TY  - THES
A1  - Schwedhelm, Ivo Peter
T1  - A non-invasive microscopy platform for the online monitoring of hiPSC aggregation in suspension cultures in small-scale stirred tank bioreactors
T1  - Entwicklung und Etablierung einer Mikroskopieplattform zur zerstörungsfreien Messung der Aggregierung von hiPSCs in kleinmaßstäbigen Bioreaktor-Suspensionskulturen
N2  - The culture of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) at large-scale becomes feasible with the aid of scalable suspension setups in continuously stirred tank reactors (CSTRs). Suspension cul- tures of hiPSCs are characterized by the self-aggregation of single cells into macroscopic cell aggre- gates that increase in size over time. The development of these free-floating aggregates is dependent on the culture vessel and thus represents a novel process parameter that is of particular interest for hiPSC suspension culture scaling. Further, aggregates surpassing a critical size are prone to spon- taneous differentiation or cell viability loss. In this regard, and, for the first time, a hiPSC-specific suspension culture unit was developed that utilizes in situ microscope imaging to monitor and to characterize hiPSC aggregation in one specific CSTR setup to a statistically significant degree while omitting the need for error-prone and time-intensive sampling. For this purpose, a small-scale CSTR system was designed and fabricated by fused deposition modeling (FDM) using an in-house 3D- printer. To provide a suitable cell culture environment for the CSTR system and in situ microscope, a custom-built incubator was constructed to accommodate all culture vessels and process control devices. Prior to manufacture, the CSTR design was characterized in silico for standard engineering parameters such as the specific power input, mixing time, and shear stress using computational fluid dynamics (CFD) simulations. The established computational model was successfully validated by comparing CFD-derived mixing time data to manual measurements. Proof for system functionality was provided in the context of long-term expansion (4 passages) of hiPSCs. Thereby, hiPSC aggregate size development was successfully tracked by in situ imaging of CSTR suspensions and subsequent automated image processing. Further, the suitability of the developed hiPSC culture unit was proven by demonstrating the preservation of CSTR-cultured hiPSC pluripotency on RNA level by qRT-PCR and PluriTest, and on protein level by flow cytometry.
N2  - Die Vermehrung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) im Indus- triemaßstab wird durch skalierbare Bioprozesse in aktiv durchmischten Rührkessel-Bioreaktoren (CSTRs) ermöglicht. Hierbei zeichnet sich das Wachstum von hiPSCs durch die charakteristische Bildung von sphäroidischen Zellaggregaten aus, deren Durchmesser sich im Laufe der Kultivierung vergrößert. Die Agglomeration von hiPSCs ist sowohl abhängig vom Grad der Durchmischung als auch vom jeweiligen Kulturgefäß, und stellt somit einen wichtigen Prozessparameter dar, welcher während der Prozessskalierung berücksichtigt werden muss. Weiterhin weisen hiPSCs in Aggregaten, welche eine kritische Größe überschreiten, eine erhöhte Wahrscheinlichkeit auf, ihre Pluripotenz zu verlieren oder hinsichtlich ihrer Viabilität beeinträchtigt zu werden. Auf Grundlage dessen wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Plattform für die Durchführung von hiPSCs-Suspensionskulturen en- twickelt, welche die zerstörungsfreie Überwachung des hiPSC-Aggregatwachstums in Echtzeit durch den Einsatz von in situ-Mikroskopie ermöglicht. Neben den eigens entworfenen Bioreaktoren, welche zum Großteil aus 3D-gedruckten Komponenten bestehen, wurde eine Peripherie in Form eines Inkubator-Prototyps entwickelt und konstruiert, welcher die Unterbringung der Bioreaktoren, der Systemkomponenten zur Erzeugung von Zellkulturbedingungen sowie einer in situ-Mikroskop- Spezialanfertigung gewährleistet. Als Ausgangspunkt der Entwicklung des CSTR Systems diente ein Strömungssimulationsmodell, welches dazu verwendet wurde, prozesstechnische Kennzahlen zu er- mitteln um das CSTR System hinsichtlich des spezifischen Leistungseintrags, der Mischzeit und der Scherbelastung zu charakterisieren. Das erstellte Simulationsmodell wurde zudem erfolgreich an- hand eines Messdatenabgleichs der Mischzeit hinsichtlich seiner Aussagekraft validiert. Des Weit- eren wurde die Funktionsfähigkeit des gesamten Systems durch Langzeitversuche belegt. Hierbei wurden hiPSCs in den entwickelten Bioreaktoren über einen Zeitraum von vier Passagen expandiert und das Aggregatwachstum mittels in situ-Mikroskopie in Kombination mit einer automatisierten Bildauswertung beschrieben. Überdies hinaus wurde die Qualität der kultivierten hiPSCs hinsichtlich ihrer Differenzierungskapazität durch den Nachweis von Pluripotenzmarkern auf RNA (qRT-PCR und PluriTest) sowie Proteinebene (Durchflusszytometrie) untersucht.
KW  - Induzierte pluripotente Stammzelle
KW  - Mikroskopie
KW  - Suspensionskultur
KW  - Aggregation
KW  - in situ microscopy
KW  - bioreactor
KW  - hiPSC aggregation
KW  - Bioreaktor
KW  - iPSC
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192989
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TY  - THES
A1  - Soares Machado, Jéssica
T1  - Dosimetry-based Assessment of Radiation-associated Cancer risk for \(^9\)\(^9\)\(^m\)Tc-MAG3 Scans in Infants and Optimization of Administered Activities for \(^6\)\(^8\)Ga-labelled Peptides in Children and Adolescents
T1  - Dosimetrie-basierte Abschätzung des strahlungsassoziierten Krebsrisikos für \(^9\)\(^9\)\(^m\)Tc-MAG3-Scans bei Säuglingen und Optimierung der verabreichten Aktivitäten für \(^6\)\(^8\)Ga-markierte Peptide bei Kindern und Jugendlichen
N2  - In 2006, 0.18 Mio pediatric nuclear medicine diagnostic exams were performed worldwide. However, for most of the radiopharmaceuticals used data on biokinetics and, as a consequence on dosimetry, are missing or have not been made publicly available. Therefore, most of the dosimetry assessments presented today for diagnostic agents in children and adolescents rely on the biokinetics data of adults. Even for one of the most common nuclear medicine exams for this patient group, renal scintigraphy with 99mTc-MAG3 for assessing renal function measured data on biokinetics is available only from a study performed on four children of different ages. In particular, renal scans are among the most frequent exams performed on infants and toddlers. Due to the young age, this patient group can be classified as a risk group with a higher probability of developing stochastic radiation effects compared to adults. As there are only limited data on biokinetics and dosimetry in this patient group, the aim of this study is to reassess the dosimetry and the associated radiation risk for a larger number of infants undergoing 99mTc-MAG3 renal scans based on a retrospective analysis of existing patient data. 
Data were collected retrospectively from 34 patients younger than 20 months with normal (20 patients) and abnormal renal function (14 patients) undergoing 99mTc-MAG3 scans. The patient-specific organ activity was estimated based on a retrospective calibration which was performed based on a set of two 3D-printed infant kidneys (newborns: 8.6 ml; 1-year-old: 23.4 ml) filled with known activities. Both phantoms were scanned at different positions along the anteroposterior axis inside a water phantom, providing depth- and size-dependent attenuation correction factors for planar imaging. Time-activity curves were determined by drawing kidney, bladder, and whole body regions-of-interest for each patient, and subsequently applying the calibration factor for conversion of counts to activity. Patient-specific time-integrated activity coefficients were obtained by integrating the organ-specific time-activity curves. Absorbed and effective dose coefficients for each patient were assessed with OLINDA/EXM for the provided newborn and 1-year-old phantom. Based on absorbed dose values, the radiation risk estimation was performed individually for each of the 34 patients with the National Cancer Institute’s Radiation Risk Assessment Tool.
The patients’ organ-specific mean absorbed dose coefficients for the patients with normal renal function were 0.04±0.03 mGy/MBq for the kidneys and 0.27±0.24 mGy/MBq for the bladder. This resulted in a mean effective dose coefficient of 0.02±0.02 mSv/MBq. Based on the dosimetry results, the evaluation of the excess lifetime risk (ELR) for the development of radiation-induced cancer showed that the group of newborns has an ELR of 16.8 per 100,000 persons, which is higher in comparison with the 1-year-old group with an ELR of 14.7 per 100,000 persons. With regard to the 14 patients with abnormal renal function, the mean values for the organ absorbed dose coefficients for the patients were: 0.40±0.34 mGy/MBq for the kidneys and 0.46±0.37 mGy/MBq for the bladder. The corresponding effective dose coefficients (mSv/MBq) was: 0.05±0.02 mSv/MBq. The mean ELR (per 100,000 persons) for developing cancer from radiation exposure for patients with abnormal renal function was 29.2±18.7 per 100,000 persons. 
As a result, the radiation-associated stochastic risk increases with the organ doses, taking age- and gender-specific influences into account. Overall, the lifetime radiation risk associated with the 99mTc-MAG3 scans is very low in comparison to the general population risk for developing cancer.
Furthermore, due to the increasing demand for PET-scans in children and adolescents with 68Ga-labelled peptides, in this work published data sets for those compounds were analyzed to derive recommendations for the administered activities in children and adolescents. The recommendation for the activities to be administered were based on the weight-independent effective dose model, proposed by the EANM Pediatric Dosage Card for application in pediatric nuclear medicine. The aim was to derive recommendations on administered activities for obtaining age-independent effective doses. Consequently, the corresponding weight-dependent effective dose coefficients were rescaled according to the formalism of the EANM dosage card, to determine the radiopharmaceutical class of 68Ga-labeled peptides (“multiples”), and to calculate the baseline activities based on the biokinetics of these compounds and an upper limit of the administered activity of 185 MBq for an adult. Analogous to 18F-fluoride, a minimum activity of 14 MBq is recommended. As a result, for those pediatric nuclear medicine applications involving 68Ga-labeled peptides, new values for the EANM dosage card were proposed and implemented based on the results derived in this work. 
