TY - THES A1 - Schmitt, Dominik T1 - Structural Characterization of the TFIIH Subunits p34 and p44 from C. thermophilum T1 - Strukturelle Charakterisierung der TFIIH Untereinheiten p34 und p44 aus C. thermophilum N2 - Several important cellular processes, including transcription, nucleotide excision repair and cell cycle control are mediated by the multifaceted interplay of subunits within the general transcription factor II H (TFIIH). A better understanding of the molecular structure of TFIIH is the key to unravel the mechanism of action of this versatile protein complex within these pathways. This becomes especially important in the context of severe diseases like xeroderma pigmentosum, Cockayne syndrome and trichothiodystrophy, that arise from single point mutations in some of the TFIIH subunits. In an attempt to structurally characterize the TFIIH complex, we harnessed the qualities of the eukaryotic thermophile Chaetomium thermophilum, a remarkable fungus, which has only recently been recognized as a novel model organism. Homologues of TFIIH from C. thermophilum were expressed in E. coli, purified to homogeneity and subsequently utilized for crystallization trials and biochemical studies. The results of the present work include the first crystal structure of the p34 subunit of TFIIH, comprising the N-terminal domain of the protein. The structure revealed a von Willebrand Factor A (vWA) like fold, which is generally known to be involved in a multitude of protein-protein interactions. Structural comparison allowed to delineate similarities as well as differences to already known vWA domains, providing insight into the role of p34 within TFIIH. These results indicate that p34 assumes the role of a structural scaffold for other TFIIH subunits via its vWA domain, while likely serving additional functions, which are mediated through its C-terminal zinc binding domain and are so far unknown. Within TFIIH p34 interacts strongly with the p44 subunit, a positive regulator of the XPD helicase, which is required for regulation of RNA Polymerase II mediated transcription and essential for eukaryotic nucleotide excision repair. Based on the p34 vWA structure putative protein-protein interfaces were analyzed and binding sites for the p34 p44 interaction suggested. Continuous crystallization efforts then led to the first structure of a p34 p44 minimal complex, comprising the N-terminal vWA domain of p34 and the C-terminal C4C4 RING domain of p44. The structure of the p34 p44 minimal complex verified the previous hypothesis regarding the involved binding sites. In addition, careful analysis of the complex interface allowed to identify critical residues, which were subsequently mutated and analyzed with respect to their significance in mediating the p34 p44 interaction, by analytical size exclusion chromatography, electrophoretic mobility shift assays and isothermal titration calorimetry. The structure of the p34 p44 complex also revealed a binding mode of the p44 C4C4 RING domain, which differed from that of other known RING domains in several aspects, supporting the hypothesis that p44 contains a novel variation of this domain. N2 - Zelluläre Prozesse, wie beispielsweise die Transkription, die Nukleotid-Exzisionsreparatur und die Kontrolle des Zellzyklus sind abhängig vom vielschichtigen Zusammenspiel der zehn Protein-Untereinheiten des allgemeinen Transkriptionsfaktors II H (TFIIH). Zur Aufklärung der genauen Funktion dieses Komplexes ist ein besseres Verständnis seiner molekularen Struktur essentiell. Besondere Bedeutung erhält der TFIIH dabei im Hinblick auf verschiedene schwerwiegende Krankheiten, wie z.B. Xeroderma pigmentosum (XP), Cockayne-Syndrom (CS) und Trichothiodystrophie (TTD), die als Folge von einzelnen Punkt-Mutationen in bestimmten Untereinheiten des Komplexes entstehen. In der vorliegenden Arbeit wurden zur strukturellen Charakterisierung der TFIIH Untereinheiten p34 und p44 die homologen Proteine aus Chaetomium thermophilum verwendet. Hierbei handelt es sich um einen eukaryotischen und thermophilen Pilz, der erst kürzlich als neuer und vielversprechender Modellorganismus an Bedeutung gewann. Die TFIIH Homologe aus C. thermophilum wurden rekombinant exprimiert, gereinigt und anschließend für Kristallisations-Versuche eingesetzt. Darüber hinaus wurden die Proteine mittels verschiedener biochemischer Verfahren analysiert. Die erzielten Resultate beinhalten unter anderem die erste Kristall-Struktur der p34 Untereinheit des TFIIH und zeigen eine von Willebrand Faktor A (vWA) ähnliche Domäne im N-terminalen Bereich des Proteins. Vergleiche mit bereits bekannten vWA Proteinen liefern Gemeinsamkeiten sowie Unterschiede und erlauben erste Einblicke in die Funktion der p34 Untereinheit innerhalb des TFIIH Komplexes. Die gewonnenen Erkenntnisse legen nahe, dass p34 