TY - THES A1 - Steinmeyer, Ralf T1 - Untersuchungen und Simulationen zur Koordination der Ionenflüsse bei der Schließzellbewegung in Vicia faba und Arabidopsis thaliana T1 - Studies and Simulations about the Coordination of Ion Fluxes during the Guard Cell Movement in Vicia faba and Arabidopsis thaliana N2 - Trotz der bereits lange gut bekannten Funktion der Stomata und der einzelnen, an der Funktion beteiligten Transportproteine, fehlen Funktionsmodelle, die diese schließzellspezifsch in einen Zusammenhang bringen und ihre Koordination untersuchen. Ergebnisse - Der einwärts gleichrichtende Kaliumkanal aus Arabidopsis thaliana, KAT1 ist sowohl molekularbiologisch, als auch elektrophysiologisch gut charakterisiert. Ein „ausschalten“ dieses Kanals sollte die Stomaöffnung deutlich verlangsamen oder vermindern. Es wurde aber unter verschiedenen Bedingungen, weder mit Licht als Öffungsreiz, noch mit Fusicoccin, kein Unterschied zwischen Wildtyp und KAT1::En-1 Mutante gefunden. - Einige Publikationen schlagen Zucker, vornehmlich Glukose als osmotisch aktive Substanz zur Stomaöffnung vor, da im Tagesgang bei längerer Stomaöffnung auch die Zuckerkonzentration zunimmt. Die Zuckeraufnahme wurde mit einem fluoreszierenden Glukose-Derivat gemessen und als lichtabhängig gefunden. Weiterhin wurde die Aufnahme besonders durch CCCP gehemmt, was auf eine Abhängigkeit von einem Protonengradienten hindeutet. - Die Aufnahme von Glukose wurde weiterhin mit einer Knockout-Mutante des AtSTP1 Protonen/Zucker-Kotransporters getestet. Die deutliche Verminderung des Anteils der fluoreszierenden Zellen gegenüber dem Wildtyp unter den gleichen Bedingungen zeigt eine Beteiligung dieses Kotransporters an der Glukose-Aufnahme. - Schließzellen in der intakten Pflanze wurden auf den Verlauf ihres Membranpotentials in CO2-freier Luft bei Licht/Dunkel Wechseln untersucht. Ein großer Teil dieser Zellen zeigte eine wiederholbare Hyperpolarisation im Licht und Depolarisation im Dunklen. Als Auslöser dieser Änderung in der Membranspannung wurde hauptsächlich die (In-)Aktivierung eines instantanen positiven Stromes in der Größÿe von etwa 35 pA festgestellt, vermutlich die H+-ATPase. - Die Abhängigkeiten des Anionenkanals, der einwärts und auswärts gleichrichtenden Kaliumkanäle und der Protonenpumpe von internen und externen Ionenkonzentrationen, dem pH-Wert und der Membranspannung wurden in einer biophysikalischen Simulation vereint. Zusammen mit den jeweiligen Leitfähigkeiten und Literaturdaten der Konzentrationsverläufe ergibt sich ein realistisches Modell der Flüsse zur Stomabewegung. - Aus dem Modell ergeben sich zwei wesentliche Voraussagen für das Zusammenwirken der Transportproteine: 1. Bei der Stomaöffnung muss die H+-ATPase zur Beendigung der Öffnung wieder deaktiviert werden, anderenfalls steigt die interne Kaliumkonzentration und das Membranpotential fällt auf Werte, die in Messungen nie gefunden wurden. Eine Desensitisierung der H+-ATPase wurde zwar nach Blaulicht-Pulsen bereits gemessen, jedoch nicht bei andauernder Beleuchtung. 2. Der bisher in Schließzellen noch nicht elektrophysiologisch nachgewiesene Protonen/Chlorid Kotransporter zum Import von Chlorid muss nicht nur während der Stomaöffnung aktiv sein, sondern erhält auch eine Rolle beim Stomaschluss. Da die cytosolische Chloridkonzentration deutlich unter der von Kalium liegt, würde die für den Efflux der beiden Ionen nötige Depolarisation bereits enden, wenn die Chloridkonzentration deutlich sinkt, also bevor auch die Konzentration von Kalium soweit abgenommen hätte, dass die Spaltöffnung geschlossen wäre. - Zur Messung interner Ionenkonzentrationen in intakten Schlieÿzellen wurden verschiedene Methoden der Beladung mit fluoreszierenden Indikatorfarbsto#en getestet. Die Beladung durch niedrigen pH, niedrige Temperatur oder der Farbstoffe als Acetoxymethyl-Ester kann bei Schließzellen von Vicia faba als nicht praktikabel angesehen werden. Lediglich eine Detergenz unterstützte Farbstoffbeladung wurde in der Literatur gefunden. - Zur parallelen Anwendung elektrophysiologischer Messungen und fluoreszenzbasierter Bestimmung von Ionenkonzentrationen wurde eine Technik der Druckinjektion über einen Kanal einer Doppel-Elektrode getestet. Diese Methode erlaubt die Farbstoffinjektion, allerdings hat sich die Spannungs-Klemm-Technik mit der für einen einzelnen Kanal einer Einstichelektrode notwendigen gepulsten Technik als nicht