increase of expression of the cofilin kinase LIMK-2. Integrated genetic and epigenetic analysis of the chronophin locus identified an aberrant promoter methylation as a possible mechanism leading to chronophin down-regulation in glioblastoma tissue samples. In contrast, molecular alterations of the chronophin locus were undetectable in glioblastoma cell lines characterized by different chronophin expression levels. Analysis of glioblastoma cells demonstrated striking effects of ROCK and LIMK inhibitors on cell morphology, providing first evidence of the induction of a stellate cell-phenotype by the LIMK inhibitor BMS-5. While ROCK and LIMK inhibitors had no detectable effect on the 2D motility of the tumor cells, the inhibitors increased or decreased the 3D-invasiveness of the glioma cells depending on their basal cofilin activity. The findings of this study stress the importance of the cofilin signaling pathway as a key regulator of glioma migration and invasion, indicate novel targets for glioma therapy, but also warn against a noncritical use of new drugs. KW - Cofilin KW - Glioblastom KW - Chronophin KW - Actin KW - Rho-Proteine KW - PDXP KW - LIMK KW - BMS-5 KW - Signalkette KW - Rho-GTPasen Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-127065 ER - TY - THES A1 - Stumpf, Anette D. T1 - Development of fluorescent FRET receptor sensors for investigation of conformational changes in adenosine A1 and A2A receptors T1 - Entwicklung fluoreszenter FRET Rezeptor-Sensoren zur Untersuchung von Konformationsänderungen in Adenosin A1 und A2A Rezeptoren N2 - Adenosine receptors that belong to the rhodopsin-like G protein-coupled receptors (GPCRs) are involved in a lot of regulatory processes and are widely distributed throughout the body which makes them an attractive target for drugs. However, pharmacological knowledge of these receptors is still limited. A big advance regarding the structural knowledge of adenosine receptors was the development of the first crystal structure of the adenosine A2A receptor in 2008. The crystal structure revealed the amino acids that form the ligand binding pocket of the receptor and depicted the endpoint of receptor movement in the ligand binding process. Within the scope of this work two members of the adenosine receptor family were investigated, namely the adenosine A1 and the A2A receptor (A1R, A2AR). A1R was generated on base of the previously developed A2AR. Receptors were tagged with fluorophores, with the cyan fluorescent protein (CFP) at the C-terminal end of receptor and the Fluorescein Arsenical Hairpin binder (FlAsH) binding sequence within the third intracellular loop of receptors. Resulting fluorescent receptor sensors A1 Fl3 CFP and A2A Fl3 CFP were investigated with help of Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) measurements within living cells. FRET experiments enable the examination of alteration in the distance of two fluorophores and thus the observation of receptor dynamical movements. For comparison of A1R and A2AR regarding receptor dynamical movement upon ligand binding, fluorescent receptor sensors A1 Fl3 CFP and A2A Fl3 CFP were superfused with various ligands and the outcomes of FRET experiments were compared regarding signal height of FRET ratio evoked by the distinct ligand that is correlated to the conformational change of receptor upon ligand binding. Beside the different direction of FRET ratio upon ligand binding at A1R and A2AR sensor, there were differences observable when signal height and association and dissociation kinetics of the various ligands investigated were compared to each other. Differences between the adenosine receptor subtypes were especially remarkable for the A1R subtype selective agonist CPA and the A2AR subtype selective agonist CGS 21680. Another part of the project was to investigate the influence of single amino acids in the ligand binding process within the fluorescent A1R sensor. Amino acid positions were derived from the crystal structure of the A2AR forming the ligand binding pocket and these amino acids were mutated in the A1R structure. Investigation of the A1R sensor and its mutants regarding confocal analysis showed involvement of some amino acids in receptor localization. When these amino acids were mutated receptors were not expressed in the plasma membrane of cells. Some amino