über seine vWA Domäne anderen TFIIH Untereinheiten als strukturelles Gerüst dient, während die C-terminale Zinkfinger-Domäne des Proteins sehr wahrscheinlich zusätzliche Aufgaben übernimmt, die bisher noch nicht genau bekannt sind. Innerhalb des TFIIH Komplexes ist p34 eng mit der p44 Untereinheit assoziiert. Letztere ist als positiver Regulator der XPD Helikase bekannt, die im Rahmen der RNA Polymerase II vermittelten Transkription und der eukaryotischen Nukleotid-Exzisionsreparatur eine entscheidende Rolle spielt. Basierend auf der erzielten p34ct vWA Struktur wurden verschiedene Interaktions-Flächen zwischen p34 und p44 analysiert und mögliche Bindestellen für die beiden Proteine ermittelt. Weitere Kristallisations-Experimente ermöglichten schließlich die Aufklärung der Struktur eines p34 p44 Minimal-Komplexes, bestehend aus der N-terminalen vWA Domäne von p34 und der C-terminalen C4C4 RING Domäne von p44. Die gewonnenen Struktur-Daten bestätigten die zuvor ermittelte Bindestelle der beiden Proteine. Eine genauere Untersuchung der Kontakt-Fläche zwischen p34 und p44 lieferte darüber hinaus entscheidende Hinweise auf besonders wichtige Interaktions-Bereiche und Aminosäuren, die im Folgenden mutiert wurden, um deren Bedeutung für die Komplexbildung zu ermitteln. Mit Hilfe der analytischen Größenausschluss-Chromatographie, elektro-phoretischer Mobilitäts-Verlagerungs-Assays und isothermaler Titrations-Kalorimetrie konnten hierbei verschiedene Aminosäuren identifiziert werden, die für eine stabile p34 p44 Interaktion erforderlich sind. Ferner zeigte die Struktur des p34 p44 Minimal-Komplexes eine Bindungsweise der p44 C4C4 RING Domäne, die sich von der anderer, bereits bekannter RING Domänen in verschiedenen Punkten unterschied. Diese Erkenntnis bestätigt die zuvor aufgestellte Hypothese, dass es sich im Falle von p44 um eine neue Variante der bereits gut charakterisierten RING Domäne handelt. KW - DNA-Reparatur KW - Transkription KW - Transkriptionsfaktor KW - TFIIH KW - General Transcription Factor II H KW - p34 KW - p44 KW - Tfb4 KW - Ssl1 KW - Chaetomium thermophilum Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-104851 ER - TY - THES A1 - Kaiser, Sebastian T1 - A RecQ helicase in disguise: Characterization of the unconventional Structure and Function of the human Genome Caretaker RecQ4 T1 - Die unkonventionelle RecQ Helikase RecQ4: Charakterisierung der ungewöhnlichen Struktur und Funktion eines essentiellen Beschützers des menschlichen Genoms N2 - From the simplest single-cellular organism to the most complex multicellular life forms, genetic information in form of DNA represents the universal basis for all biological processes and thus for life itself. Maintaining the structural and functional integrity of the genome is therefore of paramount importance for every single cell. DNA itself, as an active and complex macromolecular structure, is both substrate and product of many of these biochemical processes. A cornerstone of DNA maintenance is thus established by the tight regulation of the multitude of reactions in DNA metabolism, repressing adverse side reactions and ensuring the integrity of DNA in sequence and function. The family of RecQ helicases has emerged as a vital class of enzymes that facilitate genomic integrity by operating in a versatile spectrum of nucleic acid metabolism processes, such as DNA replication, repair, recombination, transcription and telomere stability. RecQ helicases are ubiquitously expressed and conserved in all kingdoms of life. Human cells express five different RecQ enzymes, RecQ1, BLM, WRN, RecQ4 and RecQ5, which all exhibit individual as well as overlapping functions in the maintenance of genomic integrity. Dysfunction of three human RecQ helicases, BLM, WRN and RecQ4, causes different heritable cancer susceptibility syndromes, supporting the theory that genomic instability is a molecular driving force for cancer development. However, based on their inherent DNA protective nature, RecQ helicases represent a double-edged sword in the maintenance of genomic integrity. While their activity in normal cells is essential to prevent cancerogenesis and cellular aging, cancer cells may exploit this DNA protective function by the overexpression of many RecQ helicases, aiding to overcome the disadvantageous results of unchecked DNA replication and simultaneously gaining resistance against chemotherapeutic drugs. Therefore, detailed knowledge how RecQ helicases warrant genomic integrity is required to understand their implication in cancerogenesis and aging, thus setting the stage to develop new strategies towards the treatment of cancer. The current study presents and discusses the first high-resolution X-ray structure of the human RecQ4 helicase. The structure encompasses the conserved RecQ4 helicase core, including a large