TY - THES A1 - Voß, Katrin T1 - Identifizierung und Charakterisierung von Interaktiopnspartnern des humanen CCM3-Proteins T1 - Identification and Characterisation of Interaction Partners of the human CCM3 Protein N2 - Zerebrale kavernöse Malfomationen (CCM) sind vaskuläre Fehlbildungen im Gehirn. Sie sind gekennzeichnet durch stark dilatierte, blutgefüllte Gefäße mit einschichtigem Endothel, denen Merkmale ausgereifter Blutgefäße fehlen. Die klinischen Symptome reichen von Kopfschmerz bis hin zu hämorraghischem Schlaganfall. Eine genaue Vorhersage des Krankheitsverlaufs ist nicht möglich und die neurochirurgische Dissektion ist in der Regel die Therapieform der Wahl. Die genauen molekularen Mechanismen der CCM-Pathogenese sind unbekannt. CCMs treten sporadisch oder familiär gehäuft auf und folgen einem autosomal-dominanten Erbgang. Drei krankheitsverursachende Gene wurden in familiären CCMs identifiziert: CCM1/KRIT1, CCM2/MGC4607 und CCM3/PDCD10. Da Patienten mit einer Mutation in einem der drei CCM-Gene denselben klinischen Phänotyp aufweisen, wurde angenommen, dass die CCM-Proteine (CCM1, CCM2 und CCM3) Bestandteile eines molekularen Signalwegs sind. In dieser Arbeit wurde erstmals gezeigt, dass CCM3 mit CCM2 interagiert und zusammen mit CCM1 einen ternären Proteinkomplex bildet. Untersuchungen mit der humanen in-frame CCM2-Deletionsmutante CCM2:p.P11_K68del belegten, dass CCM2 das zentrale Gerüstprotein des CCM1/CCM2/CCM3-Proteinkomplexes ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass CCM3 an die Serin/Threonin-Kinase STK25 und an die Fas-assoziierte Phosphatase-1 (FAP-1) bindet. STK25 phosphoryliert CCM3 am Serin 39 und am Threonin 43. Die katalytische Domäne von FAP-1 dephosphoryliert CCM3. Untersuchungen mit der einzig bekannten humanen CCM3-Deletionsmutante, der aufgrund einer in-frame Deletion von Exon 5 im CCM3-Gen 18 Aminosäuren (CCM3:p.L33_K50del) fehlen, belegten zudem, dass in vitro dephosphoryliertes CCM3 Bestandteil des ternären CCM-Proteinkomplexes ist. Während STK25 die Deletionsmutante nicht mehr binden und phosphorylieren konnte, war die Interaktion mit CCM2 und die Bildung des ternären CCMKomplexes nicht beeinträchtigt. Somit könnte CCM3 über die Dephosphorylierung durch FAP-1 und die Phosphorylierung durch STK25 funktionell reguliert werden. Es stellte sich zudem heraus, dass CCM3 durch Induktion von oxidativem Stress mittels H2O2-Behandlung in humanen dermalen mikrovaskulären Endothelzellen herunterreguliert wird. Die in dieser Arbeit beschriebene Charakterisierung von CCM3-Interaktionen bringt CCM3 über seine Interaktionspartner erstmals in Zusammenhang mit molekularen Signalwegen, die an Prozessen der Angiogenese und vaskulären Entwicklung beteiligt sind. Die Ergebnisse liefern wichtige Hinweise für die Entschlüsselung der pathogenen Mechanismen zerebraler kavernöser Malformationen und stellen einen ersten Schritt dar, um andere Behandlungsansätze als den bisher angewandten chirurgischen Eingriff, der multiple Risiken birgt, entwickeln zu können. N2 - Cerebral cavernous malformations (CCMs) are vascular lesions in the brain which are characterized by greatly dilated blood-filled vessels without intervening brain parenchyma. The vessels are lined by a monolayer of endothelial cells (EC) and lack characteristics of maturated vessels. The clinical symptoms can vary from headaches to hemorrhagic stroke. The clinical progression is unpredictable and therapeutic interventions are limited to neurosurgical resection. The molecular mechanisms which lead to CCM formation are unknown. CCM lesions occur sporadically or in a familial form following autosomal-dominant inheritance. Three genes have been associated with familial CCMs: CCM1/KRIT1, CCM2/MGC4607 und CCM3/PDCD10. Patients carrying a mutation in one of the three CCM genes are phenotypically indistinguishable. Therefore, it was suggested that the three CCM proteins (CCM1, CCM2, and CCM3) are part of one molecular pathway. In this study, we first show that CCM3 interacts with CCM2 and is part of a ternary CCM1/CCM2/CCM3 complex. Studies with the only known human in-frame deletion of exon 2 of the CCM2 gene, which lacks 58 amino acids (CCM2:p.P11_K68del), revealed that CCM2 is the linker molecule between CCM1 and CCM3 and scaffolds the ternary complex. Additionally, it is shown that CCM3 binds to