acids investigated were found to be involved in the ligand binding process in general whereas other amino acids were found to have an influence on the binding of distinct structural groups of the ligands investigated. In a further step, A1R and A2AR were N-terminally tagged with SNAP or CLIP which allowed to label receptor sensors with multiple fluorophores. With this technique receptor distribution in cells could be investigated with help of confocal analysis. Furthermore, ligand binding with fluorescent adenosine receptor ligands and their competition with help of a non-fluorescent antagonist was examined at the SNAP tagged A1R and A2AR. Finally the previously developed receptor sensors were combined to the triple labeled receptor sensors SNAP A1 Fl3 CFP and SNAP A2A Fl3 CFP which were functional regarding FRET experiments and plasma membrane expression was confirmed via confocal analysis. In the future, with the help of this technique, interaction between fluorescent ligand and SNAP tagged receptor can be monitored simultaneously with the receptor movement that is indicated by the distance alteration between FlAsH and CFP. This can lead to a better understanding of receptor function and its dynamical movement upon ligand binding which may contribute to the development of new and more specific drugs for the A1R and A2AR in the future. N2 - Adenosin Rezeptoren, die zur Gruppe der Rhodopsin-ähnlichen G Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) gehören, sind in eine Vielzahl regulatorischer Prozesse eingebunden und weit im Körper verbreitet. Das macht sie zu einer interessanten Zielstruktur für Arzneistoffe. Das Wissen über die Struktur der Adenosin Rezeptoren ist jedoch noch begrenzt. Ein großer Fortschritt zu mehr strukturellem Wissen war die Entwicklung der ersten Kristallstruktur des Adenosin A2A Rezeptors im Jahr 2008. Mit der Kristallstruktur wurden die Aminosäuren bekannt, die die Ligandenbindetasche dieses Rezeptors formen. Zudem gab die Kristallstruktur Einblick in den Endpunkt der dynamischen Rezeptorbewegung nach Ligandenbindung. Im Rahmen der hier vorgestellten Arbeit wurden zwei Mitglieder der Adenosin Rezeptor Familie, der Adenosin A1 Rezeptor und der Adenosin A2A Rezeptor (A1R, A2AR), genauer untersucht. Der A1R wurde auf Basis des vor kurzem veröffentlichten A2AR entwickelt. Die Rezeptoren wurden mit Fluorophoren versehen, zum einen mit dem cyan fluoreszierenden Protein (CFP) am C-Terminus des Rezeptors und zum anderen mit der Bindesequenz des kleinen Fluorophors "Fluorescein Arsenical Hairpin binder" (FlAsH) in der dritten intrazellulären Schleife des Rezeptors. Die daraus resultierenden Rezeptorsensoren A1 Fl3 CFP und A2A Fl3 CFP wurden mit Hilfe des Fluoreszenz Resonanz Energie Transfers (FRET) in lebenden Zellen erforscht. FRET Messungen ermöglichen es, eine Änderung der Distanz zwischen den beiden Fluorophoren und damit Rezeptorbewegungen zu untersuchen. Um A1R und A2AR bezüglich dynamischer Rezeptorbewegungen nach Ligandenbindung vergleichen zu können, wurden die fluoreszierenden Rezeptorsensoren A1 Fl3 CFP und A2A Fl3 CFP mit verschiedenen Liganden umspült. Die Ergebnisse der FRET Messungen bezüglich ihrer Höhe des FRET Ratio wurden verglichen, welche mit der Konformationsänderung des Rezeptors nach Ligandenbindung zusammenhängt. Neben der unterschiedlichen Richtung des FRET Ratio nach Ligandenbindung am A1R und A2AR Sensor waren Unterschiede bezüglich der Signalhöhe und der Bindungs- und Dissoziationskinetiken feststellbar, wenn die verschiedenen Liganden miteinander verglichen wurden. Unterschiede zwischen den Adenosin Rezeptor Subtypen waren speziell für den A1R subtypselektiven Agonist CPA und für den A2AR subtypselektiven Agonist CGS 21680 feststellbar. Einen weiteren Punkt in diesem Projekt stellte die Erforschung des Einflusses, den einzelne Aminosäuren im fluoreszierenden A1R Sensor auf den Prozess der Ligandenbindung haben, dar. Die Position der Aminosäuren wurde der Kristallstruktur des A2AR entnommen und entsprechende Aminosäuren im A1R mutiert. Die konfokalmikroskopische Analyse des A1R Sensors und seiner Mutanten ergab, dass einige Aminosäuren direkt an der zellulären Expression des Rezeptors beteiligt waren. Wurden diese Aminosäuren mutiert, wurde der Rezeptor nicht in der Plasmamembran der Zellen exprimiert. Einige Aminosäuren die untersucht