TY - THES A1 - Regneri, Janine T1 - Transcriptional regulation of cancer genes in the Xiphophorus melanoma system T1 - Transkriptionelle Regulation von Krebsgenen im Xiphophorus-Melanommodell N2 - The Xiphophorus melanoma system is a useful animal model for the study of the genetic basis of tumor formation. The development of hereditary melanomas in interspecific hybrids of Xiphophorus is connected to pigment cell specific overexpression of the mutationally activated receptor tyrosine kinase Xmrk. In purebred fish the oncogenic function of xmrk is suppressed by the molecularly still unidentified locus R. The xmrk oncogene was generated by a gene duplication event from the Xiphophorus egfrb gene and thereby has acquired a new 5’ regulatory sequence, which has probably altered the transcriptional control of the oncogene. So far, the xmrk promoter region was still poorly characterized and the molecular mechanism by which R controls xmrk-induced melanoma formation in Xiphophorus still remained to be elucidated. To test the hypothesis that R controls melanoma development in Xiphophorus on the transcriptional level, the first aim of the thesis was to gain a deeper insight into the transcriptional regulation of the xmrk oncogene. To this end, a quantitative analysis of xmrk transcript levels in different Xiphophorus genotypes carrying either the highly tumorigenic xmrkB or the non-tumorigenic xmrkA allele was performed. I was able to demonstrate that expression of the tumorigenic xmrkB allele is strongly increased in malignant melanomas of R-free backcross hybrids compared to benign lesions, macromelanophore spots, and healthy skin. The expression level of the non-tumorigenic xmrkA allele, in contrast, is not influenced by the presence or absence of R. These findings strongly indicate that differential transcriptional regulation of the xmrk promoter triggers the tumorigenic potential of these xmrk alleles. To functionally characterize the xmrk promoter region, I established a luciferase assay using BAC clones containing the genomic regions where xmrk and egfrb are located for generation of reporter constructs. This approach showed for the first time a melanoma cell specific transcriptional activation of xmrkB by its flanking regions, thereby providing the first functional evidence that the xmrk oncogene is controlled by a pigment cell specific promoter region. Subsequent analysis of different deletion constructs of the xmrkB BAC reporter construct strongly indicated that the regulatory elements responsible for the tumor-inducing overexpression of xmrkB in melanoma cells are located within 67 kb upstream of the xmrk oncogene. Taken together, these data indicate that melanoma formation in Xiphophorus is regulated by a tight transcriptional control of the xmrk oncogene and that the R locus acts through this mechanism. As the identification of the R-encoded gene(s) is necessary to fully understand how melanoma formation in Xiphophorus is regulated, I furthermore searched for alternative R candidate genes in this study. To this end, three genes, which are located in the genomic region where R has been mapped, were evaluated for their potential to be a crucial constituent of the regulator locus R. Among these genes, I identified pdcd4a, the ortholog of the human tumor suppressor gene PDCD4, as promising new candidate, because this gene showed the expression pattern expected from the crucial tumor suppressor gene encoded at the R locus. N2 - Fische der Gattung Xiphophorus sind ein gut etabliertes Modellsystem zur Analyse der genetischen Grundlagen der Tumorentwicklung. Die Entwicklung hereditärer Melanome in bestimmten interspezifischen Xiphophorus-Hybriden wird durch die pigmentzellspezifische Überexpression des Onkogens xmrk ausgelöst. Dieses Gen codiert für eine durch Mutationen aktivierte Rezeptortyrosinkinase. In den reinerbigen Elterntieren wird die onkogene Funktion von xmrk durch den Regulator-Locus R unterdrückt, welcher jedoch auf molekularer Ebene noch nicht identifiziert wurde. Das Onkogen xmrk ist durch eine Genduplikation aus dem Protoonkogen