TY - JOUR A1 - Altieri, Barbara A1 - Di Dato, Carla A1 - Martini, Chiara A1 - Sciammarella, Concetta A1 - Di Sarno, Antonella A1 - Colao, Annamaria A1 - Faggiano, Antongiulio T1 - Bone Metastases in Neuroendocrine Neoplasms: From Pathogenesis to Clinical Management JF - Cancers N2 - Bone represents a common site of metastases for several solid tumors. However, the ability of neuroendocrine neoplasms (NENs) to localize to bone has always been considered a rare and late event. Thanks to the improvement of therapeutic options, which results in longer survival, and of imaging techniques, particularly after the introduction of positron emission tomography (PET) with gallium peptides, the diagnosis of bone metastases (BMs) in NENs is increasing. The onset of BMs can be associated with severe skeletal complications that impair the patient's quality of life. Moreover, BMs negatively affect the prognosis of NEN patients, bringing out the lack of curative treatment options for advanced NENs. The current knowledge on BMs in gastro-entero-pancreatic (GEP) and bronchopulmonary (BP) NENs is still scant and is derived from a few retrospective studies and case reports. This review aims to perform a critical analysis of the evidence regarding the role of BMs in GEP- and BP-NENs, focusing on the molecular mechanisms underlining the development of BMs, as well as clinical presentation, diagnosis, and treatment of BMs, in an attempt to provide suggestions that can be used in clinical practice. KW - neuroendocrine neoplasms KW - bone metastases KW - bone microenvironment KW - skeletal-related events KW - epithelial-to-mesenchymal transition KW - microRNA KW - prognosis KW - treatment KW - denosumab Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-221079 VL - 11 ER - TY - THES A1 - Hahn, Sarah T1 - Investigating non-canonical, 5' UTR-dependent translation of MYC and its impact on colorectal cancer development T1 - Untersuchung der nicht-kanonischen, 5' UTR-abhängigen Translation von MYC und ihres Einflusses auf die Entwicklung von Darmkrebs N2 - Colorectal cancer (CRC) is the second most common tumour disease in Germany, with the sequential accumulation of certain mutations playing a decisive role in the transition from adenoma to carcinoma. In particular, deregulation of the Wnt signalling pathway and the associated deregulated expression of the MYC oncoprotein play a crucial role. Targeting MYC thus represents an important therapeutic approach in the treatment of tumours. Since direct inhibition of MYC is challenging, various approaches have been pursued to date to target MYC indirectly. The MYC 5' UTR contains an internal ribosomal entry site (IRES), which has a particular role in the initiation of MYC translation, especially in multiple myeloma. As basis for this work, it was hypothesised on the basis of previous data that translation of MYC potentially occurs via its IRES in CRC as well. Based on this, two IRES inhibitors were tested for their potential to regulate MYC expression in CRC cells. In addition, alternative, 5’ UTR-dependent translation of MYC and interacting factors were investigated. EIF3D was identified as a MYC 5' UTR binding protein which has the potential to regulate MYC expression in CRC. The results of this work suggest that there is a link between eIF3D and MYC expression/translation, rendering eIF3D a potential therapeutic target for MYC-driven CRCs. N2 - Das kolorektale Karzinom (KRK) ist die zweithäufigste Tumorerkrankung in Deutschland, wobei die sequenzielle Akkumulation bestimmter Mutationen eine entscheidende Rolle beim Übergang vom Adenom zum Karzinom spielt. Insbesondere die Deregulation des Wnt-Signalweges und die damit verbundene deregulierte Expression des MYC-Onkoproteins spielen eine entscheidende Rolle. MYC ist ein zentraler Vermittler von Zellfunktionen und reguliert als Transkriptionsfaktor die Expression fast aller Gene sowie verschiedener RNA-Spezies. Selbst kleine Veränderungen der zellulären MYC-Konzentration können das Proliferationsverhalten beeinflussen und die Entstehung und das Fortschreiten von Tumoren fördern. Die gezielte Beeinflussung von MYC stellt daher einen wichtigen therapeutischen Ansatz für die Behandlung von Tumoren dar. Da eine direkte Hemmung von MYC aufgrund seiner Struktur herausfordernd ist, wurden bisher verschiedene Ansätze verfolgt, um MYC indirekt zu beeinflussen, etwa über seinen Interaktionspartner MAX oder auf Ebene der Stabilität, Transkription oder Translation. In unserer eigenen Forschungsgruppe lag der Schwerpunkt in den letzten Jahren speziell auf der Translation von MYC im KRK. Es konnte gezeigt werden, dass die Hemmung der kanonischen cap-abhängigen Translation nicht wie erwartet zu einer Verringerung der zellulären MYC-Level führt, was auf einen alternativen Mechanismus der MYC-Translation hindeutet, der unabhängig vom eIF4F-Komplex abläuft. Die 5'-UTR von MYC enthält eine interne ribosomale Eintrittsstelle (IRES), die eine besondere Rolle bei der Initiierung der MYC-Translation spielt, insbesondere im Multiplen Myelom. Als Grundlage für diese Arbeit wurde daher die Hypothese aufgestellt, dass die Translation von MYC im KRK möglicherweise ebenfalls über die IRES erfolgt. Auf dieser Grundlage wurden zunächst zwei publizierte IRES-Inhibitoren auf ihr Potenzial zur Regulierung der MYC-Expression in KRK-Zellen getestet. J007-IRES hatte keine Auswirkungen auf die MYC-Proteinmenge, und Cymarin scheint weitaus globalere Auswirkungen zu haben, die nicht ausschließlich auf die Verringerung der MYC-Proteinmenge zurückzuführen sind. Daher wurde weiter untersucht, inwieweit die alternative Translation von MYC generell von der 5'-UTR und damit interagierenden Faktoren abhängig ist. EIF3D wurde als MYC-5'-UTR-Bindungsprotein identifiziert, dessen Knockdown zu reduzierten MYC-Leveln, einem Proliferationsdefizit sowie einer Verringerung der globalen Proteinsynthese in KRK-Zellen führte. Darüber hinaus führte die Depletion von EIF3D zu ähnlichen Veränderungen im zellulären Genexpressionsmuster wie die Depletion von MYC, wobei viele tumorassoziierte Signalwege betroffen waren. Mittels eCLIP-seq wurde die Bindung von eIF3D an die MYC mRNA nachgewiesen, der genaue Mechanismus einer möglicherweise durch eIF3D vermittelten Translation von MYC muss jedoch weiter untersucht werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass eine Verbindung zwischen eIF3D und der MYC-Expression/Translation besteht, wodurch eIF3D zu einem potenziellen therapeutischen Ziel für MYC-getriebene KRKs wird. KW - Myc KW - Translation KW - Colorectal cancer KW - 5' UTR Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-364202 ER - TY - THES A1 - Papay, Marion T1 - Notwendigkeit der präoperativen Reposition von distalen, nach dorsal dislozierten Radiusfrakturen bei bestehender