TY  - THES
A1  - Vögtle, Timo
T1  - Studies on receptor signaling and regulation in platelets and T cells from genetically modified mice
T1  - Studien zur Signaltransduktion und Regulierung von Rezeptoren in Thrombozyten und T-Zellen genetisch veränderter Mäuse
N2  - Receptors with tyrosine-based signaling motifs control essential functions of hematopoietic cells, including lymphocytes and platelets. Downstream of the platelet receptor glycoprotein (GP) VI and the T cell receptor (TCR) the immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) initiates a signaling cascade that involves kinases, adapter and effector proteins and finally leads to cellular activation. This thesis summarizes the results of three studies investigating different aspects of receptor signaling and regulation in platelets and T cells.
In the first part, the impact of constitutive Ca2+ influx on TCR signaling and T cell physiology was investigated using a transgenic mouse line with a mutation in the Ca2+ sensor stromal interaction molecule 1 (STIM1). The elevated cytoplasmic Ca2+ level resulted in an altered phosphorylation pattern of the key enzyme phospholipase (PL) Cγ1 in response to TCR stimulation, but without affecting its enzymatic activity. Withdrawal of extracellular Ca2+ or inhibition of the phosphatase calcineurin restored the normal phosphorylation pattern. In addition, there was a decrease in the release of Th2-type cytokines interleukin 4, 5 and 13 upon stimulation in vitro.
The second part of the thesis deals with the role of the adapter protein growth factor receptor-bound protein 2 (Grb2) in platelets using a megakaryocyte/platelet-specific knockout mouse line. Loss of Grb2 severely impaired signaling of GPVI and C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2), a related hemITAM receptor. This was attributed to defective stabilization of the linker for activation of T cells (LAT) signalosome and resulted in reduced adhesion, aggregation, Ca2+ mobilization and procoagulant activity downstream of (hem)ITAM-coupled receptors in vitro. In contrast, the signaling pathways of G protein-coupled receptors (GPCRs) and the integrin αIIbβ3, which do not utilize the LAT signalosome, were unaffected. In vivo, the defective (hem)ITAM signaling caused prolonged bleeding times, however, thrombus formation was only affected under conditions where GPCR signaling was impaired (upon acetylsalicylic acid treatment). These results establish Grb2 as an important adapter protein in the propagation of GPVI- and CLEC-2-induced signals.
Finally, the proteolytic regulation of the immunoreceptor tyrosine-based switch motif (ITSM)-bearing receptor CD84 in platelets was investigated. This study demonstrated that in mice CD84 is cleaved by two distinct and independent proteolytic mechanisms upon platelet activation: shedding of the extracellular part, which is exclusively mediated by a disintegrin and metalloproteinase (ADAM) 10 and cleavage of the intracellular C-terminus by the protease calpain. Finally, the analysis of soluble CD84 levels in the plasma of transgenic mice revealed that shedding of CD84 by ADAM10 occurs constitutively in vivo.
N2  - Rezeptoren mit Tyrosin-basierten Signaltransduktionsmotiven sind von fundamentaler Bedeutung für die Funktion hematopoietischer Zellen wie Lymphozyten und Thrombozyten. Unterhalb des Glykoproteins (GP) VI auf Thrombozyten und des T-Zell Rezeptors (TZR) auf T-Zellen initiiert das immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) eine Signalkaskade, die Kinasen, Adapter- und Effektorproteine mit einbezieht und schlussendlich zur Aktivierung der Zelle führt. Die hier vorgelegte Arbeit fasst die Ergebnisse dreier Studien zusammen, die sich mit verschiedenen Aspekten der Signaltransduktion und Regulation von Rezeptoren in Thrombozyten und T-Zellen befasst.
Im ersten Teil wurde der Einfluss eines konstitutiven Ca2+-Einstroms auf die TZR Signalkaskade und T-Zell Funktion untersucht. Hierzu wurde eine transgene Mauslinie mit einer Mutation im Ca2+-Sensor stromal interaction molecule 1 (STIM1) verwendet. Die erhöhte zytoplasmatische Ca2+-Konzentration veränderte das Phosphorylierungsmuster der Phospholipase (PL) Cγ1, ein Schlüsselenzym der Signalkaskade, nach Stimulation des TZRs. Die enzymatische Aktivität der PLCγ1 blieb hierbei jedoch unverändert. In der Abwesenheit von extrazellulärem Ca2+ oder bei Inhibition der Phosphatase Calcineurin war das Phosphorylierungsmuster hingegen wieder normal. Darüber hinaus zeigten die T Zellen nach Stimulation in vitro eine verringerte Produktion von Interleukinen des Th2-Typs (Interleukin-4, 5 und 13).
Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit der Funktion des Adapterproteins growth factor receptor-bound protein 2 (Grb2) in Thrombozyten, die unter Zuhilfenahme einer Megakaryozyten- und Thrombozyten-spezifischen Knockout Mauslinie untersucht wurde. Hierbei zeigte es sich, dass der Verlust von Grb2 die Signaltransduktion von GPVI und des verwandten hemITAM-Rezeptors C type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) schwer beeinträchtigt. Dies konnte auf eine mangelnde Stabilisierung des linker for activation of T cells (LAT) Signalosoms zurückgeführt werden und resultierte in einer verminderten Adhäsion, Aggregation, Ca2+-Mobilisierung und prokoagulatorischen Aktivität nach Aktivierung (hem)ITAM gekoppelter Rezeptoren in vitro. Im Gegensatz hierzu blieben die Signaltransduktionswege G-protein-gekoppelter Rezeptoren (GPCRs) und des Integrins αIIbβ3, die das LAT Signalosom nicht nutzen, unbeeinflusst. In in vivo Studien verursachte die beeinträchtigte (hem)ITAM Signaltransduktion eine verlängerte Blutungszeit der Mäuse, während die Entstehung von Thromben nur bei gleichzeitiger Hemmung von GPCR-Signalwegen (durch Acetylsalicylsäuregabe) vermindert war. Diese Ergebnisse etablieren Grb2 als ein wichtiges Adapterprotein in der Signaltransduktionskaskade von GPVI und CLEC-2.
Schließlich wurde im dritten Teil dieser Arbeit die proteolytische Regulation des Rezeptors CD84, der ein immunoreceptor tyrosine-based switch motif (ITSM) enthält, untersucht. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass CD84 in Mausthrombozyten durch zwei verschiedene und unabhängige proteolytische Mechanismen geschnitten wird: Zum einen durch Shedding des extrazellulären Teils, was ausschließlich durch die a disintegrin and metalloproteinase (ADAM) 10 bewerkstelligt wird, und zum anderen durch das Schneiden des intrazellulären C Terminus durch die Protease Calpain. Des Weiteren zeigte eine Untersuchung von Plasmaproben transgener Mäuse, dass das Shedding von CD84 durch ADAM10 konstitutiv in vivo erfolgt.
KW  - Thrombozyt
KW  - T-Lymphozyt
KW  - Rezeptor
KW  - Signaltransduktion
KW  - Calcium
KW  - Platelet
KW  - Thrombose
KW  - T cell
KW  - receptor signaling
KW  - calcium
KW  - ITAM
KW  - Hämostase
KW  - Metalloproteinasen
KW  - Adapterprotein
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-97114
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kottmair, Mathias
T1  - Bambi – Charakterisierung eines inhibitorischen BMP-Pseudorezeptors
T1  - Bambi - characterization of an inhibitoric BMP pseudoreceptor
N2  - Die TGF-β-Proteinfamilie umfasst eine Vielzahl von zumeist homodimeren sezernierten Liganden in höheren Tieren, die viele Vorgänge und Entwicklungen im Embryo wie im adulten Lebewesen über absolute oder graduelle Einflussnahme steuern. Die Signalweiterleitung ins Zytoplasma und den Nukleus erfolgt über promisk paarig rekrutierte Typ-I- und Typ-II-Rezeptoren, ehe vorwiegend rezeptorabhängig verschiedene SMAD-Proteine von Typ-I-Kinasen der Rezeptoren aktiviert werden, in den Kern translozieren und die Transkription induzieren. Zu jedem Zeitpunkt dieser Signalweiterleitung kann mittels verschiedener endogener Inhibitoren regulatorisch eingegriffen werden. Dem bisher einzig bekannten membranständigen Pseudorezeptor Bambi (BMP and Activine membrane bound inhibitor) wurde in vorangegangenen Arbeiten inhibitorisches Potential gegenüber dem BMP- und Activin-vermittelten Signalweg über Bindung an distinkte ligandenadressierte Rezeptoren zugeschrieben, wobei die genaue Wirkweise bislang noch vollkommen unklar war.
