TY  - THES
A1  - Godbole, Amod Anand
T1  - A new paradigm in GPCR signaling at the trans-Golgi network of thyroid cells
T1  - Ein neues Model der GPCR Signaltransduktion am trans-Golgi-Netzwerk von Schilddrüsenzellen
N2  - Whereas G-protein coupled receptors (GPCRs) have been long believed to signal through cyclic AMP exclusively at cell surface, our group has previously shown that GPCRs not only signal at the cell surface but can also continue doing so once internalized together with their ligands, leading to persistent cAMP production. This phenomenon, which we originally described for the thyroid stimulating hormone receptor (TSHR) in thyroid cells, has been observed also for other GPCRs. However, the intracellular compartment(s) responsible for such persistent signaling and its consequences on downstream effectors were insufficiently characterized. The aim of this study was to follow by live-cell imaging the trafficking of internalized TSHRs and other involved signaling proteins as well as to understand the consequences of signaling by internalized TSHRs on the downstream activation of protein kinase A (PKA). cAMP and PKA
activity was measured in real-time in living thyroid cells using FRET-based sensors Epac1-camp and AKAR2 respectively. The results suggest that TSH co-internalizes with its receptor and that the internalized TSH/TSHR complexes traffic retrogradely to the trans-Golgi network (TGN). This study also provides evidence that these internalized TSH/TSHR complexes meet an intracellular pool of Gs proteins in sorting endosomes and in TGN and activate it there, as visualized in real-time using a conformational biosensor nanobody, Nb37. Acute Brefeldin A-induced Golgi collapse hinders the retrograde trafficking of TSH/TSHR complexes, leading to reduced cAMP production and PKA signaling. BFA pretreatment was also able to attenuate CREB phosphorylation suggesting that an intact Golgi/TGN organisation is essential
for an efficient cAMP/PKA signaling by internalized TSH/TSHR complexes. Taken together this data provides evidence that internalized TSH/TSHR complexes meet and activate Gs proteins in sorting endosomes and at the TGN, leading to a local activation of PKA and consequently increased CREB activation. These findings suggest unexpected functions for receptor internalization, with major pathophysiological and pharmacological implications.
N2  - G-Protein-gekoppelte Rezeptoren sind nur in Eukaryonten vorhandeln und bilden die größte und diverseste Familie von Zellmembranrezeptoren. Sie reagieren auf eine vielfältige Gruppe von Stimuli die verschiedene Effektoren aktivieren und damit nachgelagerte Signalkaskaden auslösen, die letztlich entscheidend für die Zellphysiologie sind. Die Regelung der Ligand-vermittelten Signaltransduktion wird hauptsächlich durch die Desensibilisierung des GPCR mittels Dephosphorylierung (katalysiert durch GRK) und zusätzlich durch Internalisierung des GPCR gesteuert. Die Annahme, dass GPCRs für cAMP nur an der Zellmembran signalisieren und nicht mehr sobald sie in die Zelle internalisiert wurden, konnte durch wegweisende unabhängige Forschung an GPCRs im Besonderen an TSHR und PTHR geändert werden. So konnte gezeigt werden, dass sie für cAMP nicht nur an der Zellmembran signalisieren, sondern auch, wenn sie in intrazelluläre Zellkompartimente internalisiert wurde. Dieses Phänomen („sustained signaling“ hier „anhaltende Signalisierung“) wurde seitdem für andere GPCRs (z.B. 2-AR, V2R und LHR) beschrieben. Aber die Zellkompartimente wurden für nachhaltige intrazelluläre Signale nicht ausreichend charakterisiert. Das Ziel dieser Arbeit war es die Bewegung und die dynamische Natur der möglichen signalisierenden Kompartimente mittels „real-time TIRF“-Mikroskopie und die Signalisierung unter Verwendung von „real-time FRET“ in primären Maus Schilddrüsenzellen zu untersuchen.
Die vorliegende Arbeit berichtet, dass TSH/TSHR Komplexe internalisieren und ein signifikanter Teil, welcher vom Retromer Komplex angeführt wird, gelangt über den retrograden (rückwärts gerichteten) Transport in das trans-Golgi-Netzwerk (TGN). Diese TSH/TSHR-Komplexe treffen nicht in den frühen Endosomen auf die Gs-Proteine, sondern in den „Sortierer Endosomen“ und in dem TGN. Ein direkter Beweis für Gs Protein Aktivierung und Signaltransduktion am TGN und in Sortierer Endosomen konnte mittels des nanobody Nb37, einem spezifischen Biosensor für das aktive Gs Protein, erbracht werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Sequestrierung von Nb37 an diesen Kompartimenten ein szintillierendes Verhalten in Zeit und Raum zeigt. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass die katalytische Untereinheit der PKA am Golgi/TGN angereichert ist. Die Behandlung mit Brefeldin A führt zum Verlust dieser PKA Lokalisation am Golgi. Die Beschädigung und Reorganisation des TGN durch Brefeldin A führt zu a) einer abgeschwächten cAMP Reaktion b) einer dreiphasigen PKA Reaktion charakterisiert durch eine schnelle erste Phase, eine langsame (deutlich abgeschwächte) zweite Phase und eine verzögerte dritte Phase und schließlich c) einer abgeschwächte CREB Phosphorylierung. Es gibt Anzeichen dafür, dass die Reorganisation des TGN Kompartimente betrifft, die verantwortlich für intrazelluläre cAMP- und PKA-Signalisierung sind. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das TGN eines der Kompartimente ist, das für die anhaltende TSHR-Signalisierung verantwortlich ist.
KW  - G-Protein gekoppelte Rezeptoren
KW  - GPCR
KW  - thyroid stimulating hormone receptor
KW  - trans-Golgi network
KW  - Signaltransduktion
KW  - Golgi-Apparat
KW  - Schilddrüse
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-147159
ER  - 
TY  - THES
A1  - Wobbe, Thomas
T1  - Beeinflussung der Signaltransduktion des humanen Parathormon (PTH)-2 Rezeptors mittels Einzel- und Kombinationsmutationen
T1  - Signaling characteristics of the human type 2 receptor for parathyroid hormone using receptor chimeras
N2  - Parathormon (PTH) aktiviert am PTH-1 Rezeptor (P1R) mindestens zwei Signalwege: Über Guanosintriphosphat-bindende Proteine (Gs) kommt es intrazellulär zu einem Anstieg von zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) und zu einer Aktivierung der Proteinkinase A (PKA). Gq Protein-vermittelt erfolgt eine Aktivierung der Phospholipase C (PLC) und ein intrazellulärer Anstieg des Inositoltriphosphat (IP3). Der verwandte PTH-2 Rezeptor (P2R) wird einerseits durch seinen vermutlich physiologischen Liganden, das tuberoinfundibuläre Peptid (TIP39), und andererseits durch PTH aktiviert. Im Gegensatz zum P1R zeigt der P2R nur eine Ankopplung an den cAMP Signalweg und keine an den PLC Signalweg. Voruntersuchungen hatten gezeigt, dass intrazelluläre Abschnitte der zweiten und dritten Schleife sowie Bereiche des C-Terminus des P1R für die Aktivierung des PLC Signalweges verantwortlich sind. In der vorliegenden Dissertation erfolgte eine stufenweise Angleichung intrazellulärer Abschnitte des P2R an den P1R. Die generierten Hybridrezeptoren wurden hinsichtlich ihres Signaltransduktionsverhaltens untersucht. Mit der Bestimmung der akkumulierten Gesamtinositole und des intrazellulären Calciums [Ca]i konnte gezeigt werden, dass trotz einer 95%-igen Übereinstimmung der intrazellulären Aminosäuresequenzen der P2R-Hybridrezeptoren mit denen des P1R, die Ankopplung an den PLC Signalweg nicht übertragen werden kann. Diese Ergebnisse wurden für Stimulationen mit PTH und TIP39 nachgewiesen. Durch Hemmung der Proteinkinasen A und C konnte, wie erwartet, am P1R ein verstärktes IP3 Signal beobachtet werden. Eine Aktivierbarkeit des PLC Signalweges wurde auch hierbei für die Hybridrezeptoren nicht gesehen. Für die Aktivierung des cAMP Signalweges der Hybridrezeptoren konnte beobachtet werden, dass diese sich weitestgehend in Anlehnung zum P2R verhalten. Außerdem konnte gezeigt werden, dass für eine effiziente Ankopplung an den cAMP Signalweg alle aus dem P1R in den P2R einfügten Teilabschnitte (zweite, dritte Schleife und C-Terminus) zusammenwirken. Der Hybridrezeptor, an dem alle drei Teilabschnitte ausgetauscht wurden, führte zu einer signifikant besseren Ankopplung an den cAMP Signalweg, als die Einzelmutation des C-Terminus. Die Messung zum cAMP Signalweg wurden mit den Liganden TIP39 und PTH durchgeführt. Für die Aktivierung des Gs Protein-vermittelten cAMP Signalweg am P1R oder P2R sind daher vermutlich Interaktionen verschiedener Rezeptorabschnitte verantwortlich. Insgesamt konnten in dieser Arbeit weitere wichtige Erkenntnisse bezüglich unterschiedlicher Aspekte der Signaltransduktion des P1R und des P2R gewonnen werden.