Operationsindikation im Hinblick auf das Schmerzniveau sowie postoperative Ergebnisse T1 - Necessity of preoperative closed reduction of dorsally displaced distal radius fractures with existing surgical indication with regard to the pain level and postoperative results N2 - Die distale Radiusfraktur gehört zu den häufigsten Frakturen in Deutschland mit einem Inzidenzanstieg im Alter unter Betonung des weiblichen Geschlechts. Dabei zeigt sich ein zunehmender Trend in Richtung operative Versorgung, allen voran die Versorgung mittels winkelstabiler Plattensysteme. Instabile, distale Radiusfrakturen werden dabei vor geplanter operativer Versorgung im Rahmen der Initialbehandlung üblicherweise geschlossen reponiert und im Gipsverband retiniert. Ziel der vorliegenden monozentrischen, prospektiv randomisierten Studie mit zwei Studiengruppen war es herauszufinden, ob sich das Unterlassen der Reposition vor geplanter Operation nachteilig auf das Schmerzniveau in der präoperativen Phase auswirkt und ob sich durch die Dislokation Nachteile in Bezug auf den Nervus medianus im Sinne eines Traktionsschadens sowie bezüglich des klinisch-radiologischen Ausheilungsergebnisses zeigen. Die Studie zeigte, dass das Schmerzempfinden während der präoperativen Gipsbehandlung unabhängig von einer vorherigen Reposition war. Für den primären Endpunkt an Tag 1 nach der Akutbehandlung konnte statistisch signifikante Nichtunterlegenheit der Gruppe ohne Reposition gegenüber der Gruppe mit Reposition nachgewiesen werden. Gleiches galt für Tag 2, sowohl für die absoluten Schmerzniveaus als auch für die Schmerzlinderung. Das Unterlassen der Reposition hatte zudem keine nachteiligen Effekte auf den Nervus medianus. Gleiches zeigte sich für das klinische und radiologische Ausheilungsergebnis. Für die funktionellen DASH- und Krimmer-Scores konnte ein Jahr postoperativ ebenfalls statistisch signifikante Nichtunterlegenheit der Gruppe ohne Reposition nachgewiesen werden. Diese Erkenntnisse bestätigen die in der Literatur vorhandenen Ergebnisse verschiedener Studien dahingehend, dass das Unterlassen der Reposition keine nachteiligen Effekte auf das postoperative Outcome hat. Einige Studien verdeutlichen zudem, dass es nach Reposition, insbesondere bei Vorliegen gewisser Risiko- und Instabilitätsfaktoren, ohnehin zur sekundären Dislokation kommt, sodass die generelle Notwendigkeit der Reposition vor Gipsanlage sowohl vor einer operativen als auch vor einer konservativen Weiterbehandlung angezweifelt werden muss. N2 - The distal radius fracture is one of the most common fractures in Germany, with an increase in incidence with age and an emphasis on the female sex. There is an increasing trend towards surgical treatment, above all treatments using locking plate systems. Prior to planned surgical treatment, unstable, distal radius fractures are usually reduced in a closed manner as part of the initial treatment and are retained in a plaster cast. The aim of the present monocentric, prospective randomized study with two study groups was to find out whether omitting reduction before planned surgery has a negative effect on the pain level in the preoperative phase and whether the dislocation has disadvantages with regard to the median nerve in terms of traction damage and with regard to the clinical and radiological healing result. The study showed that the sensation of pain during preoperative plaster treatment was independent of previous reduction. For the primary endpoint on day 1 after acute treatment, statistically significant non-inferiority of the group without reduction compared to the group with reduction was demonstrated. The same was true for day 2, both for absolute pain levels and pain relief. The omission of the reduction also had no adverse effects on the median nerve. The same was shown for the clinical and radiological healing results. For the functional DASH and Krimmer scores, statistically significant non-inferiority of the group without reduction was also demonstrated one year postoperatively. These findings confirm the results of various studies in the literature to the effect that omitting reduction has no detrimental effects on the postoperative outcome. Some studies also make it clear that secondary dislocation occurs anyway after reduction, especially in the presence of certain risk and instability factors, so that the general necessity of reduction prior to plaster application must be questioned both before surgical and conservative further treatment. KW - distale Radiusfraktur KW - Reposition KW - geschlossene präoperative Reposition KW - präoperatives Schmerzniveau KW - distale instabile Radiusfraktur KW - preoperative closed reduction KW - preoperative pain level KW - unstable distal radius fracture Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-363882 N1 - Erstellung der Disseration an folgendem Institut: Abteilung für Orthopädie und Unfallchirurgie Caritas Krankenhaus Bad Mergentheim Lehrkrankenhaus der Universität Würzburg ER - TY - THES A1 - Yu, Yanying T1 - Applied machine learning for the analysis of CRISPR-Cas systems T1 - Angewandtes maschinelles Lernen für die Analyse von CRISPR-Cas-Systemen N2 - Among the defense strategies developed in microbes over millions of years, the innate adaptive CRISPR-Cas immune systems have spread across most of bacteria and archaea. The flexibility, simplicity, and specificity of CRISPR-Cas systems have laid the foundation for CRISPR-based genetic tools. Yet, the efficient administration of CRISPR-based tools demands rational designs to maximize the on-target efficiency and off-target specificity. Specifically, the selection of guide RNAs (gRNAs), which play a crucial role in the target recognition of CRISPR-Cas systems, is non-trivial. Despite the fact that the emerging machine learning techniques provide a solution to aid in gRNA design with prediction algorithms, design rules for many CRISPR-Cas systems are ill-defined, hindering their broader applications. CRISPR interference (CRISPRi), an alternative gene silencing technique using a catalytically dead Cas protein to interfere with transcription, is a leading technique in bacteria for functional interrogation, pathway manipulation, and genome-wide screens. Although the application is promising, it also is hindered by under-investigated design rules. Therefore, in this work, I develop a state-of-art predictive machine learning model for guide silencing efficiency in bacteria leveraging the advantages of feature engineering, data integration, interpretable AI, and automated machine learning. I first systematically investigate the influential factors that attribute to the extent of depletion in multiple CRISPRi genome-wide essentiality screens in Escherichia coli and demonstrate the surprising dominant contribution of