In der vorliegenden Arbeit wurde initial ein Homologiemodell der extrazellulären Domäne von hBambi anhand der gelösten Kristallstruktur der extrazellulären Domäne von BR1A im gebundenen Zustand (PDB-ID: 1REW) erstellt. Anhand dieses Modells wurde eine Arbeitshypothese entwickelt und es gelang in der Folge, biologisch aktives rekombinantes Protein zum einen aus transfizierten Insektenzellen sowie aus der Renaturierung aus bakteriellen Einschlusskörpern in hinreichender Menge herzustellen und chromatographisch aufzureinigen. Nach einer vergleichenden Qualitätskontrolle beider Exprimate wurden mittels CD-Spektroskopie und analytischer Gelfiltration der Anteil der Sekundärstrukturelemente sowie der Oligomerisierungsgrad erfolgreich bestimmt. In SPR-Bindestudien wurde der Beweis erbracht, dass hBambi-ECD Affinität zu annähernd allen getesteten Liganden der BMP-/GDF-Gruppe, die den SMAD-1/-5-/-8-Signalweg aktivieren, zeigt. Bekannte Typ-I- und Typ-II-Bindungsmutanten von BMP-2 wurden ebenfalls von hBambi-ECD quasi wildtypisch gebunden. Verschiedene Rezeptorektodomänen sowie ActivinA wurden, wie bisher in der Literatur fälschlich angenommen wurde, hingegen nicht gebunden. Die propagierte Homooligomerisierung von Bambi wird überdies nicht über die extrazelluläre Domäne vermittelt. Eingesetzt in Stimulationsversuche mit BMP-responsiven Zellen wurde eine konzentrationsabhängige inhibierende Wirkung von freier hBambi-ECD auf die BMP-2-vermittelte Signalweiterleitung mit unterschiedlichen Nachweismethoden ermittelt, welche die Ergebnisse aus den SPR-Versuchen erfolgreich bestätigten.
In einem weiteren Teil dieser Arbeit wurden verschiedene chimäre Konstrukte aus für Bambi- und BR1A-Domänen kodierenden Sequenzen kloniert, in HEK Ad293-Zellen zusammen mit BMP- und Activin-responsiven Reportergenkonstrukten transient transfiziert und Stimulationsversuche mit BMP-2 und ActivinA durchgeführt. Wildtypisches Bambi zeigte hierbei ein ambivalentes Verhalten in Bezug auf die Regulation des BMP-2-Signals: geringe Mengen wirken agonistisch, höhere Mengen antagonistisch auf die Ausbildung des Reporters. Im Fall von ActivinA zeigte sich hingegen kein antagonistischer Einfluss von Bambi. In den Experimenten mit chimären Varianten erfolgte durch die erhaltenen Daten die Eingrenzung der Bindestelle von hBambi-ECD an BMP-2 auf den Bereich der Typ-I-Bindestelle. Ein direkter Einfluss der intrazellulären Domäne auf den BMP-2-Signalweg wurde ausgeschlossen. Weiterhin konnte gerade in Versuchen mit einem Antikörper gegen BR1A-ECD eine weitere Eigenheit der Bindung von Bambi an den Liganden offenbart werden: so bildet das Konstrukt aus hBambi-ECD und der intrazellulären BR1A-Domäne mit zugehöriger GS-Box und Typ-I-Kinase einen korrekt in den signalaktiven heterohexameren Komplex rekrutierten funktionellen Typ-I-Rezeptor.
Mit den in dieser Arbeit erzielten Ergebnissen, nämlich der gelungenen Erstellung eines Herstellungsprotokolls der ECD, deren erfolgreich identifizierten Bindepartnern sowie der Charakterisierung der Bindung an BMP-2 ist der Grundstein für die Strukturaufklärung von hBambi-ECD gelegt, welche weitere Klarheit in die Funktionalität dieses Modulators der BMP-/GDF-vermittelten Signalweiterleitung bringen wird. Ebenso sind erste das Verständnis der ICD aufklärende Ergebnisse erzielt worden, die das Fundament für weitere Experimente und darauf folgende Kenntnisgewinne darstellen werden.
N2  - The protein family of TGF-β-proteins consists of a huge number of predominantly homodimeric secreted ligands in higher animals, regulating many processes and developmental procedures in embryonic and adult forms via absolute or gradual influence. Signal transduction to cytoplasm and nucleus occurs by the aid of promiscuous, pairwisely recruited type-I- and type-II-receptors, usually activating a variety of receptor-dependent nucleus-permissive SMAD-proteins by an intracellular kinase-phosphorylation-cascade. After translocation they induce transcription of bre-promoted genes. Every signal transduction step may be interfered by endogenous inhibitors. So far the known membrane-bound pseudoreceptor Bambi (BMP and activine membrane-bound inhibitor) is hypothesized to have inhibitory potential against BMP- and activin-mediated signaling pathway via binding of distinct ligand-dependent receptors. However, its proper function still remains unclear.