N2  - Activation of the phospholipase C (PLC) pathway upon stimulation with PTH is unique to the PTH-1 receptor (P1R) and is virtually absent in the PTH-2 receptor (P2R). The sites of P1R mutations known to reduce PLC signaling may achieve this indirectly by disturbing coupling at other sites. We therefore chose a more stringent approach and attempt to reestablish PLC signaling in the closely (70%) related P2R by gradually adapting the P2Rs cytosolic interface to a P1R-like sequence by engineering hybrid P1R/P2R constructs. Key differing regions of the P1R´s second loop (DT272-273:EK), third loop (IW344-345:LR), and C-terminal tail (T440-end: K-end) were put into the P2R. A fourth chimeric P1R/P2R receptor, combining all these changes, thus had a > 90% sequence identity with the cytosolic interface of the P1R. All mutants were expressed on the cell surface of stably transfected HEK 293 cells, using a radioreceptor assay with [125I]-Nle8,21-Tyr34-rat PTH(1-34), with a similar density of 1.1 to 2.5 mio receptors/cell. Activation of the PLC pathway was assessed by: 1) accumulation of total inositol phosphates in myo[3H]-inositol-prelabeled cells. No increase was detectable in the P2R or any of the receptor chimeras, even after enhancing the possible response by blockade of protein kinases A and C, despite an up to 13-fold increase with the P1R upon PTH stimulation. 2) Similarly, a PTH-induced increase in intracellular calcium (detected by fluo-3) of the wildtype P1R with as little as 1 nM hPTH(1-34) was completely absent in all mutants as well as in the P2R. The PTH-induced max. response of the cyclic AMP pathway was virtually identical for the P1R and P2R. However, the max. response of the mutant with the P1R tail sequence was reduced to only 35% (PTH) and 26% (TIP39) of the P2R response. Surprisingly, this signaling loss could be overcome by introducing more P1R sequence into the second and third cytoplasmic loop of this P1R/P2R hybrid receptor thus regaining a max. cAMP response of 64% (PTH) and 85% (TIP39). Presumably, an interaction of P1R sequences seems to result in a more effective coupling to the cAMP signaling pathway. In conclusion, these results suggest that the activation of the IP / intracellular calcium signaling pathway by the P1R is highly dependent on a P1R-like intracellular contact interface, which can not be mimicked easily even in the presence of > 90% of P1R sequence in the cytosolic interface of the P2R.
KW  - Parathormon
KW  - Epithelkörperchen
KW  - Signaltransduktion
KW  - Cyclo-AMP
KW  - Inosittriphosphate <myo->
KW  - Ligand <Biochemie>
KW  - Rezeptor-Kinasen
KW  - Wirkstoff-Rezep
KW  - PTH-1 Rezeptor
KW  - PTH-2 Rezeptor
KW  - TIP39
KW  - Calcium
KW  - GPCR
KW  - PTH-1 receptor (P1R)
KW  - PTH-2 receptor (P2R)
KW  - PLC signaling
KW  - cAMP signaling pathway
Y1  - 2007
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27880
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Maiellaro, Isabella
A1  - Lohse, Martin J.
A1  - Kitte, Robert J.
A1  - Calebiro, Davide
T1  - cAMP Signals in Drosophila Motor Neurons Are Confined to Single Synaptic Boutons
JF  - Cell Reports
N2  - The second messenger cyclic AMP (cAMP) plays an important role in synaptic plasticity. Although there is evidence for local control of synaptic transmission and plasticity, it is less clear whether a similar spatial confinement of cAMP signaling exists. Here, we suggest a possible biophysical basis for the site-specific regulation of synaptic plasticity by cAMP, a highly diffusible small molecule that transforms the physiology of synapses in a local and specific manner. By exploiting the octopaminergic system of Drosophila, which mediates structural synaptic plasticity via a cAMP-dependent pathway, we demonstrate the existence of local cAMP signaling compartments of micrometer dimensions within single motor neurons. In addition, we provide evidence that heterogeneous octopamine receptor localization, coupled with local differences in phosphodiesterase activity, underlies the observed differences in cAMP signaling in the axon, cell body, and boutons.
KW  - cAMP
KW  - synaptic plasticity
KW  - PDE
KW  - octopamine
KW  - FRET
KW  - active zone
KW  - dunce
KW  - GPCR
Y1  - 2016
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-162324
VL  - 17
IS  - 5
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schneider, Matthias
T1  - Characterisation of Metalloprotease-mediated EGFR Signal Transactivation after GPCR Stimulation
T1  - Charakterisierung der EGFR Signaltransaktivierung nach GPCR Stimulation
N2  - In the context of metalloprotease-mediated transactivation of the epidermal growth factor receptor, different monoclonal antibodies against ADAM17 / TACE were characterized for their ability to block the sheddase. Activity of some of them was observed at doses between 2µg/mL and 10µg/mL. Kinetic analyses showed their activity starting at around 30 minutes. In cellular assays performed with the antibodies, especially upon treatment of cells with sphingosine-1-phosphate a reduction in proliferation was observed with some candidates. Moreover this study provides potential new roles for ß-Arrestins. Their involvement in the triple membrane-passing signal pathway of EGFR transactivation was shown. Furthermore, in overexpressing cellular model systems, an interaction between ADAM17 and ß-Arrestin1 could be observed. Detailed analysis discovered that phosphorylation of ß-Arrestin1 is crucial for this interaction. Additionally, the novel mechanism of UV-induced EGFR transactivation was extended to squamous cell carcinoma. The mechanism happens in a dose dependent manner and requires a metalloprotease to shed the proligand Amphiregulin. The involvement of both ADAM9 and ADAM17, being the metalloproteases responsible for this cleavage, was shown for SCC9 cells.