Overall, despite the low additional radiation-related cancer risk, all efforts should be undertaken to optimize administered activities in children and adolescents for obtaining sufficient diagnostic information with minimal associated radiation risk.
N2  - Im Jahr 2006 wurden weltweit 0,18 Mio. nuklearmedizinische Diagnostikuntersuchungen bei Kindern durchgeführt. Für die meisten Radiopharmazeutika fehlen jedoch Daten zur Biokinetik und damit zur Dosimetrie oder diese wurden nicht öffentlich zugänglich gemacht. Daher basieren die meisten der heute vorgestellten Dosimetriedaten für Diagnostika bei Kindern und Jugendlichen auf den biokinetischen Daten von Erwachsenen. Selbst für eine der häufigsten nuklearmedizinischen Untersuchungen für diese Patientengruppe, die Nierenszintigraphie mit 99mTc-MAG3 für Bestimmung der Nierenfunktion, wurden Daten zur Biokinetik bisher nur für vier Kinder unterschiedlichen Alters erhoben. Insbesondere Nierenuntersuchungen gehören zu den häufigsten Untersuchungen bei Säuglingen und Kleinkindern. Aufgrund des jungen Alters kann diese Patientengruppe als Hochrisikogruppe mit einer höheren Wahrscheinlichkeit für das Eintreten stochastischer Strahlenwirkungen im Vergleich zu Erwachsenen eingestuft werden. Da es in dieser Patientengruppe nur begrenzte Daten zur Biokinetik und Dosimetrie gibt, ist das Ziel dieser Arbeit, die Dosimetrie und das damit verbundene Strahlenrisiko für eine größere Anzahl von Kleinkindern, die sich 99mTc-MAG3-Nierenscans unterziehen, auf der Grundlage einer retrospektiven Analyse bestehender Patientendaten neu zu bewerten. 
Die Daten wurden retrospektiv von 34 Patienten unter 20 Monaten mit normaler (20 Patienten) und eingeschränkter Nierenfunktion (14 Patienten) erhoben, bei denen 99mTc-MAG3-Scans durchgeführt wurden. Die patientenspezifische Organaktivität wurde basierend auf einer retrospektiven Kalibrierung abgeschätzt. Diese Kalibrierung basiert auf einem Satz von zwei 3D-gedruckten Säuglingsnieren, die mit bekannten Aktivitäten gefüllt wurden. Beide Phantome wurden an verschiedenen Positionen entlang der anteroposterioren Achse innerhalb eines Wasserphantoms gescannt und lieferten tiefen- und größenabhängige Schwächungskorrekturfaktoren für die planare Bildgebung. Die Zeit-Aktivitäts-Kurven wurden bestimmt, indem für jeden Patienten Nieren-, Blasen- und Ganzkörperregionen eingezeichnet und anschließend der entsprechende Kalibrierfaktor für die Umwandlung der Zählraten in Aktivität angewendet wurde. Patientenspezifische zeitintegrierte Aktivitätskoeffizienten wurden durch Integration der organspezifischen Zeit-Aktivitätskurven ermittelt. Die Energie- und effektiven Dosiskoeffizienten für jeden Patienten wurden mit OLINDA/EXM für das bereitgestellte Neugeborenen- und 1-Jahres-Phantom ermittelt. Basierend auf diesen Werten für die Energiedosen wurde eine individuelle Abschätzung des Strahlenrisikos für jeden der 34 Patienten mit dem Radiation Risk Assessment Tool des National Cancer Institute durchgeführt.
Die organspezifischen mittleren Energiedosiskoeffizienten der Patienten mit normaler Nierenfunktion lagen bei 0,04±0,03 mGy/MBq für die Nieren und 0,27±0,24 mGy/MBq für die Blase, was in einem mittleren effektiven Dosiskoeffizienten von 0,02±0,02 mSv/MBq resultiert. Basierend auf den  Ergebnissen der Dosimetrie, zeigte die Auswertung des zusätzlichen Lebenszeitrisikos ("excess lifetime risk", ELR) für die Entwicklung von strahleninduziertem Krebs, dass die Gruppe der Neugeborenen ein ELR von 16,8 pro 100.000 Personen aufweist, was höher ist als das der Gruppe der 1-jährigen mit 14,7 pro 100.000 Personen. Bei den 14 Patienten mit abnormaler Nierenfunktion waren die Mittelwerte für die Koeffizienten der organspezifischen Energiedosen für die Patienten: 0,40±0,34 mGy/MBq für die Nieren; 0,46±0,37 mGy/MBq für die Blase. Der effektivendosiskoeffizienten (mSv/MBq) waren: 0,05±0,02 mSv/MBq. Der mittlere ELR (pro 100.000 Personen) für die Entstehung von Krebs durch die Strahlenexposition von Patienten mit abnormaler Nierenfunktion betrug 29,2±18,7 pro 100.000 Personen. 
Das mit der Strahlung verbundene stochastische Risiko steigt mit den Organdosen unter Berücksichtigung alters- und geschlechtsspezifischer Einflüsse. Im Allgemeinen ist das mit den 99mTc-MAG3-Scans verbundene lebenslange Strahlenrisiko im Vergleich zum allgemeinen Bevölkerungsrisiko für die Entstehung von Krebs sehr gering.
Aufgrund der steigenden Nachfrage nach PET-Scans bei Kindern und Jugendlichen mit 68Ga-markierten Peptiden wurden zusätzlich publizierte Datensätze für diese Verbindungen analysiert, um Empfehlungen für zu verabreichende Aktivitäten bei Kindern und Jugendlichen abzuleiten. 
Die Dosisberechnungen dazu basierten auf dem Modell einer gewichtsunabhängigen effektiven Dosis, das von der EANM Pediatric Dosage Card für den Einsatz in der pädiatrischen Nuklearmedizin vorgeschlagen wurde. Ziel war es, Empfehlungen zu verabreichenden Aktivitäten so aufzuteilen, dass sich altersunabhängige effektive Dosen ergeben. Dazu wurden die entsprechenden gewichtsabhängigen effektiven Dosiskoeffizienten gemäß dem Formalismus der EANM-Dosierungsempfehlung neu berechnet, um die radiopharmazeutische Klasse der 68Ga-markierten Peptide ("Multiples") zu bestimmen und die Werte für Basisaktivität zu berechnen. Diese basierend auf den Biokinetiken dieser Verbindungen und einer Obergrenze der verabreichten Aktivität von 185 MBq für einen Erwachsenen. Analog zu 18F-Fluorid, wird eine Mindestaktivität von 14 MBq empfohlen. Darauf basierend wurden für die pädiatrischen nuklearmedizinischen Anwendungen mit 68Ga-markierten Peptiden neue Werte für die EANM-Dosierungsempfehlung vorgeschlagen. 
Insgesamt sollten, trotz des geringen zusätzlichen strahlenbedingten Krebsrisikos, alle Anstrengungen unternommen werden, um die verabreichten Aktivitäten bei Kindern und Jugendlichen zu optimieren, um ausreichende diagnostische Informationen bei minimalem zusätzlichem Strahlenrisiko zu erhalten.
KW  - Biokinetics
KW  - Absorbed Doses
KW  - Risk Assessment
KW  - Pediatric Patients
KW  - Dosimetry
KW  - Nuclear Medicine
KW  - Pediatric Nuclear Medicine
KW  - Diagnostic Imaging Exams
KW  - Radiation Protection
KW  - Administered Activities
KW  - Radiation-associated Cancer Risk
KW  - Ga-68-labelled Peptides
KW  - Tc-99m-MAG3 Scans
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192640
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TY  - THES
A1  - AL-Hijailan, Reem Saud
T1  - Establishment of endothelialized cardiac tissue using human induced pluripotent stem cells generated cardiomyocytes
T1  - Etablierung eines endothelialisierten kardialen Gewebes mittels Kardiomyozyten, differenziert aus induzierten pluripotenten Stammzellen
N2  - Cardiovascular diseases are considered the leading cause of death worldwide according to the World Health Organization. Heart failure is the last stage of most of these diseases, where loss of myocardium leads to architectural and functional decline. 
The definitive treatment option for patients with CVDs is organ or tissue transplantation, which relies on donor availability. Therefore, generating an autologous bioengineered myocardium or heart could overcome this limitation. In addition, generating cardiac patches will provide ventricular wall support and enable reparative stem cells delivery to damaged areas.  Although many hurdles still exist, a good number of researches have attempted to create an engineered cardiac tissue which can induce endogenous cardiac repair by replacing damaged myocardium. 
The present study provided cardiac patches in two models, one by a detergent coronary perfusion decellularization protocol that was optimized, and the other that resulted in a 3D cell-free extracellular matrix with intact architecture and preserved s-glycosaminoglycan and vasculature conduits.  Perfusion with 1% Sodium dodecyle sulfate (SDS) under constant pressure resulted in cell-free porcine scaffold within two and cell-free rat scaffold in 7 days, whereas scaffold perfused with 4% sodium deoxycholate (SDO) was not able to remove cells completely.  Re-reendothelialization of tissue vasculature was obtained by injecting human microvascular endothelial cell and human fibroblast in 2:1 ratio in a dynamic culture. One-week later, CD31 positive cells and endothelium markers were observed, indicating new blood lining. Moreover, functionality test of re-endothelialized tissue revealed improvement in clotting seen in decellularized tissues.  When the tissue was ready to be repopulated, porcine induced pluripotent stem cells (PiPSc) were generated by transfected reprogramming of porcine skin fibroblast and then differentiated to cardiac cells following a robust protocol, for an autologous cardiac tissue model. However, due to the limitation in the PiPSc cell number, alternatively, human induced pluripotent stem cells generated cardiac cells were used. 