At the beginning of this work a homology model of the extracellular domain of hBambi was built based on a solved 3D-structure of BR1A-ECD bound to its ligand (PDB-ID: 1REW). Upon this model a work hypothesis was issued and biologically active recombinant protein was obtained successfully, both from transfected insect cells and from refolding ex bacterial inclusion bodies in sufficient amount and purified by chromatography, respectively. After comparative quality control of both samples the degree of oligomerisation and secondary structure composition was analyzed via CD spectroscopy and analytical gelfiltration runs. Binding affinity towards nearly all ligands of BMP-/GDF-group assigned to SMAD-1/-5-/-8-signaling was shown for hBambi-ECD by SPR experiments. Known BMP-2-mutants lacking affinity for type-I- or type-II-receptors exhibited wildtype-like binding to hBambi-ECD, respectively. Contrary to the current opinion, neither various ectodomains of receptors nor ActivinA did show any specific binding. Moreover, proposed homooligomerisation of Bambi is not mediated via ECD. Introduction of hBambi-ECD into stimulation experiments on several BMP-responsive cells with differing detection modes yielded in concentration-dependent inhibition of BMP-2-signalling, confirming the results of SPR-attempts well.
In a further part of this work various chimeric constructs consisting of Bambi- and BR1A-coding sequence were cloned and effectively co-transfected into HEK Ad293 cells together with plasmids coding for BMP- and Activin-dependent reporters. Stimulation experiments with BMP-2 and ActivinA provided insights into Bambi participation within cellular processes. Full length Bambi exhibited ambivalent behaviour with respect to BMP-2-signaling: small amounts have an agonistic effect, while increasing levels revert it into an antagonistic one with respect to reporter formation. Regarding ActivinA no antagonistic effect was observed. Assays with chimeric constructs led to a containment for Bambi-epitope to the type-I-binding-site of BMP-2. Direct impact of Bambi-ICD on BMP-2-signaling could be blackballed. Furthermore, attempts with an antibody against BR1A-epitope revealed another feature of Bambi-binding to the ligand: a construct of Bambi-ECD fused to intracellular BR1A-domain including kinase and GS-Box forms a functional type-I-receptor correctly orientated and incorporated into heterohexameric signaling-complex.
Upon gained results within this work, namely the successful establishment of a purification protocol for the extracellular domain of hBambi, the identification of its binding partners as well as the characterization of a prominent binding partner the basis for successful structure determination of hBambi-ECD aiming to unravel the function of this modulator of BMP-/GDF-signaling is laid. Likewise, first knowledge of the ICD was acquired that will be the basis for further experiments leading to continuative scientific findings.
KW  - Knochen-Morphogenese-Proteine
KW  - BMP
KW  - Rezeptor
KW  - Inhibitor
KW  - Activin
KW  - Transforming Growth Factor
KW  - Bambi
KW  - Inhibitor
KW  - Activin
KW  - TGF
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-103530
ER  - 
TY  - THES
A1  - Sumski, Anna Magdalena
T1  - Adenosinrezeptoren auf Zervix-, Uterus- und Mammakarzinomzellen
T1  - Adenosine receptors in cervical, uterine and breast cancer cells
N2  - Adenosinrezeptoren werden auf nahezu allen Körperzellen exprimiert und übernehmen dort vielfältige und wichtige Funktionen. Auch auf diversen Tumorzelllinien konnten bereits Adenosinrezeptoren nachgewiesen und – je nach Subtyp – mit Pro- oder Anti-tumor-Effekten in Zusammenhang gebracht werden. 
In dieser Arbeit wurden Gebärmutterhalskrebszellen sowie endometriale und triple-negative Brustkrebszellen auf Expression und mögliche Funktionen von Adenosinrezep-toren untersucht. Da spezifische Antikörper bis heute nicht verfügbar sind, wurde ein pharmakologischer Ansatz mit subtypspezifischen Agonisten und Antagonisten gewählt. 
In Radioliganden-Bindungsassays, konnte nachgewiesen werden, dass sich auf der Zer-vixkarzinom-Zelllinie SiHa und der Brustkrebs-Zelllinie HCC1806 Adenosinrezeptoren des Subtyps A1 befinden. Die endometrialen Krebszelllinien Ishikawa und HEC-1-A exprimieren Rezeptoren vom Subtyp A1 und A2A. A3-Adenosinrezeptoren wurden auf keiner der untersuchten Zelllinien gefunden. 
Der Nachweis von A2B-Rezeptoren kann mit dem Radioliganden-Bindungsassay nicht erbracht werden, da bislang kein Radioligand bekannt ist, der eine ausreichende Affini-tät besitzt, um diesen Subtyp zweifelsfrei nachweisen zu können. 