gene-specific effects, such as gene expression level. These observations allowed me to segregate the confounding gene-specific effects using a mixed-effect random forest (MERF) model to provide a better estimate of guide efficiency, together with the improvement led by integrating multiple screens. The MERF model outperformed existing tools in an independent high-throughput saturating screen. I next interpret the predictive model to extract the design rules for robust gene silencing, such as the preference for cytosine and disfavoring for guanine and thymine within and around the protospacer adjacent motif (PAM) sequence. I further incorporated the MERF model in a web-based tool that is freely accessible at www.ciao.helmholtz-hiri.de. When comparing the MERF model with existing tools, the performance of the alternative gRNA design tool optimized for CRISPRi in eukaryotes when applied to bacteria was far from satisfying, questioning the robustness of prediction algorithms across organisms. In addition, the CRISPR-Cas systems exhibit diverse mechanisms albeit with some similarities. The captured predictive patterns from one dataset thereby are at risk of poor generalization when applied across organisms and CRISPR-Cas techniques. To fill the gap, the machine learning approach I present here for CRISPRi could serve as a blueprint for the effective development of prediction algorithms for specific organisms or CRISPR-Cas systems of interest. The explicit workflow includes three principle steps: 1) accommodating the feature set for the CRISPR-Cas system or technique; 2) optimizing a machine learning model using automated machine learning; 3) explaining the model using interpretable AI. To illustrate the applicability of the workflow and diversity of results when applied across different bacteria and CRISPR-Cas systems, I have applied this workflow to analyze three distinct CRISPR-Cas genome-wide screens. From the CRISPR base editor essentiality screen in E. coli, I have determined the PAM preference and sequence context in the editing window for efficient editing, such as A at the 2nd position of PAM, A/TT/TG downstream of PAM, and TC at the 4th to 5th position of gRNAs. From the CRISPR-Cas13a screen in E. coli, in addition to the strong correlation with the guide depletion, the target expression level is the strongest predictor in the model, supporting it as a main determinant of the activation of Cas13-induced immunity and better characterizing the CRISPR-Cas13 system. From the CRISPR-Cas12a screen in Klebsiella pneumoniae, I have extracted the design rules for robust antimicrobial activity across K. pneumoniae strains and provided a predictive algorithm for gRNA design, facilitating CRISPR-Cas12a as an alternative technique to tackle antibiotic resistance. Overall, this thesis presents an accurate prediction algorithm for CRISPRi guide efficiency in bacteria, providing insights into the determinants of efficient silencing and guide designs. The systematic exploration has led to a robust machine learning approach for effective model development in other bacteria and CRISPR-Cas systems. Applying the approach in the analysis of independent CRISPR-Cas screens not only sheds light on the design rules but also the mechanisms of the CRISPR-Cas systems. Together, I demonstrate that applied machine learning paves the way to a deeper understanding and a broader application of CRISPR-Cas systems. N2 - Unter den Verteidigungsstrategien, welche sich über Millionen von Jahren in Mikroben entwickelt haben, hat sich das angeborene adaptive CRISPR-Cas Immunsystem in vielen Bakterien und den meisten Archaeen verbreitet. Flexibilität, Einfachheit und Spezifizität von CRISPR-Cas Systemen bilden die Grundlage für CRISPR-basierten genetischen Werkzeugen. Dennoch verlangt die effiziente Anwendung CRISPR-basierter genetischer Werkzeuge ein rationales Design, um die Effektivität zu maximieren und Spezifizität zu gewährleisten. Speziell die Auswahl an Leit-RNAs, oder auch „guide“ RNAs (gRNAs), welche eine essentielle Rolle in der Ziel-Erkennung des CRISPR-Cas Systems spielen, ist nicht trivial. Trotz aufkommender Techniken des maschinellen Lernens, die mit Hilfe von Vorhersage-Algorithmen eine Unterstützung im gRNA-Design darstellen, sind die Design-Regeln für viele CRISPR-Cas Systeme schlecht definiert und die breite Anwendung dadurch bisher gehindert. CRISPR Interferenz (CRISPRi), eine Methode der Genrepression, nutzt ein katalytisch inaktives Cas-Protein, um die Gen-Transkription zu verhindern und ist eine führende Technik für Gen-Funktionsstudien, der Manipulation von Stoffwechselwegen und genomweiter Screens in Bakterien. Auch wenn viele der Anwendungen vielversprechend sind, ist die Umsetzung aufgrund der wenig untersuchten Design-Regeln schwierig. Daher entwickele ich in dieser Arbeit ein hochmodernes auf maschinellem Lernen basierendes Modell für die Vorhersage der gRNA Genrepressions-Effizienz in Bakterien, wobei die Merkmalskonstruktion, Datenintegration, interpretierbare künstliche Intelligenz (KI) und automatisiertes maschinelles Lernen genutzt wurden. Zuerst untersuche ich systematisch die Einflussfaktoren, welche zum Ausmaß der Depletion in genomweiten CRISPRi-Screens zur Gen-Essentialität in Escherichia coli beitragen und demonstriere den überraschend dominanten Beitrag genspezifischer Effekte, wie z. B. dem Genexpressionslevel. Diese Beobachtungen erlaubten mir die genspezifischen Störvariablen mit einem sogenannten mixed-effect random forest (MERF) Modell zu segregieren, um eine bessere Einschätzung der gRNA Effizienz zu erreichen und durch die Integration zusätzlicher Screen-Daten noch weiter zu verbessern. Das MERF Modell übertraf dabei bereits existierende Werkzeuge in einem unabhängigen Hochdurchsatz Sättigungs-Screen. Als nächstes interpretiere ich die Modell Vorhersage, um Design-Regeln für eine solide Genrepression zu extrahieren, wie z. B. eine Präferenz für Cytosin und eine Abneigung gegenüber Guanin und Thymin innerhalb und der „protospacer adjacent motif“ (PAM) direkt umgebenden Sequenz. Weiterhin integrierte ich das MERF Modell in einem Web-basierten Werkzeug, welches unter www.ciao.helmholtz-hiri.de frei zugänglich ist. Ein Vergleich von existierenden Werkzeugen mit dem MERF Modell zeigt, dass alternative, für CRISPRi in Eukaryoten optimierte, gRNA Design-Werkzeuge schlecht abschneiden, sobald sie in Bakterien angewandt werden. Dies lässt Zweifel an einer robusten Übertragbarkeit dieser Vorhersage-Algorithmen zwischen verschiedenen Organismen. Zusätzlich haben CRISPR-Cas Systeme, trotz einiger genereller Gemeinsamkeiten, höchst diverse Wirkungsmechanismen. Die Vorhersagemuster eines Datensets sind daher schlecht generalisierbar, sobald sie auf andere Organismen oder CRISPR-Cas Techniken angewandt