serine/threonine kinase STK25 and to Fas-associated phosphatase-1 (FAP- 1). STK25 phosphorylates CCM3 at serine 39 and threonine 43. The catalytic domain of FAP-1 dephosphorylates CCM3. With the help of the human mutant CCM3:c.97_150del which carries an in-frame deletion of exon 5 of CCM3 and therefore lacks the 18 amino acids (CCM3:p.L33_K50del), we were able to reveal that dephosphorylated CCM3 is part of the ternary CCM complex in vitro. This mutant lacks the STK25 binding and phosphorylation sites but is still able to form a ternary protein complex with CCM1 and CCM2. Therefore, STK25 and FAP-1 could regulate CCM3 function due to their catalytic activities. Finally, it has been proven that induction of oxidative stress by H2O2 down-regulates CCM3 expression in human dermal microvascular endothelial cells. Combined the results link CCM3 to molecules and regulatory processes, which are part of signalling pathways important for angiogenesis and vascular development. Further characterization of CCM3 interactions and their regulatory mechanisms could help to unmask the molecular pathways underlying CCM formation and offer the possibility for an alternative therapeutic treatment other than surgery, which contains multiple risks for patients. KW - Angiogenese KW - CCM KW - Kavernom KW - CCM1/Krit1 KW - CCM2/Malcavernin KW - CCM3/PDCD10 KW - STK25/SOK-1/YSK-1 KW - FAP-1/PTPN13 KW - vaskuläre Malformation KW - CCM KW - cavernoma KW - CCM1/Krit1 KW - CCM2/Malcavernin KW - CCM3/PDCD10 KW - STK25/SOK-1/YSK-1 KW - FAP-1/PTPN13 KW - angiogenesis KW - vascular malformation Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-28188 ER - TY - THES A1 - Schneider, Magdalena T1 - Synthese, Radiomarkierung und biochemische sowie präklinische Evaluierung neuer Aminopeptidase N- und Fibroblasten-Aktivierungs-Protein alpha- affiner Verbindungen für die molekulare Bildgebung mittels Positronen-Emissions-Tomographie T1 - Synthesis, radiolabeling and biochemical as well as preclinical evaluation of novel Aminopeptidase N- and Fibroblast-activation-protein alpha-affine compounds for molecular imaging using Positron-Emission-tomography N2 - Nach einem Myokardinfarkt setzen Wundheilungsprozesse ein, um die Durchblutung wieder herzustellen und nekrotisches Muskelgewebe durch Narbengewebe zu ersetzen. Die Einsprossung neuer Kapillaren vom bestehenden Gefäßnetz aus wird als Angiogenese bezeichnet. Das dabei vermehrt exprimierte proteolytische Enzym Aminopeptidase N (APN) spielt eine entscheidende Rolle bei der Einsprossung von Endothelzellen. Beim kardialen Remodeling werden abgestorbene Myozyten mithilfe der Einwanderung von Fibroblasten durch Binde- oder Stützgewebe ersetzt, dabei übernimmt das Fibroblasten-Aktivierungs-Protein alpha (FAP) Aufgaben bei der Proliferation und Fortbewegung von Fibroblasten. Durch ihre erhöhte Expression bei den Wundheilungs- und Remodelingprozessen nach einem Herzinfarkt stellen die Metalloprotease APN und die Serinprotease FAP molekulare Targets für die Diagnostik und Therapie dar. Als Diagnosemethode besonders geeignet ist die Positronen-Emissions-Tomographie (PET), die es ermöglicht, biochemische Prozesse in Echtzeit im zu untersuchenden Organismus zu visualisieren und zu quantifizieren. Eine als Radiopharmakon oder Tracer bezeichnete biochemische Sonde kann im Falle eines Enzyms dessen radioaktiv markiertes Substrat oder ein Inhibitor sein. Ziel dieser Arbeit war es, spezifische APN- und FAP-affine Tracer für die nicht-invasive Untersuchung der APN- und FAP-Expression mittels PET zu entwickeln und dadurch die Rolle von APN und FAP bei Remodelingprozessen nach Myokardinfarkt besser verstehen bzw. klären zu können. Um die Protease APN mittels PET zu untersuchen, wurden die für APN affine Verbindung NOTA-NGR (Komplexbildner + cyclisches Peptid inkl. Asparagin-Glycin-Arginin) mit dem Positronen-emittierenden Nuklid Gallium-68 (68Ga) markiert. Das Potential von 68Ga-NOTA-NGR als PET-Tracer wurde in vivo am Infarktmodell mittels Kleintier-PET untersucht und mit 68Ga-NOTA-RGD, einem zur Visualisierung des neo-angiogenetischen alphavbeta3-Integrins etablierten Tracer, verglichen. Untersuchungen ergaben, dass 68Ga-NOTA-NGR einen vielversprechenden neuen PET-Tracer für die Visualisierung und Quantifizierung der APN-Expression im Rahmen der Angiogenese nach einem Myokardinfarkt darstellt. 