praktikabel erwiesen, da die Membranspannung vermutlich aufgrund nicht kompensierbarer Kapazitäten nicht die vorgegebenen Werte erreichte. N2 - While the function of stomata as well as of the different proteins involved in ion fluxes across the plasma membrane are well understood, a guard cell specific model for the concerted function and coordination is still missing. Results - KAT1, the inward rectifying potassium channel from Arabidopsis thaliana is well characterized in terms of structure and electrophysiological function. A knock-out mutant of this channel should be restrained in stomatal opening. Nevertheless under different conditions, with light or fusicoccin as opening stimulus, no difference could be found between wild type and KAT1::En-1 mutant plants. - Glucose is found to accumulate in guard cells during the day when stomata are opened and it is thus suggested to contribute to the osmotical pressure for opening. The uptake of a fluorescent glucose derivative was found to be light dependent and impaired by addition of CCCP which eliminates the proton gradient across the plasma membrane. - A knock-out mutant of the proton/sugar cotransporter protein AtSTP1 showed a significant reduction of cells showing 2-NBDG fluorescence as compared to the wild type. This shows a prominent contribution of this transporter to the uptake of glucose. - Changes of the free running membrane potential upon light/dark transitions were measured in guard cells of intact Vicia faba plants. A majority of these cells showed repeatable hyperpolarizations in light and depolarizations in darkness. These changes in potential were mainly driven by the (in-)activation of an instantaneous positive current of about 35 mA, most probably the H+-ATPase. - In a biophysical simulation, the dependence of anion channel, inward as well as outward rectifying potassium channels and proton pump on cytosolic and apoplastic ion concentrations, pH and membrane potential were included to build a model of ion fluxes for stomatal movements. Also included were literature values for channel conductance and the kinetics of concentrations during stomatal movements. - From this model, two main predictions were made for the cooperation of transport proteins in stomatal movements: 1. At the end of the opening phase of stomata, the H+-ATPase must be deactivated, since otherwise the cytosolic potassium concentration would rise and the membrane potential would decrease both to values that were never reproduced in measurements. A desensitization of the H+-ATPase was already found after pulses of blue light, but never upon permanent white light. 2. The proton/chloride cotransporter not only needs to be active during stomal opening for chloride uptake, but also during closure. Since in guard cells of open stomata, the concentration of potassium is higher than that of chloride, a 1:1 efflux of both ions would soon end the depolarization needed for further potassium efflux. To overcome this, a chloride cycle is suggested, where the cotransporter is active and keeps the net efflux of chloride small. - Different loading techniques were tested for fluorescent calcium indicator dyes. Incubation at low pH, for the free acid form as well as low temperature for the acetoxymethyl-ester forms of the dyes were shown to be impossible in Vicia faba guard cells. During the work on this thesis, one example for a detergent-aided loading of free acid dyes was published. - For parallel recording of electrophyiological parameters and cytosolic ion concentrations, an injection technique was tested that operates by regulated air pressure on one barrel of a double-barreled pipette. The other barrel was used for measurements of the membrane potential. Experiments with a discontinuous voltage clamp amplifier failed, since the target voltage was not reached probably due to non-compensable, variable pipette capacities. KW - Ackerbohne KW - Schließzelle KW - Ionenkanal KW - Ackerschmalwand KW - Schließzelle KW - Ionenkanal KW - Apoplast KW - Membranpotential KW - guard cell KW - ion channel KW - apoplast KW - membrane potential Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17098 ER - TY - THES A1 - Konrad, Kai Robert T1 - Untersuchung zu den frühen ABA-induzierten elektrischen Reaktionen in Schließzellen von Vicia faba T1 - Investigation of the early ABA-induced electric responses of Vicia faba guard cells N2 - Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Perzeption und frühe Signaltransduktion des Phytohormons ABA in Schließzellprotoplasten von Vicia faba mittels der Patch-Clamp-Technik untersucht. Es wurde entdeckt, dass der ABA-Signaltransduktionskette zur Aktivierung von Plasmamembran-ständigen Anionenkanälen voraussichtlich eine Proteinkinase beinhaltet und durch eine cytosolische ABA-Perzeption ausgelöst wird. Die durch ABA-bewirkte Anionenkanal-Aktivierung verursacht in Schließzellen eine Plasmamembran-Depolarisation. Basierend auf der ABA-induzierten Schließzellen-Depolarisation wurde zudem eine Methode etabliert, um mit dem Spannungs-sensitiven Farbstoff DiBAC4(3) in Populationen von intakten Vicia faba-Schließzellprotoplasten Membranpotential-Änderungen zu quantifizieren. N2 - Within the framework of this dissertation the perception and early signal transduction chain of the phytohormon ABA was investigated with the Patch-Clamp-technique in Vicia faba guard cell protoplasts. It was discovered that the ABA-signalling chain to activate plasma-membrane anion channels likely implied a protein kinase and was triggered through a cytosolic ABA-perception. The ABA-induced anion channel activation leads to plasma membrane depolarization. Based on the ABA-evoked depolarization response a method was developed to monitor and quantify membrane potential changes in populations of Vicia faba guard cell protoplasts with the voltage-sensitive dye DiBAC4(3). KW - Schließzelle KW - Membranpotenzial KW - Anionentranslokator KW - Ackerbohne KW - Abscisinsäure KW - DiBAC4(3) KW - guard cell KW - anion channel KW - membrane potential KW - abscisic acid KW - DiBAC4(3) Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27216 ER - TY - THES A1 - Jeworutzki, Elena T1 - Elektrophysiologische Untersuchungen zur frühen Erkennungsphase zwischen Pflanzen und Mikroorganismen T1 - Electrophysiological analyses of the early recognition phase between plants and microorganism N2 - An der pflanzlichen Plasmamembran geschieht die erste Wahrnehmung von mikrobiellen Molekülen, die MAMPs genannt werden. MAMP/PAMP Rezeptoren leiten frühe Abwehrantworten, wie die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), externe Alkalisierung oder Ethylen, ein. Die Arabidopsis FLS2 rezeptorartige Kinase (RLK) stellt einen plasmamembran-lokalisierten MAMP Rezeptor dar, der über die Detektion des Flagellum von Pseudomonas species, eine basale Immunität in Arabidopsis thaliana vermittelt. Flg22, der kürzeste aktive Teil des bakteriellen Flagellins besteht aus 22 Aminosäuren und ist der bestuntersuchte bakterielle Elizitor. In der vorliegenden Arbeit zeigen wir eine starke Beteiligung von Ionenflüssen in der Initiationsphase der basalen Immunität. Unsere Messungen an intakten Arabidopsis Pflanzen und Pflanzengeweben sind in höchstem Masse reproduzierbar und öffnen eine neue Sicht, über die Natur von Ionentransporten in der Pflanzen - Mikroben Interaktion. Als Antwort auf die Applikation von flg22, haben wir nach einer Verzögerungsphase von etwa 2 Minuten eine transiente, dosis-abhängige Depolarisation (EC50=0,2 nM) in Mesophyll- und Wurzelhaarzellen von A. thaliana messen können. Das um 2 Aminsäuren kürzere Peptid flg22 Δ2 oder das Flagellin anderer Bakterien (Agrobacterium or Azospirillum) führten zu keiner Membrandepolarisation. Ebenso konnten keine Membranspannungsänderungen in dem Arabidopsis Ökotypen Ws-0, dem der funktionelle FLS2 Rezeptor fehlt, detektiert werden. Die Komplementation von Ws-0 Pflanzen mit dem intakten FLS2 Rezeptorgen rief eine Resensibilisierung für flg22 hervor. Mit dem EF-Tu Elizitor Peptid aus E.coli, welches durch den Arabidopsis MAMP Rezeptor EFR detektiert wird, wurden ähnliche Ergebnisse erzielt. Auf der Basis von Aequorin wurden Kalzium-induzierte Lumineszenzmessungen durchgeführt, in denen ein transienter Anstieg der zytosolischen Kalziumkonzentration als Antwort auf die Applikation von flg22 gemessen werden konnte. Dosis-Abhängigkeitsmessungen von flg22 und [Ca2+]cyt wiesen zwei unterschiedliche EC50 Werte, von 43 ± 2 pM und 67 ± 42 nM, auf. Möglicherweise wird auf zwei verschiedene Kalziumpools zugegriffen oder es werden zwei verschiedene Kalziumleitfähigkeiten aktiviert. Die Ionenkanalaktivierung und folgende Depolarisation benötigt die aktive Rezeptorkinase. In bak1-4 Arabidopsis Pflanzen, in denen die FLS2 Untereinheit BAK1 – eine weitverbreitete RLK, die auch mit dem