Obwohl die Mehrheit der untersuchten Zelllinien Adenosinrezeptoren exprimiert, konnte ein signifikanter Effekt auf die Adenylatcyclase bei Stimulation der auf den Zellen vorhandenen Adenosinrezeptoren nur bei den HEC-1-A-Zellen festgestellt werden. Auch auf funktionelle A2B-Rezeptoren fand sich im Adenylatcyclaseassy kein Hinweis.
Im durchgeführten Kristallviolettassay zeigte sich ein proapoptotischer Effekt auf Ishi-kawa- und HEC-1-A-Zellen bei hohen Adenosin-Konzentrationen (100 µM). Die im BrdU-Assay gemessene Proliferationsrate hingegen änderte sich nach Vorbehandlung mit Adenosin nicht. Das metabolisch stabilere NECA (in Kombination mit ADA) hatte im Kristallviolettassay einen stärkeren Einfluss auf die Apoptoserate der jeweiligen Zelllinie als Adenosin und auch im BrdU-Assay sank die Menge an inkorporiertem BrdU. Ein Synergismus zwischen Stimulation von Adenosinrezeptoren und diversen Todesliganden bzw. Chemotherapeutika konnte nicht nachgewiesen werden. 
Freies extrazelluläres Adenosin kann auch aus dem Abbau von ATP generiert werden, wenn Zellen die Ektonukleotidasen CD39 und CD73 exprimieren. Aufgrund der im-munsuppressiven Wirkung von Adenosin können diese Enzyme T-Zell- und NK-Zellantworten im Mikromilieu von Tumoren hemmen. Die durchflusszytometrische Analyse von HEC-1-A- und Ishikawa-Zellen zeigte zwar, dass die Expression von CD39 und CD73 nach Stimulation der Adenosinrezeptoren unverändert blieb. Die Ex-pression von Enzymen, lässt aber vermuten, dass die Zellen in vivo von Adenosin profi-tieren könnten. Angesichts der in vitro Daten, die allenfalls einen wachstumshemmen-den Effekt von Adenosin zeigten, könnte die vorrangige Wirkung von Adenosin im Tumormikromilieu tatsächlich auf der Inhibition von Immunantworten beruhen. Mög-licherweise würden die Rezeptoren dann in erster Linie als Sensoren dienen.       
Weitere Forschungsarbeit wird helfen, die Rolle der Adenosinrezeptoren im Tumorge-schehen vollständig zu verstehen und möglicherweise für die Krebstherapie nutzbar zu machen.
N2  - In this thesis, cell lines from cervical, endometrial and triple-negative breast cancer were investigated for expression and putative functions of adenosine receptors. Due to the lack of specific antibodies, a pharmacological approach using subtype-specific agonists and antagonists was taken. Radio ligand binding assays showed that adenosine receptors of the A1 subtype are expressed by SiHa cervical cancer and by HCC1806 breast cancer cells. Receptors of the A1 and A2A subtype are expressed by the endometrial cancer cell lines Ishikawa and HEC-1-A. A3 adenosine receptors could not be detected in any of the 5 investigated cell lines and the presence of receptors of the A2B subtype cannot be assessed with the available ligands. However, while the majority of the cell lines expressed adenosine receptors, a significant effect of adenosine receptor stimulation on adenylylcyclase activity was only detected in HEC-1-A cells. In crystal violet assays, high concentrations (100 µM) of adenosine showed a proapoptotic effect in Ishikawa- and HEC-1-A cells.  The proliferation rate as measured by BrdU uptake was not affected by adenosine. The metabolically more stable adenosine receptor agonist NECA (in combination with ADA) had, in contrast, a stronger impact on the rate of apoptosis in the respective cell lines. Moreover, NECA also reduced BrdU uptake. Using various chemotherapeutics and death ligands, no synergy was observed between stimulation of adenosine receptors and further death stimuli.
Free extracellular adenosine can also be generated from ATP when cells express the ectonucleotidases CD39 and CD73. Due to the immunosuppressive effect of adenosine, these enzymes can inhibit T cell and NK cell responses in the tumor microenvironment. Flow cytometry, however, showed that expression of CD39 and/or CD73 remained unaltered after stimulation of adenosine receptors. Thus, further investigations will be required to reveal the functional role of adenosine receptor expression on the investigated tumor cell lines.
KW  - Adenosinrezeptor
KW  - Rezeptor
KW  - Adenosin
KW  - Gebärmutterhalskrebs
KW  - Brustkrebs
KW  - Liganden
KW  - Adenylatcyclaseassay
KW  - FACS
KW  - Bindungsassay
KW  - BrdU
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-99332
ER  -