TY - THES A1 - Meir [geb. Rother], Juliane T1 - Influence of oncolytic vaccinia viruses on metastases of human and murine tumors T1 - Einfluss von onkolytischen Vaccinia Viren auf Metastasen von humanen und murinen Tumoren N2 - Cancer is one of the leading causes of death. 90% of all deaths are caused by the effects of metastases. It is of major importance to successfully treat the primary tumor and metastases. Tumors and metastases often differ in their properties and therefore, treatment is not always successful. In contrast, those therapeutic agents can even promote formation and growth of metastases. Hence, it is indispensable to find treatment options for metastatic disease. One promising candidate represents the oncolytic virus therapy with vaccinia viruses. The aim of this work was to analyze two cell lines regarding their metastatic abilities and to investigate whether oncolytic vaccinia viruses are useful therapy options. The cell lines used were the human cervical cancer cell line C33A implanted into immune-compromised mice and the murine melanoma cell line B16F10, implanted into immune-competent mice. The initial point of the investigations was the observation of enlarged lumbar und renal lymph nodes in C33A tumor-bearing mice 35 days post implantation of C33A cells subcutaneously into immune-compromised nude mice. Subsequently, the presence of human cells in enlarged lymph nodes was demonstrated by RT-PCR. To facilitate the monitoring of cancer cell spreading, the gene encoding for RFP was inserted into the genome of C33A cells. In cell culture experiments, it was possible to demonstrate that this insertion did not negatively affect the susceptibility of the cells to virus infection, replication and virus-mediated cell lysis. The analysis of the metastatic process in a xenografted mouse model revealed the continuous progression of lumbar (LN) and renal (RN) lymph node metastasis after C33A-RFP tumor cell implantation. The lymph node volume and the amount of RFP-positive LNs and RNs was increasing from week to week in accordance with the gain of the primary tumor volume. Moreover, the metastatic spread of cancer cells in lymph vessels between lumbar and renal lymph nodes was visualized. Additionally, the haematogenous way of cancer cell migration was demonstrated by RFP positive cancer cells in blood vessels. The haematogenous route of spreading was confirmed by detecting micrometastases in lungs of tumor bearing mice. The next step was to investigate whether the recombinant oncolytic vaccinia virus GLV-1h68 is a suitable candidate to cure the primary tumor and metastases. Therefore, GLV-1h68 was systemically injected into C33A-RFP tumor bearing mice 21 days after tumor cell implantation. It was demonstrated that the volume of the primary tumor was drastically reduced, and the volume and the amount of RFP positive lumbar and renal lymph nodes were significantly decreasing compared to the untreated control group. Subsequently, this process was analyzed further by investigating the colonization pattern in the C33A-RFP model. It was shown that first the primary tumor was colonized with highest detectable virus levels, followed by LN and RN lymph nodes. Histological analyses revealed the proliferative status of tumor cells in the tumor and lymph nodes, the amount of different immune cell populations and the vascular permeability in primary tumors and lymph nodes having an influence on the colonization pattern of the virus. Whereby, the vascular permeability seems to have a crucial impact on the preferential colonization of tumors compared to lymph node metastases in this tumor model. C33A turned out to be a useful model to study the formation and therapy of metastases. However, a metastatic model in which the influence of the immune system on tumors and especially on tumor therapy can be analyzed would be preferable. Therefore, the aim of the second part was to establish a syngeneic metastatic mouse model. Accordingly, the murine melanoma cell line B16F10 was analyzed in immunocompetent mice. First, the highly attenuated GLV 1h68 virus was compared to its parental strain LIVP 1.1.1 concerning infection, replication and cell lysis efficacy in cell culture. LIVP 1.1.1 was more efficient than GLV-1h68 and was subsequently used for following mouse studies. Comparative studies were performed, comparing two different implantation sites of the tumor cells, subcutaneously and footpad, and two different mouse strains, FoxN1 nude and C57BL/6 mice. Implantation into the footpad led to a higher metastatic burden in lymph nodes compared to the subcutaneous implantation site. Finally, the model of choice was the implantation of B16F10 into the footpad of immune-competent C57BL/6 mice. Furthermore, it was inevitable to deliver the virus as efficient as possible to the tumor and metastases. Comparison of two different injection routes, intravenously and intratumorally, revealed, that the optimal injection route was intratumorally. In summary, the murine B16F10 model is a promising model