Brassinosteroid Rezeptor assoziiert ist – fehlt, konnte keine Depolarisation als Antwort auf flg22 gemessen werden. Arabidopsis Mesophyllzellen zeigten die typische Alkalisierung des Apoplasten als Antwort auf flg22. Nicht-invasive MIFETM Experimente mit Ionen-selektiven Elektroden ergaben, dass der pH-Anstieg durch einen Einstrom von Protonen hervorgerufen wurde. Zusätzlich wurde ein Ausstrom von Chlorid und Kalium aufgezeichnet. Ähnlich wie das Kalziumsignal waren alle detektierten Ionenströme von transienter Natur. Im zweiten Ansatz wurden Membranpotential-Messungen durchgeführt, während in der externen Lösung die Konzentrationen von Protonen, Kalzium, Kalium oder Anionen variiert wurden. Nur eine Änderung des Anionengradienten hatte einen entscheidenden Einfluss auf die flg22-induzierte Depolarisation, was die Wichtigkeit der Anionenkanalaktivierung unterstreicht. Exudat Analysen ergaben, dass Nitrat das bevorzugt transportierte Ion ist. Unter zahlreichen getesteten Ionenkanalblockern erwies sich lediglich Lanthan als effektiver Blocker des flg22-induzierten zytosolichen Kalziumanstiegs, des Protoneneinstroms und der Membrandepolarisation. Da Lanthan bekanntlich unspezifische Kationenkanäle blockt, kann man an diesem Punkt davon ausgehen, dass Kalzium-aktivierte Anionenkanäle die Membrandepolarisation vermitteln und darauf eine Aktivierung von auswärtsgerichteten Kaliumkanälen folgt. Zukünftige Studien mit Doppelläufigen-Mikroelektroden Spannungsklemmexperimenten oder externen ionenselektiven Elektroden an intakten Schliesszellen werden helfen weitere Informationen über die Natur der Ionenkanäle in der basalen Immunität oder generell in der Pflanzen-Mikroben Interaktion zu erhalten. Über die elektrophysiologische Charakterisierung der multiplen Ionenströme in der basalen Immunität hinaus, ist natürlich der nächste wichtige Schritt das oder die Gene zu finden, die für die Ionenkanäle oder Transporter kodieren, die durch nicht nekrotisierende Elizitoren wie flg22 in der basalen Immunantwort in Pflanzen aktiviert werden. N2 - The plant plasma membrane represents the first site for recognition of microbial patterns called MAMPs. MAMP receptors mediate early defense responses including production of reactive oxygen species (ROS), external alkalinisation or ethylene. The Arabidopsis FLS2 receptor-like kinase (RLK) represents a plasma-membrane localized MAMP receptor that provides for innate immunity in Arabidopsis thaliana plants by specifically recognizing the flagellum (flg) of Pseudomonas species. Flg22, the shortest active part of flagellin, composed by 22 aminoacids is the best established bacterial elicitor that. About the role of ion channels in innate immunity nothing was known yet. In the current work we show a strong involvement of ion fluxes in the initiating phase of innate immunity. Our measurements on intact Arabidopsis plants and plant tissues are highly reproducible and open a new view of ion channel functions in plant microbe interactions. In response to the application of flg22, after a delay of about 2 minutes, we recorded a transient, dose-dependent depolarization (EC50=0.2 nM) in mesophyll and root hair cells of A. thaliana. Following wash-out of the peptide elicitor and recovery of the membrane potential to resting potential values within 70 ± 9 min, depolarizations could be elicited several times. No membrane depolarization was evoked upon application of flg22Δ2, a truncated flg22 peptide, or by application of flagellin from other bacteria (Agrobacterium or Azospirillum). Likewise, depolarization was not observed in the natural knockout mutant of the Arabidopsis ecotype Ws-0 lacking the functional FLS2 receptor. Complementation of transgenic Ws-0 plants with the functional FLS2 receptor restored flg22 sensitivity, indicating that FLS2 is essential for flg22 evoked membrane potential changes. Similar results were obtained using the E. coli EF-Tu elicitor peptide elf18, which is recognized by the Arabidopsis MAMP receptor EFR. Aequorin based calcium measurements allowed us to record a transient increase in cytosolic calcium concentration in response to applied flg22. Dose-response studies revealed two distinct EC50 values for the calcium response of 43 ± 2 pM and 67 ± 42 nM respectively. This indicates that two different calcium pools or two different calcium permeabilities in the plasma membrane were activated by flg22. In line with