For reseeding a coculture of human iPSc generated cardiac cells, human mesenchymal stem cells and human fibroblast in 2:1:1 ratio respectively were used in a dynamic culture for 6-8 weeks. Contractions at different areas of the tissue were recorded at an average beating rate of 67 beats/min.  In addition, positive cardiac markers (Troponin T), Fibroblast (vemintin), and mesenchymal stem cells (CD90) were detected.  Not only that, but by week 3, MSC started differentiating to cardiac cells progressively until few CD90 positive cells were very few by week 6 with increasing troponin t positive cells in parallel.  Electrophysiological and drug studies were difficult to obtain due to tissue thickness and limited assessment sources. However, the same construct was established using small intestine submucosa (SISer) scaffold, which recorded a spontaneous beating rate between 0.88 and 1.2 Hz, a conduction velocity of 23.9 ± 0.74 cm s−1, and a maximal contraction force of 0.453 ± 0.015 mN. Moreover, electrophysiological studies demonstrated a drug-dependent response on beating rate; a higher adrenalin frequency was revealed in comparison to the untreated tissue and isoproterenol administration, whereas a decrease in beating rate was observed with propranolol and untreated tissue. 
The present study demonstrated the establishment of vascularized cardiac tissue, which can be used for human clinical application.
N2  - Etablierung eines endothelialisierten kardialen Gewebes mittels Kardiomyozyten, differenziert aus induzierten pluripotenten Stammzellen
KW  - cardiac tissue
KW  - biological scaffolds
KW  - decellularization
KW  - induced pluripotent stem cells
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-173979
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TY  - THES
A1  - Gorelashvili, Maximilian Georg
T1  - Investigation of megakaryopoiesis and the acute phase of ischemic stroke by advanced fluorescence microscopy
T1  - Untersuchungen der Megakaryopoese und der akuten Phase des ischämischen Schlaganfalls mit Hilfe von hochentwickelter Fluoreszenzmikroskopie
N2  - In mammals, anucleate platelets circulate in the blood flow and are primarily responsible for maintaining functional hemostasis. Platelets are generated in the bone marrow (BM) by megakaryocytes (MKs), which mainly reside directly next to the BM sinusoids to release proplatelets into the blood. MKs originate from hematopoietic stem cells and are thought to migrate from the endosteal to the vascular niche during their maturation, a process, which is, despite being intensively investigated, still not fully understood. 
Long-term intravital two photon microscopy (2PM) of MKs and vasculature in murine bone marrow was performed and mean squared displacement analysis of cell migration was performed. The MKs exhibited no migration, but wobbling-like movement on time scales of 3 h. Directed cell migration always results in non-random spatial distribution. Thus, a computational modelling algorithm simulating random MK distribution using real 3D light-sheet fluorescence microscopy data sets was developed. Direct comparison of real and simulated random MK distributions showed, that MKs exhibit a strong bias to vessel-contact. However, this bias is not caused by cell migration, as non-vessel-associated MKs were randomly distributed in the intervascular space. Furthermore, simulation studies revealed that MKs strongly impair migration of other cells in the bone marrow by acting as large-sized obstacles. MKs are thought to migrate from the regions close to the endosteum towards the vasculature during their maturation process. MK distribution as a function of their localization relative to the endosteal regions of the bones was investigated by light sheet fluorescence microscopy (LSFM). The results show no bone-region dependent distribution of MKs. Taken together, the newly established methods and obtained results refute the model of MK migration during their maturation.
Ischemia reperfusion (I/R) injury is a frequent complication of cerebral ischemic stroke, where brain tissue damage occurs despite successful recanalization. Platelets, endothelial cells and immune cells have been demonstrated to affect the progression of I/R injury in experimental mouse models 24 h after recanalization. However, the underlying Pathomechanisms, especially in the first hours after recanalization, are poorly understood.
Here, LSFM, 2PM and complemental advanced image analysis workflows were established for investigation of platelets, the vasculature and neutrophils in ischemic brains. Quantitative analysis of thrombus formation in the ipsilateral and contralateral hemispheres at different time points revealed that platelet aggregate formation is minimal during the first 8 h after recanalization and occurs in both hemispheres. Considering that maximal tissue damage already is present at this time point, it can be concluded that infarct progression and neurological damage do not result from platelet aggregated formation. Furthermore, LSFM allowed to confirm neutrophil infiltration into the infarcted hemisphere and, here, the levels of endothelial cell marker PECAM1 were strongly reduced. However, further investigations must be carried out to clearly identify the role of neutrophils and the endothelial cells in I/R injury.
N2  - In Säugetieren zirkulieren kernlose Thrombozyten im Blutstrom und sind primär für die Aufrechterhaltung der funktionellen Hämostase verantwortlich. Thrombozyten werden im Knochenmark durch Megakaryozyten gebildet, die sich hauptsächlich in direkter Nähe zu Knochenmarkssinusoiden befinden, um Proplättchen in das Blut freizusetzen. Megakaryo-zyten stammen von hämatopoetischen Stammzellen ab und man glaubt, dass sie während ihres Reifungspro¬zesses von der endostalen in die vaskuläre Nische wandern – ein Prozess, der trotz intensiver Forschung noch nicht vollständig verstanden ist. 
Langzeit-Zwei-Photonen-Mikroskopie von Megakaryozyten und des Gefäßbaums wurde in murinem Knochenmark von lebenden Tieren in Kombination mit der Analyse der mittleren quadratischen Verschiebung der Zellmigration durchgeführt. Die Megakaryozyten zeigten keine Migration, sondern eine wackelartige Bewegung auf Zeitskalen von 3 Stunden. Die gerichtete Zellmigration führt stets zu einer nicht zufälligen räumlichen Verteilung der Zellen. Daher wurde ein Computermodellierungsalgorithmus entwickelt, der eine zufällige Megakaryo¬zytenverteilung unter Verwendung von realen 3D-Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie-Datensätzen simuliert. Der direkte Vergleich realer und simuliert zufälliger Megakaryozyten¬verteilungen zeigte, dass MKs stark mit Knochenmarksgefäßen assoziiert sind. Dieses wird jedoch nicht durch Zellmigration verursacht, da nicht-Gefäß-assoziierte MKs zufällig im intervaskulären Raum verteilt waren. Darüber hinaus zeigten Simulationsstudien, dass Megakaryozyten die Migration anderer Zellen im Knochenmark stark beeinträchtigen, da sie als sterische Hindernisse wirken. Es wird angenommen, dass MKs während ihres Reife¬prozesses von den Regionen in der Nähe des Endosteums in Richtung des Gefäßsystems wandern. Die Megakaryozytenverteilung als Funktion ihrer Lokalisierung relativ zu den endo¬stalen Regionen des Knochens wurde durch Lichtblattmikroskopie untersucht. Die Ergebnisse zeigen keine knochenregionabhängige Verteilung von Megakaryozyten. Zusammenge¬nommen widerlegen die neu etablierten Methoden und erzielten Ergebnisse das Modell der Megakaryozyten¬migration während ihrer Reifung.
Ischämie-Reperfusionsschaden (I/R) ist eine häufige Komplikation des zerebralen ischämischen Schlaganfalls, bei dem trotz erfolgreicher Rekanalisierung eine Schädigung des Hirngewebes auftritt. Es wurde gezeigt, dass Thrombozyten, Endothelzellen und Immunzellen das Fortschreiten der I/R-Verletzung in experimentellen Mausmodellen 24 Stunden nach der Rekanalisierung beeinflussen. Die zugrundeliegenden Pathomechanismen, insbesondere in den ersten Stunden nach der Rekanalisierung, sind jedoch kaum verstanden.
Hier wurden Lichtblattmikroskopie, Zwei-Photonen-Mikroskopie und ergänzende hochkom-plexe Bildanalyse-Workflows zur Untersuchung von Thrombozyten, der Gefäße und Neutro-philen in ischämischen Gehirnen etabliert. Die quantitative Analyse der Thrombusbildung in der ipsilateralen und kontralateralen Hemisphäre zu verschiedenen Zeitpunkten zeigte, dass die Thrombozytenaggregationsbildung während der ersten 8 Stunden nach der Rekanalisierung minimal ist und in beiden Hemisphären auftritt. In Anbetracht dessen, dass zu diesem Zeitpunkt bereits eine maximale Gewebeschädigung vorliegt, kann geschlossen werden, dass die Infarkt¬progression und der neurologische Schaden nicht aus der Bildung von Thrombozytenaggre¬gaten resultieren. Darüber hinaus erlaubte Lichtblattmikroskopie die Neutrophileninfiltration in die infarzierte Hemisphäre zu bestätigen und hier waren die Spiegel des Endothelzellmarkers PECAM1 stark reduziert. Es müssen jedoch weitere Untersuchungen durchgeführt werden, um die Rolle von Neutrophilen und Endothelzellen bei I/R-Verletzungen klar zu identifizieren.