to study the effects of the immune system on vaccinia virus mediated therapy of primary tumors and metastases. N2 - Weltweit ist Krebs eine der häufigsten Todesursachen des Menschen. Allerdings wird angenommen, dass ca. 90 % dieser Todesfälle nicht auf den Primärtumor zurückzuführen sind, sondern durch den direkten und indirekten Einfluss von Metastasen verursacht werden. Deshalb ist es wichtig, eine Therapieform zu wählen, die sowohl den Primärtumor als auch Metastasen bekämpft. Bei den derzeit eingesetzten Behandlungsmethoden für Metastasen handelt es sich weitestgehend um die gleichen Therapieformen die auch zur Bekämpfung des Primärtumors eingesetzt werden. Allerdings unterscheiden sich Primärtumor und Metastasen häufig in ihren Eigenschaften, weshalb die Therapie oft keinen Erfolg bei Metastasen zeigt und im schlimmsten Fall sogar deren Neubildung und Wachstum fördern kann. Deswegen ist es von immenser Bedeutung, neue Therapieformen zu entwickeln, die speziell auch auf die Wirksamkeit gegen Metastasen zugeschnitten sind. Eine vielversprechende Möglichkeit hierfür stellt die onkolytische Virustherapie dar. Das Hauptziel dieser Arbeit war es, zwei verschiedene Tumorzelllinien hinsichtlich ihrer metastatischen Fähigkeiten zu untersuchen und anschließend zu überprüfen, ob onkolytische Vaccinia Viren zur Therapie dieser Metastasen beitragen können. Bei den hierfür untersuchten Zelllinien handelte es sich um die menschliche Zervixkarzinomzelllinie C33A, implantiert in immunsupprimierte Mäuse und um die murine Melanomzelllinie B16F10, implantiert in immunkompetente Mäuse. Ausgangspunkt der Untersuchungen im ersten Teil der Arbeit, bildete die Beobachtung, dass nach der subkutanen Implantation von C33A-Zellen in die abdominale Flanke von immunsupprimierten Nacktmäusen die lumbalen und renalen Lymphknoten der tumortragenden Mäuse vergrößert waren. Die Untersuchung dieser vergrößerten Lymphknoten mittels RT-PCR, unter zu Hilfenahme von spezifischen Primern für humanes β-Aktin, wies tatsächlich humane Zellen in allen lumbalen und der Hälfte der renalen Lymphknoten nach. Darum sollte im nächsten Schritt das metastatische Verhalten dieser Zellen genauer untersucht werden. Hierfür wurde mittels lentiviraler Transduktion, das für das rotfluoreszierende Protein kodierende Gen in C33A-Zellen integriert. In Zellkulturexperimenten konnte nachgewiesen werden, dass die Insertion sich nicht negativ auf die Infektion, Replikation und Zelllyse der Viren auswirkte. Anschließende Mausexperimente zeigten den Verlauf der Metastasierung der lumbalen und renalen Lymphknoten. Sowohl das Volumen als auch die Anzahl an RFP positiven Lymphknoten nahm nach Implantation von Woche zu Woche zu und korrelierte mit der Zunahme des Primärtumorvolumens. Darüber hinaus konnte die Migration der Tumorzellen in Lymphgefäßen zwischen dem lumbalen und renalem Lymphknotenpaar mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden. Zusätzlich konnte die Metastasierung über die Blutbahn nachgewiesen werden, da sich RFP positive Zellen in dem Blutgefäß neben dem Lymphgefäß, das die lumbalen und renalen Lymphknoten miteinander verbindet, befanden. Die hämatogene Verbreitung wurde auch dadurch bestätigt, dass in den Lungen der tumortragenden Mäuse Mikrometastasen detektiert werden konnten. Im nächsten Schritt wurde untersucht, ob das rekombinante Vaccinia Virus GLV-1h68 in der Lage ist, nicht nur den primären Tumor zu bekämpfen, sondern auch Metastasen. Dafür wurde tumortragenden Mäusen systemisch eine einzelne Dosis GLV-1h68 21 Tage nach Tumorzellimplantation injiziert. Daraufhin reduzierte sich nicht nur das Volumen des Primärtumors innerhalb von weiteren 21 Tagen auf die Ausgangsgröße, sondern auch das Volumen und die Anzahl der RFP positiven lumbalen und renalen Lymphknoten nahm ab, im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Die Analyse der Kolonisierungsdynamik von Primärtumor und Metastasen durch GLV 1h68 zeigte, dass zuerst der Primärtumor kolonisiert wurde, gefolgt von LN und RN. Des Weiteren war der virale Titer in Tumoren zu jedem Zeitpunkt höher als in den metastasierten Lymphknoten. Histologische Untersuchungen des tumorösen Gewebes zeigten, dass der proliferative Status der Tumorzellen, die Menge verschiedener Immunzellpopulationen und die vaskuläre Permeabilität einen Einfluss auf die Kolonisierung durch GLV-1h68 haben. Dabei wird angenommen, dass vor allem die vaskuläre Permeabilität den größten Einfluss auf die Kolonisierungsreihenfolge hat. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass C33A ein hilfreiches Model ist, um die Bildung von Metastasen sowie die onkolytische Virustherapie dieser in einem immunsupprimierten Model zu untersuchen. Aus klinischer Sicht allerdings wäre es wünschenswert, ein Model zu haben, in dem auch der Einfluss des Immunsystems auf die Tumortherapie untersucht werden kann. Deswegen war das Ziel im zweiten Teil der Arbeit die murine Melanomazelllinie B16F10 im immunkompetenten Mausmodell als metastatisches System zu etablieren. Als erstes wurde in Zellkulturexperimenten überprüft, wie geeignet GLV-1h68 ist, um die murinen Zellen zu infizieren, in ihnen zu replizieren und sie anschließend zu lysieren und mit dem parentalen Virus LIVP 1.1.1 verglichen. Dabei stellte sich heraus, dass LIVP 1.1.1 effizienter und geeigneter ist als GLV-1h68. Deswegen wurde in weiteren Versuchen das parentale Virus LIVP 1.1.1 verwendet. Bevor diese Experimente durchgeführt wurden, wurden Studien durchgeführt, bei denen 2 verschiedene Implantationsstellen, subkutan und in die Fußsohle, und 2 verschiedene Mausstämme, FoxN1 nude und C57BL/6, verglichen wurden. Dabei stellte sich heraus, dass nach Implantation in die Fußsohle mehr Lymphknotenmetastasen entstanden als nach subkutaner Implantation. Im weiteren Verlauf wurde die Implantation von B16F10 Zellen in die Fußsohle von C57BL/6 Mäusen bevorzugt, um eine verlässliches Metastasenmodel zu generieren. Im Folgenden wurden zwei verschiedene Injektionswege untersucht, intravenös und intratumoral, wobei sich die intratumoral Injektion als geeigneter erwies, um effizient so viel Virus wie möglich in Tumore und Metastasen zu bringen. Generell handelt es sich hierbei um ein geeignetes Model, um die Wirkungen des Immunsystems auf Vaccinia Virus vermittelte Therapie von Primärtumor und Lymphknotenmetastasen zu untersuchen. KW - Krebs KW - Metastase KW - Vaccinia-Virus KW - onkolytische Virustherapie KW - oncolytic virus therapy Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-118530 ER - TY - THES A1 - Junker, Markus T1 - Development and characterization of monoclonal antibodies to GDF-15 for potential use in cancer therapy T1 - Die Entwicklung und Charakterisierung monoklonaler Antikörper gegen GDF-15 zur potenziellen Anwendung in der Krebstherapie N2 - Background GDF-15 is a divergent member of the TGF-superfamily, which was first described as macrophage inhibitory cytokine-1 (MIC-1), revealing an immune modulatory function. GDF-15 is a soluble protein which is, under physiological conditions, highly expressed in the placenta and found in elevated levels in blood sera of pregnant women. Apart from the placenta, GDF-15 is expressed in healthy tissue, albeit to a lower extent and overexpressed in many solid tumors. A variety of different functions are attributed to GDF-15 in healthy as well as diseased humans. On the one hand, GDF-15 is required for successful pregnancy and low GDF-15 serum levels during pregnancy correlate with fetal abortion. On the other hand, overexpression of GDF-15, which can be observed in several malignancies is correlated with a poor prognosis. Furthermore, tumor derived GDF-15 leads to cancer associated anorexia-cachexia syndrome in mice. The aim of my PhD thesis was to further investigate the role of GDF-15 as an immune modulatory factor in cancer, in particular, by inhibiting the target molecule in vitro and in vivo. Therefore, the main focus was placed on the generation and characterization of monoclonal GDF-15 specific blocking antibodies, which were tested in vitro and in vivo, which represents a substantial part of my work. Results Here, GDF-15 was shown to be highly expressed in human gynecological cancer and brain tumors. We could then demonstrate that GDF-15 modulates effector immune cells in vitro. GDF-15 mediated a slight downregulation of the activating NKG2D receptor on NK and CD8+ T cells, which is crucial for proper anti-tumoral immune responses. Furthermore, we could demonstrate that GDF-15 reduces the adhesion of CD4+ and CD8+ T cells on endothelial cells in vitro. A negatively affected trans-endothelial migration of leukocytes into inflamed tissue could explain the low T cell infiltration in GDF-15 expressing tumors, which were observed in vivo, where mice bearing (shRNA mediated) GDF-15 deficient glioma cells revealed enhanced immune cell infiltrates in the tumor microenvironment, compared with the GDF-15 expressing control group. Those animals further exhibited a decreased tumor growth and prolonged survival. GDF-15 is a soluble protein, secreted by more than 50 % of solid tumors and associated with grade of malignancy. Therefore a neutralizing monoclonal antibody to GDF-15 was assumed to be an auspicious therapeutically anti-cancer tool. Such an antibody was thus generated in GDF-15 knock out mice against human GFD-15. Amongst many clones, the GDF-15 antibody clone B1-23 was found to be applicable in Western Blot as well as in ELISA techniques, detecting a three-dimensional epitope of the mature GDF-15 dimer with high affinity and specificity. To enable the humanization for a later administration in humans, the variable regions of antibody B1-23 were identified by a special PCR method using degenerate primers and cloned into a sequencing vector. The sequence obtained thereby enabled the generation of chimeric and humanized B1-23 variants. After further comprehensive characterization, the original mouse antibody B1-23 as well as the chimeric antibody (ChimB1-23) and the humanized B1-23 antibody (H1L5) were applied in a melanoma xenograft study in vivo. None of the