werden. Diese Lücke kann mit dem hier präsentierten Ansatz des maschinellen Lernens für CRISPRi geschlossen werden und als eine Vorlage für die Entwicklung effektiver Vorhersage-Algorithmen für spezifische Organismen oder CRISPR-Cas Systeme dienen. Der explizite Arbeitsablauf beinhaltet drei Hauptschritte: 1) Aufnehmen des Merkmalsets des jeweiligen CRISPR-Cas Systems bzw. der CRISPR-Cas Technik; 2) Optimierung des maschinellen Lernen Modells durch automatisiertes maschinelles Lernen; 3) Erklärung des Modells mit interpretierbarer KI. Um die Anwendbarkeit des Arbeitsablaufs und die Diversität der Ergebnisse, im Zusammenhang mit unterschiedlichen Organismen und CRISPR-Cas Systemen, zu demonstrieren, habe ich diese Arbeitsschritte zur Analyse drei unterschiedlicher genomweiter Screens angewandt. Von dem CRISPR „base editor“ Essentialitäts-Screen in E. coli, konnten die PAM Präferenzen und der Sequenzkontext innerhalb des Editierungsfensters für eine effiziente Editierung abgeleitet werden. Beispielsweise tragen ein A an der zweiten PAM Position, ein A/TT/TG an der PAM direkt nachgeschalten Position und ein TC an der vierten oder fünften gRNA Position zur effizienten Editierung bei. Im CRISPR-Cas13a Screen in E. coli, stellten wir eine starke Korrelation zwischen dem Genexpressionslevel und der gRNA-Depletion fest. Zusätzlich ist das Expressionslevel des Ziel-Gens der stärkste Vorhersagefaktor des Modells, was das Expressionslevel als Hauptdeterminante für die Cas13-induzierte Immunität hervorhebt und die bessere Charakterisierung von CRISPR-Cas13 Systemen ermöglicht. Aus dem CRISPR-Cas12a Screen in Klebsiella pneumoniae, habe ich gRNA Design Regeln für die robuste antimikrobielle Aktivität über unterschiedliche K. pneumoniae Stämme hinweg extrahiert und einen Vorhersage-Algorithmus für das gRNA Design bereitgestellt. Dies ermöglicht die Nutzung von Cas12a als eine alternative Lösung, um Antibiotikaresistenzen zu bekämpfen. Zusammengefasst präsentiert diese Thesis einen akkuraten Vorhersage-Algorithmus für die CRISPRi gRNA Effizienz in Bakterien und gibt Einblicke in die Determinanten für eine effiziente Genrepression und optimales gRNA Design. Die systematische Exploration führte zu einem robusten Ansatz des maschinellen Lernens für effektive Modell Entwicklungen in unterschiedlichen bakteriellen Spezies und CRISPR-Cas Systemen. Durch die Anwendung dieses Ansatzes auf unabhängige CRISPR-Cas Screens, konnte ich nicht nur wichtige Design Regeln ableiten, sondern auch die Mechanismen der jeweiligen CRISPR-Cas Systeme besser erleuchten. Zu guter Letzt demonstriere ich hier, dass angewandtes maschinelles Lernen den Weg zu einem tieferen Verständnis und einer breiteren Anwendung von CRISPR-Cas Systemen ebnen kann. KW - Maschinelles Lernen KW - CRISPR/Cas-Methode KW - Bakterien KW - machine learning KW - CRISPR-Cas KW - guide effiiciency Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-320219 ER - TY - THES A1 - Reissland, Michaela T1 - USP10 is a \(de\) \(novo\) tumour-specific regulator of β-Catenin and contributes to cancer stem cell maintenance and tumour progression T1 - USP10 ist ein \(de\) \(novo\) tumorspezifischer Regulator von ß-Catenin und trägt zur Erhaltung von Krebsstammzellen und zur Tumorprogression bei N2 - Colorectal Cancer (CRC) is the third most common cancer in the US. The majority of CRC cases are due to deregulated WNT-signalling pathway. These alterations are mainly caused by mutations in the tumour suppressor gene APC or in CTNNB1, encoding the key effector protein of this pathway, β-Catenin. In canonical WNT-signalling, β-Catenin activates the transcription of several target genes, encoding for proteins involved in proliferation, such as MYC, JUN and NOTCH. Being such a critical regulator of these proto-oncogenes, the stability of β-Catenin is tightly regulated by the Ubiquitin-Proteasome System. Several E3 ligases that ubiquitylate and degrade β-Catenin have been described in the past, but the antagonists, the deubiquitylases, are still unknown. By performing an unbiased siRNA screen, the deubiquitylase USP10 was identified as a de novo positive regulator of β-Catenin stability in CRC derived cells. USP10 has previously been shown in the literature to regulate both mutant and wild type TP53 stability, to deubiquitylate NOTCH1 in endothelial cells and to be involved in the regulation of AMPKα signalling. Overall, however, its role in colorectal tumorigenesis remains controversial. By analysing publicly available protein and gene expression data from colorectal cancer patients, we have shown that USP10 is strongly upregulated or amplified upon transformation and that its expression correlates positively with CTNNB1 expression. In contrast, basal USP10 levels were found in non-transformed tissues, but surprisingly USP10 is upregulated in intestinal stem cells. Endogenous interaction studies in CRC-derived cell lines, with different extend of APCtruncation, revealed an APC-dependent mode of action for both proteins. Furthermore, by utilising CRISPR/Cas9, shRNA-mediated knock-down and overexpression of USP10, we could demonstrate a regulation of β-Catenin stability by USP10 in CRC cell lines. It is widely excepted that 2D cell culture systems do not reflect complexity, architecture and heterogeneity and are therefore not suitable to answer complex biological questions. To overcome this, we established the isolation, cultivation and genetically modification of murine intestinal organoids and utilised this system to study Usp10s role ex vivo. By performing RNA sequencing, dependent on different Usp10 levels, we were able to recapitulate the previous findings and demonstrated Usp10 as important regulator of β-dependent regulation of stem cell homeostasis. Since genetic depletion of USP10 resulted in down-regulation of β-Catenin-dependent transcription, therapeutic intervention of USP10 in colorectal cancer was also investigated. Commercial and newly developed inhibitors were tested for their efficacy against USP10, but failed to significantly inhibit USP10 activity in colorectal cancer cells. To validate the findings from this work also in vivo, development of a novel mouse model for colorectal cancer has begun. By combining CRISPR/Cas9 and classical genetic engineering with viral injection strategies, WT and genetically modified mice could be transformed and, at least in some animals, intestinal lesions were detectable at the microscopic level. The inhibition of USP10, which we could describe as a de novo tumour-specific regulator of β-Catenin, could become a new therapeutic strategy for colorectal cancer patients. N2 - Darmkrebs ist die dritthäufigste Krebsart in den USA. Die Mehrheit der Darmkrebsfälle sind auf einen deregulierten WNT-Signalweg zurückzuführen. Diese Veränderungen wer- den