fraction of its unique C- terminus. Our structural analysis of the RecQ4 model highlights distinctive differences and unexpected similarities to other, structurally conserved, RecQ helicases and permits to draw conclusions about the functional implications of the unique domains within the RecQ4 C-terminus. The biochemical characterization of various RecQ4 variants provides functional insights into the RecQ4 helicase mechanism, suggesting that RecQ4 might utilize an alternative DNA strand separation technique, compared to other human RecQ family members. Finally, the RecQ4 model permits for the first time the analysis of multiple documented RecQ4 patient mutations at the atomic level and thus provides the possibility for an advanced interpretation of particular structure-function relationships in RecQ4 pathogenesis. N2 - Vom simpelsten einzelligen Organismus bis hin zu hoch komplexen Lebensformen, genetische Information in Form von DNA repräsentiert die universelle Grundlage aller biologischer Prozesse, und damit die des Lebens selbst. Die Aufrechterhaltung der intakten Struktur und Funktion des Genoms ist daher von höchster Priorität für jede einzelne Zelle. Die DNA selbst, als aktives und komplexes Makromolekül, ist sowohl Substrat als auch Produkt einer Vielzahl dieser biochemischen Prozesse. Ein wesentlicher Aspekt für die Aufrechterhaltung genomischer Integrität besteht daher in der gezielten Regulation aller Prozesse des DNA Metabolismus, um die Konservierung der DNA in Sequenz und Funktion zu gewährleisten und unerwünschte Nebenreaktionen zu verhindern. Die Familie der RecQ Helikasen hat sich als eine essentielle Gruppe von Enzymen etabliert, die diese genomische Integrität gewährleisten, indem sie eine Vielzahl von DNA basierten Prozessen kontrollieren. Dies umfasst die Replikation, Reparatur, Rekombination und Transkription von DNA, sowie Prozesse, die der Stabilisierung der Telomere dienen. RecQ Helikasen werden von allen Zellen exprimiert und können in allen Domänen des Lebens – Bakterien, Archaeen und Eukaryoten nachgewiesen werden. Humane Zellen enthalten fünf verschiedene RecQ Helikasen, RecQ1, BLM, WRN, RecQ4 und RecQ5, welche sowohl individuelle als auch überlappende Funktionen in der Aufrechterhaltung genomischer Integrität innehaben. Eine Beeinträchtigung der Funktion der humanen RecQ Helikasen BLM, WRN und RecQ4 führt zu Krankheiten die durch eine erhöhte Wahrscheinlichkeit für die Entstehung von Krebs gekennzeichnet sind. Dies unterstützt die Theorie, dass die genomische Instabilität eine molekulare Grundlage für die Entstehung von Krebs darstellt. Allerdings repräsentiert die den RecQ Helikasen innewohnende Funktion der Aufrechterhaltung genomischer Integrität ein zweischneidiges Schwert. Während ihre Aktivitäten auf der einen Seite für normale Zellen essentiell sind, um Krankheiten und zelluläre Alterungserscheinungen zu verhindern, wird ihre DNA protektive Funktion von Krebszellen genutzt, indem sie verschiedenste RecQ Helikasen überexprimieren und damit den nachteiligen Effekten der unkontrollierten DNA Replikation entgegenwirken. Zudem erlangen Tumorzellen durch die erhöhte Präsenz der RecQ Helikasen Resistenz gegenüber einer Vielzahl von Chemotherapeutika. Es ist daher von größter Bedeutung zu verstehen, wie genau die einzelnen RecQ Helikasen in der Entstehung von Krebs und dem Alterungsprozess involviert sind, um neue Ansätze in der Krebstherapie zu entwickeln. Die vorliegende Arbeit präsentiert und diskutiert die erste detaillierte Röntgen-Kristallographische Struktur der humanen RecQ4 Helikase. Die vorgestellte Struktur umfasst den konservierten Kern der RecQ4 Helikase, einschließlich eines großen Teils ihres einzigartigen C-terminus. Eine Analyse des RecQ4 Modells weist sowohl eindeutige Unterschiede als auch unerwartete Gemeinsamkeiten im Vergleich mit anderen, untereinander strukturell und funktional ähnlichen, humanen RecQ Helikasen auf und erlaubt zudem Rückschlüsse auf die Funktion der einzigartigen C-terminalen RecQ4 Domäne. Die biochemische Charakterisierung verschiedener RecQ4 Varianten liefert funktionelle Einblicke in den Mechanismus der DNA Doppelstrangtrennung durch RecQ4 und deutet darauf hin, dass sich dieser in weiten Teilen vom Mechanismus der anderen humanen RecQ Helikasen unterscheidet. Letztlich repräsentiert das hier vorgestellte Modell der RecQ4 Helikase die Grundlage für die Analyse verschiedenster dokumentierter RecQ4 Patientenmutationen und erlaubt damit eine erste Abschätzung von Struktur-und-Funktions-Beziehungen bezüglich der bekannten RecQ4- assoziierten Krankheitsbilder. KW - Helikasen KW - DNA-Reparatur KW - RecQ helicase KW - X-ray crystallography KW - Rothmund-Thomson-Syndrome KW - Genome Instability Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-160414 N1 - Zugriff gesperrt bis 16.03.2020 ER -