antibodies could significantly inhibit tumor growth. .However of utmost importance, body weight loss mediated by tumor derived GDF-15 could be significantly prevented upon administration of all three GDF-15 specific antibodies, which confirmed the antagonizing functionality of the immunoglobulin. Conclusion GDF-15 is a promising cancer target, involved in tumor progression and cancer related cachexia. A monoclonal GDF-15 antibody was generated, which served on one hand as a tool for molecular biological applications (Western Blot, ELISA, etc.) and on the other hand was applied as an antagonizing antibody in vitro and in vivo. Even though tumor growth inhibition by GDF-15 depletion in T cell deficient athymic mice failed using B1-23, the same antibody and derivates thereof (chimeric and humanized) impressively prevented tumor associated cachexia in UACC-257 melanoma bearing nude mice. The missing anti-tumor effect in our own melanoma model in nude mice can only partially be explained by the missing secondary immunity, in particular cytotoxic T cells, in the athymic animals, since in a similar melanoma model, performed by an external company, a tumor reduction in immunocompromised animals was observed, when B1-23 was administered. These findings support the idea that T cells are substantial for an effective tumor immunity and are in line with the results of the syngeneic, T cell comprising, mouse glioma model, where silencing of tumor expressed GDF-15 led to an enhanced intratumoral T cell infiltration and a prolonged survival. Taken together our data allow for the conclusion that tumor associated cachexia can be combatted with the GDF-15 antibody B1-23. Further, B1-23 might elicit direct anti-tumor effects in immune competent models, which contain T cells, rather than in an athymic, T cell deficient nude mouse model. N2 - Hintergrund GDF-15 ist ein divergentes Mitglied der TGF-Superfamilie, welches zuerst als „macrophage inhibitory cytokine-1“ (MIC-1) mit immunmodulatorischen Eigenschaften beschrieben wurde. GDF-15 ist ein lösliches Protein, das unter physiologischen Bedingungen hauptsächlich in der Plazenta exprimiert wird und welches im Serum von Schwangeren in erhöhten Konzentrationen nachgewiesen werden kann. Mit Ausnahme der Plazenta wird GDF-15 in verschiedenen gesunden Geweben gefunden, hier jedoch in deutlich niedrigeren Konzentrationen, und ist in vielen soliden Tumoren überexprimiert. GDF-15 werden sowohl bei gesunden, als auch bei kranken Menschen, unterschiedlichste Funktionen zugeschrieben. Zum einen ist GDF-15 für eine erfolgreiche Schwangerschaft notwendig. Niedrige GDF-15 Spiegel im Serum während der Schwangerschaft korrelieren mit dem Verlust des Fötus. Zum anderen korreliert die Überexpression von GDF-15, welche bei unterschiedlichen Malignitäten beobachtet werden kann, mit einer schlechten Prognose. Darüber hinaus verursacht das von Tumorzellen sezernierte GDF-15 das sogenannte „Anorexie-Kachexie Syndrom“ in Mäusen. Das Ziel meiner Arbeit war es, die immunmodulatorische Funktion von GDF-15 im Tumorkontext zu untersuchen, insbesondere durch eine Hemmung des Zielmoleküls in vitro und in vivo. Aus diesem Grund wurde der Schwerpunkt auf die Generierung und Charakterisierung monoklonaler, GDF-15 spezifischer, blockierender Antikörper gelegt. Diese wurden sowohl in vitro als auch in vivo getestet, was einen großen Teil dieser Arbeit darstellt. Ergebnisse Es konnte gezeigt werden, dass GDF-15 in humanen gynäkologischen Tumoren wie auch in Hirntumoren überexprimiert ist. Weiterhin ließ sich zeigen, dass GDF-15 Effektorzellen des Immunsystems in vitro moduliert. Dabei verursacht GDF-15 eine moderate Herunterregulation des aktivierenden Killing Rezeptors NKG2D auf NK und CD8+ T Zellen, welcher eine hohe Bedeutung für eine effektive anti-tumorale Immunantwort hat. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass GDF-15 die Adhäsion von CD4+ und CD8+ T Zellen auf Endothelzellen in vitro herabsetzt. Eine daraus resultierende Reduktion der trans-endothelialen Migration von Leukozyten in entzündetes Gewebe erklärt möglicherweise die niedrige T Zell Infiltration in GDF-15 exprimierenden Tumoren, welche in vivo beobachtet werden konnten. Mäuse, denen (auf shRNA basierende) GDF-15-defiziente Gliomzellen appliziert wurden, zeigten im Vergleich zur Kontrollgruppe, welche GDF-15-exprimierenden Gliomzellen erhalten hatte, ein verlängertes Überleben, vermindertes Tumorwachstum und eine erhöhte Immunzellinfiltration in das Tumormikromillieu. GDF-15 ist ein lösliches Protein, das von mehr als 50 % aller soliden Tumore sezerniert wird und mit dem Grad der Malignität korreliert. Daher wurde postuliert, dass ein neutralisierender monoklonaler Antikörper gegen GDF-15 eine effektive neue Antikrebstherapie ermöglichen sollte. Solch ein Antikörper wurde entsprechend in GDF-15-defizienten Mäusen generiert. Unter verschiedenen Klonen wurde der Antikörper Klon B1-23 identifiziert, welcher sowohl im Western Blot als auch im ELISA anwendbar ist. Dieser Klon detektiert ein drei-dimensionales