KW  - Fluoreszenzmikroskopie
KW  - Schlaganfall
KW  - Megakaryozyt
KW  - Computersimulation
KW  - Light sheet microscopy
KW  - ischemic stroke
KW  - megakaryopoiesis
KW  - multi-photon microscopy
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-186002
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TY  - THES
A1  - Mohammadi, Milad
T1  - Role of oxidized phospholipids in inflammatory pain
T1  - Rolle von oxidierten Phospholipiden bei entzündlichen Schmerzen
N2  - Introduction: During inflammation, reactive oxygen species (ROS) such as Hydrogen peroxide accumulate at the inflammation site and by oxidizing lipids, they produce metabolites such as 4-hydroxynonenal (4-HNE) and oxidized phospholipids (OxPLs). Transient receptor potential ankyrin 1 (TRPA1) and vanilloid 1 (TRPV1) are ligand gated ion channels that are expressed on nociceptors and their activation elicits pain. Hydrogen peroxide and 4-HNE are endogenous ligands for TRPA1 and their role in inflammatory pain conditions has been shown. OxPLs play a major pro-inflammatory role in many pathologies including atherosclerosis and multiple sclerosis. E06/T15 is a mouse IgM mAb that specifically binds oxidized phosphatidylcholine. D-4F is an apolipoprotein A-I mimetic peptide with a very high affinity for OxPLs and possess anti-inflammatory properties. E06 mAb and D-4F peptide protect against OxPLs-induced damage in atherosclerosis in vivo. 
Methods: To investigate the role of ROS and their metabolites in inflammatory pain, I utilized a combination of diverse and complex behavioral pain measurements and binding assays. I examined E06 mAb and D-4F as local treatment options for hypersensitivity evoked by endogenous and exogenous activators of TRPA1 and TRPV1 as well as in inflammatory and OxPL-induced pain models in vivo. 4-HNE, hydrogen peroxide as ROS source and mustard oil (AITC) were used to activate TRPA1, while capsaicin was used to activate TRPV1.
Results: Intraplantar injection of oxidized 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (OxPAPC) into rats’ hind paw elicited thermal and mechanical hypersensitivity. Genetic and pharmacological evidence in vivo confirmed the role of TRPA1 in OxPLs-induced hypersensitivity. OxPLs formation increased in complete Freund’s adjuvant (CFA)-induced inflamed rats’ paw. E06 mAb and D-4F prevented OxPAPC–induced mechanical and thermal hypersensitivity (hyperalgesia) as well as CFA-induced mechanical hypersensitivity. Also, all irritants induced thermal and mechanical hypersensitivity as well as affective-emotional responses and spontaneous nocifensive behaviors. E06 mAb blocked prolonged mechanical hypersensitivity by all but hydrogen peroxide. In parallel, D-4F prevented mechanical hypersensitivity induced by all irritants as well as thermal hypersensitivity induced by capsaicin and 4-HNE. In addition, competitive binding assays showed that all TRPA1/V1 agonists induced prolonged formation of OxPLs in the paw tissue explaining the anti-nociceptive properties of E06 mAb and D-4F. Finally, the potential of gait analysis as a readout for non-provoked pain behavioral measurements were examined.
Conclusion and implications: OxPLs were characterized as novel targets in inflammatory pain. Treatment with the monoclonal antibody E06 or apolipoprotein A-I mimetic peptide D-4F are suggested as potential inflammatory pain medications. OxPLs’ role in neuropathic pain is yet to be investigated.
N2  - Im entzündeten Gewebe akkumulieren reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sowie oxidierte Phospholipide (OxPLs). ROS und in der Reaktionskette nachgeschaltete Verbindungen, wie 4- Hydroxynonenal (4-HNE) aktivieren Transiente Rezeptor Potential (TRP) Ionenkanäle: Ankyrin 1 (TRPA1) und Vanilloid 1 (TRPV1). Diese TRP-Kanäle werden auf Nozizeptoren exprimiert und rufen Schmerz z.B. bei Entzündung hervor. OxPLs sind an vielen entzündungsfördernden Prozessen maßgebend beteiligt und spielen eine Schlüsselrolle bei Pathologie von Atherosklerose und Multipler Sklerose. E06/T15 ist ein Maus IgM-mAb, welcher spezifisch an oxidierte Phosphatidylcholine bindet. D-4F ist ein Apolipoprotein A-I (ApoA-I) mimetisches Peptid, das eine sehr hohe Affinität für OxPLs aufweist und auch entzündungshemmende Eigenschaften besitzt. E06 mAb und D-4F schützen vor Atherosklerose in vivo. Um die mögliche Rolle von OxPLs beim Entzündungsschmerz zu untersuchen, verwendete ich eine Kombination von verschiedenen und komplexen Schmerzverhaltensmessungen, Bindungsassays und immunhistologische Färbungen. ...
KW  - Inflammatory pain
KW  - Oxidized phospholipids
KW  - reactive oxygen species
KW  - ROS
KW  - 4-HNE
KW  - HNE
KW  - OxPL
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192402
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TY  - THES
A1  - Nelke, Lena
T1  - Establishment and optimization of 3-dimensional mamma carcinoma models for therapy simulation and drug testing
T1  - Etablierung und Optimierung 3-dimensionaler Mammakarzinommodelle für die Therapiesimulation und die Wirkstofftestung
N2  - Breast cancer is the most common cancer among women worldwide and the second most common cause of cancer death in the developed countries. As the current state of the art in first-line drug screenings is highly ineffective, there is an urgent need for novel test systems that allow for reliable predictions of drug sensitivity.
In this study, a tissue engineering approach was used to successfully establish and standardize a 3-dimensional (3D) mamma carcinoma test system that was optimized for the testing of anti-tumour therapies as well as for the investigation of tumour biological issues. This 3D test system is based on the decellularised scaffold of a porcine small intestinal segment and represents the three molecular subsets of oestrogen receptor-positive, HER2/Neu-overexpressing and triple negative breast cancer (TNBC). The characterization of the test system with respect to morphology as well as the expression of markers for epithelial-mesenchymal transition (EMT) and differentiation indicate that the 3D tumour models cultured under static and dynamic conditions reflect tumour relevant features and have a good correlation with in vivo tumour tissue from the corresponding xenograft models. In this respect, the dynamic culture in a flow bioreactor resulted in the generation of tumour models that exhibited best reflection of the morphology of the xenograft material. Furthermore, the proliferation indices of 3D models were significantly reduced compared to 2-dimensional (2D) cell culture and therefore better reflect the in vivo situation. As this more physiological proliferation index prevents an overestimation of the therapeutic effect of cytostatic compounds, this is a crucial advantage of the test system compared to 2D culture. Moreover, it could be shown that the 3D models can recapitulate different tumour stages with respect to tumour cell invasion. The scaffold SISmuc with the preserved basement membrane structure allowed the investigation of invasion over this barrier which tumour cells of epithelial origin have to cross in in vivo conditions during the process of metastasis formation. Additionally, the data obtained from ultrastructural analysis and in situ zymography indicate that the invasion observed is connected to a tumour cell-associated change in the basement membrane in which matrix metalloproteinases (MMPs) are also involved. This features of the model in combination with the mentioned methods of analysis could be used in the future to mechanistically investigate invasive processes and to test anti-metastatic therapy strategies.
The validation of the 3D models as a test system with respect to the predictability of therapeutic effects was achieved by the clinically relevant targeted therapy with the monoclonal antibody trastuzumab which induces therapeutic response only in patients with HER2/Neu-overexpressing mamma carcinomas due to its specificity for HER2. While neither in 2D nor in 3D models of all molecular subsets a clear reduction of cell viability or an increase in apoptosis could be observed, a distinct increase in antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) was detected only in the HER2/NEU-overexpressing 3D model with the help of an ADCC reporter gene assay that had been adapted for the application in the 3D model in the here presented work. This correlates with the clinical observations and underlines the relevance of ADCC as a mechanism of action (MOA) of trastuzumab. In order to measure the effects of ADCC on the tumour cells in a direct way without the indirect measurement via a reporter gene, the introduction of an immunological component into the models was required. This was achieved by the integration of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), thereby allowing the measurement of the induction of tumour cell apoptosis in the HER2/Neu-overexpressing model. Hence, in this study an immunocompetent model could be established that holds the potential for further testing of therapies from the emergent field of cancer immunotherapies.
Subsequently, the established test system was used for the investigation of scientific issues from different areas of application. By the comparison of the sensitivity of the 2D and 3D model of TNBC towards the water-insoluble compound curcumin that was applied in a novel nanoformulation or in a DMSO-based formulation, the 3D test system was successfully applied for the evaluation of an innovative formulation strategy for poorly soluble drugs in order to achieve cancer therapy-relevant concentrations. Moreover, due to the lack of targeted therapies for TNBC, the TNBC model was applied for testing novel treatment strategies. On the one hand, therapy with the WEE1 kinase inhibitor MK 1775 was evaluated as a single agent as well as in combination with the chemotherapeutic agent doxorubicin. This therapy approach did not reveal any distinct benefits in the 3D test system in contrast to testing in 2D culture. On the other hand, a novel therapy approach from the field of cellular immunotherapies was successfully applied in the TNBC 3D model. The treatment with T cells that express a chimeric antigen receptor (CAR) against ROR1 revealed in the static as well as in the dynamic model a migration of T cells into the tumour tissue, an enhanced proliferation of T cells as well as an efficient lysis of the tumour cells via apoptosis and therefore a specific anti-cancer effect of CAR-transduced T cells compared to control T cells. These results illustrate that the therapeutic application of CAR T cells is a promising strategy for the treatment of solid tumours like TNBC and that the here presented 3D models are suitable for the evaluation and optimization of cellular immunotherapies.
In the last part of this work, the 3D models were expanded by components of the tumour stroma for future applications. By coculture with fibroblasts, the natural structures of the intestinal scaffold comprising crypts and villi were remodelled and the tumour cells formed tumour-like structures together with the fibroblasts. This tissue model displayed a strong correlation with xenograft models with respect to morphology, marker expression as well as the activation of dermal fibroblasts towards a cancer-associated fibroblast (CAF) phenotype. For the integration of adipocytes which are an essential component of the breast stroma, a coculture with human adipose-derived stromal/stem cells (hASCs) which could be successfully differentiated along the adipose lineage in 3D static as well as dynamic models was established. These models are suitable especially for the mechanistic analysis of the reciprocal interaction between tumour cells and adipocytes due to the complex differentiation process.