a requirement of receptor-kinase activity for ion channel activation and subsequent depolarization, the latter was completely blocked by the kinase inhibitor K-252a. In bak1-4 Arabidopsis plants, lacking the FLS2 subunit BAK1 – a promiscuous RLK also associated with the brassinosteroid receptor - no depolarisation was measured in response to flg22. This indicated that both RLKs – FLS2 and BAK1 – are required for flagellin induced ion channel activation. Arabidopsis mesophyll cells showed the typical alkalinization of the apoplast in response to flg22. Noninvasive experiments with vibrating ion-selective electrodes revealed that this pH rise was due to an influx of protons. In addition an efflux of chloride and potassium was recorded. All fluxes were transient in nature, as was the observed calcium signal. Simultaneous measurements using two ion-selective electrodes showed a delay of the potassium efflux in comparison to the other ions that participate in the flg22 response. In the second approach, membrane potential measurements were performed while changing extracellular concentrations of protons, calcium, potassium or anions. Changing the anion gradient had the greatest impact on flg22 induced depolarization, suggestive of anion channel activation. Exudates analyses of flg22 treated leaves revealed that nitrate was the favored anion transported. Among many putative channel blocking agents tested, only lanthanum was identified to be potent in blocking the flg22 induced the cytosolic calcium rise, proton influx, and membrane potential depolarization. Since lanthanum represents a non-specific cation channel blocker, we favor to conclude that a calcium dependent activation of anion channels mediated membrane potential depolarization and consequently outward rectifying potassium channels. Future studies with double-barreled microelectrode voltage-clamp or external ion selective electrodes on intact guard cells may help to gain further information about the nature of ion channels in innate immunity or plant microbe interaction in general. Of course, all over the electrophysiological characterization of the multiple ion fluxes in innate immunity the next important step would be to discover the gene(s) coding for ion channels or transporters activated by non necrotic elicitors as flg22 in the innate immune response of plants. KW - Calcium KW - Induzierte Resistenz KW - Ackerschmalwand KW - Ionenkanal KW - Elektrophysiologie KW - Pseudomonas syringae KW - Membranpotenzial KW - Flagelline KW - Ionenkanäle KW - Anionen KW - Rezeptorkinasen KW - basale Immunität KW - Einstichmessungen KW - innate immunity KW - Calcium KW - Anion KW - ion channels KW - receptor kinases KW - flagellin KW - membrane potential KW - Pseudomonas syringae KW - Arabidopsis thaliana Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-47489 ER - TY - THES A1 - Baumann, Melanie T1 - Optogenetische Simulation und Analyse elektrischer und Calcium-basierter Signale in Pflanzen T1 - Optogenetic simulation and analysis of electrical and Calcium based signals in plants N2 - Funktionelle Expression von ChR2 in Pflanzen In der vorliegenden Arbeit konnte erstmalig die funktionelle Expression des licht-aktivierten Channelrhodopsin-2 aus Chlamydomonas reinhardtii in höheren Pflanzen gezeigt werden. Obwohl die erfolgreiche Transformation auf der Basis der Integration einer Expressionskassette für WT-ChR2 in Pflanzen genetisch nachgewiesen werden konnte, war ein funktioneller Nachweis nicht möglich. Demgegenüber war die funktio-nelle Expression aller getesteten ChR2-Mutanten im transienten Expressionsansatz er-folgreich und konnte schließlich auf der Basis der im Rahmen dieser Arbeit generierten Konstrukte auch für stabil transformierte Arabidopsis-Pflanzen bestätigt werden. ChR2 wurde in Arabidopsis-Protoplasten sowie Tabak-Epidermis- und Mesophyllzellen an der Plasmamembran lokalisiert, zeigte jedoch aufgrund der Überexpression eine starke Überladung des Endomembransystems. Elektrophysiologische Messungen mit Hilfe der Einstichtechnik belegten, dass ChR2 sowohl in Arabidopsis-Keimlingen als auch im Tabakmesophyll funktionell ist, wobei sich die erzeugten Blaulicht-vermittelten Depolarisationen weitaus erfolgreicher im Ta-baksystem darstellten. Alle eingesetzten ChR2-Mutanten waren funktionell und zeigten in Einstichmessungen mit Oozytendaten korrelierende Kinetiken. Die Mutante C128A wurde hinsichtlich