Epitop des maturen GDF-15 Dimers mit hoher Affinität und Spezifität. Um den Antikörper für eine spätere Anwendung im Menschen humanisieren zu können, wurden die variablen Regionen des Klons B1-23 durch eine spezielle PCR Methode unter Verwendung degenerierter Primer und nachfolgender Klonierung in einen Sequenzierungsvektor identifiziert. Die hierdurch gewonnenen Sequenzen ermöglichten die Generierung von chimären und humanisierten Varianten von B1-23. Nach anschließender intensiver Charakterisierung konnte sowohl der ursprüngliche Maus-Antikörper B1-23 als auch der chimäre B1-23 Antikörper (ChimB1-23) und der humanisierte B1-23 Antikörper (H1L5) in einer Melanom Xenograft Studie in vivo getestet werden. Zwar ließ sich mit keinem der Antikörper eine signifikante Hemmung des Tumorwachstums beobachten. Als herausragendes Ergebnis zeigte sich allerdings, dass der durch GDF-15 induzierte Gewichtsverlust signifikant durch die Verabreichung der GDF-15 spezifischen Antikörper verhindert werden konnte, was die antagonisierende Funktionalität des entwickelten Immunglobulins bestätigte. Schlussfolgerung GDF-15 ist ein vielversprechendes Zielmolekül bei Krebserkrankungen, welches bei der Tumorprogression und Tumor-assoziierter Kachexie beteiligt ist. Es konnte ein monoklonaler Anti-GDF-15 Antikörper generiert werden, welcher zum einen molekularbiologisch zum Einsatz kam (z.B. Western Blot, ELISA, etc.) und zum anderen als antagonisierender Antikörper sowohl in vitro als auch in vivo Anwendung fand. Auch wenn B1-23 scheinbar keine Tumorwachstumshemmung durch die Depletion von GDF-15 in T Zell defizienten athymischen Mäusen zeigte, konnte derselbe Antikörper wie auch die abgeleiteten Varianten (chimärisiert und humanisiert) eindrücklich die Tumor assoziierte Kachexie im UACC-257 Melanom Modell verhindern. Der ausgebliebene antitumorale Effekt in unserem Melanom Modell in Nacktmäusen lässt sich nur zum Teil durch eine fehlende sekundäre Immunkomponente, insbesondere das Fehlen zytotoxischer T Zellen, erklären, da es in einem ähnlichen Xenograft Melanom Modell, welches in Auftragsforschung (CRO) durchgeführt wurde, zu einer Reduktion des Tumorwachstums durch die Applikation von B1-23 kam. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass T Zellen unerlässlich für eine effektive antitumorale Antwort sind, eine Annahme, die durch die Ergebnisse des syngenen Gliom Maus-Modells unterstützt wird, in welchem es durch das Ausschalten von Tumor produziertem GDF-15 zu einer erhöhten intratumoralen T Zell Infiltration und einem längeren Überleben kam. Zusammengenommen erlauben uns diese Daten den Schluss, dass eine tumorbedingte Kachexie durch den GDF-15-Antikörper B1-23 bekämpft werden kann. Allerdings sind direkte B1-23 vermittelte antitumorale Effekte eher in immunkompetenten Modellen mit T Zellen als in einem athymischen, T Zell defizienten Nacktmaus-Modell zu erwarten. KW - Growth-differentiation Factor 15 KW - GDF-15 KW - Monoklonaler Antikörper KW - Krebs KW - Therapie Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-132424 ER - TY - THES A1 - Wolter, Patrick T1 - Characterization of the mitotic localization and function of the novel DREAM target GAS2L3 and Mitotic kinesins are regulated by the DREAM complex, often up-regulated in cancer cells, and are potential targets for anti-cancer therapy T1 - Charakterisierung der mitotischen Lokalisation und Funktion von GAS2L3, eines kürzlich gefundenen Zielgens des DREAM Komplexes und Mitotische Kinesine werden vom DREAM Komplex reguliert, sind in Krebszellen häufig hochreguliert und sind potentielle Zielle für die Krebstherapie N2 - The recently discovered human DREAM complex (for DP, RB-like, E2F and MuvB complex) is a chromatin-associated pocket protein complex involved in cell cycle- dependent gene expression. DREAM consists of five core subunits and forms a complex either with the pocket protein p130 and the transcription factor E2F4 to repress gene expression or with the transcription factors B-MYB and FOXM1 to promote gene expression. Gas2l3 was recently identified by our group as a novel DREAM target gene. Subsequent characterization in human cell lines revealed that GAS2L3 is a microtubule and F-actin cross-linking protein, expressed in G2/M, plays a role in cytokinesis, and is important for chromosomal stability. The aim of the first part of the study was to analyze how expression of GAS2L3 is regulated by DREAM and to provide a better understanding of the function of GAS2L3 in mitosis and cytokinesis. ChIP assays revealed that the repressive and the activating form of DREAM bind to the GAS2L3 promoter. RNA interference (RNAi) mediated GAS2L3 depletion demonstrated the requirement of GAS2L3 for proper cleavage furrow ingression in cytokinesis. Immunofluorescence-based localization studies showed a localization of GAS2L3 at the mitotic spindle in mitosis and at the midbody in cytokinesis. Additional experiments demonstrated that the GAS2L3 GAR domain, a putative microtubule- binding domain, is responsible for GAS2L3 localization to