68Ga-NOTA-NGR zeigte eine erhöhte Aufnahme im Bereich des Myokardinfarkts im Sinne einer vermehrten Angiogenese. Die Aufnahme des Tracers in infarzierten Arealen war quantitativ höher als in der Untersuchung mit 68Ga-NOTA-RGD. In Autoradiographie-Experimenten wurde 68Ga-NOTA-NGR ex vivo untersucht. Die Akkumulation von 68Ga-NOTA-NGR im ischämischen Bereich war deutlich höher als im gesunden Myokard. Der Nachweis der unterschiedlichen Bereiche des Herzens erfolgte mit HE-Färbung. Die Expression von APN wurde immunohistochemisch mittels spezifischer Antikörper bestätigt. Zum Vergleich wurden ebenso einige andere an der Angiogenese beteiligte Faktoren untersucht. APN stellte sich auch hier als geeignetes Target zum Nachweis der Angiogenese heraus. Um die Protease FAP mittels PET zu untersuchen, wurden eine Reihe peptidomimetischer Inhibitoren, die die Erkennungssequenz Glycin-Prolin mit einer Carbonitril-Gruppe als elektrophiler Einheit zur kovalent-reversiblen Hemmung des Enzyms enthalten, entwickelt. Ausgehend vom N-Acetylglycin-pyrrolidin-(2S)-carbonitril als Leitstruktur wurden Inhibitoren und Vorstufen zur Radiomarkierung inkl. verschieden substituierter Benzoesäuren dargestellt. Zusätzlich wurden noch bereits bekannte Inhibitoren synthetisiert, die zum Vergleich in den Enzymassays dienten. Drei Verbindungen zeigten gute inhibitorische Wirkung an FAP und außerdem Selektivität gegenüber DPP IV. Keine der entwickelten Verbindungen zeigte einen KI-Wert im nanomolaren Bereich, erforderlich für einen potentiellen Tracer zur in-vivo-Visualisierung einer Enzymexpression mittels PET. Um die Inhibitoren mit der besten Hemmung an FAP zum PET-Tracer weiterzuentwickeln, mussten sie mit einem Positronenemitter markiert werden. Die Markierung erfolgte über Isotopenaustausch, bei dem nicht-radioaktives Iod am aromatischen Ring des Precursors durch das radioaktive Iod-124 (124I) substituiert wurde. Es konnten dadurch die radioiodierten Verbindungen 1-(2-[124I]Iodhippursäure)-pyrrolidin-(2S)-carbonitril und 1-(4-[124I]Iod-hippursäure)-pyrrolidin-(2S)-carbonitril synthetisiert werden. Trotz der relativ niedrigen Affinität für FAP wurde das neue 1-(2-[124I]Iodhippursäure)-pyrrolidin-(2S)-carbonitril in Ratten am Infarktmodell mittels Kleintier-PET getestet. Die Lage der ischämischen Zone wurde im Anschluss durch HE-Färbung bestimmt. In vivo zeigte sich eine nur sehr geringe Aufnahme des Radiopharmakons in der ischämischen Zone des Myokards. Damit ist 1-(2-[124I]Iod-hippursäure)-pyrrolidin-(2S)-carbonitril kein für den gewünschten Zweck geeigneter PET-Tracer. Nichtsdestotrotz war der Ansatz vielversprechend und es wurde zum ersten Mal ein PET-Tracer dieser Art zur Untersuchung des FAP im Myokardinfarkt hergestellt. N2 - After myocardial infarction, processes of wound healing are initiated in order to regain perfusion and to replace necrotic muscle tissue with soft tissue. The sprouting of new capillaries from the vasculature is called angiogenesis. During Angiogenesis, Aminopeptidase N (APN) plays an important role in the sprouting of endothelial cells. Cardiac remodeling is the process of replacement of necrotic myocytes with soft tissue through invasion of fibroblasts. For this cause, also a lot of proteases are activated. During the process of cardiac remodeling, fibroblast activation protein alpha (FAP) is involved in proliferation and migration of cardiac fibroblasts. Due to their increased expression during remodeling processes after myocardial infarction, the metalloprotease APN and the serine protease FAP have been identified as potential molecular targets for diagnosis and therapy. Diagnosis of the heart by nuclear imaging techniques is a well established method in clinical cardiology. Most of all positron emission tomopgraphy (PET) provides information on biochemical processes in vivo using specific radiotracers in real time. This imaging probe is labeled with a positron emitting radionuclide and is called radiopharmaceutical or tracer. In case of an enzyme, the tracer might for example be a labeled substrate or inhibitor of the enzyme. To visualize the protease APN with PET, NOTA-NGR (chelating agent + peptide sequence incl. asparagine-glycine-arginine), a compound that shows high affinity for APN, was labeled with the positron emitting nuclide Gallium-68 (68Ga). 