N2  - Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene monoklonale Antikörper gegen ADAM17 / TACE im Kontext der Metalloprotease-vermittelten Transaktivierung des Epidermalen Wachstumsfaktors auf ihre Fähigkeit hin untersucht, die Proteaseaktivität zu unterdrücken. Einige von Ihnen zeigten inhibitorische Aktivität bei Konzentrationen zwischen 2µg/ml und 10µg/ml. Die Untersuchung der Zeitabhängigkeit ihrer Wirkungsweise ergab eine Aktivität ab 30 Minuten Vorinkubation. In zellulären Versuchen konnte eine Verminderung der Proliferation besonders nach Stimulation mit Sphingosin-1-Phosphat gezeigt werden. Darüber hinaus konnten möglich neue Funktionen von ß-Arrestinen gezeigt werden. Eine Beteiligung am „triple membrane-passing“ Signalwegs der Transaktivierung des Epidermalen Wachstumsfaktors wurde dargestellt. Zudem wurde eine Interaktion von ß-Arrestin1 und ADAM17 in überexprimierenden Zellsystemen gezeigt. Detaillierte Analysen belegten, dass die Phosphorylierung von ß-Arrestin1 eine notwendige Voraussetzung dafür ist. Weiterhin wurde der neue Mechanismus der UV-vermittelten Aktivierung des epidermalen Wachstumsfaktors auf Plattenephithelkarzinom-Zellen ausgeweitet. Er findet in einer dosisabhängigen Form statt und bedarf einer Metalloprotease zum Aktivieren des Liganden Amphiregulin. Sowohl ADAM9 als auch ADAM17 wurden als die verantwortlichen Metalloproteasen in den untersuchten SCC9 Zellen ermittelt.
KW  - Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor
KW  - G-Protein gekoppelte Rezeptoren
KW  - Metalloprotease
KW  - Krebs <Medizin>
KW  - EGF Rezeptor
KW  - Transaktivierung
KW  - GPCR
KW  - UV
KW  - EGFR Transactivation
KW  - Metalloprotease
KW  - GPCR
KW  - Cancer
KW  - UV
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65105
ER  - 
TY  - THES
A1  - Hart, Stefan
T1  - Characterisation of the molecular mechanisms of EGFR signal transactivation in human cancer
T1  - Charakterisierung der molekularen Mechanismen der EGFR-Transaktivierung in humanen Tumoren.
N2  - In a variety of established tumour cell lines, but also in primary mammary epithelial cells metalloprotease-dependent transactivation of the EGFR, and EGFR characteristic downstream signalling events were observed in response to stimulation with physiological concentrations of GPCR agonists such as the mitogens LPA and S1P as well as therapeutically relevant concentrations of cannabinoids. Moreover, this study reveals ADAM17 and HB-EGF as the main effectors of this mechanism in most of the cancer cell lines investigated. However, depending on the cellular context and GPCR agonist, various different members of the ADAM family are selectively recruited for specific ectodomain shedding of proAR and/or proHB-EGF and subsequent EGFR activation. Furthermore, biological responses induced by LPA or S1P such as migration in breast cancer and HNSCC cells, depend on ADAM17 and proHB-EGF/proAR function, respectively, suggesting that highly abundant GPCR ligands may play a role in tumour development and progression. Moreover, EGFR signal transactivation could be identified as the mechanistic link between cannabinoid receptors and the activation of mitogen activated protein kinases (MAPK) ERK1/2 as well as pro-survival Akt/PKB signalling. Depending on the cellular context, cannabinoid-induced signal cross-communication was mediated by shedding of proAmphiregulin and/or proHB-EGF by ADAM17. Most importantly, our data show that concentrations of THC comparable to those detected in the serum of patients after THC administration accelerate proliferation of cancer cells instead of apoptosis and thereby may contribute to cancer progression in patients.
N2  - Im Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass in verschiedenen etablierten Tumorzelllinien, aber auch in primären Brustepithelzellen sowohl physiologische Konzentrationen von GPCR Liganden, wie z.B. den Mitogenen LPA und S1P, als auch therapeutische Konzentrationen von Cannabinoiden zur metalloproteaseabhängigen Aktivierung des EGFRs führen. Abhängig von diesem Mechanismus konnte die Aktivierung der mitogenen Ras/MAPK-Kaskade als auch des antiapoptotischen Akt/PKB Signalweges beobachtet werden. Untersuchungen mit Hilfe der siRNA-Technik oder dominant-negativen Konstrukten identifizierten ADAM17 sowie den EGFR-Liganden HB-EGF als wichtigste Komponenten dieses Signalweges. Abhängig vom Zellsystem konnte aber auch eine Beteiligung anderer Mitglieder der ADAM Familie sowie des EGFR-Liganden Amphiregulin nachgewiesen werden. Weiterhin konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die durch LPA und S1P induzierten biologische Prozesse, wie z.B. die Migration in Brustkrebs- oder HNSCC-Zellen, vollständig von der Aktivität von ADAM17 und HB-EGF/AR abhängig waren. Außerdem konnte die ADAM17- und HB-EGF/AR-vermittelte EGFR-Transaktivierung als Bindeglied zwischen Cannabinoid-Rezeptoren und MAPK- und Akt-Aktivierung sowie erhöhter Zellproliferation identifiziert werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstreichen die Rolle der EGFR Signaltransaktivierung und dadurch induzierter biologischer Antworten wie Zellmigration oder –proliferation in Tumorzellen, und sollten darüber hinaus zu einer Neubewertung der Krebstherapie mit Cannabinoiden führen.
KW  - Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor
KW  - Krebs <Medizin>
KW  - Signaltransduktion
KW  - EGFR
KW  - GPCR
KW  - Transaktivierung
KW  - Krebs
KW  - Metalloprotease
KW  - EGFR
KW  - GPCR
KW  - transactivation
KW  - cancer
KW  - metalloprotease
Y1  - 2004
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-10067
ER  - 
TY  - THES
A1  - Anton, Selma
T1  - Characterization of cAMP nanodomains surrounding the human Glucagon-like peptide 1 receptor using FRET-based reporters
T1  - Charakterisierung der Rezeptor-assoziierten cAMP Nanodomänen des humanen Glucagon-like peptide 1 Rezeptors mittels FRET-basierter Sensoren
N2  - Cyclic adenosine monophosphate (cAMP), the ubiquitous second messenger produced upon stimulation of GPCRs which couple to the stimulatory GS protein, orchestrates an array of physiological processes including cardiac function, neuronal plasticity, immune responses, cellular proliferation and apoptosis. By interacting with various effector proteins, among others protein kinase A (PKA) and exchange proteins directly activated by cAMP (Epac), it triggers signaling cascades for the cellular response. Although the functional outcomes of GSPCR-activation are very diverse depending on the extracellular stimulus, they are all mediated exclusively by this single second messenger. Thus, the question arises how specificity in such responses may be attained. A hypothesis to explain signaling specificity is that cellular signaling architecture, and thus precise operation of cAMP in space and time would appear to be essential to achieve signaling specificity. Compartments with elevated cAMP levels would allow specific signal relay from receptors to effectors within a micro- or nanometer range, setting the molecular basis for signaling specificity. Although the paradigm of signaling compartmentation gains continuous recognition and is thoroughly being investigated, the molecular composition of such compartments and how they are maintained remains to be elucidated. In addition, such compartments would require very restricted diffusion of cAMP, but all direct measurements have indicated that it can diffuse in cells almost freely.
In this work, we present the identification and characterize of a cAMP signaling compartment at a GSPCR. We created a Förster resonance energy transfer (FRET)-based receptor-sensor conjugate, allowing us to study cAMP dynamics in direct vicinity of the human glucagone-like peptide 1 receptor (hGLP1R). Additional targeting of analogous sensors to the plasma membrane and the cytosol enables assessment of cAMP dynamics in different subcellular regions. We compare both basal and stimulated cAMP levels and study cAMP crosstalk of different receptors. With the design of novel receptor nanorulers up to 60nm in length, which allow mapping cAMP levels in nanometer distance from the hGLP1R, we identify a cAMP nanodomain surrounding it. Further, we show that phosphodiesterases (PDEs), the only enzymes known to degrade cAMP, are decisive in constraining cAMP diffusion into the cytosol thereby maintaining a cAMP gradient. Following the discovery of this nanodomain, we sought to investigate whether downstream effectors such as PKA are present and active within the domain, additionally studying the role of A-kinase anchoring proteins (AKAPs) in targeting PKA to the receptor compartment. We demonstrate that GLP1-produced cAMP signals translate into local nanodomain-restricted PKA phosphorylation and determine that AKAP-tethering is essential for nanodomain PKA.