der erzielten lichtinduzierten Membranpotentialdepolarisationen als effektivste ChR2-Variante identifiziert. Calcium-Messungen mit dem Reporterprotein Aequorin lieferten keinen Beweis für einen direkt durch ChR2-C128A vermittelten Calcium-Einstrom in Arabidopsis-Protoplasten. Jedoch konnte ein cytosolischer Calcium-Anstieg ca. 3min nach Blau-lichtapplikation beobachtet werden. Dies deutet darauf hin, dass die durch ChR2 vermittelten Membranpotentialänderungen zu einer Aktivierung endogener, Calcium-permeabler Ionenkanäle führen könnte. Für die ChR2-L132C Mutante konnte allerdings in ersten Messungen ein direkter Calcium-Anstieg nach Lichtgabe beobachtet werden.   Transkriptionelle Änderungen aufgrund ChR2-basierter, elektrischer Signalmuster In RNA-Seq-Analysen mit transient transformierten Tabakblättern konnte die Bedeu-tung der Signalsignatur elektrischer bzw. Calcium-basierter Signale verifiziert werden: Die Applikation zweier in ihrer Form gänzlich unterschiedlicher elektrischer Signal-muster lieferte ein signifikant unterschiedlich reguliertes Set an Genen, wobei einige wenige durch beide Behandlungen induziert werden konnten. Langanhaltende Depolari-sationen regulierten deutlich mehr Gene und waren daher in ihrer Wirkung weitaus ef-fektiver als kurze, repetitive Depolarisationen. Die bioinformatische Analyse dieser Daten zeigte, dass die Nachahmung eines im Zuge der Pathogenantwort bekannten, langen Depolarisationspulses Gene der Flagellin-induzierten Signaltransduktion adressierte, während kurze, wiederkehrende Pulse mit gleichem Informationsgehalt diese nicht regulierten. N2 - Functional expression of ChR2 in plants The current work for the first time proves the functional expression of the light gated ChR2 derived from the unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii in higher plants. In line with its function ChR2 was localized primarily at the plasma membrane in Ara-bidopsis protoplasts and Tobacco epidermal and mesophyll cells. However, overexpres-sion as well as codon-usage often resulted in overloading of the endomembrane system such as Golgi and ER. Electrophysiological recordings by means of the impalement technique proved ChR2 function in Arabidopsis seedlings as well as Tobacco mesophyll cells. Blue light induced depolarization, however, was more efficient in the Tobacco system. In contrast to the WT protein all ChR2-mutants tested in this study were shown to be functional. Channel kinetics gained from Xenopus oocyte TEVC measurements corre-lated well with observed depolarization and repolarization kinetics of individual mu-tants. Highest depolarization levels were generated by the mutant C128A. Using the Calcium reporter Aequorin, measurements provided no evidence for ChR2-C128A mediated Calcium-influx in Arabidopsis protoplasts. However, a delayed Cal-cium increase approximately 3min following blue light application suggests that ChR2 mediated membrane potential changes activated endogenous Calcium permeable ion channels. Preliminary experiments using the L132C mutant showed cytosolic Calcium elevation directly after light stimulation. All ChR2 mutants tested in this study are suited for generating defined depolarization patterns in plants, whereas simulation of specific Calcium signatures seems possible with ChR2 variants based on the L123C mutation. Transcriptional changes based on ChR2-mediated, electrical patterns Transcriptional analyses of transiently transformed Tobacco leaves verified the im-portance of signature shape of electrical or Calcium-based signals in plants: Application of two blue light triggered depolarization patterns differing in shape revealed two sets of significantly differentially regulated genes, although a small number of genes was regulated by both stimuli. Sustained depolarizations regulated more genes and thus turned out to be more effective than short, repetitive depolarizations. Bioinformatic analyses of the data generated by RNA-Seq revealed the power of elec-trical signal application. Mimicking known electrical pathogen responses by applying a sustained depolarization pattern indeed addressed genes involved in flagellin signaling. In contrast, repetitive depolarization pulses regulated a completely different set of genes. KW - Channelrhodopsin-2 KW - Calcium KW - Membranpotential KW - membrane potential KW - Pflanzen Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-87974 ER -