egfrb entstanden und hat dabei eine neue regulatorische 5‘ Region erhalten, welche mit hoher Wahrscheinlichkeit die transkriptionelle Regulation des Onkogens verändert hat. Die Promotorregion von xmrk war allerdings bisher nur unzureichend charakterisiert und der molekulare Mechanismus, durch den der R-Locus die xmrk-induzierte Melanomentwicklung kontrolliert, war noch weitgehend unbekannt. Um zu analysieren, ob der R-Locus die Melanomentwicklung in Xiphophorus auf transkriptioneller Ebene kontrolliert, war das erste Ziel dieser Arbeit die transkriptionelle Regulation des xmrk Onkogens genauer zu untersuchen. Zu diesem Zweck habe ich eine quantitative Analyse der xmrk Expressionslevel in Geweben verschiedener Xiphophorus-Genotypen durchgeführt, welche entweder das stark tumorigene xmrkB oder das nicht tumorigene xmrkA Allel besitzen. Ich konnte zeigen, dass im Vergleich zu benignen Läsionen, Macromelanophoren und gesunder Haut, die Expression des tumorigenen xmrkB Allels in den malignen Melanomen der R-defizienten Rückkreuzungshybride stark erhöht ist. Das Expressionslevel des xmrkA Allels wird hingegen nicht durch den R-Locus beeinflusst. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass eine differenzielle transkriptionelle Regulierung des xmrk Promotors für die Unterschiede im onkogenen Potential dieser Allele verantwortlich ist. Um die xmrk Promotorregion funktional zu charakterisieren, habe ich in der hier vorliegenden Studie einen Luciferase-Assay etabliert, für den BAC-Klone, welche die xmrk- oder egfrb-Region enthalten, zur Herstellung von Reporterkonstrukten verwendet wurden. Mit Hilfe dieses Ansatzes konnte ich zum ersten Mal eine melanomzellspezifische Aktivierung des xmrkB Gens durch seine regulatorischen Regionen zeigen. Dies liefert den ersten funktionalen Beweis, dass das xmrk Onkogen tatsächlich durch einen pigmentzellspezifischen Promotor kontrolliert wird. Durch die nachfolgende Analyse einer Deletionsserie des xmrkB Reporterkonstrukts konnte gezeigt werden, dass die regulatorischen Elemente, welche die starke Überexpression von xmrk in Melanomzellen steuern, in den proximalen 67 kb der xmrk 5‘ Region lokalisiert sind. Zusammengefasst deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Melanomentwicklung in Xiphophorus durch eine strikte transkriptionelle Kontrolle des xmrk Onkogens reguliert wird und dass der Regulator-Locus R seine tumorsuppressive Funktion über diesen Mechanismus ausübt. Da die Identifizierung des R-Locus-Gens entscheidend ist, um die Melanomentwicklung in Xiphophorus vollständig zu verstehen, habe ich im zweiten Teil dieser Arbeit drei Gene, welche in derselben genomischen Region liegen in der R lokalisiert wurde, genauer untersucht, um zu testen, ob es sich bei einem dieser Gene um eine entscheidende tumorsuppressive Komponente des R-Locus handelt. Von diesen Genen wurde pdcd4a, welches das Ortholog zum humanen Tumorsuppressorgen PDCD4 ist, als vielversprechendes neues Kandidatengen identifiziert, da das Expressionsmuster von pdcd4a mit dem zu erwartenden Expressionsmuster des am R-Locus codierten Tumorsuppressorgens übereinstimmt. KW - Melanom KW - Schwertkärpfling KW - Chromatophor KW - Epidermaler Wachstumsfaktor KW - Onkogen KW - Tumorsuppressorgen KW - Hybrid KW - transkriptionelle Regulation KW - melanoma KW - Xiphophorus KW - xmrk KW - transcriptional control KW - pigment cell KW - Hautkrebs KW - Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-82319 ER - TY - THES A1 - Leikam, Claudia T1 - Oncogene-induced senescence in melanocytes T1 - Onkogen-induzierte Seneszenz in Melanozyten N2 - Melanoma is the most aggressive skin cancer with very limited treatment options. Upon appearance of metastases chemotherapeutics are used to either kill or slow down the growth of cancer cells by inducing apoptosis or senescence, respectively. With melanomas originating from melanocytes, it is vital to elucidate the mechanisms that distinguish senescence induction from proliferation and tumourigenicity. Xmrk (Xiphophorus melanoma receptor kinase), the fish orthologue of the human epidermal growth