Taken together, our results provide evidence for the existence of a dynamic, receptor associated cAMP nanodomain and give prospect for which key proteins are likely to be involved in its formation. These conditions would allow cAMP to exert its function in a spatially and temporally restricted manner, setting the basis for a cell to achieve signaling specificity. Understanding the molecular mechanism of cAMP signaling would allow modulation and thus regulation of GPCR signaling, taking advantage of it for pharmacological treatment.
N2  - G Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) stellen eine große und sehr vielfältige Familie an Membranproteinen dar, deren primäre Funktion die Signalübertragung von extrazellulären Stimuli in intrazelluläre Signale ist. Dank ihrer breiten Expression im gesamten menschlichen Körper regulieren sie unterschiedliche zelluläre Prozesse und damit deren physiologische Funktion, unter anderem die Sinnesempfindung, zelluläre Kommunikation und Neurotransmission. GPCRs stehen im Zusammenhang mit unterschiedlichen Erkrankungen wie Herzinsuffizienz, Krebs, neurologischen Funktionsstörungen und diverser metabolischer Krankheiten, weswegen sie als Ziele („Targets“) zur Behandlung verschiedener Erkrankungen erforscht und genutzt werden. Aufgrund ihrer Expression auf der Zelloberfläche sind sie leicht zugänglich, und die Diversität ihrer Liganden begünstigt zusätzlich ihre Nutzung als pharmakologische Targets. Heutzutage vermitteln bereits 30% aller weltweit zugelassenen Arzneistoffe ihre Wirkung an GPCRs.
GPCRs üben ihre Funktion aus, indem sie hauptsächlich an G Proteine binden, welche wiederum die Produktion sogenannter second messenger in Gang setzen. cAMP ist das Hauptsignalmolekül der Rezeptoren, welche an das stimulatorische GS Protein koppeln. cAMP überträgt hunderte ankommende Signale in einer hochspezifischen Weise, indem es an unterschiedliche Effektorproteine bindet, welche sich in bestimmten zellulären Regionen befinden. Dadurch koordiniert dieses Signalmolekül eine Vielzahl zellulärer Prozesse, angefangen bei der Regulierung von Ionenkanalaktivität über die Kontraktilität glatter- und quergestreifter Muskulatur bis hin zur Genexpression, Zellproliferation und Apoptose. Durch die pleiotropen Effekte, welche durch cAMP reguliert werden, stellt sich die Frage, wie GS-gekoppelte Rezeptoren Signalspezifität erreichen, obwohl sie ihre Funktion durch dieses eine Signalmolekül ausführen.
Ursprünglich ging man von einer uneingeschränkten Diffusion und dadurch homogenen Verteilung von cAMP in der Zelle aus. Diese Vorstellung ist jedoch nicht mit der Signalisierungsspezifität von GPCRs vereinbar, da unter diesen Umständen cAMP unselektiv all seine Effektorproteine in der gesamten Zelle aktivieren könnte. Daher entstand die Hypothese der cAMP-Kompartimentierung, wobei die Zelle lokal begrenzte Bereiche mit hohen oder niedrigen cAMP Konzentrationen umfassen würde. Jedoch gab es bisher keinerlei Beweise für die Existenz und die molekulare Zusammensetzung mutmaßlicher Domänen. Folglich setzten wir uns als Ziel, hochkonzentrierte cAMP-Kompartimente in der Zelle zu lokalisieren, ihre räumliche Dimension aufzuklären und ihre Rolle zur Realisierung zellulärer Signalisierungsspezifität zu ermitteln. Im Rahmen der vorliegenden Studie setzten wir einen Förster resonance energy transfer (FRET)-basierten cAMP Sensor ein, fusionierten ihn mit dem humanen glucagone-like peptide 1 Rezeptor (hGLP1R) als Prototyp eines GS-koppelnden Rezeptors, um cAMP am Ursprung des Signals zu messen. Mittels dieser Sensoren weisen wir eine Rezeptor-umgebende begrenzte cAMP Domäne nach, welche eine erhöhte cAMP Konzenztration aufweist (Figure ‎3.10). Bei Stimulation des Rezeptors mit GLP1 Konzenztrationen beginnend bei 10 fM entsteht eine Rezeptordomäne mit lokal erhöhten cAMP Konzentrationen, welche getrennt von Plasmamembran und Cytosol ist. Wir zeigen, dass das hGLP1R-Kompartiment geschützt ist vor cAMP Signalen, welche an weiteren, unabhängigen GS-gekoppelten Rezeptoren ihren Ursprung haben (Figure ‎3.11). Um die räumliche Dimension dieser Domäne zu untersuchen, verwendeten wir Nanolinker der Länge 30- und 60 nm als Abstandhalter zwischen Rezeptor und Sensor (Figure ‎3.12) und zeigen dabei, dass sich die Domäne über eine Länge von 60 Nanometern erstreckt, wobei ein abnehmender cAMP-Gradient erkennbar ist. Weiterhin beweisen wir, dass Phosphodiesterasen (PDEs) Schlüsselfaktoren für die Bildung des cAMP-Gradienten um den Rezeptor herum sind, indem sie die Diffusion ins Cytosol beschränken (Figure ‎3.13). Darüber hinaus zeigen wir (Figure ‎3.15), dass Rezeptor-spezifische cAMP Signale PKA-Phosphorylierung in der Rezeptordomäne auslösen und, dass AKAPs elementar für nanodomänen PKA-Aktivität sind, wohingegen die cytosolische PKA-Phosphorylierung unabhängig von AKAP-Targeting der PKA ist (Figure ‎3.16). 
Zusammenfassend beweisen unsere Ergebnisse die Existenz einer Rezeptor-umgebenden Nanodomäne mit erhöhten cAMP Spiegeln eines GS-gekoppelten Rezeptors. Zeitgleiche Studien in unserer Gruppe zeigen, dass cAMP in der Zelle weitgehend gebunden vorliegt und diffusionslimitiert ist. Dies stellt den Nachweis für eine eingeschränkte Diffusion als molekulare Voraussetzung für die Bildung von Signalkompartimenten dar. Wir gehen davon aus, dass unsere Ergebnisse ein Ausgangspunkt für die Aufklärung von Rezeptoren als Quelle für Signalkompartimente darstellen, jedoch bedarf es weiterer Studien, um die präzise molekulare Zusammensetzung und die beteiligten Proteine dieser Signaldomäne zu untersuchen. Das Grundverständnis der Signalisierungskaskaden auf molekularer Ebene könnte es uns ermöglichen, die zellulären Reaktionen zu manipulieren, um eine Fehlfunktion der Signalisierung in erkrankten Zellen wiederherzustellen. Da der hGLP1R entscheidend für Aufrechterhaltung ausgeglichener Blutglucosespiegel ist, würde die Erfassung der molekularen Details der kompartimentalisierten Signalübertragung die Feinabstimmung der Rezeptorsignale ermöglichen, um ihn als spezifisches Target zur Behandlung von Diabetes Mellitus einzusetzen.
KW  - FRET
KW  - cAMP
KW  - compartments
KW  - GPCR
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-190695
ER  - 
TY  - THES
A1  - Dolles, Dominik
T1  - Development of Hybrid GPCR Ligands: Photochromic and Butyrylcholinesterase Inhibiting Human Cannabinoid Receptor 2 Agonists
T1  - Entwicklung von hybriden GPCR Liganden: Photochrome und Butyrylcholinesterase-inhibierende Cannabinoid Rezeptor 2 Agonisten
N2  - While life expectancy increases worldwide, treatment of neurodegenerative diseases such as AD becomes a major task for industrial and academic research. Currently, a treatment of AD is only symptomatical and limited to an early stage of the disease by inhibiting AChE. A cure for AD might even seem far away. A rethinking of other possible targets is therefore necessary. Addressing targets that can influence AD even at later stages might be the key. Even if it is not possible to find a cure for AD, it is of great value for AD patients by providing an effective medication. The suffering of patients and their families might be relieved and remaining years may be spent with less symptoms and restrictions.