hauptsächlich durch Mutationen im Tumorsuppressor-Gen APC oder in CTNNB1 verursacht, welches für das zentrale Protein dieses Signalwegs, β-Catenin, kodiert. Beim kanonischen WNT-Signalweg aktiviert β-Catenin die Transkription mehrerer Gene, die für, an der Proliferation beteiligte Proteine wie MYC, JUN und NOTCH, kodieren. Da β-Catenin ein kritischer Regulator dieser proto-Onkogene ist, wird die Stabilität von β-Catenin durch das Ubiquitin-Proteasom-System streng reguliert. In der Vergangen- heit wurden mehrere E3-Ligasen beschrieben, die β-Catenin ubiquitylieren und abbauen, aber die Deubiquitylasen, sind grö𐀀tenteils noch unbekannt. Mit Hilfe eines unvoreingenommenen siRNA-Screens wurde die Deubiquitylase USP10 als de novo Regulator der β-Catenin-Stabilität in Darmkrebs-Zellen identifiziert. In der Literatur wurde bereits gezeigt, dass USP10 sowohl die Stabilität von mutiertem als auch von wild typ TP53 reguliert, NOTCH1 in Endothelzellen deubiquityliert und an der Regulation des AMPKα Signalwegs beteiligt ist. Insgesamt bleibt seine Rolle in der kolorektalen Tumorgenese aber bisher umstritten. Anhand der Analyse öffentlich zugänglicher Protein- und Genexpressionsdaten haben wir gezeigt, dass USP10 bei der Transformation stark hochreguliert oder amplifiziert wird und dass seine Expression positiv mit der von CTNNB1 korreliert. Im Gegensatz dazu wurden in nicht transformiertem Gewebe basale USP10-Spiegel gefunden, aber überraschenderweise ist USP10 in intestinalen Stammzellen hochreguliert. Endogene Interaktionsstudien in Darmkrebs-Zelllinien mit unterschiedlichem Ausma𐀀 an APC-Trunkierung zeigten eine APC-abhängige Interaktion für beide Proteine. Darüber hinaus konnten wir mit Hilfe von CRISPR/Cas9, shRNA-vermitteltem Knock-down und Überexpression von USP10 eine Regulation der β-Catenin-Stabilität durch USP10 in Darmkrebs-Zelllinien nachweisen. Es ist allgemein bekannt, dass 2D-Zellkultursysteme die Komplexität, Architektur und Heterogenität nicht widerspiegeln und daher nicht geeignet sind, um komplexe biologische Fragen zu beantworten. Um dies zu überwinden, haben wir die Isolierung, Kultivierung und genetische Veränderung von murinen Dar- morganoiden etabliert und dieses System genutzt, um die Rolle von Usp10 ex vivo zu untersuchen. Durch die Durchführung von RNA-Sequenzierungen in Abhängigkeit von unterschiedlichen Usp10-Spiegeln konnten wir die bisherigen Ergebnisse rekapitulieren und Usp10 als wichtigen Regulator der β-Catenin-abhängigen Regulation der Stammzell- homöostase nachweisen. Da die genetische Depletion von USP10 zu einer Herunterregulierung der β-Catenin- abhängigen Transkription führte, wurde auch die therapeutische Intervention von USP10 in Darmkrebs untersucht. Kommerzielle und neu entwickelte Inhibitoren wurden auf ihre Wirksamkeit gegen USP10 getestet, konnten jedoch die Aktivität von USP10 in Darmkrebs- Zellen nicht hemmen. Um die Erkenntnisse aus dieser Arbeit auch in vivo zu validieren, wurde mit der Entwicklung eines neuartigen Mausmodells für Darmkrebs begonnen. Durch die Kombination von CRISPR/Cas9 und klassischer Gentechnik mit viralen Injektionsstrategien konnten WT- und gentechnisch veränderte Mäuse trans- formiert werden und zumindest bei einigen Tieren waren Darmläsionen auf mikroskopis- cher Ebene nachweisbar. Die Inhibtierung von USP10, als de novo tumorspezifischer Regulator von β-Catenin, könnte eine neue therapeutische Strategie für Darmkrebs-Patienten werden. KW - Biomedizin KW - Biomedicine Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-319579 ER - TY - THES A1 - Cruz de Casas, Paulina T1 - Sphingolipids as modulators of T cell function T1 - Sphingolipide als Modulatoren der T-Zell-Funktion N2 - The immune system is responsible for the preservation of homeostasis whenever a given organism is exposed to distinct kinds of perturbations. Given the complexity of certain organisms like mammals, and the diverse types of challenges that they encounter (e.g. infection or disease), the immune system evolved to harbor a great variety of distinct immune cell populations with specialized functions. For instance, the family of T cells is sub-divided into conventional (Tconv) and unconventional T cells (UTCs). Tconv form part of the adaptive arm of the immune system and are comprised of αβ CD4+ or CD8+ cells that differentiate from naïve to effector and memory populations upon activation and are essential during infection and cancer. Furthermore, UTCs, which include γδ T cells, NKT and MAIT, are involved in innate and adaptive immune responses, due to their dual mode of activation, through cytokines (innate-like) or TCR (adaptive), and function. Despite our understanding of the basic functions of T cells in several contexts, a great number of open questions related to their basic biology remain. For instance, the mechanism behind the differentiation of naïve CD4+ and CD8+ T cells into effector and memory populations is not fully understood. Moreover, the exact function and relevance of distinct UTC subpopulations in a physiological context have not been fully clarified. Here, we investigated the factors mediating naïve CD8+ T cell differentiation into effector and memory cells. By using flow cytometry, mass spectrometry, enzymatic assays, and transgenic mouse models, we found that the membrane bound enzyme sphingomyelin-phosphodiesterase acid-like 3b (Smpdl3b) is crucial for the maintenance of memory CD8+ T cells. Our data show that the absence of Smpdl3b leads to diminished CD8+ T cell memory, and a loss of stem-like memory populations due to an aggravated contraction. Our scRNA-seq data suggest that Smpdl3b could be involved in clathrinmediated endocytosis through modulation of Huntingtin interacting protein 1 (Hip1) levels, likely regulating TCR-independent signaling events. Furthermore, in this study we explored the role of UTCs in lymph node-specific immune responses. By using transgenic mouse models for photolabeling, lymph node transplantation models, infection models and flow cytometry, we demonstrate that S1P regulates the migration of tissue-derived UTC from tissues to draining lymph nodes, resulting in heterogeneous immune responses mounted by lymph nodes draining different tissues. Moreover, our unbiased scRNAseq and single lineage-deficient mouse models analysis revealed that all UTC lineages (γδ T cells, NKT and MAIT) are organized in functional units, based on transcriptional homogeneity, shared microanatomical location and migratory behavior, and numerical and functional redundancy. Taken together, our studies describe additional cell intrinsic (Smpdl3b) and extrinsic (S1Pmediated migration) functions of sphingolipid metabolism modulating T cell biology. We propose the S1P/S1PR1/5 signaling axis as the potential survival pathway for Smpdl3b+ memory CD8+ T cells and UTCs, mainly in lymph nodes. Possibly, Smpdl3b regulates S1P/S1PR signaling by balancing ligandreceptor endocytosis, while UTCs migrate to lymph nodes during homeostasis to be exposed to specific levels of S1P that assure their maintenance. Our results are clinically relevant, since several drugs modulating the S1P/S1PR signaling axis or the levels of Smpdl3b are currently used to treat human diseases, such as multiple sclerosis and B cell-mediated diseases. We hope that our discoveries will inspire future studies focusing on sphingolipid metabolism in immune cell biology. N2 - Das Immunsystem ist für die Aufrechterhaltung der Homöostase verantwortlich, wenn ein bestimmter Organismus verschiedenen Arten von Störungen ausgesetzt ist. In Anbetracht der Komplexität bestimmter Organismen wie Säugetiere und der verschiedenen Arten von Störungen, denen sie ausgesetzt sein können (z. B. Infektionen oder Krankheiten), hat sich das Immunsystem so entwickelt, dass es eine große Vielfalt verschiedener Immunzellpopulationen mit spezialisierten Funktionen beherbergt. So wird beispielsweise die Familie der T-Zellen in konventionelle (Tconv) und unkonventionelle T-Zellen (UTC) unterteilt. Tconv sind Teil des adaptiven Arms des Immunsystems und bestehen aus αβ-CD4+- oder CD8+-Zellen, die sich bei der Aktivierung von naiven zu Effektor- und Gedächtnispopulationen differenzieren und bei Infektionen und Krebs eine wichtige Rolle spielen. Darüber hinaus sind UTCs, zu denen γδ-T-Zellen, NKT und MAIT gehören, aufgrund ihrer dualen Aktivierungsweise durch Zytokine (angeboren) oder TCR (adaptiv) und ihrer Funktion an angeborenen und adaptiven Immunantworten beteiligt. Trotz unseres Verständnisses der grundlegenden Funktionen von T-Zellen in verschiedenen Zusammenhängen gibt es nach wie vor eine große Anzahl offener Fragen im Zusammenhang mit ihrer grundlegenden Biologie. So ist beispielsweise der Mechanismus der Differenzierung naiver CD4+ und CD8+ T-Zellen in Effektor- und Gedächtnispopulationen noch nicht ausreichend verstanden. Auch die genaue Funktion und Bedeutung der verschiedenen UTCSubpopulationen im physiologischen Kontext sind noch nicht vollständig geklärt. Wir haben die Faktoren untersucht, die die Differenzierung naiver CD8+ T-Zellen in Effektorund Gedächtniszellen vermitteln. Mithilfe von Durchflusszytometrie, Massenspektrometrie, enzymatischen Assays und transgenen Mausmodellen konnten wir feststellen, dass das membrangebundene Enzym Sphingomyelin-Phosphodiesterase acid-like 3b (Smpdl3b) für die Aufrechterhaltung der CD8+ T-Zell-Gedächtnisfunktion entscheidend ist. Unsere Daten zeigen, dass das Fehlen von Smpdl3b zu einer verminderten Anzahl and CD8+ T Gedächtniszellen durch eine verstärke Kontraktion sowie einem Verlust von stammzellartigen Gedächtnispopulationen führt. Unsere scRNAseq- Daten deuten jedoch darauf hin, dass Smpdl3b an der Clathrin-vermittelten Endozytose beteiligt sein könnte, indem es die Spiegel des Huntingtin interacting protein 1 (Hip1) moduliert und wahrscheinlich TCR-unabhängige Signalereignisse reguliert. Darüber hinaus untersuchten wir in dieser Studie die Rolle von UTCs bei lymphknotenspezifischen Immunantworten. Mit Hilfe von transgenen Mausmodellen für Photolabeling, Lymphknotentransplantationsmodellen, Infektionsmodellen und Durchflusszytometrie konnten wir zeigen, dass S1P die Migration von UTCs aus dem Gewebe in die drainierenden Lymphknoten reguliert, was zu heterogenen Immunantworten in den Lymphknoten führt, die verschiedene Gewebe drainieren. Ausserdem ergab unsere Analyse von scRNA-seq-Daten, sowie Mausmodelle mit einer genetischen Defizienz einzelner UTC-Linien (γδ-T-Zellen, NKT und MAIT), dass diese zusammen in funktionellen Einheiten organisiert sind, die auf transkriptioneller Homogenität, gemeinsamer mikroanatomischer Lage und Migrationsverhalten sowie numerischer und funktioneller Redundanz basieren. Zusammengenommen beschreiben unsere Studien zusätzliche zellinterne (Smpdl3b) und - externe (S1P-vermittelte Migration) Funktionen des Sphingolipid-Stoffwechsels, welche die T-Zell- Biologie modulieren. Wir schlagen die S1P/S1PR1/5-Signalachse als potenziellen Überlebensweg für Smpdl3b+ Gedächtnis-CD8+-T-Zellen und UTCs ausschließlich in Lymphknoten vor. Möglicherweise reguliert Smpdl3b die S1P/S1PR-Signalübertragung, indem es die Endozytose des Liganden-Rezeptors reguliert. Dadurch könnte deren Exposition zu bestimmten S1P-Mengen in der Homöostase im Lymphknoten reguliert werden, die wiederum das Überleben der UTC steuern. Unsere Ergebnisse sind klinisch relevant, da mehrere Medikamente, die die S1P/S1PR-Signalachse oder die Smpdl3b- Konzentration modulieren, derzeit zur Behandlung menschlicher Krankheiten eingesetzt werden, z. B. bei Multipler Sklerose und B-Zell-vermittelten Krankheiten. Wir hoffen, dass unsere Entdeckungen zukünftige Studien anregen werden, die sich auf den Sphingolipid-Stoffwechsel in der Immunzellbiologie konzentrieren. KW - T-Lymphozyt KW - Infektion KW - Lymphknoten KW - Cytokine KW - Sphingolipide KW - CD8+ T cell differentiation KW - Unconventional T cells KW - Sphingolipid biology KW - Immunology Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-359698 ER - TY - THES A1 - Gronemeyer, Karen T1 - Kardiovaskuläre und renale Komorbiditäten in Zusammenhang mit chronischem Hypoparathyreoidismus T1 - Cardiovascular and Renal Comorbidities in Chronic Hypoparathyroidism N2 - Der cHPT ist eine seltene Erkrankung, die durch zu niedriges Kalzium im Serum aufgrund einer zu geringen PTH-Sekretion über 6 Monate charakterisiert ist. Auch bei Patienten mit einem gut kontrollierten cHPT treten Komorbiditäten und Langzeitkomplikationen auf, die jedoch bisher kaum in prospektiven Studien untersucht wurden. Ziel dieser Arbeit war es daher, im Rahmen einer systematischen und prospektiv erfassten Studie das Auftreten kardiovaskulärer und renaler Komorbiditäten bei Patienten mit cHPT zu untersuchen und mögliche Prädiktoren für diese zu ermitteln. Außerdem erfolgte ein Vergleich mit gematchten Kontrollgruppen der deutschen Normalbevölkerung mithilfe der SHIP-TREND Studie. Patienten mit cHPT zeigten eine signifikant höhere QTc-Zeit, eine höhere Prävalenz für QTc-Zeit-Verlängerung und signifikant höhere systolische und diastolische Blutdruckwerte trotz tendenziell, jedoch nicht signifikant, häufigerer Einnahme antihypertensiver Medikamente. In der Echokardiographie lagen eine geringere linksventrikuläre Masse, eine geringere Prävalenz für linksventrikuläre Hypertrophie und signifikant häufiger Klappenstenosen vor. Eine renale Insuffizienz lag mit 21% der Patienten mit cHPT signifikant häufiger als bei gesunden Kontrollpersonen vor. Die Prävalenz renaler Kalzifikationen betrug 9,6%. Mögliche Risikofaktoren für das Auftreten kardiovaskulärer und renaler