68Ga-NOTA-NGR was developed including an improved synthesis, isolation and formulation of the tracer. Its potential as a PET-tracer was assessed in vivo using micro-PET and compared to the established tracer 68Ga-NOTA-RGD, used to visualize the integrin alphavbeta3 in angiogenesis. Studies in rats with ischemia/reperfusion showed high uptake of the new radiopharmaceutical 68Ga-NOTA-NGR in myocardial infarction area being used in diagnostic PET imaging of APN. The new tracer shows even a slightly higher uptake in angiogenetic areas compared with results obtained with 68Ga-NOTA-RGD. 68Ga-NOTA-NGR was also examined ex vivo using autoradiography, confirming the significant higher accumulation of the tracer in the ischemic area compared with the healthy myocardium. The different areas of the tissue were displayed by HE staining. For the purpose of immunohistochemistry, the expression of the enzyme APN was verified using antibody staining. Additionally several other factors that are involved in angiogenesis were stained. Through antibody staining APN was shown to be a suitable target for the evidence of angiogenesis. With 68Ga-NOTA-NGR, the development of a new PET-tracer for diagnosis of the expression of APN during angiogenesis after myocardial infarction was successful. In order to develop an imaging probe suitable for investigation of the protease FAP using PET, several peptidomimetic inhibitors containing the dipeptide motif glycine-proline and the electrophilic moiety carbonitrile were designed. With N-Acetylglycine-pyrrolidine-(2S)-carbonitrile being the basic structure, modifications were introduced through a benzoylic residue at the N-terminus. In addition, some well-known inhibitors were synthesized for comparison to the new ones in enzymatic assay. To evaluate their inhibitory effect, the new inhibitors were tested in enzymatic assays using FAP and dipeptidyl peptidase IV, a prolyl peptidase from the same family in order to compare the results with regard to selectivity. None of the new compounds showed a KI-value in the nanomolar range, required for visualization of an enzyme expression using PET. In order to investigate a PET-Tracer, the best inhibitors against FAP had to be labeled with a positron emitter. The radioactive analogues of the inhibitors were obtained using isotopic exchange of the natural iodine-nuclide by iodine-124 (124I), resulting in 1-(2-[124I]Iodohippuric acid)-pyrrolidine-(2S)-carbonitrile und 1-(4-[124I]Iodohippuric acid)-pyrrolidine-(2S)-carbonitrile. 1-(2-[124I]Iodohippuric acid)-pyrrolidine-(2S)-carbonitrile was tested in vivo using microPET in rats with myocardial infarction. Very low uptake of the radiopharmaceutical was observed in the ischemic area of the rat´s heart. Locations of ischemic and surviving parts of the myocardium were confirmed using HE staining. To our knowledge, 1-(2-[124I]Iodohippuric acid)-pyrrolidine-(2S)-carbonitrile is the first FAP-affine tracer developed for PET investigation. However, its potential as tracer for the FAP-expression within the myocardial infarction in vivo using PET could not be proven in the present study. Therefore, developments based on the structure of 1-(2-[124I]Iodohippuric acid)-pyrrolidine-(2S)-carbonitrile are going on, with view to identify a PET-tracer suitable for in-vivo-investigation of FAP in healing processes and remodeling after myocardial infarction using PET. KW - Positronen-Emissions-Tomographie KW - Alanyl-Aminopeptidase KW - Angiogenese KW - Fibroblasten-Aktivierungs-Protein Alpha KW - positron-emission-tomography KW - aminopeptidase N KW - remodeling KW - angiogenesis Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-102562 ER - TY - THES A1 - Schleider, Elisa T1 - Angiogenese-Modellsysteme zur Funktionsanalyse des humanen CCM3 Proteins T1 - Angiogenesis in vitro modeling of human CCM3 function N2 - Zerebrovaskuläre kavernöse Malformationen (CCM) sind Blutgefäßfehlbildungen, welche hauptsächlich im Gehirn vorkommen. Sie sind gekennzeichnet durch stark dilatierte kapillarähnliche Gefäße mit niedriger Flussrate („slow-flow lesions“). Intervenierendes Gehirnparenchym fehlt ebenso wie Perizyten oder glatte Gefäßmuskelzellen. Die klinischen Symptome reichen von starken Kopfschmerzen über Epilepsie bis hin zum Schlaganfall. Dennoch bleiben viele Kavernomträger aufgrund unvollständiger Penetranz ihr Leben lang