Taken together, in this study a human 3D mamma carcinoma test system for application in the preclinical development and testing of anti-tumour therapies as well as in basic research in the field of tumour biology was successfully established. With the help of this modular test system, relevant data can be obtained concerning the efficacy of therapies in tumours of different molecular subsets and different tumour stages as well as for the optimization of novel therapy strategies like immunotherapies. In the future this can contribute to improve the preclinical screening and thereby to reduce the high attrition rates in pharmaceutical industry as well as the amount of animal experiments.
N2  - Brustkrebs ist die häufigste Krebsart bei Frauen und die zweithäufigste Todesursache bei Krebserkrankungen in den Industrienationen. Aufgrund der Ineffizienz der derzeit verwendeten Modelle für die Identifizierung neuer Therapeutika herrscht ein hoher Bedarf an neuartigen Testsystemen, welche aussagekräftige Vorhersagen über die Wirksamkeit ermöglichen.
In dieser Arbeit wurde mit Hilfe des Tissue Engineerings erfolgreich ein 3-dimensionales (3D) Mammakarzinom-Testsystem etabliert, standardisiert und für die Testung von anti-tumoralen Therapien sowie weitere tumorbiologische Fragestellungen optimiert. Dieses 3D Testsystem basiert auf der dezellularisierten Gerüststruktur eines porcinen Dünndarmsegments und repräsentiert die drei molekularen Subtypen des Östrogen-Rezeptor-positiven, HER2/Neu-überexprimierenden sowie des tripel-negativen Brustkrebses (TNBC). Die Charakterisierung des Testsystems anhand der Morphologie sowie der Expression von Markern zur Bestimmung der epithelialen-mesenchymalen Transition (EMT) und der Differenzierung zeigte, dass die statisch und dynamisch kultivierten 3D Modelle Tumor-relevante Charakteristika widerspiegeln und eine deutliche Ähnlichkeit zu in vivo Tumormaterial aus entsprechenden Xenograft-Modellen aufweisen, wobei die dynamische Kultivierung in einem Flussreaktor zur Generierung von Tumormodellen führte, welche die Morphologie des Tumorgewebes aus Xenograft-Modellen am besten repräsentierten. Des Weiteren war die Proliferationsrate in den 3D Modellen im Vergleich zu 2-dimensionalen (2D) Zellkulturen signifikant reduziert und entspricht daher eher der Situation in vivo. Dies ist ein entscheidender Vorteil des Testsystems gegenüber der 2D Zellkultur, da durch die physiologischere Proliferationsrate eine Überschätzung des Therapieeffekts zytostatischer Medikamente vermieden wird. Zudem konnte gezeigt werden, dass mit Hilfe der 3D Modelle unterschiedliche Tumorstadien in Bezug auf die Tumorzellinvasion abgebildet werden können. Die Gerüststruktur SISmuc mit erhaltener Basalmembranstruktur ermöglichte eine Untersuchung der Invasion über diese Barriere, welche Tumorzellen epithelialen Ursprungs unter in vivo-Bedingungen beim Prozess der Metastasierung überwinden müssen. Zudem deuten die durch ultrastrukturelle Analysen und in situ Zymographie gewonnenen Daten darauf hin, dass die beobachtete Invasion mit einer Tumorzell-assoziierten Veränderung der Basalmembran, an der auch Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) beteiligt sind, einhergeht. Diese Eigenschaften des Modells in Kombination mit den erwähnten Untersuchungsmethoden könnten in Zukunft dazu eingesetzt werden, Invasionsprozesse mechanistisch zu untersuchen sowie neue anti-metastatisch wirkende Therapiestrategien zu testen. 
Die Validierung der 3D Modelle als Testsystem bezüglich der Vorhersagbarkeit von Therapieeffekten erfolgte mit Hilfe der klinisch relevanten, zielgerichteten Therapie mit dem monoklonalen Antikörper Trastuzumab, welcher aufgrund seiner Spezifität für HER2/Neu nur in Patienten mit HER2/Neu-überexprimierendem Mammakarzinom einen Therapieerfolg erzielt. Während weder in 2D noch in den 3D Modellen aller molekularer Subtypen eine eindeutige Reduktion der Zellviabilität oder ein Anstieg der Apoptose gemessen werden konnte, zeigte sich mit Hilfe eines ADCC-Reportergenassays, der in dieser Arbeit für die Anwendung im 3D Modell angepasst wurde, ein deutlicher Anstieg der Antikörper-abhängigen zellvermittelten Zytotoxizität (ADCC) lediglich für das HER2/Neu-überexprimierende Modell. Dies entspricht den klinischen Beobachtungen und unterstreicht die Relevanz der ADCC als Wirkmechanismus des Antikörpers. Um die direkten Effekte einer ADCC auf die Tumorzellen im 3D Testsystem direkt – ohne den Umweg über ein Reportergen – messbar zu machen, war die Einführung einer immunologischen Komponente notwendig. Dies gelang mit Hilfe der Integration von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs), wodurch die Induktion der Apoptose im HER2/Neu-überexprimierenden Modell messbar war. Somit konnte im Rahmen dieser Arbeit ein immunkompetentes Modell etabliert werden, welche das Potenzial für weitere Testungen aus dem aufstrebenden Bereich der Krebsimmuntherapien bietet. 
Anschließend wurde das etablierte Testsystem zur Untersuchung von Fragestellungen aus unterschiedlichen Anwendungsbereichen eingesetzt. Durch den Vergleich der Sensitivität von Tumorzellen in 2D und im 3D Modell des TNBC gegenüber des wasserunlöslichen Wirkstoffs Curcumin, welcher in einer neuartigen Nanoformulierung bzw. in einer DMSO-basierten Formulierung appliziert wurde, konnte das 3D Testsystem für die Evaluation einer innovativen Formulierungsstrategie für unlösliche Wirkstoffe angewendet werden, um für die Krebstherapie relevante Dosierungen zu erreichen. Weiterhin wurden aufgrund des Mangels an zielgerichteten Therapien für das tripel-negative Mammakarzinom neuartige Therapiestrategien anhand des 3D Modells getestet. Zum einen wurde die Therapie mit dem WEE1-Kinase Inhibitor MK 1775 als Monotherapie sowie in Kombination mit dem Chemotherapeutikum Doxorubicin evaluiert. Diese zeigte im Gegensatz zu Testungen in 2D Kultur keinen eindeutigen Therapieeffekt im 3D Testsystem. Zum anderen wurde eine neuartige Behandlung aus dem Bereich der zellulären Immuntherapie erfolgreich im TNBC 3D Modell angewendet. Die Behandlung mit T-Zellen, welche einen chimären Antigen-Rezeptor (CAR) gegen ROR1 tragen, zeigte sowohl im statischen als auch im dynamischen Modell eine Migration der T-Zellen in das Tumorgewebe, eine erhöhte Proliferation der T-Zellen sowie eine effiziente Lyse der Tumorzellen mittels Apoptose und damit eine spezifische anti-tumorale Wirkung der CAR-transduzierten T-Zellen im Vergleich zu Kontroll-T-Zellen. Diese Ergebnisse verdeutlichen einerseits, dass die therapeutische Anwendung von CAR-T-Zellen eine vielversprechende Strategie für die Behandlung von soliden Tumoren wie des TNBC ist, zum anderen, dass die hier vorgestellten 3D Modelle als Testsystem für die Evaluierung und Optimierung von zellulären Immuntherapien geeignet sind.
Im letzten Teil der Arbeit wurde das 3D Modell für die zukünftige Anwendung um Komponenten des Tumorstromas erweitert. Durch die Kokultur mit Fibroblasten wurden die natürlichen Strukturen der Darmmatrix, bestehend aus Krypten und Villi, umgebaut und die Krebszellen bildeten zusammen mit den Fibroblasten tumorartige Strukturen aus. Das so erzeugte Gewebemodell zeigte sowohl in morphologischer Hinsicht als auch bezogen auf die Markerexpression und die Aktivierung der dermalen Fibroblasten hin zu Krebs-assoziierten Fibroblasten (CAFs) starke Ähnlichkeit mit Xenograft-Modellen. Für die Integration von Adipozyten, welche ein wichtiger Bestandteil des Stromas in der Brust sind, wurde eine Kokultur mit humanen, aus dem Fettgewebe stammenden Stroma-/Stammzellen (hASCs) etabliert, welche sowohl im statischen als auch im dynamischen 3D Modell erfolgreich adipogen differenziert werden konnten. Diese Modelle eignen sich aufgrund des komplexen Differenzierungsprozesses vor allem für die mechanistische Untersuchung der Interaktionen zwischen Tumorzellen und Adipozyten.
Zusammenfassend ist es in dieser Arbeit gelungen, ein humanes 3D Mammakarzinom-Testsystem zur Anwendung in der präklinischen Entwicklung und Testung anti-tumoraler Therapien sowie der Grundlagenforschung im Bereich der Tumorbiologie zu etablieren. Mit Hilfe dieses modularen Testsystems können relevante Daten zur Wirksamkeit von Therapien in Tumoren unterschiedlicher molekularer Subtypen sowie unterschiedlich fortgeschrittener Tumorstadien und zur Optimierung neuartiger Therapiestrategien wie Immuntherapien gewonnen werden. Dies kann in Zukunft dazu beitragen das präklinische Screening zu verbessern und somit die hohen klinischen Ausfallraten in der pharmazeutischen Industrie und die Zahl von Tierversuchen zu reduzieren.