Komorbiditäten bei cHPT sind weiterhin unklar. In dieser Studie zeigte sich eine mögliche Assoziation zwischen den Elektrolytstörungen wie Hyperphosphatämie und Hypomagnesiämie, der Hyperkalziurie und dem PTH-Mangel mit valvulären, vaskulären und renalen Kalzifikationen sowie den Blutdruckwerten und der Nierenfunktion. Demnach erscheint eine Überwachung der Serumelektrolyte sowie der Kalziumausscheidung im Urin notwendig und essenziell. Auch die Bedeutung der PTH-Ersatztherapie ist weiterhin im Hinblick auf die Prävention kardiovaskulärer und renaler Erkrankungen unklar. N2 - cHPT is a rare disease characterized by low serum calcium due to insufficient PTH secretion over 6 months. Comorbidities and long-term complications also occur in patients with well-controlled cHPT but have rarely been investigated in prospective studies. The aim of this study was therefore to investigate the occurrence of cardiovascular and renal comorbidities in patients with cHPT as part of a systematic and prospective study and to identify possible predictors for these. In addition, a comparison was made with matched control groups from the normal German population using the SHIP-TREND study. Patients with cHPT showed a significantly higher QTc time, a higher prevalence of QTc time prolongation and significantly higher systolic and diastolic blood pressure values despite a tendency, although not significant, to take antihypertensive medication more frequently. Echocardiography showed a lower left ventricular mass, a lower prevalence of left ventricular hypertrophy and significantly more frequent valve stenosis. Renal insufficiency was significantly more common in 21% of patients with cHPT than in healthy controls. The prevalence of renal calcifications was 9.6%. Possible risk factors for the occurrence of cardiovascular and renal comorbidities in cHPT remain unclear. This study showed a possible association between electrolyte disturbances such as hyperphosphatemia and hypomagnesemia, hypercalciuria and PTH deficiency with valvular, vascular and renal calcifications as well as blood pressure values and renal function. Accordingly, monitoring of serum electrolytes and urinary calcium excretion appears necessary and essential. The significance of PTH replacement therapy also remains unclear regarding the prevention of cardiovascular and renal diseases. KW - Hypoparathyreoidismus KW - Niereninsuffizienz KW - Verkalkung KW - Kardiovaskuläre Krankheit KW - Kardiovaskuläre Komorbiditäten KW - SHIP-TREND KW - renale Kalzifikationen Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-360693 ER - TY - RPRT ED - Nieswandt, Bernhard T1 - Platelets – Molecular, cellular and systemic functions in health and disease T1 - Thrombozyten – molekulare, zelluläre und systemische Funktionen unter physiologischen und pathologischen Bedingungen (SFB/TR240 - Abschlussbericht BT - Final Report (2018/2 - 2023/1) N2 - Besides their central role in haemostasis and thrombosis, platelets are increasingly recognised as versatile effector cells in inflammation, the innate and adaptive immune response, extracellular matrix reorganisation and fibrosis, maintenance of barrier and organ integrity, and host response to pathogens. These platelet functions, referred to as thrombo-inflammation and immunothrombosis, have gained major attention in the COVID-19 pandemic, where patients develop an inflammatory disease state with severe and life-threatening thromboembolic complications. In the CRC/TR 240, a highly interdisciplinary team of basic, translational and clinical scientists explored these emerging roles of platelets with the aim to develop novel treatment concepts for cardiovascular disorders and beyond. We have i) unravelled mechanisms leading to life-threatening thromboembolic complica-tions following vaccination against SARS-CoV-2 with adenoviral vector-based vaccines, ii) identified unrecognised functions of platelet receptors and their regulation, offering new potential targets for pharmacological intervention and iii) developed new methodology to study the biology of megakar-yocytes (MKs), the precursor cells of platelets in the bone marrow, which lay the foundation for the modulation of platelet biogenesis and function. The projects of the CRC/TR 240 built on the unique expertise of our research network and focussed on the following complementary fields: (A) Cell bi-ology of megakaryocytes and platelets and (B) Platelets as regulators and effectors in disease. To achieve this aim, we followed a comprehensive approach starting out from in vitro systems and animal models to clinical research with large prospective patient cohorts and data-/biobanking. Despite the comparably short funding period the CRC/TR 240 discovered basic new mechanisms of platelet biogenesis, signal transduction and effector function and identified potential MK/platelet-specific molecular targets for diagnosis and therapy of thrombotic, haemorrhagic and thrombo-inflammatory disease states. N2 - Thrombozyten sind von zentraler Bedeutung für die Hämostase, aber auch bei der Entstehung akuter thrombotischer Erkrankungen wie Herzinfarkt oder Schlaganfall. Darüber hinaus sind Thrombozyten aber auch vielseitige Effektorzellen von Entzündungsprozessen, der angeborenen Immunität, bei zellulären Abwehrmechanismen sowie bei der Aufrechterhaltung der Gefäß- und Organintegrität. Diese neuen, als Thrombo-Inflammation und Immunothrombose bezeichneten Funktionen haben im Rahmen der COVID-19 Pandemie große Aufmerksamkeit erlangt, da betroffene Patienten systemische Entzündungszustände in Verbindung mit thromboembolischen Komplikationen aufweisen, die oft auch tödlich verlaufen. Im SFB/TR 240 arbeitete ein interdisziplinäres Team von grundlagenorientierten, translationalen und klinischen Wissenschaftlern zusammen an der Erforschung dieser neuartigen Thrombozytenfunktionen mit dem Ziel, neue verbesserte Therapiemöglichkeiten für kardiovaskuläre, aber auch andere Erkrankungen zu entwickeln. Während der Förderphase haben wir i) die Mechanismen aufgeklärt, die in seltenen Fällen nach Impfung mit Adenovirus-basierten Vakzinen gegen Sars-CoV-2 zu lebensbedrohlichen thromboembolischen Komplikationen führten, ii) neue Funktionen und Regulationsmechanismen thrombozytärer Rezeptoren identifiziert, die Grundlage zur therapeutischen Intervention sein könnten und iii) neue Technologien entwickelt, die vertiefte Studien zur Biologie der Megakaryozyten, den Vorläuferzellen der Thrombozyten im Knochenmark, ermöglichen und den Weg zu einer gezielten Beeinflussung der Thrombozytenbiogenese und –funktion ebnen könnten. Die Projekte des TR 240 konzentrierten sich auf die folgenden komplementären Forschungsgebiete: (A) Zellbiologie der Megakaryozyten und Thrombozyten mit dem Ziel eines verbesserten Verständnisses der