asymptomatisch. Die Prävalenz beträgt ca. 0,5% in der Gesamtbevölkerung. Es gibt sowohl sporadische als auch dominant vererbte Krankheitsformen. In den letzten Jahren konnten 3 Gene ursächlich mit der Krankheit in Verbindung gebracht werden. Mutationen in CCM1, CCM2 oder CCM3 führen zu einem nicht unterscheidbaren klinischen Phänotyp. Alle drei Proteine bilden einen ternären Komplex in vitro, was eine Beteiligung an einem gemeinsamen molekularen Signalweg bekräftigt. Während die Proteine CCM1 und CCM2 in den letzten Jahren umfangreich erforscht wurden, ist über das CCM3-Protein bis heute wenig bekannt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass CCM3 eine wichtige Rolle in der Angiogenese spielt und diese bei Überexpression in humanen Endothelzellen stark negativ reguliert: die Migration, die Proliferation und die Fähigkeit, kapillarähnliche Strukturen in Matrix-Gelen zu bilden kommt nahezu zum Erliegen. Ein gegenläufiger Effekt nach siRNA induziertem Knock-down von CCM3 war weniger stark ausgeprägt. Einzig die Fähigkeit, gefäßähnliche Strukturen in Matrigelen zu bilden, war erhöht. Um weiterhin Klarheit über die intrazellulären, von CCM3 beeinflussten Signalwege zu schaffen, wurden Tyrosin Kinase Arrays durchgeführt, bei welchen CCM3-überexprimierende HUVEC Lysate mit Kontrolllysaten verglichen wurden. Dabei stellte sich heraus, dass 5 Substrate signifikant erhöht phosphoryliert wurden: der Discoidin Domänen Rezeptor 1 (discoidin domain receptor; DDR1), die duale spezifitätstyrosinphosphorylierungsregulierte Kinase 1A (dual specificity tyrosine-phosphorylation-regulated kinase 1A; DYR1A), die Protoonkogen Tyrosin- Protein Kinase FER (proto-oncogene tyrosine-protein kinase FER; FER), die fynbezogene Kinase (Fyn-related kinase; FRK) und die phosphoinositolabhängige Kinase 1 (Phosphoinositide-dependent kinase 1, PDPK-1). Im Folgenden bestätigten Western Blot, dass die Überexpression von CCM3 in Endothelzellen die phosphoinositolabhängige Kinase 1 und die nachgeschaltete Serin-Threonin Kinase Akt/PBK aktiviert, welche ein bedeutsames Überlebenssignal der Zelle darstellt. Schließlich konnte gezeigt werden, dass CCM3 nicht nur antiangiogen, sondern auch antiapoptotisch wirkt. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit legen nahe, dass CCM3 für die Integrität des ruhenden, adulten Endothelbettes wichtig ist. N2 - Cerebral cavernous malformations are slow-flow vascular lesions, mainly located in the brain. They consist of blood-filled dilated capillary-like vessels without brain parenchyma or mural cells. Clinical symptoms include intense headaches, epilepsy and stroke. However, about 40% of lesion carriers live without any symptoms throughout their lives due to incomplete penetrance. The disease prevalence is 0.5% in the population. Sporadic as well as autosomal-dominantly inherited familial forms exist. In recent years, 3 disease-related genes have been identified. Mutations within CCM1, CCM2 or CCM3 lead to indistinguishable clinical phenotypes. All three proteins form a ternary complex in vitro, confirming their participation in one main signaling pathway. While CCM1 and CCM2 have been explored to a great extent over the past years, little is known about CCM3 and its function so far. In this study, we show that CCM3 plays an important role in angiogenesis. Upon overexpression it has strong negative effects in endothelial cells. The ability to migrate, proliferate and to form capillary-like structures in matrix gels is significantly impaired. Knockdown experiments with siRNA against CCM3 did not reveal such distinct effects. Only the ability to form capillary-like structures was elevated. To identify signaling pathways modulated by CCM3, tyrosine kinase arrays were conducted. Lysates from HUVECs overexpressing CCM3 were compared with control lysates. Five substrates revealed significantly increased phosphorylation: the discoidin domain receptor 1 (DDR1), the dual specificity tyrosine-phosphorylation-regulated kinase 1A (DYR1A), the proto-oncogene tyrosine-protein kinase FER (FER), the fyn-related kinase (FRK) and the Phosphoinositidedependent kinase 1 (PDPK-1). The candidate 3-Phosphoinositide-dependent protein kinase- 1 is an important upstream activator of the serine-threonine kinase Akt/PKB. Subsequent experiments confirmed and demonstrated that p-PDPK-1 and