wurden,hatten einen generellen Einfluss auf die Bindung der Liganden, andere Aminosäuren hatten mehr Einfluss auf die Bindung bestimmter struktureller Gruppen der untersuchten Liganden. In einem weiteren Schritt wurden A1R und A2AR am N-terminalen Rezeptorende mit SNAP oder CLIP versehen, was eine Markierung der Rezeptoren mit einer Vielzahl an Fluorophoren erlaubt. Mit Hilfe dieser Technik konnte die Verteilung der Rezeptoren in der Zelle mit konfokaler Mikroskopie untersucht werden. Des Weiteren wurde die Bindung von fluoreszierenden Adenosin Rezeptor Liganden und deren Verdrängung mit einem nicht-fluoreszierenden Adenosin Rezeptor Antagonist erforscht. Am Ende des Projekts wurden die zuvor beschriebenen fluoreszierenden Rezeptorsensoren zu dreifach fluorophormarkierten Rezeptorsensoren kombiniert, was zu den Sensoren SNAP A1 Fl3 CFP und SNAP A2A Fl3 CFP führte. Beide Rezeptorsensoren waren funktionell bezüglich FRET Experimenten und der Expression in der Plasmamembran der Zellen. In Zukunft können mit dieser Methode gleichzeitig die Bindung von fluoreszierenden Liganden am SNAP-markierten Rezeptor, so wie die Rezeptorbewegung beobachtet werden, die durch eine Distanzänderung zwischen CFP und FlAsH angezeigt wird. Das kann zu einem besseren Verständnis der Rezeptorfunktion und der dynamischen Rezeptorbewegung nach Ligandenbindung führen, die in Zukunft zur Entwicklung spezifischerer Wirkstoffe am A1R und A2AR beitragen könnte. KW - Adenosinrezeptor KW - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer KW - G-Protein gekoppelte Rezeptoren KW - Adenosine receptors Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-125469 ER - TY - JOUR A1 - Boivin, Valérie A1 - Beyersdorf, Niklas A1 - Palm, Dieter A1 - Nikolaev, Viacheslav O. A1 - Schlipp, Angela A1 - Müller, Justus A1 - Schmidt, Doris A1 - Kocoski, Vladimir A1 - Kerkau, Thomas A1 - Hünig, Thomas A1 - Ertl, Georg A1 - Lohse, Martin J. A1 - Jahns, Roland T1 - Novel Receptor-Derived Cyclopeptides to Treat Heart Failure Caused by \(Anti-β_1-Adrenoceptor\) Antibodies in a Human-Analogous Rat Model JF - PLoS One N2 - Despite recent therapeutic advances the prognosis of heart failure remains poor. Recent research suggests that heart failure is a heterogeneous syndrome and that many patients have stimulating auto-antibodies directed against the second extracellular loop of the \(β_1\) adrenergic receptor \((β_1EC2)\). In a human-analogous rat model such antibodies cause myocyte damage and heart failure. Here we used this model to test a novel antibody-directed strategy aiming to prevent and/or treat antibody-induced cardiomyopathy. To generate heart failure, we immunised n = 76/114 rats with a fusion protein containing the human β1EC2 (amino-acids 195–225) every 4 weeks; n = 38/114 rats were control-injected with 0.9% NaCl. Intravenous application of a novel cyclic peptide mimicking \(β_1EC2\) (\(β_1EC2-CP\), 1.0 mg/kg every 4 weeks) or administration of the \(β_1-blocker\) bisoprolol (15 mg/kg/day orally) was initiated either 6 weeks (cardiac function still normal, prevention-study, n = 24 (16 treated vs. 8 untreated)) or 8.5 months after the 1st immunisation (onset of cardiomyopathy, therapy-study, n = 52 (40 treated vs. 12 untreated)); n = 8/52 rats from the therapy-study received \(β_1EC2-CP/bisoprolol\) co-treatment. We found that \(β_1EC2-CP\) prevented and (alone or as add-on drug) treated antibody-induced cardiac damage in the rat, and that its efficacy was superior to mono-treatment with bisoprolol, a standard drug in heart failure. While bisoprolol mono-therapy was able to stop disease-progression, \(β_1EC2-CP\) mono-therapy -or as an add-on to bisoprolol- almost fully reversed antibody-induced cardiac damage. The cyclo¬peptide acted both by scavenging free \(anti-β_1EC2-antibodies\) and by targeting \(β_1EC2\)-specific memory B-cells involved in antibody-production. Our model provides the basis for the clinical translation of a novel double-acting therapeutic strategy that scavenges harmful \(anti-β_1EC2-antibodies\) and also selectively depletes memory B-cells involved in the production of such antibodies. Treatment with immuno-modulating cyclopeptides alone or as an add-on to \(β_1\)-blockade represents a promising new therapeutic option in immune-mediated heart failure. KW - memory B cells KW - antibodies KW - T cells KW - B cells