factor receptor (EGFR), causes highly aggressive melanoma in fish. Using an inducible variant, HERmrk, I showed that high receptor levels result in melanocyte senescence, whereas low and medium expression allows for cell proliferation and tumourigenicity. Mechanistically, HERmrk leads to increased reactive oxygen species (ROS) levels, which trigger a DNA damage response. Consequently, multinucleated, senescent cells develop by both endomitosis and fusion. Furthermore, oncogenic N‐RAS (N-‐RAS61K) induces a similar multinucleated phenotype in melanocytes. In addition, I found that both overexpression of C‐MYC and the knockdown of miz­‐1 (Myc­‐interacting zinc finger protein 1) diminished HERmrk‐induced senescence entry. C‐MYC prevent ROS induction, DNA damage and senescence, while acting synergistically with HERmrk in conveying tumourigenic features to melanocytes. Further analyses identified cystathionase (CTH) as a novel target gene of Myc and Miz-­1 crucial for senescence prevention. CTH encodes an enzyme involved in the synthesis of cysteine from methionine, thereby allowing for increased ROS detoxification. Even though senescence was thought to be irreversible and hence tumour protective, I demonstrated that prolonged expression of the melanoma oncogene N­‐RAS61K in pigment cells overcomes initial OIS by triggering the emergence of tumour‐initiating, mononucleated stem‐like cells from multinucleated senescent cells. This progeny is dedifferentiated, highly proliferative, anoikis­‐resistant and induces fast­‐growing, metastatic tumours upon transplantation into nude mice. Our data demonstrate that induction of OIS is not only a cellular failsafe mechanism, but also carries the potential to provide a source for highly aggressive, tumour­‐initiating cells. N2 - Das Melanom ist der aggressivste Hautkrebstyp mit aeußerst begrenzten Therapiemoeglichkeiten. Sobald Metastasen diagnostiziert werden, kommen Chemotherapeutika zum Einsatz, deren Aufgabe darin besteht, die Krebszellen durch Apotoseinduktion zu toeten oder ihre Verbreitung mittels Seneszenz zu verlangsamen. Da Melanome aus Melanozyten hervorgehen, ist es essentiell, die Mechanismen zu analysieren, die entscheiden, ob Zellen seneszent oder tumorigen werden. Xmrk, die Xiphophorus­‐Melanom‐Rezeptor­‐Kinase und Fischortholog des humanen epidermalen Wachstumsfaktors (EGFR), verursacht aggressive Melanome in Fischen. Durch den Einsatz von HERmrk, einer induzierbaren Variante des Rezeptors, konnte ich zeigen, dass hohe Expressionslevel Seneszenz in Melanozyten zur Folge haben, wohingegen niedrige oder mittlere Rezeptorlevel mit erhöhter Zellproliferation und Tumorigenitaet der Zellen einhergehen. Mechanistisch gesehen, führt die Aktivierung von HERmrk zu gesteigerten Level an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), die wiederum DNA‐Schäden verursachen und dadurch bestimmte Signalwege auslösen. Durch Endomitose und Fusion entstehen letztendlich multinukleaere, seneszente Zellen. Interessanterweise, führte die Expression von onkogenem N‐RAS (N‐RAS61K) in Melanozyten zu einem sehr ähnlichen Phaenotyp. Des Weiteren konnte ich zeigen, dass sowohl die Überexpression von C-­MYC als auch der Knockdown von miz‐1 (Myc­‐interagierendes Zinkfingerprotein 1) der HERmrk-­induzierten Seneszenz entgegenwirkten. C‐MYC verhindert einerseits die Entstehung von ROS, die dadurch verursachten DNA‐Schaeden und damit die Seneszenz und wirkt andererseits synergistisch mit HERmrk, indem es den Melanozyten tumorigene Eigenschaften verleiht. In weiteren Analysen wurde Cystathionase (CTH) als neues Zielgen von Myc und Miz-­1 identifiziert, dem eine zentrale Rolle in der Seneszenzverhinderung zukommt. CTH kodiert fuer ein Enzym, das die Synthese von Cystein aus Methionin und damit die Entsorgung von ROS ermöglicht. Obwohl man davon ausgeht, dass Seneszenz einen irreversiblen Mechanismus darstellt, der die Tumorentstehung verhindert, konnte ich zeigen, dass die langfristige Expression des Melanomonkogens N‐RAS61K die initiale Seneszenzinduktion durchbricht. Dabei gehen mononukleaere, tumorigene, stammzellaehnliche