KW  - Brustkrebs
KW  - Mamma carcinoma
KW  - Tissue Engineering
KW  - Drug testing
KW  - 3D model
KW  - therapy simulation
KW  - Mammakarzinom
KW  - Wirkstofftestung
KW  - 3D Modell
KW  - Therapiesimulation
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-172280
ER  - 
TY  - THES
A1  - Anany, Mohamed Ahmed Mohamed Mohamed
T1  - Enhancement of Toll-like receptor3 (TLR3)-induced death signaling by TNF-like weak inducer of apoptosis (TWEAK)
T1  - Verstärkung der Toll-like receptor3 (TLR3)-induzierten Todessignalisierung durch TNF-like weak inducer of apoptosis (TWEAK)
N2  - Tumor necrosis factor (TNF)-like weak inducer of apoptosis (TWEAK) is a member of the TNF superfamily (TNFSF) and is as such initially expressed as type II class transmembrane glycoprotein from which a soluble ligand form can be released by proteolytic processing. While the expression of TWEAK has been detected at the mRNA level in various cell lines and cell types, its cell surface expression has so far only been documented for dendritic cells, monocytes and interferon-γ stimulated NK cells. The fibroblast growth factor-inducible-14 (Fn14) is a TRAF2-interacting receptor of the TNF receptor superfamily (TNFRSF) and is the only receptor for TWEAK. The expression of Fn14 is strongly induced in a variety of non-hematopoietic cell types after tissue injury. The TWEAK/Fn14 system induces pleiotropic cellular activities such as induction of proinflammatory genes, stimulation of cellular angiogenesis, proliferation, differentiation, migration and in rare cases induction of apoptosis. On the other side, Toll-like receptor3 (TLR3) is one of DNA- and RNA-sensing pattern recognition receptors (PRRs), plays a crucial role in the first line of defense against virus and invading foreign pathogens and cancer cells. Polyinosinic-polycytidylic acid poly(I:C) is a synthetic analog of dsRNA, binds to TLR3 which acts through the adapter TRIF/TICAM1, leading to cytokine secretion, NF-B activation, IRF3 nuclear translocation, inflammatory response and may also elicit the cell death. TWEAK sensitizes cells for TNFR1-induced apoptosis and necroptosis by limiting the availability of protective TRAF2-cIAP1 and TRAF2-cIAP2 complexes, which interact with the TNFR1-binding proteins TRADD and RIPK1. In accordance with the fact that poly(I:C)-induced signaling also involves these proteins, we found enhanced necroptosis-induction in HaCaT and HeLa-RIPK3 by poly(I:C) in the presence of TWEAK (Figure 24). Analysis of a panel of TRADD, FADD, RIPK1 and caspase-8 knockout cells revealed furthermore similarities and differences in the way how these molecules act in cell death signaling by poly(I:C)/TWEAK and TNF and TRAIL. RIPK1 turned out to be essential for poly(I:C)/TWEAK-induced caspase-8-mediated apoptosis but was dispensable for these responses in TNF and TRAIL signaling. Lack of FADD protein abrogated TRAIL- but not TNF- and poly(I:C)-induced necroptosis. Moreover, we observed that both long and short FLIP rescued HaCaT and HeLa-RIPK3 cells from poly(I:C)-induced apoptosis or necroptosis.
To sum up, our results demonstrate that TWEAK, which is produced by interferon stimulated myeloid cells, controls the induction of apoptosis and necroptosis by the TLR3 ligand poly(I:C) and may thus contribute to cancer or anti-viral immunity treatment.
N2  - Tumor necrosis factor (TNF)-like weak inducer of apoptosis (TWEAK) ist ein Mitglied der TNF-Superfamilie (TNFSF) und wird als solches anfänglich als Transmembranglykoprotein der Klasse II exprimiert, aus dem eine lösliche Ligandenform durch proteolytische Prozessierung freigesetzt werden kann. Während die Expression von TWEAK auf mRNA-Ebene in verschiedenen Zelllinien und Zelltypen nachgewiesen wurde, konnte ihre Zelloberflächenexpression bisher nur für dendritische Zellen, Monozyten und Interferon-γ-stimulierte NK-Zellen dokumentiert werden.  Fibroblast growth factor-inducible-14 (Fn14) ist ein TRAF2-wechselwirkender Rezeptor der TNF-Rezeptor-Superfamilie (TNFRSF) und der einzige Rezeptor für TWEAK. Die Expression von Fn14 wird nach Gewebeverletzung in einer Vielzahl von nicht hämatopoetischen Zelltypen stark induziert. Das TWEAK / Fn14-System induziert pleiotrope zelluläre Aktivitäten, die von der proinflammatorischen Geninduktion über die Stimulierung der Angiogenese, Proliferation und Zelldifferenzierung bis hin zur Zellmigration und in seltenen Fällen zur Induktion von Apoptose reichen. Auf der anderen Seite spielt der Toll-like Rezeptor3 (TLR3), einer der DNA- and RNA-sensing pattern recognition receptors (PRRs), eine entscheidende Rolle in der ersten Verteidigungslinie gegen Viren und eindringende fremde Krankheitserreger und Krebszellen. Polyinosin-Polycytidylsäure-Poly (I: C) ist ein synthetisches Analogon von dsRNA, das an TLR3 bindet, das über den Adapter TRIF / TICAM1 wirkt und zu Zytokinsekretion, NF-B-Aktivierung, IRF3-Kerntranslokation und Entzündungsreaktion führt der Zelltod.
TWEAK sensibilisiert Zellen für TNFR1-induzierte Apoptose und Nekroptose, indem es die Verfügbarkeit von schützenden TRAF2-cIAP1- und TRAF2-cIAP2-Komplexen begrenzt, die mit den TNFR1-bindenden Proteinen TRADD und RIPK1 interagieren. Entsprechend der Tatsache, dass diese Proteine auch von Poly (I: C) induziert werden, fanden wir eine verstärkte Nekroptose-Induktion in HaCaT und HeLa-RIPK3 durch Poly (I: C) in Gegenwart von TWEAK (Figure 24). Die Analyse eines Panels von TRADD-, FADD-, RIPK1- und Caspase-8-Knockout-Zellen ergab außerdem Ähnlichkeiten und Unterschiede in der Art und Weise, wie diese Moleküle bei der Zelltodsignalisierung durch Poly (I: C) / TWEAK und TNF und TRAIL wirken. RIPK1 erwies sich als essentiell für die Poly (I: C) / TWEAK-induzierte Caspase-8-vermittelte Apoptose, war jedoch für diese Reaktionen bei TNF- und TRAIL-Signalen entbehrlich. Das Fehlen von FADD-Protein hob TRAIL-, aber nicht TNF- und Poly (I: C) -induzierte Nekroptose auf. Darüber hinaus beobachteten wir, dass sowohl langes als auch kurzes FLIP HaCaT- und HeLa-RIPK3-Zellen vor Poly (I: C) -induzierter Apoptose oder Nekroptose retteten.
Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass TWEAK, das von Interferon-stimulierten myeloischen Zellen produziert wird, die Induktion von Apoptose und Nekroptose durch den TLR3-Liganden Poly(I: C) steuert und somit zur Krebsbehandlung oder antiviralen Immunität beitragen kann.
KW  - Immunologe
KW  - TLR3
KW  - TWEAK
KW  - Krebs
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-189757
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schiele, Miriam
T1  - Interaction of 5-HTT/NPSR1 variants with distal and acute stress on dimensional and neuroendocrine anxiety endophenotypes – A multi-dimensional model of anxiety risk
T1  - Interaktion von 5-HTT/NPSR1 Varianten mit distalem und akutem Stress bei dimensionalen und neuroendokrinen Endophänotypen von Angst – Ein multidimensionales Modell der Angstentstehung
N2  - The etiology of anxiety disorders is multifactorial with contributions from both
genetic and environmental factors. Several susceptibility genes of anxiety disorders or
anxiety-related intermediate phenotypes have been identified, including the
serotonin transporter gene (5-HTT) and the neuropeptide S receptor gene (NPSR1),
which have been shown to modulate responses to distal and acute stress experiences.
For instance, gene-environment interaction (GxE) studies have provided evidence
that both 5-HTT and NPSR1 interact with environmental stress, particularly
traumatic experiences during childhood, in the moderation of anxiety traits, and
both 5-HTT and NPSR1 have been implicated in hypothalamic-pituitary-adrenal
(HPA) axis reactivity – an intermediate phenotype of mental disorders – in response
to acute stress exposure. The first part of this thesis aimed to address the interplay of
variations in both 5-HTT and NPSR1 genes and distal stress experiences, i.e.
childhood trauma, in the moderation of anxiety-related traits, extended by
investigation of the potentially protective effect of positive influences, i.e. elements of
successful coping such as general self-efficacy (GSE), on a GxE risk constellation by
introducing GSE as an indicator of coping ability (“C”) as an additional dimension in
a GxExC approach conferring – or buffering – vulnerability to anxiety. Increased
anxiety was observed in 5-HTTLPR/rs25531 LALA genotype and NSPR1 rs324981 AA
genotype carriers, respectively, with a history of childhood maltreatment but only in
the absence of a person’s ability to cope with adversity, whereas a dose-dependent
effect on anxiety traits as a function of maltreatment experiences irrespective of
coping characteristics was observed in the presence of at least one 5-HTT S/LG or
NSPR1 T allele, respectively. The second part of this thesis addressed the respective
impact of 5-HTT and NPSR1 variants on the neuroendocrine, i.e. salivary cortisol
response to acute psychosocial stress by applying the Maastricht Acute Stress Test
(MAST). A direct effect of NPSR1 – but not 5-HTT – on the modulation of acute
stress reactivity could be discerned, with carriers of the more active NPSR1 T allele
Summary
III
displaying significantly higher overall salivary cortisol levels in response to the MAST
compared to AA genotype carriers.