the constriction zones in cytokinesis suggesting a function for GAS2L3 in the abscission process. DREAM is known to promote G2/M gene expression. DREAM target genes include several mitotic kinesins and mitotic microtubule-associated proteins (mitotic MAPs). However, it is not clear to what extent DREAM regulates mitotic kinesins and MAPs, so far. Furthermore, a comprehensive study of mitotic kinesin expression in cancer cell lines is still missing. Therefore, the second major aim of the thesis was to characterize the regulation of mitotic kinesins and MAPs by DREAM, to investigate the expression of mitotic kinesins in cancer cell line panels and to evaluate them as possible anti-cancer targets. ChIP assays together with RNAi mediated DREAM subunit depletion experiments demonstrated that DREAM is a master regulator of mitotic kinesins. Furthermore, expression analyses in a panel of breast and lung cancer cell lines revealed that mitotic kinesins are up-regulated in the majority of cancer cell lines in contrast to non-transformed controls. Finally, an inducible lentiviral-based shRNA system was developed to effectively deplete mitotic kinesins. Depletion of selected mitotic kinesins resulted in cytokinesis failures and strong anti-proliferative effects in several human cancer cell lines. Thus, this system will provide a robust tool for future investigation of mitotic kinesin function in cancer cells. N2 - Der vor kurzem entdeckte humane DREAM Komplex (für DP,RB ähnlich, E2F und MuvB Komplex) ist ein Chromatin bindender Pocket-Protein-Komplex involviert in Zellzyklusphase abhängiger Genregulation. DREAM besteht aus fünf Kernproteinen, die entweder zusammen mit dem Pocket-Protein p130 und dem Transkriptionsfaktor E2F4 die Genexpression reprimieren oder zusammen mit den Transkriptionsfaktoren B-MYB und FOXM1 die Genexpression fördern. GAS2L3 wurde vor kurzem als neues Zielgen des DREAM Komplexes identifiziert. Eine anschließende Charakterisierung in humanen Zelllinien offenbarte, dass GAS2L3 in der Lage ist, das F-Aktin und das Mikrotubuli Cytoskelett zu binden und zu vernetzen. Außerdem ist GAS2L3 speziell während der G2/M Phase exprimiert, spielt eine Rolle in der Cytokinese und ist wichtig für die genomische Integrität. Der erste Teil der Arbeit hatte zum Ziel zu ergründen in welcher Art und Weise DREAM GAS2L3 reguliert. Außerdem sollte das Verständnis der Rolle von GAS2L3 in der Cytokinese erweitert werden. Hierzu durchgeführte ChIP Analysen zeigten, dass sowohl der reprimierende als auch der aktivierende DREAM Komplex an den Promoter von GAS2L3 bindet. Experimente, in denen GAS2L3 durch RNA-Interferenz (RNAi) depletiert wurde, demonstrierten, dass GAS2L3 in der Cytokinese am Prozess der Einschnürung der Teilungsfurche beteiligt ist. Anschließende auf Immunfluoreszenzmikroskopie basierende Lokalisationsstudien zeigten, dass GAS2L3 an der mitotischen Spindel in der Mitose und am Midbody in der Cytokinese lokalisiert ist. Weiterführende Studien zeigten, dass die GAR Domäne von GAS2L3, eine mutmaßliche Mikrotubuli- Bindedomäne, für die Lokalisierung von GAS2L3 in der für die Abszission wichtigen Konstriktionszone verantwortlich ist. Dieses Ergebnis lässt vermuten, dass GAS2L3 eine Rolle in diesem Prozess spielt. Der DREAM Komplex ist bekannt dafür G2/M Genexpression zu fördern. G2/M Zielgene des Komplexes sind unter anderem mehrere mitotische Kinesine und mitotische Mikrotubuli-Bindeproteine. Bisher ist die Art und Weise und das Ausmaß der Regulierung dieser Proteingruppen durch DREAM aber nur ungenügend untersucht worden. Des Weiteren fehlt bisher eine umfassende Charakterisierung der Expression von mitotischen Kinesinen in Krebszellen. Deswegen befasste sich der zweite Teil der Arbeit mit der Charakterisierung der Regulation von mitotischen Kinesinen und Mikrotubuli-Bindeproteinen durch DREAM, untersuchte die Expression dieser beiden Proteingruppen in Krebszelllinien und evaluierte diese anschließend als potentielle Ziele für die Krebstherapie. Eine Kombination aus ChIP Analysen und RNAi Experimenten zeigte, dass DREAM eine zentrale Rolle in der Regulierung von mitotischen Kinesinen spielt. Expressions- analysen deckten auf, dass mitotische Kinesine in der Mehrheit der Krebszelllinien hochreguliert sind im Gegensatz zu den nicht entarteten Kontrollzelllinien. Schließlich wurde ein auf Lentiviren basierendes induzierbares shRNA System etabliert, welches mitotische Kinesine effektiv herunterregulieren konnte. Depletion ausgewählter mitotischer Kinesine führte zu Fehlern in der Cytokinese und hatte starke Auswirkungen auf das Wachstumsverhalten von mehreren Krebszelllinien. Aufgrund dieser Erkenntnisse wird das lentivirale System eine solide Ausgangsbasis für zukünftige Untersuchungen von mitotischen Kinesinen in Krebszellen bilden. KW - Zellzyklus KW - GAS2L3 KW - B-MYB KW - DREAM KW - cytokinesis KW - mitosis KW - kinesin KW - cancer KW - FOXM1 KW - regulation KW - Zellteilung KW - Regulation KW - Krebs KW - Biologie / Zellbiologie Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-122531 