Zellen aus seneszenten Zellen hervor. Diese Tochterzellen sind dedifferenziert, hochproliferativ, Anoikis­‐resistent und induzieren schnellwachsende, metastasierende Tumoren in Nacktmaeusen. Damit machen meine Daten deutlich, dass Seneszenz nicht nur als zellulaerer Schadensbegrenzungsmechanismus fungiert, sondern auch das Potential hat, aeußerst aggressive Tumorzellen zu generieren. KW - Melanom KW - Altern KW - Onkogen KW - Melanophor KW - Hautkrebs KW - Seneszenz KW - Xmrk KW - N-RAS KW - melanoma KW - senescence KW - OIS KW - skin cancer KW - oncogenes Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-79316 ER - TY - JOUR A1 - Houben, Roland A1 - Hesbacher, Sonja A1 - Schmid, Corinna P. A1 - Kauczok, Claudia S. A1 - Flohr, Ulrike A1 - Haferkamp, Sebastian A1 - Müller, Cornelia S. L. A1 - Schrama, David A1 - Wischhusen, Jörg A1 - Becker, Jürgen C. T1 - High-Level Expression of Wild-Type p53 in Melanoma Cells is Frequently Associated with Inactivity in p53 Reporter Gene Assays N2 - Background: Inactivation of the p53 pathway that controls cell cycle progression, apoptosis and senescence, has been proposed to occur in virtually all human tumors and p53 is the protein most frequently mutated in human cancer. However, the mutational status of p53 in melanoma is still controversial; to clarify this notion we analysed the largest series of melanoma samples reported to date. Methodology/Principal Findings: Immunohistochemical analysis of more than 180 melanoma specimens demonstrated that high levels of p53 are expressed in the vast majority of cases. Subsequent sequencing of the p53 exons 5–8, however, revealed only in one case the presence of a mutation. Nevertheless, by means of two different p53 reporter constructs we demonstrate transcriptional inactivity of wild type p53 in 6 out of 10 melanoma cell lines; the 4 other p53 wild type melanoma cell lines exhibit p53 reporter gene activity, which can be blocked by shRNA knock down of p53. Conclusions/Significance: In melanomas expressing high levels of wild type p53 this tumor suppressor is frequently inactivated at transcriptional level. KW - Krebs KW - Hautkrebs Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69012 ER - TY - THES A1 - Wienrich, Bernd Gregor T1 - Expression von LEEP-CAM (Lymphocyte Endothelial EPithelial-Cell Adhesion Molecule) in Haut und Hoden - funktionelle Implikationen für die Immunevasion epithelialer Hauttumoren und Entzündungen immunprivilegierter Gewebe T1 - Expression of LEEP-CAM (Lymphocyte Endpthelial EPithelial-Cell Adhesion Molecule) in Skin and testis –functional implication of immunevasion in epithelial skincancer and inflammation in immunologically privileged tissue N2 - Der Schutz vor der Einwanderung von Immunzellen ist einerseits unter physiologischen Bedingungen wichtig für die Integrität immunprivilegierter Organe, andererseits aber auch (mit)entscheidend für die Pathogenese maligner Tumoren. Vor diesem Hintergrund wurde LEEP-CAM (Lymphocyte Endothelial EPithelial-Cell Adhesion Molecule) untersucht, ein Adhäsionsmolekül, welches in der Epidermis und den dermalen Blutgefäßen in normaler Haut konstitutiv exprimiert wird. Durch immunhistochemische Untersuchungen wurde im ersten Teil der Arbeit gezeigt, dass LEEP-CAM in Basalzellkarzinomen, Plattenepithelkarzinomen und Keratoakanthomen der Haut deutlich vermindert oder gar nicht exprimiert wird. Die verminderte Expression war mit fehlender Infiltration von T-Lymphozyten in das Tumorgewebe assoziiert, was insbesondere durch zwei hinsichtlich ihrer LEEP-CAM-Expression unterschiedenen Populationen von Keratoakanthomen nahe gelegt wurde. Die Hypothese, dass LEEP-CAM in die epidermale Rekrutierung aktivierter T-Zellen involviert ist, wurde durch funktionelle Stamper-Woodruff-Experimente (Adhäsion aktivierter T-Lymphozyten an Gewebe-Gefrierschnitte) mit Basalzellkarzinomen und psoriatischer Haut gestützt. Durch metabolische Markierung mit 35(S)-Methionin und anschließende Radioimmunpräzipitation sowie durch durchflusszytometrische Untersuchungen an kultivierten Zellen wurde gezeigt, dass LEEPCAM