It was shown that a combination of hCB2R agonist and BChE inhibitor might exactly be a promising approach to combat AD. In the previous chapters, a first investigation of dual-acting compounds that address both hCB2R and BChE was illustrated (figure 6.1).

A set of over 30 compounds was obtained by applying SARs from BChE inhibitors to a hCB2R
selective agonist developed by AstraZeneca. In a first in vitro evaluation compounds showed
selectivity over hCB1R and AChE. Further investigations could also prove agonism and showed
that unwanted off-target affinity to hMOP receptor could be designed out. The development of
a homology model for hCB2R (based on a novel hCB1R crystal) could further elucidate the
mode of action of the ligand binding. Lastly, first in vivo studies showed a beneficial effect of
selected dual-acting compounds regarding memory and cognition.
Since these first in vivo studies mainly aim for an inhibition of the BChE, it should be the aim
of upcoming projects to proof the relevance of hCB2R agonism in vivo as well. In addition,
pharmacokinetic as well as solubility studies may help to complete the overall picture.
Currently, hybrid-based dual-acting hCB2R agonists and selective BChE inhibitors are under
investigation in our lab. First in vitro evaluations showed improved BChE inhibition and
selectivity over AChE compared to tacrine.78 Future in vitro and in vivo studies will clarify their
usage as drug molecules with regard to hepatotoxicity and blood-brain barrier penetration.
Since the role of hCB2R is not yet completely elucidated, the use of photochromic toolcompounds
becomes an area of interest. These tool-compounds (and their biological effect) can
be triggered upon irradiation with light and thus help to investigate time scales and ligand
binding.
A set of 5-azobenzene benzimidazoles was developed and synthesized. In radioligand binding
studies, affinity towards hCB2R could be increased upon irradiation with UV-light (figure 6.2).
This makes the investigated compounds the first GPCR ligands that can be activated upon
irradiation (not vice versa).

The aim of upcoming research will be the triggering of a certain intrinsic activity by an
“efficacy-switch”. For this purpose, several attempts are currently under investigation: an
introduction of an azobenzene moiety at the 2-position of the benzimidazole core already led to
a slight difference in efficacy upon irradiation with UV light. Another approach going on in our
lab is the development of hCB1R switches based on the selective hCB1R inverse agonist
rimonabant. First in vitro results are not yet available (figure 6.3).
N2  - Durch die weltweit steigende Lebenserwartung rückt die Behandlung von neurodegenerativen Krankheiten, wie der Alzheimer’schen Krankheit, immer mehr in den Fokus der industriellen und akademischen Forschung. Momentan erfolgt die Behandlung der Alzheimer’schen Krankheit durch die Blockade der AChE nur symptomatisch und in einem Frühstadium. Eine Heilung scheint dabei in weiter Ferne zu liegen, weshalb ein Umdenken nach neuen Ansätzen stattfinden sollte. Der Schlüssel könnte darin liegen, dass man biologischen Funktionen adressiert, die den Verlauf der Alzheimer’schen Krankheit auch in einem späteren Stadium beeinflussen. Selbst wenn eine Heilung in absehbarer Zeit unmöglich bleibt, ist es für die betroffenen Patienten eine erhebliche Erleichterung auf eine effektive Medikation zurückgreifen zu können. Das Leid der Patienten und ihrer Familien könnte dadurch gelindert und die verbleibenden Lebensjahre ohne Symptome und Einschränkungen genossen werden.
In den vorangegangenen Kapiteln wurde bereits gezeigt, dass die Kombination aus einem hCB2R Agonisten und einem BChE Hemmer genau diesen vielversprechenden Ansatz verfolgt. Ein erster Entwicklungsansatz von dual-aktiven hCB2R Agonisten / BChE Hemmern wurde in den Kapiteln 3 und 4 ausführlich dargestellt (Abb. 7.1).

Ein Set von 30 verschiedenen Verbindungen wurde synthetisiert, indem die Erkenntnisse der Struktur-Wirkungsbeziehungen von anderen BChE Hemmern auf einen von AstraZeneca entwickelten selektiven hCB2R Agonisten angewendet wurden. Erste in vitro Untersuchungen zeigten eine hohe Selektivität gegenüber hCB1R und AChE auf. Desweiteren verhielten sich alle getesteten Substanzen wie Agonisten. Nachdem ausgewählte Substanzen auf ihre „off-target“ Wechselwirkung mit dem hMOP Rezeptor untersucht wurden, konnten diese strukturellen Merkmale in nachfolgenden Entwicklungsbemühungen berücksichtigt werden. Die Entwicklung eines hCB2R Homologiemodells (basierend auf einer erst kürzlich veröffentlichten hCB1R Kristallstruktur) lieferte wertvolle Informationen zum Bindemodus und der Wirkweise der Liganden am Rezeptor. Schlussendlich konnte in einer ersten in vivo Studie bewiesen werden, dass ausgewählte dual-aktive Substanzen eine positive Auswirkung auf das Gedächtnis und die kognitiven Eigenschaften haben.
Da diese in vivo Untersuchungen hauptsächlich die Hemmung der BChE berücksichtigen, wäre es sinnvoll, in zukünftigen Studien den Einfluss der hCB2R Agonisten zu untersuchen. Pharmakokinetik- und Löslichkeitsstudien könnten zudem helfen, das Gesamtbild zu komplettieren.
Im Moment befinden sich auch dual-aktive hCB2R Agonisten / BChE Hemmer in der Entwicklung, die den Hybrid-Ansatz verfolgen. Erste in vitro Untersuchungen dazu ergaben vielversprechende Ergebnisse mit einer guten Selektivität gegenüber AChE und einer erhöhten Hemmung der BChE verglichen mit Tacrin.78 Es wird Gegenstand zukünftiger in vitro und in vivo Untersuchungen sein, herauszufinden, ob sich diese Hybride mit Hinblick auf Hepatotoxizität und Blut-Hirnschrankengängigkeit als Wirkstoffe eignen.
Da die Rolle des hCB2R noch nicht komplett erforscht ist, erfreut sich die Entwicklung von sog. „tool-compounds“ großen wissenschaftlichen Interesses. Durch die Bestrahlung mit Licht können diese „tool-compounds“ (und ihr nachgeschalteter biologischer Effekt) gesteuert werden. Eine genauere Untersuchung von Zeitskalen und Ligandbindung an den Rezeptor wird dadurch ermöglicht.
Ein Set von 5-Azobenzolbenzimidazolen wurde zu diesem Zwecke entwickelt und synthetisiert. In Radioligandbindungsstudien konnte gezeigt werden, dass sich die Affinität gegenüber dem hCB2R durch die Bestrahlung mit UV-Licht erhöhen lässt (Abb. 7.2). Diese Eigenschaft macht die entwickelten Substanzen zu den ersten GPCR-Liganden, die durch Licht aktiviert werden
können (nicht umgekehrt wie bei den bisher beschriebenen photochromen GPCR-Liganden).

Ziel zukünftiger Forschungsbemühungen wird die Steuerung einer bestimmten intrinsischen
Aktivität / Effekts durch die Bestrahlung mit Licht sein. Zu diesem Zwecke werden aktuell
mehrere Herangehensweisen untersucht: die Einführung eines Azobenzol-Strukturelements an
Position 2 des Benzimidazol-Grundgerüsts zeigte in ersten in vitro Untersuchungen bereits
Unterschiede bei Bestrahlung mit UV-Licht. Eine weitere Herangehensweise ist die
Entwicklung von „Photo-Schaltern“ auf Basis von Rimonabant, einem selektiven hCB1R
inversen Agonisten. Hier stehen erste in vitro Ergebnisse jedoch noch aus (Abb. 7.3).