grundlegenden Funktionen beider Zelltypen und (B) Thrombozyten als Modulatoren und Effektoren bei Erkrankungen. Um dieses Ziel zu erreichen, wurde ein sehr umfassender Ansatz verfolgt, der sich von in vitro Systemen über Tiermodelle bis hin zur klinischen Forschung mit Biobanken und großen, prospektiven Patientenkohorten erstreckte. Der SFB/TR 240 konnte in der vergleichsweisen kurzen Zeit seiner Förderung grundlegend neue Erkenntnisse zu den Mechanismen der Thrombozytenbiogenese, Thrombozyten-Signaltransduktion und -Effektorfunktionen erarbeiten und neue MK/Thrombozyten-spezifische Angriffspunkte für Diag-nose und Therapie thrombotischer, hämorrhagischer und thrombo-inflammatorischer Erkrankungen identifizieren. KW - Thrombozyt KW - platelets KW - thrombo-inflammation KW - haemostasis KW - stroke KW - megakaryocytes KW - Sonderforschungsbereich Transregio 240 KW - Bericht KW - Collaborative Research Center KW - Experimental Biomedicine Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-359636 ER - TY - JOUR A1 - Kuon, Jonas A1 - Blasi, Miriam A1 - Unsöld, Laura A1 - Vogt, Jeannette A1 - Mehnert, Anja A1 - Alt-Epping, Bernd A1 - Oorschot, Birgitt van A1 - Sistermanns, Jochen A1 - Ahlborn, Miriam A1 - Ritterbusch, Ulrike A1 - Stevens, Susanne A1 - Kahl, Christoph A1 - Ruellan, Anne A1 - Matthias, Kathrin A1 - Kubin, Thomas A1 - Stahlhut, Kerstin A1 - Heider, Andrea A1 - Lordick, Florian A1 - Thomas, Michael T1 - Impact of molecular alterations on quality of life and prognostic understanding over time in patients with incurable lung cancer: a multicenter, longitudinal, prospective cohort study JF - Supportive Care in Cancer N2 - Purpose The purpose of this study is to investigate changes over time in quality of life (QoL) in incurable lung cancer patients and the impact of determinants like molecular alterations (MA). Methods In a prospective, longitudinal, multicentric study, we assessed QoL, symptom burden, psychological distress, unmet needs, and prognostic understanding of patients diagnosed with incurable lung cancer at the time of the diagnosis (T0) and after 3 (T1), 6 (T2) and 12 months (T3) using validated questionnaires like FACT-L, National Comprehensive Cancer Network (NCCN) Distress Thermometer (DT), PHQ-4, SCNS-SF-34, and SEIQoL. Results Two hundred seventeen patients were enrolled, 22 (10%) with reported MA. QoL scores improved over time, with a significant trend for DT, PHQ-4, and SCNS-SF-34. Significant determinants for stable or improving scores over time were survival > 6 months, performance status at the time of diagnosis, and presence of MA. Patients with MA showed better QoL scores (FACT-L at T1 104.4 vs 86.3; at T2 107.5 vs 90.0; at T3 100.9 vs 92.8) and lower psychological distress (NCCN DT at T1 3.3 vs 5; at T2 2.7 vs 4.5; at T3 3.7 vs 4.5; PHQ-4 at T1 2.3 vs 4.1; at T2 1.7 vs 3.6; at T3 2.2 vs 3.6), but also a worsening of the scores at 1 year and a higher percentage of inaccurate prognostic understanding (27 vs 17%) compared to patients without MA. Conclusion Patients with tumors harboring MA are at risk of QoL deterioration during the course of the disease. Physicians should adapt their communication strategies in order to maintain or improve QoL. KW - lung cancer KW - quality of life KW - molecular alterations KW - prognostic awareness Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-308211 SN - 0941-4355 SN - 1433-7339 VL - 30 IS - 4 ER - TY - JOUR A1 - Homberger, Christina A1 - Hayward, Regan J. A1 - Barquist, Lars A1 - Vogel, Jörg T1 - Improved bacterial single-cell RNA-seq through automated MATQ-seq and Cas9-based removal of rRNA reads JF - mBio N2 - Bulk RNA sequencing technologies have provided invaluable insights into host and bacterial gene expression and associated regulatory networks. Nevertheless, the majority of these approaches report average expression across cell populations, hiding the true underlying expression patterns that are often heterogeneous in nature. Due to technical advances, single-cell transcriptomics in bacteria has recently become reality, allowing exploration of these heterogeneous populations, which are often the result of environmental changes and stressors. In this work, we have improved our previously published bacterial single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) protocol that is based on multiple annealing and deoxycytidine (dC) tailing-based quantitative scRNA-seq (MATQ-seq), achieving a higher throughput through the integration of automation. We also selected a more efficient reverse transcriptase, which led to reduced cell loss and higher workflow robustness. Moreover, we successfully implemented a Cas9-based rRNA depletion protocol into the MATQ-seq workflow. Applying our improved protocol on a large set of single Salmonella cells sampled over different growth conditions revealed improved gene coverage and a higher gene detection limit compared to our original protocol and allowed us to detect the expression of small regulatory RNAs, such as GcvB or CsrB at a single-cell level. In addition, we confirmed previously described phenotypic heterogeneity in Salmonella in regard to expression of pathogenicity-associated genes. Overall, the low percentage of cell loss and high gene detection limit makes the improved MATQ-seq protocol particularly well suited for studies with limited input material, such as analysis of small bacterial populations in host niches or intracellular bacteria. IMPORTANCE: Gene expression heterogeneity among isogenic bacteria is linked to clinically relevant scenarios, like biofilm formation and antibiotic tolerance. The recent development of bacterial single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) enables the study of cell-to-cell variability in bacterial populations and the mechanisms underlying these phenomena. Here, we report a scRNA-seq workflow based on MATQ-seq with increased robustness, reduced cell loss, and improved transcript capture rate and gene coverage. Use of a more efficient reverse transcriptase and the integration of an rRNA depletion step, which can be adapted to other bacterial single-cell workflows, was instrumental for these improvements. Applying the protocol to the foodborne pathogen Salmonella, we confirmed transcriptional heterogeneity across and within different growth phases and demonstrated that our workflow captures small regulatory RNAs at a single-cell level. Due to low cell loss and high transcript capture rates, this protocol is uniquely suited for experimental settings in which the starting material is limited, such as infected tissues. KW - MATQ-seq KW - single-cell RNA-seq KW - Salmonella enterica KW - rRNA depletion KW - gene expression heterogeneity KW - DASH KW - Cas9 Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-350059 VL - 14 IS - 2 ER -