In summary, study 1 observed a moderating effect of GSE in interaction with
childhood maltreatment and 5-HTT and NPSR1, respectively, in an extended GxExC
model of anxiety risk, which may serve to inform targeted preventive interventions
mitigating GxE risk constellations and to improve therapeutic interventions by
strengthening coping ability as a protective mechanism to promote resilient
functioning. In study 2, a modulation of HPA axis function, considered to be an
endophenotype of stress-related mental disorders, by NPSR1 gene variation could be
discerned, suggesting neuroendocrine stress reactivity as an important potential
intermediate phenotype of anxiety given findings linking NPSR1 to dimensional and
categorical anxiety. Results from both studies may converge within the framework of
a multi-level model of anxiety risk, integrating neurobiological, neuroendocrine,
environmental, and psychological factors that act together in a highly complex
manner towards increasing or decreasing anxiety risk.
N2  - Die Entstehung von Angsterkrankungen ist multifaktoriell bedingt durch
sowohl genetische als auch umweltbezogene Faktoren. Verschiedene
Suszeptibilitätsgene von Angsterkrankungen und angstbezogenen Phänotypen
konnten identifiziert werden, darunter das Serotonintransportergen (5-HTT) und
das Neuropeptid S Rezeptorgen (NPSR1). Für beide Gene konnte gezeigt werden,
dass sie die Reaktion auf sowohl distale als auch akute Stresserlebnisse beeinflussen
können. Unter anderem legen Befunde aus Gen-Umwelt-Interaktionsstudien (GxE)
nahe, dass sowohl 5-HTT also auch NPSR1 mit Umwelteinflüssen interagieren,
insbesondere mit traumatischen Kindheitserlebnissen, und somit unterschiedliche
Ausprägungen der Angst mitbedingen. Weiterhin konnten sowohl 5-HTT als auch
NPSR1 in Bezug zu veränderter Reaktivität der Hypothalamus-Hypophysen-
Nebennierenrinden-Achse (HPA-Achse) auf psychosozialen Stress hin gebracht
werden, deren Funktion einen intermediären Phänotyp von psychischen
Erkrankungen darstellt. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde das Zusammenwirken
von Varianten in sowohl dem 5-HTT als auch dem NPSR1 Gen mit distalen
Stresserlebnissen, d.h. Kindheitstraumata, unter Einbezug der möglicherweise
protektiven Funktion von positiven Einflussfaktoren im Sinne von erfolgreichen
Bewältigungsstrategien (engl. Coping) wie der generellen
Selbstwirksamkeitserwartung (GSE) untersucht. Dazu wurde GSE als Indikator für
Coping-Eigenschaften („C“) als zusätzliche Ebene in einem erweiterten GxExCAnsatz
eingeführt, welche je nach Ausprägung die Vulnerabilität für Angst zusätzlich
mitbedingen oder aber abschwächen kann. Es zeigten sich jeweils erhöhte
Angstwerte in Trägern des 5-HTTLPR/rs25531 LALA Genotyps sowie des NPSR1
rs324981 AA Genotyps, welche traumatische Ereignisse während der Kindheit erlebt
hatten, aber nur bei gleichzeitig vorliegender niedriger Coping-Fähigkeit. Das
Vorliegen von mindestens einem 5-HTT S/LG-Allel beziehungsweise einem NSPR1
T-Allel war hingegen mit einem Anstieg der Angstmaße mit steigender Zahl erlebter
Zusammenfassung
V
Kindheitstraumata assoziiert unabhängig von der Ausprägung von
Bewältigungsmöglichkeiten. Der zweite Teil dieser Arbeit behandelte den jeweiligen
Einfluss von 5-HTT beziehungsweise NPSR1 Varianten bezüglich der
neuroendokrinen, d.h. Speichelkortisol-Stressantwort auf einen akuten
psychosozialen Stressor im Rahmen des Maastricht Acute Stress Tests (MAST). Es
konnte ein direkter Einfluss von NPSR1, aber nicht von 5-HTT, auf die Veränderung
der akuten Stressreaktivität gezeigt werden. Träger des höher aktiven NPSR1 T-Allels
waren gekennzeichnet durch höhere Speichelkortisollevel in Reaktion auf den MAST
im Vergleich zu Trägern des AA Genotyps.
Zusammenfassend konnte in der ersten Studie ein moderierender Einfluss von
GSE in Interaktion mit Kindheitstrauma und 5-HTT beziehungsweise NPSR1 im
Sinne eines erweiterten GxExC-Modells des Angstrisikos gezeigt werden. Dies kann
zum einen zur Entwicklung gezielter präventiver Maßnahmen und zum anderen zur
Verbesserung therapeutischer Interventionen beitragen, durch welche jeweils
Bewältigungsfähigkeiten im Sinne eines protektiven, resilienzfördernden
Mechanismus gestärkt werden. In der zweiten Studie zeigte sich eine veränderte
Funktion der HPA-Achse, welche einen Endophänotyp von stressbezogenen
psychischen Erkrankungen darstellt, in Abhängigkeit von einer NPSR1 Genvariante,
was die neuroendokrine Stressreaktivität als möglichen intermediären
Angstphänotyp im Zusammenhang von NPSR1 Variation und dimensionaler bzw.
kategorialer Angst nahelegt. Ausblickend können die Ergebnisse aus beiden Studien
im Rahmen eines Mehrebenenmodells des Angstrisikos zusammenfließen, welches
neurobiologische, neuroendokrine, umweltbezogene und psychologische Faktoren
integriert, die auf hochkomplexe Art zusammenwirken und somit das Angstrisiko
erhöhen oder herabsetzen können.
KW  - Angst
KW  - Genetik
KW  - Gen-Umwelt Interaktion
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-148600
ER  - 
TY  - THES
A1  - Agnetta, Luca
T1  - Novel Photoswitchable and Dualsteric Ligands Acting on Muscarinic Acetylcholine Receptors for Receptor Function Investigation
T1  - Neue lichtschaltbare und dualstere Liganden für die muskarinischen Acetylcholin Rezeptoren zur Untersuchung der Rezeptorfunktion
N2  - G protein-coupled receptor research looks out for new technologies to elucidate the complex
processes of receptor activation, function and downstream signaling with spatiotemporal
resolution, preferably in living cells and organisms. A thriving approach consists in making use
of the unsurpassed properties of light, including its high precision in space and time, noninvasiveness
and high degree of orthogonality regarding biological processes. This is realized
by the incorporation of molecular photoswitches, which are able to effectively respond to light,
such as azobenzene, into the structure of a ligand of a given receptor. The muscarinic
acetylcholine receptors belong to class A GPCRs and have received special attention in this
regard due to their role as a prototypic pharmacological system and their therapeutic potential.
They mediate the excitatory and inhibitory effects of the neurotransmitter acetylcholine and
thus regulate diverse important biological processes, especially many neurological functions in
our brain.
In this work, the application of photopharmacological tool compounds to muscarinic receptors
is presented, consisting of pharmacophores extended with azobenzene as light-responsive
motif. Making use of the dualsteric concept, such photochromic ligands can be designed to bind
concomitantly to the orthosteric and allosteric binding site of the receptor, which is
demonstrated for BQCAAI (M1) and PAI (M2) and may lead to subtype- and functionalselective
photoswitchable ligands, suitable for further ex vivo and in vivo studies.
Moreover, photoswitchable ligands based on the synthetic agonist iperoxo were investigated
extensively with regard to their photochemical behavior and pharmacological profile, outlining
the advantages and challenges of using red-shifted molecular photoswitches, such as tetraortho-
fluoro azobenzene. For the first time on a GPCR it was examined, which impact the
different substitution pattern has on both the binding and the activity on the M1 receptor. Results
show that substituted azobenzenes in photopharmacological compounds (F4-photoiperoxo and
F4-iper-azo-iper) not just represent analogs with other photophysical properties but can exhibit
a considerably different biological profile that has to be investigated carefully.
The achievements gained in this study can give important new insights into the binding mode
and time course of activation processes, enabling precise spatial and temporal resolution of the
complex signaling pathway of muscarinic receptors. Due to their role as exemplary model
system, these findings may be useful for the investigation into other therapeutically relevant
GPCRs.
N2  - Die Forschung an G-Protein-gekoppelten Rezeptoren verlangt nach neuen Technologien zur
Aufklärung der komplexen Prozesse der Rezeptoraktivierung, -funktion und ihrer
nachgeschalteten Signalwege mit räumlicher und zeitlicher Auflösung, vorzugsweise in
lebenden Zellen und Organismen. Ein erfolgreicher Ansatz besteht darin, die unübertroffenen
Eigenschaften des Lichts zu nutzen, welche die hohe Präzision in Raum und Zeit, die Nicht-
Invasivität und die hohe Orthogonalität in Bezug auf biologische Prozesse einschließt. Dies
wird durch den Einbau von molekularen Photoschaltern, wie z. B. Azobenzolen, in die Struktur
eines Liganden eines bestimmten Rezeptors realisiert, welche effektiv auf Licht reagieren. Die
muskarinischen Acetylcholin Rezeptoren gehören zur Klasse A der GPCRs und haben aufgrund
ihrer Rolle als prototypisches pharmakologisches System und ihres therapeutischen Potenzials
diesbezüglich besondere Beachtung gefunden. Sie vermitteln die stimulierenden und
hemmenden Wirkungen des Neurotransmitters Acetylcholin und regulieren somit verschiedene
wichtige biologische Prozesse, insbesondere viele neurologische Funktionen in unserem
Gehirn.