KW  - Ligand <Biochemie>
KW  - Hybrid
KW  - GPCR
KW  - Cannabinoid Receptor
KW  - Butyrylcholinesterase
KW  - Agonist
KW  - Agonist
KW  - Cholinesterase
KW  - G-Protein gekoppelte Rezeptor
KW  - Hybrid GPCR Ligands
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-163445
ER  - 
TY  - THES
A1  - Liu, Ruiqi
T1  - Dynamic regulation of the melanocortin 4 receptor system in body weight homeostasis and reproductive maturation in fish
T1  - Dynamische Regulation des Melanocortin-4-Rezeptor Systems bei der Körpergewichtshomöostase und der Fortpflanzungsreifung bei Fischen
N2  - Puberty is an important period of life with physiological changes to enable animals to reproduce. Xiphophorus fish exhibit polymorphism in body size, puberty timing, and reproductive tactics. These phenotypical polymorphisms are controlled by the Puberty (P) locus. In X. nigrensis and X. multilineatus, the P locus encodes the melanocortin 4 receptor (Mc4r) with high genetic polymorphisms. 
Mc4r is a member of the melanocortin receptors, belonging to class A G-protein coupled receptors. The Mc4r signaling system consists of Mc4r, the agonist Pomc (precursor of various MSH and of ACTH), the antagonist Agrp and accessory protein Mrap2. In humans, MC4R has a role in energy homeostasis. MC4R and MRAP2 mutations are linked to human obesity but not to puberty. 
Mc4rs in X. nigrensis and X. multilineatus are present in three allele classes, A, B1 and B2, of which the X-linked A alleles express functional receptors and the male-specific Y-linked B alleles encode defective receptors. Male body sizes are correlated with B allele type and B allele copy numbers. Late-maturing large males carry B alleles in high copy number while early-maturing small males carry B alleles in low copy number or only A alleles. Cell culture co-expression experiments indicated that B alleles may act as dominant negative receptor mutants on A alleles. 
In this study, the main aim was to biochemically characterize the mechanism of puberty regulation by Mc4r in X. nigrensis and X. multilineatus, whether it is by Mc4r dimerization and/or Mrap2 interaction with Mc4r or other mechanisms. Furthermore, Mc4r in X. hellerii (another swordtail species) and medaka (a model organism phylogenetically close to Xiphophorus) were investigated to understand if the investigated mechanisms are conserved in other species. 
In medaka, the Mc4r signaling system genes (mc4r, mrap2, pomc, agrp1) are expressed before hatching, with agrp1 being highly upregulated during hatching and first feeding. These genes are mainly expressed in adult brain, and the transcripts of mrap2 co-localize with mc4r indicating a function in modulating Mc4r signaling. Functional comparison between wild-type and mc4r knockout medaka showed that Mc4r knockout does not affect puberty timing but significantly delays hatching due to the retarded embryonic development of knockout medaka. Hence, the Mc4r system in medaka is involved in regulation of growth rather than puberty. 
In Xiphophorus, expression co-localization of mc4r and mrap2 in X. nigrensis and X. hellerii fish adult brains was characterized by in situ hybridization. In both species, large males exhibit strikingly high expression of mc4r while mrap2 shows similar expression level in the large and small male and female. Differently, X. hellerii has only A-type alleles indicating that the puberty regulation mechanisms evolved independently in Xiphophorus genus. Functional analysis of Mrap2 and Mc4r A/B1/B2 alleles of X. multilineatus showed that increased Mrap2 amounts induce higher cAMP response but EC50 values do not change much upon Mrap2 co-expression with Mc4r (expressing only A allele or A and B1 alleles). A and B1 alleles were expressed higher in large male brains, while B2 alleles were only barely expressed. Mc4r A-B1 cells have lower cAMP production than Mc4r A cells. Together, this indicates a role of Mc4r alleles, but not Mrap2, in puberty onset regulation signaling. Interaction studies by FRET approach evidenced that Mc4r A and B alleles can form heterodimers and homodimers in vitro, but only for a certain fraction of the expressed receptors. Single-molecule colocalization study using super-resolution microscope dSTORM confirmed that only few Mc4r A and B1 receptors co-localized on the membrane. Altogether, the species-specific puberty onset regulation in X. nigrensis and X. multilineatus is linked to the presence of Mc4r B alleles and to some extent to its interaction with A allele gene products. This is reasoned to result in certain levels of cAMP signaling which reaches the dynamic or static threshold to permit late puberty in large males. 
In summary, puberty onset regulation by dominant negative effect of Mc4r mutant alleles is a special mechanism that is found so far only in X. nigrensis and X. multilineatus. Other Xiphophorus species obviously evolved the same function of the pathway by diverse mechanisms. Mc4r in other fish (medaka) has a role in regulation of growth, reminiscent of its role in energy homeostasis in humans. The results of this study will contribute to better understand the biochemical and physiological functions of the Mc4r system in vertebrates including human.
N2  - Die Pubertät ist ein wichtiger Lebensabschnitt mit physiologischen Veränderungen, die die Fortpflanzung von Tieren ermöglichen. Xiphophorus Fische weisen einen Polymorphismus in Bezug auf Körpergröße, Pubertätszeit und Fortpflanzungstaktik auf. Diese phänotypischen Polymorphismen werden durch den Pubertäts (P) Locus gesteuert. In X. nigrensis und X. multilineatus kodiert der P Locus den Melanocortin-4-Rezeptor (Mc4r) mit hohen genetischen Polymorphismen. 
Mc4r gehört zu den Melanocortin-Rezeptoren, die zur Klasse A der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren gehören. Das Mc4r-Signalsystem besteht aus Mc4r, dem Agonisten Pomc (Prohormon der verschiedenen MSH und des ACTH), dem Antagonisten Agrp und dem akzessorischen Protein Mrap2. Beim Menschen spielt MC4R eine Rolle bei der Energiehomöostase. MC4R und MRAP2 Mutationen stehen im Zusammenhang mit menschlicher Fettleibigkeit, jedoch nicht mit der Pubertät. 
Mc4rs in X. nigrensis und X. multilineatus sind in drei Allelklassen vorhanden, A, B1 und B2, von denen die X-chromosomalen A Allele funktionelle Rezeptoren exprimieren und die spezifischen männlichen Y-chromosomalen B Allele für defekte Rezeptoren kodieren. Die männliche Körpergröße korreliert mit dem B Alleltyp und der Kopienzahl des B Allels. Spätreife große Männchen tragen B Allele in hoher Kopienzahl, während frühreife kleine Männchen B Allele in niedriger Kopienzahl oder nur A Allele tragen. Koexpressions-Experimente in Zellkultur zeigten, dass B Allele als dominant negative Mutanten-Rezeptor auf A Allele wirken können. 
In dieser Studie war das Hauptziel die biochemische Charakterisierung des Mechanismus der Pubertätsregulation durch Mc4r in X. nigrensis und X. multilineatus. Dabei wurde untersucht, ob die Regulation durch eine Mc4r Dimerisierung und/oder Mrap2 Interaktion mit Mc4r oder durch andere Mechanismen erfolgt. Des Weiteren wurde Mc4r in X. hellerii (einer anderen Schwertträger Art) und Medaka (ein phylogenetisch naheliegender Modellorganismus von Xiphophorus) untersucht, um zu verstehen, ob die untersuchten Mechanismen in anderen Arten konserviert sind. 
In Medaka werden die Gene des Mc4r Signalsystems (mc4r, mrap2, pomc, agrp1) vor dem Schlüpfen exprimiert, wobei agrp1 während des Schlüpfens und der ersten Fütterung stark hochreguliert wird. Im adulten Medaka werden diese Gene hauptsächlich im Gehirn exprimiert und die Transkripte von mrap2 und mc4r kolokalisieren, was auf eine Funktion bei der Modulation der Mc4r-Signaltransduktion hinweist. Ein funktionaler Vergleich zwischen Wildtyp- und mc4r-Knockout Medaka zeigte, dass der Mc4r-Knockout das Pubertäts-Timing nicht beeinflusst, das Schlüpfen jedoch aufgrund der verzögerten embryonalen Entwicklung von Knockout-Medaka signifikant verzögert. Daher ist das Mc4r System in Medaka eher an der Regulation des Wachstums als an der Pubertät beteiligt. 