KW - heart KW - heart failure KW - kidneys KW - enzyme-linked immunoassays Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-126028 VL - 10 IS - 2 ER - TY - THES A1 - Bellwon, Patricia T1 - Kinetic assessment by in vitro approaches - A contribution to reduce animals in toxicity testing T1 - Evaluierung der Kinetik anhand von in vitro Systemen - Ein Beitrag um die Anzahl von Tierversuchen zur Toxizitätsprüfung zu reduzieren N2 - The adoption of directives and regulations by the EU requires the development of alternative testing strategies as opposed to animal testing for risk assessment of xenobiotics. Additionally, high attrition rates of drugs late in the discovery phase demand improvement of current test batteries applied in the preclinical phase within the pharmaceutical area. These issues were taken up by the EU founded 7th Framework Program “Predict-IV”; with the overall goal to improve the predictability of safety of an investigational product, after repeated exposure, by integration of “omics” technologies applied on well established in vitro approaches. Three major target organs for drug-induced toxicity were in focus: liver, kidney and central nervous system. To relate obtained dynamic data with the in vivo situation, kinetics of the test compounds have to be evaluated and extrapolated by physiologically based pharmacokinetic modeling. This thesis assessed in vitro kinetics of the selected test compounds (cyclosporine A, adefovir dipivoxil and cisplatinum) regarding their reliability and relevance to respective in vivo pharmacokinetics. Cells were exposed daily or every other day to the test compounds at two concentration levels (toxic and non-toxic) for up to 14 days. Concentrations of the test compounds or their major biotransformation products were determined by LC-MS/MS or ICP-MS in vehicle, media, cells and plastic adsorption samples generated at five different time-points on the first and the last treatment day. Cyclosporine A bioaccumulation was evident in primary rat hepatocytes (PRH) at the high concentration, while efficient biotransformation mediated by CYP3A4 and CYP3A5 was determined in primary human hepatocytes (PHH) and HepaRG cells. The lower biotransformation in PRH is in accordance with observation made in vivo with the rat being a poor model for CYP3A biotransformation. Further, inter-assay variability was noticed in PHH caused by biological variability in CYP3A4 and CYP3A5 activity in human donors. The inter-assay variability observed for PRH and HepaRG cells was a result of differences between vehicles regarding their cyclosporine A content. Cyclosporine A biotransformation was more prominent in HepaRG cells due to stable and high CYP3A4 and CYP3A5 activity. In addition, in vitro clearances were calculated and scaled to in vivo. All scaled in vitro clearances were overestimated (PRH: 10-fold, PHH: 2-fold, HepaRG cells: 2-fold). These results should be proven by physiologically-based pharmacokinetic modeling and additional experiments, in order to verify that these overestimations are constant for each system and subsequently can be diminished by implementation of further scaling factors. Brain cell cultures, primary neuronal culture of mouse cortex cells and primary aggregating rat brain cells, revealed fast achieved steady state levels of cyclosporine A. This indicates a chemical distribution of cyclosporine A between the aqueous and organic phases and only minor involvement of biological processes such as active transport and biotransformation. Hence, cyclosporine A uptake into cells is presumably transport mediated, supported by findings of transporter experiments performed on a parallel artificial membrane and Caco-2 cells. Plastic adsorption of cyclosporine A was significant, but different for each model, and should be considered by physiologically based pharmacokinetic modeling. Kinetics of adefovir dipivoxil highlights the limits of in vitro approaches. Active transporters are required for adefovir uptake, but were not functional in RPTECT/TERT1. Therefore, adefovir uptake was limited to passive diffusion of adefovir dipivoxil, which itself degrades time-dependently under culture conditions. Cisplatinum kinetics, studied in RPTEC/TERT1 cells, indicated intracellular enrichment of platinum, while significant bioaccumulation was not noted. This could be