p-Akt are activated in lysates overexpressing CCM3. In agreement with the fact that Akt is important for cell survival, we could finally show that CCM3 is both antiangiogenic and antiapoptotic. Our data suggest that CCM3 plays a role in maintaining quiescence of adult vascular endothelial cells. KW - Blutgefäß KW - Missbildung KW - Gehirn KW - Genanalyse KW - Endothelzelle KW - Angiogenese KW - CCM3 KW - Endothelzellen KW - CCM3 KW - endothelial cells KW - angiogenesis Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51504 N1 - Includes articles: - Stahl, S., Gaetzner, S., Voss, K., Brackertz, B., Schleider, E., Sürücü, O., Kunze, E., Netzer, C., Korenke, C., Finckh, U., Habek, M., Poljakovic, Z., Elbracht, M., Rudnik-Schöneborn, S., Bertalanffy, H., Sure, U., Felbor, U. (2007) Novel CCM1, CCM2, and CCM3 mutations in patients with cerebral cavernous malformations: in-frame deletion in CCM2 prevents formation of a CCM1/CCM2/CCM3 protein complex. Hum Mutat, 29, 709-717. - Voss, K., Stahl, S., Reinders, J., Hogan, B.M., Schleider, E., Schulte-Merker, S., Felbor, U. (2009) Functional analysis of human and zebrafish 18 amino acid in-frame deletion pave the way for domain mapping of the cerebral cavernous malformation 3 (CCM3) protein. Hum Mutat, 30, 1003-1011. - Schleider, E., Stahl, S., Wüstehube, J., Walter, U., Fischer, A., Felbor, U. (2010) Evidence for anti-angiogenic and pro-survival functions of the cerebral cavernous malformation protein 3. Neurogenetics, submitted ER - TY - THES A1 - Scheller, Katharina T1 - Charakterisierung und Anwendung von humanen, primären mikrovaskulären Endothelzellen mit erweiterter Proliferationsfähigkeit T1 - Characterization and application of human primary microvascular endothelial cells with extended proliferation capacity N2 - Das Arbeitsgebiet Tissue Engineering befasst sich mit der Klärung der Mechanismen, die der Funktionen verschiedener Gewebearten zu Grunde liegen sowie mit der Entwicklung alternativer Strategien zur Behandlung von Organversagen bzw. Organverlusten. Einer der kritischsten Punkte im Tissue Engineering ist die ausreichende Versorgung der Zellen mit Nährstoffen und Sauerstoff. Bioartifizielle Gewebe mit einer Dicke von bis zu 200 µm können mittels Diffusion ausreichend versorgt werden. Für dickere Transplantate ist die Versorgung der Zellen alleine durch Diffusion jedoch nicht gegeben. Hierfür müssen Mechanismen und Strategien zur Prävaskularisierung der artifiziellen Gewebekonstrukte entwickelt werden, damit die Nährstoff- und Sauerstoffversorgung aller Zellen, auch im Inneren des Transplantates, von Anfang an gewährleistet ist. Eine wichtige Rolle bei der Prävaskularisierung spielt die Angiogenese. Dabei ist die Wahl einer geeigneten Zellquelle entscheidend, da die Zellen die Basis für die Angiogenese darstellen. Mikrovaskuläre Endothelzellen (mvEZ) sind maßgeblich an der Angiogenese beteiligt. Das Problem bei der Verwendung von humanen primären mvEZ ist ihre geringe Verfügbarkeit, ihre limitierte Proliferationskapazität und der schnelle Verlust ihrer typischen Endothelzellmarker in-vitro. Der Aufbau standardisierter in-vitro Testsysteme ist durch die geringe Zellausbeute auch nicht möglich. Die upcyte® Technologie bietet hierfür einen Lösungsansatz. In der vorliegenden Arbeit konnten upcyte® mvEZ als Alternative zu primären mvEZ generiert werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Zellen eine erweiterte Proliferationsfähigkeit aufweisen und im Vergleich zu primären mvEZ durchschnittlich 15 zusätzliche Populationsverdopplungen leisten können. Dadurch ist es möglich 3x104-fach mehr upcyte® mvEZ eines Spenders zu generieren verglichen mit den korrespondierenden Primärzellen. Die gute und ausreichende Verfügbarkeit der Zellen macht sie interessant für die Standardisierung von in-vitro Testsystemen, ebenso können die Zellen zur Prävaskularisierung von Transplantaten eingesetzt werden. Upcyte® mvEZ zeigen zahlreiche Primärzellmerkmale, die in der Literatur beschrieben sind. Im konfluenten Zustand zeigen sie die für primäre mvEZ spezifische pflastersteinartige Morphologie. Darüber hinaus exprimieren upcyte® mvEZ typische Endothelzellmarker wie CD31, vWF, eNOS, CD105, CD146 und VEGFR-2 vergleichbar zu primären mvEZ. Eine weitere endothelzellspezifische Eigenschaft ist die Bindung von Ulex europaeus agglutinin I Lektin