Bei Xiphophorus wurde die Lokalisierung von mc4r und mrap2 in erwachsenen Gehirnen von X. nigrensis und X. hellerii durch in situ Hybridisierung charakterisiert. Bei beiden Spezies zeigen große Männchen eine auffallend hohe Expression von mc4r, während mrap2 bei großen und kleinen Männchen und Weibchen ein ähnliches Expressionsniveau zeigt. Im Gegensatz dazu weist X. hellerii nur Allele vom A-Typ auf, was darauf hinweist, dass sich die Pubertätsregulationsmechanismen in dem Genus Xiphophorus unabhängig voneinander entwickelt haben. Die funktionelle Analyse der Mrap2 und Mc4r A/B1/B2 Allele von X. multilineatus zeigte, dass erhöhte Mrap2-Mengen eine höhere cAMP-Antwort induzieren, die EC50-Werte sich jedoch bei der Mrap2-Coexpression mit Mc4r nicht wesentlich ändern (nur A Allel oder A und B1 Allele). A und B1 Allele wurden in großen männlichen Gehirnen höher exprimiert, während B2 Allele kaum exprimiert wurden. Mc4r A-B1 Zellen haben eine geringere cAMP-Produktion als Mc4r A Zellen. Zusammengenommen deutet dies auf eine Rolle von Mc4r-Allelen, jedoch nicht von Mrap2, bei der Signalgebung zur Regulation des Pubertätsbeginns hin. Interaktionsstudien mit den FRET-Methoden zeigten, dass Mc4r A und B Allele in vitro Heterodimere und Homodimere bilden können, jedoch nur für einen bestimmten Anteil der exprimierten Rezeptoren. Die Einzelmolekül-co-lokalisierungsstudie unter Verwendung von der hochauflösenden Mikroskopiemethode dSTORM bestätigte, dass nur wenige Mc4r A und B1 Rezeptoren auf der Membran co-lokalisiert sind. Insgesamt ist die artspezifische Regulation des Pubertätsbeginns bei X. nigrensis und X. multilineatus auf das Vorhandensein von Mc4r B Allelen und teilweise auf deren Interaktion mit Genprodukten des A Allels zurückzuführen. Dies wird dadurch begründet, dass ein bestimmtes cAMP Niveau (statische oder dynamische Schwelle) erreicht werden muss, um die Pubertät einzuleiten. In großen Männchen wird dieses cAMP Niveau später erreicht und so die Pubertät später eingeleitet. 
Zusammenfassend ist die Regulation des Pubertätsbeginns durch die dominante negative Wirkung von mutierten Mc4r Allelen ein spezieller Mechanismus, der bisher nur bei X. nigrensis und X. multilineatus zu finden ist. Andere Xiphophorus Arten haben offensichtlich durch andere Mechanismen die gleiche Funktion des Signalwegs entwickelt. In anderen Fischen (Medaka) spielt Mc4r eine Rolle bei der Regulation des Wachstums und erinnert an seine Rolle bei der Energie-Homöostase beim Menschen. Die Ergebnisse dieser Studie werden dazu beitragen, die biochemischen und physiologischen Funktionen des Mc4r-Systems bei Wirbeltieren, einschließlich Menschen, besser zu verstehen.
KW  - Japankärpfling
KW  - Mc4r
KW  - Schwertkärpfling
KW  - Pubertät
KW  - Molekularbiologie
KW  - GPCR
KW  - Mrap2
KW  - Medaka
KW  - Xiphophorus
KW  - Puberty
KW  - Growth
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-206536
ER  - 
TY  - THES
A1  - Klenk, Johann Christoph
T1  - Effekte von Parathormon auf die Struktur und Komplexierung des Parathormonrezeptors 1
T1  - Effects of parathyroid hormone on the structure and complexation of parathyroid hormone receptor 1
N2  - Der Parathormonrezeptor Typ 1 (PTHR) ist ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor der Gruppe 2 und wichtigster Regulator des Kalziumstoffwechsels. Im ersten Teil der Arbeit wurde eine neuartige posttranslationale Modifikation des PTHR in Form einer proteolytischen Spaltung der Ektodomäne identifiziert, charakterisiert und deren Regulation beschrieben. Nach langanhaltender Stimulation des Rezeptors mit Agonisten – aber nicht mit Antagonisten – wurde eine Massen- und Mengenzunahme des Rezeptorproteins beobachtet. Es konnte gezeigt werden, dass der Rezeptor unter basalen Bedingungen einer Spaltung unterliegt. Der Massenunterschied entsteht durch die proteolytische Spaltung der Ektodomäne des PTHR, was nachfolgend die Stabilität des Rezeptors beeinträchtigt. Die Spaltung erfolgte innerhalb einer unstrukturierten Schleife der Ektodomäne, welche die Bereiche für die Ligandenbindung miteinander verbindet. Hierbei handelt es sich um eine Region, die im Vergleich zu anderen Gruppe 2-Rezeptoren spezifisch für den PTHR ist. Das durch die Spaltung entstandene N-terminale Fragment bleibt durch eine Disulfidbrücke mit dem Transmembranteil des Rezeptors verbunden. Durch Versuche mit verschiedenen Proteaseinhibitoren konnte die verantwortliche Protease der Familie der zinkabhängigen extrazellulären Proteasen zugeordnet werden. Diese Ergebnisse beschreiben einen Mechanismus wie die Homoöstase des PTHR reguliert sein könnte. In einem zweiten Abschnitt wurde die Interaktion der Adapterproteine NHERF1 und beta-Arrestin2 mit dem PTHR untersucht. Beide Proteine interagierten unabhängig mit dem Rezeptor, wobei NHERF1 über eine PDZ-Domäne konstitutiv an den C-Terminus des Rezeptors bindet. beta-Arrestin2 hingegen bindet nach Aktivierung des Rezeptors und führt zur Desensitisierung des Rezeptors. Mittels biochemischer und mikroskopischer Methoden konnte gezeigt werden, dass beide Proteine gemeinsam einen ternären Komplex mit dem PTHR bilden, welcher durch die direkte Interaktion zwischen NHERF1 und beta-Arrestin2 vermittelt wird. Dies hat zur Folge, dass beta-Arrestin im basalen Zustand durch NHERF1 an den Rezeptor gekoppelt wird. Durch Analyse der Assoziationskinetik mittels Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer-Messungen zeigte sich, dass diese Kopplung zu einer zweifach erhöhten Rekrutierungsgeschwindigkeit von beta-Arrestin2 an den PTHR führt. Somit stellt unterstützt NHERF1 die beta-Arrestin2-vermittelte Desensitisierung des PTHR.
N2  - The Parathyroid hormone receptor type 1 (PTHR) belongs to the class 2 of G-protein coupled receptors (GPCRs) and is the main regulator of calcium homeostasis of the body. The first part of the dissertation describes a novel mechanism of receptor regulation based on a proteolytic cleavage of the receptor’s extracellular domain. Prolonged stimulation with PTH led to an apparent increase in molecular mass and in stability of the PTHR. Biochemical analysis of the receptor protein revealed that the PTHR undergoes posttranslational cleavage. Agonistic but not antagonistic PTH-peptides prevented this cleavage, thereby stabilizing the molecular mass and also increasing the half life of the receptor. The cleavage was shown to occur within an unstructured stretch of the extracellular domain of the receptor, which connects two parts required for ligand binding and which is unique in the PTHR amongst all class 2 GPCRs. The cleaved N-terminal fragment was further connected by a disulfide bridge and could only be released by reducing agents. By testing a panel of different protease inhibitors, a protease belonging to the family of zinc-dependent metalloproteases could be identified to be responsible for the PTHR cleavage. Thus, these findings describe a new mechanism how PTHR homeostasis may be regulated. In the second part, the interaction between the adaptor proteins NHERF1 and beta-arrestin2 with the PTHR was assessed. Both proteins interacted independently with the receptor. While NHERF1 formed a constitutive interaction with the PTHR C-terminus, beta-arrestin2-binding required activation of the receptor. Using biochemical and microscopic methods it was shown that both proteins formed a ternary complex with the receptor. This complex was mediated by a direct interaction between NHERF1 and beta-arrestin2 which has been identified in this work. As a consequence, NHERF1 leads to a coupling of beta-arrestin2 close to the PTHR. Association kinetics of beta-arrestin2 with the PTHR measured by fluorescent resonance energy transfer were two-fold increased in the presence of NHERF, suggesting that the ternary complex facilitates the desensitization of the PTHR by beta-arrestin2.