due to cisplatinum not reaching steady state levels within 14 days repeated exposure. As shown in vivo, active transport occurred from the basolateral to apical side, but with lower velocity. Hence, obtained data need to be modeled to estimate cellular processes, which can be scaled and compared to in vivo. Repeated daily exposure to two different drug concentrations makes it possible to account for bioaccumulation at toxic concentrations or biotransformation/extrusion at non-toxic concentrations. Potential errors leading to misinterpretation of data were reduced by analyses of the vehicles as the applied drug concentrations do not necessarily correspond to the nominal concentrations. Finally, analyses of separate compartments (medium, cells, plastic) give insights into a compound’s distribution, reduce misprediction of cellular processes, e.g. biotransformation, and help to interpret kinetic data. On the other hand, the limits of in vitro approaches have also been pointed out. For correct extrapolation to in vivo, it is essential that the studied in vitro system exhibits the functionality of proteins, which play a key role in the specific drug induced toxicity. Considering the benefits and limitations, it is worth to validate this long-term treatment experimental set-up and expand it on co-culture systems and on organs-on-chips with regard to alternative toxicity testing strategies for repeated dose toxicity studies. N2 - Die Erlassung von Richtlinien und Verordnungen durch die EU führte zu der Entwicklung von alternativen Testmethoden als Ersatz von Tierversuchen zur Risikobewertung von Xenobiotika. Des Weiteren weisen hohe Ausfallraten von Arzneimitteln in der späten Entwicklungsphase auf die Notwendigkeit hin, die bisher verwendeten Testmethoden der präklinischen Phase zu verbessern. Diese Punkte wurden in dem im siebten Rahmenprogramm der EU finanzierten Projekt „Predict-IV“ aufgegriffen. Ziel des Projektes war es, die Vorhersage der Arzneimittelsicherheit durch integrierte „omics“-Technologien, angewendet an etablierten in vitro Ansätzen, zu verbessern. Dabei standen drei Zielorgane bzgl. Arzneimittel-induzierter Organtoxizität im Mittelpunkt: Leber, Niere und zentrales Nervensystem, die jeweils durch Zelllinien oder primäre Zellen vertreten waren. Um die in vitro generierten Dynamik-Daten mit der in vivo Situation in Korrelation zu bringen, muss die Kinetik der Testsubstanz berücksichtigt und die Ergebnisse mit Hilfe von physiologisch-basierter pharmakokinetischer Modellierung extrapoliert werden. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Kinetik-Daten der gewählten Testsubstanzen (Cyclosporin A, Adefovir dipivoxil und Cisplatin) in vitro zu erheben und bzgl. ihrer Zuverlässigkeit sowie ihrer Relevanz verglichen mit in vivo Daten zu beurteilen. Hierfür wurden kultivierte Zellen täglich bzw. jeden zweiten Tag für zwei Wochen mit zwei verschiedenen Konzentrationen (toxisch und nicht toxisch) des Arzneimittels behandelt. Der Gehalt des applizierten Arzneimittels oder die Hauptmetaboliten wurden mittels LC MS/MS oder ICP-MS in Vehikel, Medium und Zellen sowie die vom Plastik adsorbierte Menge in Proben bestimmt, die am ersten und letzten Behandlungstag zu fünf unterschiedlichen Zeitpunkten gewonnen wurden. Eine eindeutige Bioakkumulation von Cyclosporin A wurde in primären Rattenhepatozyten nach Behandlung mit der hohen Konzentration festgestellt. Eine effiziente CYP3A4- und CYP3A5-vermittelte Biotransformation von Cyclosporin A wurde für primäre humane Hepatozyten sowie HepaRG Zellen beobachtet. Diese Ergebnisse stimmten mit der in vivo Situation überein. Ratten sind aufgrund ihrer geringen CYP3A Aktivität schlechte Tiermodelle für CYP3A-Biotransformationsstudien. Des Weiteren wurden Interassay-Schwankungen bei primären human Hepatozyten bemerkt, die auf die biologische Variabilität der CYP3A4- sowie CYP3A5-Aktivität zwischen den menschlichen Spendern zurückzuführen sind. Rattenhepatozyten und HepaRG Zellen hingegen wiesen Interassay-Schwankungen auf, die durch unterschiedliche Cyclosporin A Behandlungskonzentrationen zwischen den Replikaten verursacht wurden. Die Cyclosporin A Biotransformation war in HepaRG Zellen am stärksten ausgeprägt, was durch stabile und wesentlich höhere CYP3A4- und CYP3A5-Aktivität in HepaRG Zellen zu erklären ist. Zusätzlich wurden die in vitro Clearance-Werte