ER - TY - THES A1 - Kober, Christina T1 - Characterization of Murine GL261 Glioma Models for Oncolytic Vaccinia Virus Therapy T1 - Charakterisierung onkolytischer Vaccinia Virus Therapie in murinen Gliommodellen N2 - Glioblastoma multiforme (GBM) is one of the most frequent and malignant forms of brain cancer in adults. The prognosis is poor with a median survival time of 12-15 months. There is a broad range of alternative treatment options studied in preclinical and clinical trials for GBM. One alternative treatment option is oncolytic virotherapy, defined as the use of replication‐competent viruses that selectively infect and destroy cancer cells while leaving, non‐transformed cells unharmed. Vaccinia virus (VACV) is one favorable candidate. Although oncolytic viruses can kill tumor cells grown in vitro with high efficiency, they often exhibit reduced replication capacity in vivo suggesting that physiological aspects of the tumor microenvironment decrease the virus’ therapeutic potential. The percentage and composition of immune cells varies between cancer types and patients and is investigated as a biomarker in several studies. Making oncolytic virotherapy successful for GBM, it is necessary to understand the individual tumor biology, the interaction with the microenvironment and immune system. It was demonstrated that the attenuated VACV wild-type (wt) isolate LIVP 1.1.1 replicate and lyse the murine GL261 glioma cell line in vitro. In the following, the replication efficacy was characterized in a comparative approach in vivo. Immunocompetent C57BL/6 (wt) mice and immunodeficient mouse strains of different genetic background C57BL/6 athymic and Balb/c athymic mice were used. In addition, subcutaneous and intracranial locations were compared. The results revealed viral replication exclusively in Balb/c athymic mice with subcutaneous tumors but in none of the other models. In the following, the tumor microenvironment of the subcutaneous tumor models at the time of infection was performed. The study showed that implantation of the same tumor cells in different mouse strains resulted in a different tumor microenvironment with a distinct composition of immune cells. Highest differences were detected between immunodeficient and immunocompetent mice. The study showed major differences in the expression of MHCII with strongest expression in C57BL/6 wt and weakest in Balb/c athymic tumors. In the following, the influence of the phenotypic change associated with the upregulation of MHCII on GL261 tumor cells on viral replication was analyzed. Comparison of C57BL/6 wt and C57BL/6 IFN-γ knockout mice revealed endogenous IFN-γ levels to upregulate MHCII on GL261 tumor cells and to reduce viral replication in C57BL/6 wt mice. Analysis of single cell suspensions of tumor homogenates of C57BL/6 and Balb/c athymic mice showed that the IFN-γ-mediated anti-tumor effect was a reversible effect. Furthermore, reasons for inhibition of virus replication in orthotopic glioma models were elucidated. By immunohistochemical analysis it was shown that intratumoral amounts of Iba1+ microglia and GFAP+ astrocytes in Gl261 gliomas was independent from intratumoral VACV injection. Based on these findings virus infection in glioma, microglia and astrocytes was compared and analyzed in cell culture. In contrast to the GL261 glioma cells, replication was barely detectable in BV-2 microglia and IMA2.1 astrocytic cells. Co-culture experiments revealed that microglia compete for virus uptake in cell culture. It was further shown that BV-2 cells showed apoptotic characteristics after VACV infection while GL261 cells showed signs of necrotic cell death. Additionally, in BV-2 cells with M1-phenotype a further reduction of viral replication and inhibition of cell lysis was detected. Infection of IMA 2.1 cells was independent of the M1/M2-phenotype. Application of BV-2 microglia with M1-phenotype onto organotypic slice cultures with implanted GL261 tumors resulted in reduced infection of BV-2 cells with LIVP 1.1.1, whereas GL261 cells were significantly infected. Taken together, the analyzed GL261 tumors were imprinted by the immunologic and genetic background in which they grow. The experimental approach applied in this thesis can be used as suitable model which reflects the principles of personalized medicine In an additional project, based on gene expression data and bioinformatic analyses, the biological role and function of the anti-apoptotic factor AVEN was analyzed with regard to oncolytic VACV therapy. Besides a comparison of the replication efficacy of GLV-1h68 and VACV-mediated cell killing of four human tumor cell lines, it was shown that AVEN was expressed in all analyzed cells. Further, shown for HT-29 and 1936-MEL, the knockdown of AVEN by siRNA in cell culture resulted in an increase of apoptotic characteristics and a decrease of VACV infection. These findings provide essential insights for future virus development. N2 - Glioblastoma multiforme (GBM) ist einer der häufigsten und bösartigsten