an die alpha-L-Fucose enthaltene Kohlenhydratstrukturen von mvEZs. Auch hier wurden upcyte® Zellen mit primären mvEZ verglichen und zeigten die hierfür charkteristischen Strukturen. Zusätzlich zu Morphologie, Proliferationskapazität und endothelzellspezifischen Markern, zeigen upcyte® mvEZ auch mehrere funktionelle Eigenschaften, welche in primären mvEZ beobachtet werden können, wie beispielsweise die Aufnahme von Dil-markiertem acetyliertem Low Density Lipoprotein (Dil-Ac-LDL) oder die Fähigkeit den Prozess der Angiognese zu unterstützen. Zusätzlich bilden Sphäroide aus upcyte® mvEZ dreidimensionale luminäre Zellformationen in einer Kollagenmatrix aus. Diese Charakteristika zeigen den quasi-primären Phänotyp der upcyte® mvEZs. Upcyte® mvEZ stellen darüber hinaus eine neuartige mögliche Zellquelle für die Generierung prävaskularisierter Trägermaterialien im Tissue Engineering dar. In der vorliegenden Arbeit konnte die Wiederbesiedlung der biologisch vaskularisierte Matrix (BioVaSc) mit upcyte® mvEZ vergleichbar zu primären mvEZ gezeigt werden. Der Einsatz von upcyte® mvEZ in der BioVaSc stellt einen neuen, vielversprechenden Ansatz zur Herstellung eines vaskularisierten Modells für Gewebekonstrukte dar, wie beispielsweise einem Leberkonstrukt. Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass upcyte® mvEZ vergleichbar zu primären mvEZs sind und somit eine geeignete Alternative für die Generierung prävaskulierter Trägermaterialien und Aufbau von in-vitro Testsystemen darstellen. Darüber hinaus wurde ein neues, innovatives System für die Generierung einer perfundierten, mit Endothelzellen wiederbesiedelten Matrix für künstliches Gewebe in-vitro entwickelt. N2 - The scope of tissue engineering includes researching mechanisms underlying the function of different types of tissue, as well as the development of alternative strategies for the treatment of organ failure or organ loss. One of the critical aspects of tissue engineering is the adequate supply of cells with nutrition and oxygen. Bioartificial tissue up to a thickness of 200µm can be supplied sufficiently via diffusion. For thicker transplants, the supply of cells, only via diffusion is not sufficient. For this purpose, mechanisms and strategies for pre-vascularization of artificial tissue constructs need to be developed in order to ensure the supply of nutrition and oxygen to the inside of a transplant from the beginning. An important part of pre-vascularization is angiogenesis. Thereby, the selection of a suitable cell source is crucial, as these cells form the basis of angiogenesis. Microvascular endothelial cells (mvEC) are an important part of angiogenesis. Using human primary mvEC is critical due to the quick loss of their endothelial cell marker in-vitro but their limited availability and capacity of proliferation presents a problem. Additionally, the number of cells is also not sufficient for setup a standardized in-vitro test system. Upcyte® technology provides an approach to solving this problem. This work focused on the generation of upcyte® mvEC as alternative to primary mvEC. It was shown that cells treated with upcyte® technology have an enhanced capability of proliferation, resulting in 15 additional population doublings, compared to primary mvEC. Thus, it is possible to generate 3x104-fold more upcyte® mvEC from one donor compared to corresponding primary cells. The sufficient cell availability is important for the standardization of in-vitro test systems, as well as the usage for pre-vascularization of transplants. Upcyte® mvEC show many primary cell-like characteristics, which are described in literature. In the confluent state, upcyte® mvEC show a primary cell-specific cobblestone-like morphology. Furthermore, upcyte® mvEC express typical endothelial cell markers, such as CD31, vWF, eNOS, CD105, CD146 and VEGFR-2, at a similar level to primary mvEZ. An additional endothelial cell-specific attribute is the linkage of Ulex europaeus agglutinin I lectin to carbohydrate-structures of mvEC, which contain alpha-L-fucose. These data showed that there was a good comparison between the characteristics of upcyte® and primary mvEC. In addition to morphology, proliferation capacity and endothelial cell-specific markers, upcyte® mvEC showed functional characteristics, which are also observed in primary mvEC. Examples