KW  - Parathormon
KW  - Proteolyse
KW  - Endokrinologie
KW  - Calcium
KW  - Rezeptor
KW  - Retinales S-Antigen
KW  - GPCR
KW  - Matrix-Metalloprotease
KW  - NHERF
KW  - Signaltransduktion
KW  - G-Protein
KW  - GPCR
KW  - Matrix-Metalloproteinase
KW  - NHERF
KW  - signal transduction
KW  - G-protein
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-47288
ER  - 
TY  - THES
A1  - Balakrishnan, Ashwin
T1  - Fast molecular mobility of β\(_2\)-adrenergic receptor revealed by time-resolved fluorescence spectroscopy
T1  - Schnelle molekulare Beweglichkeit des β\(_2\)-adrenergen Rezeptors durch zeitaufgelöste Fluoreszenzspektroskopie
N2  - G-protein- coupled receptors (GPCRs) are the largest family of membrane confined receptors and they transduce ligand binding to downstream effects. Almost 40% of the drugs in the world target GPCRs due to their function, albeit knowing less about their activation. Understanding their dynamic behaviour in basal and activated state could prove key to drug development in the future. GPCRs are known to exhibit complex molecular mobility patterns. A plethora of studies have been and are being conducted to understand the mobility of GPCRs. Due to limitations of imaging and spectroscopic techniques commonly used, the relevant timescales are hard to access. The most commonly used techniques are electron paramagnetic resonance or double electronelectron resonance, nuclear magnetic resonance, time-resolved fluorescence, single particle tracking and fluorescence recovery after photobleaching. Among these techniques only fluorescence has the potential to probe live cells. In this thesis, I use different time-resolved fluorescence spectroscopic techniques to quantify diffusion dynamics / molecular mobility of β2-adrenergic receptor (β2-AR) in live cells. The thesis shows that β2-AR exhibits mobility over an exceptionally broad temporal range (nanosecond to second) that can be linked to its respective physiological scenario. I explain how β2-AR possesses surprisingly fast lateral mobility (~10 μm²/s) associated with vesicular transport in contrast to the prior reports of it originating from fluorophore photophysics and free fluorophores in the cytosol. In addition, β2-AR has rotational mobility (~100 μs) that makes it conform to the Saffman-Delbrück model of membrane diffusion unlike earlier studies. These contrasts are due to the limitations of the methodologies used. The limitations are overcome in this thesis by using different time-resolved fluorescence techniques of fluorescence correlation spectroscopy (FCS), time-resolved anisotropy (TRA) and polarisation resolved fullFCS (fullFCS). FCS is limited to microsecond to the second range and TRA is limited to the nanosecond range. fullFCS complements the two techniques by covering the blind spot of FCS and TRA in the microsecond range. Finally, I show how ligand stimulation causes a decrease in lateral mobility which could be a hint at cluster formation due to internalisation and how β2-AR possesses a basal oligomerisation that does not change on activation. Thus, through this thesis, I show how different complementary fluorescence techniques are necessary to overcome limitations of each technique and to thereby elucidate functional dynamics of GPCR activation and how it orchestrates downstream signalling.
N2  - G¬Protein¬gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind die größte Familie der Membran¬Rezeptoren und durch Bindung von Liganden leiten sie extrazlluläre Signal in das Innere der Zelle weiter. Fast 40% der Medikamente auf der Welt zielen aufgrund ihrer Funktion auf GPCRs ab, obwohl man relative wenig über ihre Aktivierung weiß. Das Verständnis ihres dynamischen Verhaltens im basalen und aktivierten Zustand könnte sich in Zukunft als Schlüssel zur Medikamentenentwicklung erweisen. GPCRs sind dafür bekannt, dass sie komplexe molekulare Bewegungsmuster aufweisen. Eine Fülle von Studien wurden und werden durchgeführt, um die Beweglichkeit von GPCRs zu verstehen. Aufgrund der Einschränkungen der gängigen bildgebenden und spektroskopischen Techniken sind die relevanten Zeitskalen nur schwer messbar. Die am häufigsten verwendeten Techniken sind die paramagnetische Elektronenresonanz oder die Doppel¬Elektron¬Elektron¬Resonanz, die magnetische Kernresonanz, die zeitaufgelöste Fluoreszenz, die Einzelpartikelverfolgung und die Fluoreszenzwiederherstellung nach Photobleichung. Unter diesen Techniken haben nur die Fluoreszenz¬basierten Techniken das Potential, lebende Zellen zu untersuchen. In dieser Arbeit werden verschiedene zeitaufgelöste fluoreszenzspektroskopische Techniken zur Quantifizierung der Diffusionsdynamik oder molekularen Mobilität des β2¬adrenergen Rezeptors (β2¬AR) in lebenden Zellen verwendet. Diese Arbeit zeigt, dass β2-AR eine Beweglichkeit über einen außergewöhnlich breiten, zeitlichen Bereich (Nanosekunde bis Sekunde) aufweist, der mit dem jeweiligen physiologischen Szenario verknüpft werden kann. Es wird gezeigt, wie β2¬AR eine überraschend schnelle, laterale Bewegung (~10 μm²/s) besitzt, welche mit vesikulärem Transport in Verbindung gebracht werden kann. Im Gegensatz zu früheren Berichten, wonach die beobachtete Komponente von der Photophysik der Fluorophore und freien Fluorophoren im Zytosol abstammt. Zusätzlich weist β2¬AR eine Rotationsbeweglichkeit (~100 μs) auf, welche es ¬ im Gegensatz zu früheren Studien ¬ dem Saffman¬Delbrück¬Modell der Membrandiffusion zuordnen lässt. Dieser Unterschied ist auf die Beschränkungen der verwendeten Techniken zurückzuführen. Die Einschränkungen werden in dieser Arbeit durch die Verwendung verschiedener zeitaufgelöster Fluoreszenztechniken überwunden, z. B. der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) im Bereich von mehreren hundert Nanosekunden bis Sekunden, der zeitaufgelösten Anisotropie (TRA) im Nanosekundenbereich und der polarisationsaufgelösten FullFCS (FullFCS), die die zeitlich Lücke zwischen FCS und TRA schließt. Zuletzt wird eine Abnahme der lateralen Beweglichkeit durch Ligandenstimulation gezeigt, was ein Hinweis auf Clusterbildung aufgrund von Internalisierung sein könnte, und dass β2¬AR eine basale Oligomerisierung aufweist, die sich bei Aktivierung nicht ändert. Zusammenfassend kann man sagen, dass verschiedene komplementäre Fluoreszenztechniken notwendig sind, um die Einschränkungen der einzelnen Techniken zu überwinden und dadurch die funktionelle Dynamik der GPCR¬Aktivierung und deren Bedeutung für die nachgeschaltete Signalübertragung aufzuklären.
KW  - Fluorescence correlation spectroscopy
KW  - GPCR
KW  - time-resolved anisotropy
KW  - adrenergic receptor
KW  - homoFRET
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-250856
ER  -