In dieser Arbeit wird die Anwendung photopharmakologischer „Tool“-Verbindungen auf die
muskarinischen Rezeptoren vorgestellt, die aus Pharmakophoren bestehen, welche mit
Azobenzol als lichtempfindlichem Motiv modifiziert wurden. Mit Hilfe des Konzepts der
Dualsterie können solche photochromen Liganden so gestaltet werden, dass sie gleichzeitig an
die orthosterische und allosterische Bindungsstelle des Rezeptors binden, was für BQCAAI
(M1) und PAI (M2) gezeigt wurde und zu subtypen- und funktionsselektiven photoschaltbaren
Liganden führen kann, die für weitere Ex- und In-Vivo-Studien geeignet sind.
Darüber hinaus wurden photoschaltbare Liganden auf Basis des synthetischen Agonisten
Iperoxo hinsichtlich ihres photochemischen Verhaltens und ihres pharmakologischen Profils
ausführlich untersucht, um die Vorteile und Herausforderungen der Verwendung
rotverschobener molekularer Photoschalter wie tetra-ortho-Fluor-azobenzol zu erläutern. Es
wurde erstmals an einem GPCR untersucht, welche Auswirkungen das unterschiedliche
Substitutionsmuster sowohl auf die Bindung, als auch auf die Aktivität am M1-Rezeptor hat.
Diese Ergebnisse zeigen, dass substituierte Azobenzole in photopharmakologischen
Verbindungen (F4-Photoiperoxo und F4-Iper-azo-iper) nicht nur Analoga mit anderen
photophysikalischen Eigenschaften darstellen, sondern auch ein deutlich unterschiedliches
biologisches Profil aufweisen können, das sorgfältig untersucht werden muss. Die in dieser
Studie erzielten Ergebnisse geben neue und wichtige Einblicke in den Bindungsmodus und den zeitlichen Verlauf von Aktivierungsprozessen und ermöglichen eine präzise räumliche und
zeitliche Auflösung der komplexen Signalwege von muskarinischen Rezeptoren. Aufgrund
ihrer Rolle als exemplarisches Modellsystem können diese Befunde für die Untersuchung
anderer therapeutisch relevanter GPCRs sehr nützlich sein.
KW  - Muscarinrezeptor
KW  - G-Protein gekoppelte Rezeptor
KW  - G Protein-coupled receptor
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-187170
ER  - 
TY  - THES
A1  - Derakhshani, Shaghayegh
T1  - Measles virus infection enhances dendritic cell migration in a 3D environment
T1  - Die Masernvirusinfektion verstärkt die Migration dendritischer Zellen in einer 3D-Umgebung
N2  - The respiratory system is amongst the most important compartments in the human body. Due to its connection to the external environment, it is one of the most common portals of pathogen entry. Airborne pathogens like measles virus (MV) carried in liquid droplets exhaled from the infected individuals via a cough or sneeze enter the body from the upper respiratory tract and travel down to the lower respiratory tract and reach the alveoli. There, pathogens are captured by the resident dendritic cells (DCs) or macrophages and brought to the lymph node where immune responses or, as in case of MV, dissemination via the hematopoietic cell compartment are initiated. Basic mechanisms governing MV exit from the respiratory tract, especially virus transmission from infected immune cells to the epithelial cells have not been fully addressed before. Considering the importance of these factors in the viral spread, a complex close-to-in-vivo 3D human respiratory tract model was generated. This model was established using de-cellularized porcine intestine tissue as a biological scaffold and H358 cells as targets for infection. The scaffold was embedded with fibroblast cells, and later on, an endothelial cell layer seeded at the basolateral side. This provided an environment resembling the respiratory tract where MV infected DCs had to transmigrate through the collagen scaffold and transmit the virus to epithelial cells in a Nectin-4 dependent manner. For viral transmission, the access of infected DCs to the recipient epithelial cells is an essential prerequisite and therefore, this important factor which is reflected by cell migration was analyzed in this 3D system.
The enhanced motility of specifically MV-infected DCs in the 3D models was observed, which occurred independently of factors released from the other cell types in the models. Enhanced motility of infected DCs in 3D collagen matrices suggested infection-induced cytoskeletal remodeling, as also verified by detection of cytoskeletal polarization, uropod formation. This enforced migration was sensitive to ROCK inhibition revealing that MV infection induces an amoeboid migration mode in DCs. In support of this, the formation of podosome structures and filopodia, as well as their activity, were reduced in infected DCs and retained in their uninfected siblings. Differential migration modes of uninfected and infected DCs did not cause differential maturation, which was found to be identical for both populations. As an underlying mechanism driving this enforced migration, the role of sphingosine kinase (SphK) and sphingosine-1-phosphate (S1P) was studied in MV-exposed cultures. It was shown in this thesis that MV-infection increased S1P production, and this was identified as a contributing factor as inhibition sphingosine kinase activity abolished enforced migration of MV-infected DCs. These findings revealed that MV infection induces a fast push-and-squeeze amoeboid mode of migration, which is supported by SphK/S1P axis. However, this push-and-squeeze amoeboid migration mode did not prevent the transendothelial migration of MV-infected DCs.
Altogether, this 3D system has been proven to be a suitable model to study specific parameters of mechanisms involved in infections in an in vivo-like conditions.
N2  - Die respiratorische System ist ein wesentlicher physiologischer Bestandteil. Durch die direkte und konstante Verbindung der Atemwege mit der äußeren Umgebung sind sie einer der häufigsten Pfade für den Eintritt von Krankheitserregern in den Körper. Luftübertragene Krankheitserreger wie das Masern-Virus (MV), das in Flüssigkeitströpfchen mitgeführt und von Patienten durch Husten oder Niesen ausgeatmet wird, können über die oberen Atemwege in den Körper gelangen und sich bis in die unteren Atemwege und bis zu den Alveolen ausbreiten. Dort werden diese Krankheitserreger von den dort residenten dendritischen Zellen (DC) oder Makrophagen erworben und zu sekundären lymphatischen Organen transportiert, in denen sowohl virus-spezifische Immunantworten, aber auch – wie im Falle von MV – die hämatogene Dissemination initiiert wird.  Der Austrittsmechanismus des MV aus den Atemwegen, insbesondere dessen Übertragung von infizierten Immunzellen auf die Epithelzellen und die Faktoren, die diesen Ablauf bestimmen, wurden jedoch bisher unzureichend untersucht. In Anbetracht der Bedeutung dieser Faktoren für die Virusausbreitung wurde ein komplexes, realitätsnahes in-vivo 3D-Modell der menschlichen Atemwege erstellt. Dieses Modell wurde unter Verwendung von de-zellularisiertem Schweinedarmgewebe als biologischem Gerüst und H358 Epithelzellen als Empfänger etabliert. Dieses Grundgerüst wurde mit Fibroblastenzellen eingebettet.  Später wurde auf der basolateralen Seite der Modelle eine Endothelzellschicht eingebracht, um eine Umgebung zu schaffen, die der der Atemwege ähnelt. Somit mussten die Virus-Donoren, MV-infizierte DC durch das Kollagengerüst wandern und das Virus auf Epithelzellen in einer Nektin-4 abhängigen Weise übertragen. Für die Virusübertragung ist der Zugang infizierter DC zu den Empfänger-Epithelzellen eine wesentliche Voraussetzung, weshalb dieser wichtige Faktor, der sich in der Zellmigration widerspiegelt, in diesem 3D-System analysiert wurde.
Eine erhöhte Beweglichkeit spezifisch MV-infizierter DCs wurde in den 3D-Modellen beobachtet. Dies erwies sich als unabhängig von löslichen Faktoren der anderen Zelltypen in den Modellen. Erhöhte Beweglichkeit infizierten DCs wurde auch in 3D-Kollagenmatrizes gesehen, was auf einen infektionsvermittelten zytoskelettalen Umbau hindeutete, der auch anhand von Zytoskelettpolarisation und Uropodbildung bestätigt wurde. Die MV-Infektion induzierte einen schnellen amöboiden Migrationsmodus in den DCs, der sich als sensitiv gegenüber ROCK-Hemmung erwies. Im Gegensatz zu uninfizierten DCs gleichen Reifungsstadiums waren in infizierten DCs  Podosomenstrukturen und Filopodien sowie deren Aktivität stark reduziert. Als potentiell zur verstärkten Motilität infizierter DCs beitragender Faktor wurde die Rolle der Sphingosinkinase (SphK) und des Sphingosin-1-phosphats (S1P) in MV-exponierten Kulturen untersucht. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die S1P-Produktion durch eine MV-Infektion erhöht wurde, und in der Tat zur für infizierte DCs beobachteten erhöhten Geschwindigkeit beitrug, da diese sensitiv gegenüber  Hemmung der Sphingosinkinase-Aktivität war. Diese Ergebnisse zeigen, dass die MV-Infektion einen schnellen amöboid-artigen Migrationsmodus induziert, der von der SphK/S1P-Achse unterstützt wird. Dieser Push-and-Squeeze-Amoeboid-Migrationsmodus verhinderte jedoch nicht die transendotheliale Migration von MV-infizierten DCs.
Insgesamt hat sich dieses 3D-System als geeignetes Modell erwiesen, um die spezifische Parameter von Mechanismen von Infektionen in einem in-vivo-ähnlichen Zustand zu untersuchen.
KW  - Dendritische Zelle
KW  - Zell Migration
KW  - Masern-Virus
KW  - 3D-Modell
KW  - Sphingosine-1-phosphats
KW  - Dendritic cell
KW  - Cell migration
KW  - Measles virus
KW  - 3D tissue model
KW  - Tissue engineering
KW  - Sphingosine-1-phosphate
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-189182
ER  -