include the uptake of Dil-marked acetylated low density lipoprotein (Dil-Ac-LDL) and the ability to support the process of angiogenesis. In addition, spheroids formed from upcyte® mvEC formed three dimensional luminal cell formations in a collagen matrix. These characteristics show the quasi-phenotype of upcyte® mvEC. Upcyte® mvEC also represents a new promising cell source for the generation of pre-vascularized scaffolds in the tissue engineering context. The use of upcyte® mvEC in BioVaSc represents a promising new approach for producing a model for vascularized tissue constructs, such as a liver constructs. In summary, this work focussed on the development of upcyte® mvEC which were shown to be comparable to primary mvEC and therefore represent a sufficient and reliable alternative cell source for the generation of pre-vascularized scaffolds and the construction of in-vitro test systems. Moreover, a new and innovative system for the generation of a perfusable, endothelialized matrix for artificial tissue in-vitro has been developed. KW - Tissue Engineering KW - Angiogenese KW - Endothelzellen KW - Tissue Engineering KW - Angiogenese KW - Endothelial cells KW - tissue engineering KW - angiogenesis Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-76577 ER - TY - THES A1 - Partzsch, Bernhard T1 - Identifizierung und Isolierung von Angiostatin aus dem Urin bei Patienten mit Prostatakarzinom T1 - Identification and isolation of angiostatin in the urine of patients with prostate cancer N2 - Die Angiogenese beschreibt einen entscheidenden Schritt für Tumorwachstum und Metastasierung. Die Tendenz, neue Blutgefäße zu bilden, wird durch das Gleichgewicht angiogener und nicht-angiogener Faktoren bestimmt. In einer Reihe eleganter tierexperimenteller Versuche gelang es O`Reilly erstmals einen tumorassoziierten Inhibitor der Angiogenese, den er Angiostatin nannte, nachzuweisen und zu isolieren. Uns gelang es, im Western-Blot Angiostatin und Angiostatin-Spaltprodukte sowohl aus dem Urin von PCa-Patienten als auch aus dem Urin gesunder Probanden nachzuweisen und zu isolieren. Die anti-angiogene Wirksamkeit des von uns isolierten Proteins wurde im Endothelzellkultur-Assay bestätigt. Eine Differenzierung gesunder Personen von PCa-Patienten war aufgrund der kleinen Fallzahlen nicht möglich. Der Nachweis von Angiostatin bei Gesunden belegt aber, dass anti-angiogene Proteine unabhängig vom Vorhandensein maligner Tumore im Urin ausgeschieden werden. Es bleibt zu vermuten, dass Angiogenese-Inhibitoren ähnlich den Gerinnungsfaktoren bei Bedarf aktiviert und inaktiviert werden können. Der Angiogenese zugrunde liegende Mechanismen und beteiligte Faktoren sind Bestandteil intensiver Forschung. Unklar ist, ob Angiogenese-Inhibitoren in Zukunft in der Krebstherapie die Rolle spielen werden, die man ihnen bei ihrer Entdeckung zuschrieb. N2 - Angiogenesis is an essential component for tumor growth and metastasis. The formation of new blood vessels is controlled by the balance of angiogenic and angiogenesis-inhibiting factors. In several animal experiments O`Reilly was able to isolate a tumorassociated inhibitor of angiogenesis, which was named angiostatin. We ware able to detect angiostatin and angiostatin fragments in the Western blot analysis as well in the urine of patients with prostate cancer as in the urine of healthy persons. The anti-angiogenic function of the isolated protein was confirmed in an endothelial proliferation assay.Because of the small number of cases it was not possible to differentiate between healthy people and patients with prostate cancer. The detection of angiostatin in the urine of healthy persons shows, that antiangiogenic proteins are excreted with the urine even if there is no tumor. It might be possible, that inhibitors of angiogenesis – similar to the factors of the coagulation system – could be activated and inactivated if required. The mechanism of angiogenesis and the included factors are part of an intensive research. It is not clear yet, whether inhibitors of angiogenesis would be that important for therapy of tumors, that they were guessed to be when they were discovered. KW - Angiogenese KW - Angiostatin KW - Prostatakarzinom KW - Urin KW - angiogenesis KW - angiostatin KW - prostate cancer KW - urine Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17814 ER -