Hirntumoren im Erwachsenenalter. Die Prognose für GBM ist mit einer Überlebenszeit von 12-15 Monaten sehr schlecht. Eine alternative Behandlungsmöglichkeit stellt die onkolytische Virustherapie dar. Ein vielversprechender Kandidat ist das Vaccinia-Virus. Die große Diskrepanz zwischen der onkolytischen Effektivität in Zellkultur und den Ergebnissen im Mausmodell ist oftmals auf physiologische Komponenten im Tumor-Mikromilieu zurückzuführen. Die Zusammensetzung von Immunzellen im Mikromilieu variiert zwischen verschiedenen Krebsarten und Patienten und wird als Biomarker angewendet. Um eine erfolgreiche Virustherapie für GBM zu etablieren, wird ein umfangreiches Verständnis der Tumorbiologie, des Tumormikromilieus und des Immunsystems vorausgesetzt. Es wurde gezeigt, dass LIVP 1.1.1, ein attenuiertes wildtypisches VACV-Isolat, in der murinen GL261 Gliom-Zelllinie repliziert und zum Absterben der Zellen führt. Daraufhin wurde die Replikationseffizienz von LIVP 1.1.1 durch einen vergleichenden Ansatz in murinen GL261-Gliomen im Mausmodell untersucht. Es wurden immunkompetente C57BL/6-wildtypische (wt) Mäuse und immundefiziente Mausstämme mit unterschiedlichem genetischem Hintergrund, C57BL/6 athymisch und Balb/c athymisch, verwendet. Zudem wurden unterschiedliche Tumor-Lokalisationen, subkutan und intrakranial analysiert. Ausschließlich im subkutanen Tumormodell der Balb/c athymischen Mäuse fand eine effektive Replikation der Viren statt. Eine detaillierte Charakterisierung des Mikromilieus zum Zeitpunkt der Infektion zeigte, dass die Implantation derselben Tumorzellen in unterschiedliche Mausstämme zur Entwicklung eines unterschiedlichen Tumormikromilieus und einer variierenden Zusammensetzung von Immunzellen führt. Die C57BL/6-wt-Mäuse wiesen eine starke proinflammatorische Signatur auf. Des Weiteren zeigte die Studie signifikante Unterschiede in der MHCII-Expression: Die prominenteste Expression wurde in C57BL/6-wt-Mäusen detektiert. Im weiteren Verlauf wurde analysiert, wodurch die phänotypischen Veränderungen in den GL261-Zellen, verbunden mit der Hochregulierung von MHCII ausgelöst wurden und welche Konsequenzen dies für die virale Infektion dieser Zellen hat. Durch einen direkten Vergleich von C57BL/6-wt-Mäusen und C57BL/6-IFN-γ-Knockout Mäusen konnte IFN-γ als verantwortlicher Faktor im Tumormikromilieu identifiziert werden, welcher für die Reduktion des Virustiters und für die Hochregulierung von MHCII in den C57BL/6-wt-Mäusen verantwortlich ist. Der durch endogenes IFN-γ ausgelöste anti-virale Effekt war reversibel. Des Weiteren wurden Gründe für die Hemmung der viralen Replikation in den orthotopen Gliom-Modellen aufgeklärt. Durch immunhistochemische Analysen von Mikroglia und Astrozyten konnte gezeigt werden, dass die intratumorale Menge und Verteilung der Gliazellen in diesen Tumoren unabhängig von der Virus-Applikation war. Gliomzellen, Mikroglia und Astrozyten, wurden daraufhin untersucht. Im Vergleich zur starken Replikation in GL261-Zellen, ließen BV-2-Mikroglia und IMA 2.1-Astrozyten, nur eine sehr schwache Replikation von LIVP 1.1.1 zu. Ko-Kultivierungsversuche wiesen darauf hin, dass Mikroglia um die Aufnahme der Viruspartikel mit den Tumorzellen konkurrieren. Es wurde gezeigt, dass das LIVP 1.1.1 unterschiedliche Eigenschaften des Zelltods in den Zellen auslösen kann. BV-2 wiesen verstärkte Charakteristika der Apoptose auf während in GL261-Zellen nekrotische Eigenschaften überwogen. In BV-2-Zellen mit M1-Phänotyp wurde eine weitere Reduktion der viralen Infektion festgestellt. Die Infektion von IMA-2.1-Zellen war unabhängig vom induzierten M1/M2 Phänotyp. Die Applikation von BV-2-Zellen mit M1-Phänotyp auf organotypische Schnittkulturen mit implantierten GL261-Tumoren resultierte in einer reduzierten Infektion der BV-2-Zellen und einer verstärkten Infektion der GL261-Zellen. Es wurde gezeigt, dass GL261-Tumore durch den immunologischen und genetischen Hintergrund der Umgebung geprägt wurden. Es wurde ein Modell entwickelt, welches das Prinzip der personalisierten Medizin widerspiegelt. In einem zusätzlichen Projekt wurde, basierend auf Genexpressionsdaten und bioinformatischer Auswertung, die biologische Funktion des anti-apoptotischen Faktors AVEN hinsichtlich der onkolytischen Virustherapie mit dem VACV GLV-1h68 analysiert. Für diese Studie wurden vier humane Zelllinien untersucht. Neben einem Vergleich der Replikationseffizienz des VACV GLV-1h68 und der VACV-vermittelten Zelllyse wurde gezeigt, dass AVEN, in allen untersuchten Zellen exprimiert wird. Am Beispiel von HT-29 und 1936-MEL wurde gezeigt, dass die Herunterregulierung von AVEN durch siRNA zu einer Erhöhung der apoptotischen Eigenschaften und Abnahme der VACV Infektion führt. Die Ergebnisse liefern wichtige Erkenntnisse für die Entwicklung zukünftiger genetisch veränderter VACV. KW - Krebs KW - Vaccinia-Virus KW - Glioblastom KW - Onkolytische Vaccinia Virustherapie KW - Mikroglia KW - Astrozyten KW - Oncolytic Vaccinia Virus Therapy Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-118556 ER -