in transformierten Keratinozyten im Vergleich zu normalen Keratinozyten deutlich vermindert synthetisiert und exprimiert wird. In zwei komplementären murinen Karzinogenese-Modellen wurde die Assoziation der verminderten LEEP-CAM-Expression mit Entdifferenzierung und invasivem Wachstum der Tumorzellen untermauert. Insgesamt kann experimentelle Evidenz für die Hypothese, dass die Herabregulation der LEEP-CAM-Expression ein (Teil)-Mechanismus ist, durch welchen sich invasiv wachsende Tumoren den Angriffen des Immunsystems entziehen können, präsentiert werden. Im Weiteren wurde die Expression und Funktion von LEEPCAM im Keimepithel des Hodens (als ein Beispiel für ein immunprivilegiertes Gewebe) untersucht. Durch immunhistochemische Untersuchungen wurde die konstitutive Expression von LEEP-CAM in den Sertoli-Zellen des Keimepithels nachgewiesen. Mittels Immun-Elektronenmikroskopie wurde dann die Lokalisation an desmosomalen Strukturen sowie entlang der Zellmembran gezeigt. Im Hinblick auf die Funktion von LEEP-CAM wurde in modifizierten Stamper-Woodruff-Experimenten erstmals gezeigt, dass aktivierte T-Lymphozyten an das Keimepithel des Hodens binden können und dass diese Adhäsion durch LEEP-CAM-gerichtete Antikörper inhibiert werden kann. Damit ist LEEP-CAM das erste Molekül, für welches direkte experimentelle Evidenz eine mögliche Rolle bei der testikulären Lymphozyten-Rekrutierung belegt. Dies könnte Relevanz für die Pathogenese von Orchitiden, den häufigsten Ursachen männlicher Infertilität, haben. N2 - Under physiologic conditions protection of invading immune cells is on one hand important for integrity of immune-privileged organs and on the other hand crucial for the pathogenesis of malignant tumors. In the current thesis LEEP-CAM (Lymphocyte Endothelial Epithelial-Cell Adhesion Molecule), an adhesion molecule which is expressed in the epidermis and dermal blood vessels was investigated. In immunohistochemical stains LEEP-CAM expression was dramatically reduced or absent in basal cell carcinoma, squamous cell carcinoma or keratoacanthoma. Reduced expression was associated with lack of infiltrating T-lymphocytes in the tumor tissue, which was especially obvious in keratoacanthoma. The hypothesis that LEEP-CAM is involved in epidermal recruiting of activated T cells was verified by functional Stamper-Woodruff experiments (adhesion of activated T lymphocytes to frozen tissue sections) for basal cell carcinoma and psoriasis. By metabolic labeling with 35-S-methionin and subsequent radioimmuno-precipitation and additional FACS analysis we could demonstrate, that LEEP-CAM synthesis and expression was reduced in transformed keratinocytes in comparison to primary keratinocytes. The association of reduced LEEP-CAM expression with differentiation and invasive tumor growth was confirmed in two complementary murine carcinogenesis models. In summary, reduced expression of LEEP-CAM may be a mechanism by which invasive tumors are capable of escaping the immune surveillance. In the second part of the thesis, expression and function of LEEP-CAM in the testis was investigated. Constitutive expression of LEEP-CAM was identified immunhistochemically in Sertoli cells. By immunoelectron microscopy LEEP-CAM was localized to desmosomal structures and along the cell membrane. Functional analysis by modified Stamper-Woodruff experiments demonstrated the capability of activated T-lymphocytes to bind to germinal tissue of human testis. This adhesion could be blocked by anti-LEEP-CAM-antibodies. Our studies suggest that LEEP-CAM may the first molecule which is involved in lymphocyte testicular recruitment. This may be relevant for the pathogenesis of orchtitis. KW - Zell-Adhesionsmolekül KW - Hoden KW - Haut KW - Hauttumor KW - Hautkrebs KW - Basaliom KW - Epitheliom KW - Spinaliom KW - Endothel KW - Epithel KW - Keimepithel KW - Plattenepithel KW - Keratoakant KW - LEEP-CAM KW - adhesion molecule KW - inflammation KW - human testis KW - LEEP-CAM KW - adhesion molecule KW - inflammation KW - human testis Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27872 ER -