bestimmt und auf in vivo Clearance-Werte extrapoliert. Alle extrapolierten Werte waren zu hoch geschätzt (primäre Rattenhepatozyten: 10fach, primäre human Hepatpzyten: 2fach, HepaRG Zellen: 2fach). Diese Ergebnisse sollten mittels physiologisch-basierter pharmakokinetischer Modellierung sowie durch weitere Experimente überprüft werden, um zu ermitteln, ob diese hohen Schätzungen für jedes System konstant sind und somit durch die Einführung von weiteren Skalierungsfaktoren verringert werden können. Kultivierte Gehirnzellen, primäre Nervenzellkulturen der Kortex von Mäusen und primäre Hirnzellaggregate der Ratte, zeigten schnell erreichte Cyclosporin A Gleichgewichtskonzentrationen. Diese Ergebnisse deuteten auf eine Verteilung von Cyclosporin A zwischen der wässrigen und organischen Phase hin, wobei biologische Prozesse nur eine untergeordnete Rolle spielen. Daher scheint die intrazelluläre Cyclosporin A Aufnahme Transporter-vermittelt zu sein. Ergebnisse der Transporter Experimente, die an einer künstlichen Membran und Caco-2 Zellen durchgeführt wurden, unterstützten diese Hypothese. Messungen der Plastikbindung von Cyclosporin A zeigten signifikante, aber für jedes Zellsystem unterschiedliche, Adsorptionsraten, die mittels physiologisch-basierter pharmakokinetischer Modellierung berücksichtigt werden sollten. Die Kinetik von Adefovir dipivoxil machte auf die Nachteile von in vitro Versuchen aufmerksam. Für die intrazelluläre Aufnahme von Adefovir sind aktive Transportproteine nötig, die jedoch in der Nierenzelllinie RPTEC/TERT1 nicht funktionell vorhanden sind. Daher war die Aufnahme von Adefovir auf die passive Diffusion von Adefovir dipivoxil beschränkt, das aber auch zeitabhängig unter den experimentellen Konditionen zerfiel. Die an RPTEC/TERT1 Zellen untersuchte Kinetik von Cisplatin deutete auf eine intrazelluläre Platin-Anreicherung hin, die jedoch nicht in einer signifikanten Bioakkumulation resultierte. Möglicherweise sind innerhalb von 14 Tagen die Gleichgewichtskonzentrationen von Cisplatin noch nicht erreicht. Die Kinetikprofile von Cisplatin in Medium ließen einen aktiven, von der basolateralen zur apikalen Seite gerichteten Cisplatin Transport erkennen, wie schon in vivo beschrieben, wobei die Geschwindigkeit dieser Transportprozesse in vitro langsamer zu sein scheint als in der intakte Niere. Daher müssen die generierten Daten zur Schätzung von zellulären Prozessen modelliert werden, um durch anschließende Extrapolation mit in vivo Daten verglichen werden zu können. Abschließend bleibt zu sagen, dass das experimentelle Design vorteilhaft war. Wiederholte tägliche Administration von zwei unterschiedlichen Konzentrationen eines Medikaments ermöglichte die Erfassung von Bioakkumulation bei toxischen Konzentrationen sowie Biotransformation/Export bei nicht-toxischen Konzentrationen. Potenzielle Fehler, die zu einer Fehlinterpretation führen könnten, wurden durch die exakte Bestimmung der tatsächlich applizierten Arzneimittelmenge reduziert, da nicht immer die applizierte Konzentration mit der Nominalkonzentration übereinstimmt. Darüber hinaus erwies es sich als Vorteil, die Arzneimittelkonzentrationen in den einzelnen Kompartimenten (Medium, Zellen und Plastik) zu bestimmen. Somit konnten zum einen Erkenntnisse über die Verteilung der Substanz gewonnen werden und zum anderen Fehleinschätzungen von zellulären Prozessen, z.B. Biotransformation, verhindert werden, was letzten Endes bei die Interpretation von Kinetik-Daten behilflich ist. Jedoch, wurden auch die Grenzen von in vitro Ansätzen deutlich. Für eine korrekte Extrapolation ist es unverzichtbar, dass die untersuchten in vitro Systeme funktionierende Proteine aufweisen, die bei der untersuchten Arzneimittel-induzierten Toxizität eine Schlüsselrolle übernehmen. Abschließend kann festgehalten werden, dass es, unter Berücksichtigung der Vor- und Nachteile, von Nutzen sein kann diesen Versuchsansatz der Langzeitbehandlung zu validieren und darüber hinaus auf Co Kultursysteme sowie Organ-Chips anzuwenden hinsichtlich der Entwicklung von Alternativmethoden für Toxizitätsstudien bei wiederholter Gabe. KW - cell culture KW - pharmacokinetics KW - repeated dose KW - in vitro KW - toxicity testing KW - Zellkultur KW - In vitro KW - Pharmakokinetik KW - Toxizitätstest Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-122693 ER -