TY  - THES
A1  - Endres, Leo Maximilian
T1  - Development of multicellular \(in\) \(vitro\) models of the meningeal blood-CSF barrier to study \(Neisseria\) \(meningitidis\) infection
T1  - Entwicklung multizellulärer \(in\) \(vitro\) Modelle der meningealen Blut-Liquor Schranke zur Untersuchung der \(Neisseria\) \(meningitidis\) Infektion
N2  - Neisseria meningitidis (the meningococcus) is one of the major causes of bacterial meningitis, a life-threatening inflammation of the meninges. Traversal of the meningeal blood-cerebrospinal fluid barrier (mBCSFB), which is composed of highly specialized brain endothelial cells (BECs), and subsequent interaction with leptomeningeal cells (LMCs) are critical for disease progression. Due to the human-exclusive tropism of N. meningitidis, research on this complex host-pathogen interaction is mostly limited to in vitro studies. Previous studies have primarily used peripheral or immortalized BECs alone, which do not retain relevant barrier phenotypes in culture. To study meningococcal interaction with the mBCSFB in a physiologically more accurate context, BEC-LMC co-culture models were developed in this project using BEC-like cells derived from induced pluripotent stem cells (iBECs) or hCMEC/D3 cells in combination with LMCs derived from tumor biopsies. 
Distinct BEC and LMC layers as well as characteristic expression of cellular markers were observed using transmission electron microscopy (TEM) and immunofluorescence staining. Clear junctional expression of brain endothelial tight and adherens junction proteins was detected in the iBEC layer. LMC co-culture increased iBEC barrier tightness and stability over a period of seven days, as determined by sodium fluorescein (NaF) permeability and transendothelial electrical resistance (TEER). Infection experiments demonstrated comparable meningococcal adhesion and invasion of the BEC layer in all models tested, consistent with previously published data. While only few bacteria crossed the iBEC-LMC barrier initially, transmigration rates increased substantially over 24 hours, despite constant high TEER. After 24 hours of infection, deterioration of the barrier properties was observed including loss of TEER and altered expression of tight and adherens junction components. Reduced mRNA levels of ZO-1, claudin-5, and VE-cadherin were detected in BECs from all models. qPCR and siRNA knockdown data suggested that transcriptional downregulation of these genes was potentially but not solely mediated by Snail1. Immunofluorescence staining showed reduced junctional coverage of occludin, indicating N. meningitidis-induced post-transcriptional modulation of this protein, as previous studies have suggested. Together, these results suggest a potential combination of transcellular and paracellular meningococcal traversal of the mBCSFB, with the more accessible paracellular route becoming available upon barrier disruption after prolonged N. meningitidis infection. Finally, N. meningitidis induced cellular expression of pro-inflammatory cytokines and chemokines such as IL-8 in all mBCSFB models. Overall, the work described in this thesis highlights the usefulness of advanced in vitro models of the mBCSFB that mimic native physiology and exhibit relevant barrier properties to study infection with meningeal pathogens such as N. meningitidis.
N2  - Neisseria meningitidis (der Meningokokkus) ist einer der Hauptursachen bakterieller Meningitis, einer lebensbedrohlichen Entzündung der Hirnhäute. Entscheidend für das für das Voranschreiten der Krankheit ist die Fähigkeit des Erregers, die meningeale Blut-Liquor-Schranke (mBCSFB), bestehend aus spezialisierten Hirnendothelzellen (BECs) und leptomeningealen Zellen (LMCs), zu überwinden und in den submeningealen Raum einzudringen. Da es sich bei N. meningitidis um ein rein humanes Pathogen handelt, beschränkt sich die Erforschung dieser speziellen Interaktion primär auf die Verwendung von in vitro Modellen. Bisher wurden hierfür hauptsächlich periphere oder immortalisierte BECs verwendet, welchen jedoch wichtige Barriere-Eigenschaften fehlen. Um die Interaktion von N. meningitidis mit der mBCSFB in einem physiologisch relevanteren Umfeld zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit neuartige BEC-LMC Kokulturmodelle entwickelt. 
Dabei wurden sowohl BEC-ähnliche Zellen, die aus induzierten pluripotenten Stammzellen generiert wurden (iBECs), als auch hCMEC/D3 Zellen verwendet und zusammen mit LMCs aus Tumorbiopsien kultiviert. Mittels Transmissions-Elektronenmikroskopie und Immunfluoreszenzfärbung konnten die unterschiedlichen Zellschichten und deren Expression charakteristischer zellulärer Marker dargestellt werden. Durchgängige Expression von wichtigen Bestandteilen Barriere-formender Zellverbindungen, sogenannter Tight und Adherens Junctions, wurde in der iBEC-Schicht beobachtet. Die Integrität der zellulären Barriere wurde mittels transendothelialer elektrischer Resistenz (TEER) und Permeabilität gegenüber Natrium-Fluorescein (NaF) bestimmt. Erhöhte TEER-Werte und verringerte NaF-Permeabilität, gemessen über einen Zeitraum von sieben Tagen, zeigten eine durch die Kokultur mit LMCs ausgelöste Steigerung der Dichtigkeit und Stabilität der iBEC-Barriere. 
Infektionsexperimente mit N. meningitidis zeigten in allen Modellen vergleichbare bakterielle Adhäsion und Invasion der BEC-Schicht. Bakterielle Transmigration durch die gesamten Zellbarriere war im iBEC-LMC Modell kurz nach Infektion nur in geringem Maße detektierbar, nahm jedoch innerhalb von 24 Stunden deutlich zu. Interessanterweise wurde bis zu 24 Stunden nach Infektion noch eine hohe Integrität der Barriere gemessen, welche allerdings im weiteren Verlauf verloren ging. Neben signifikantem TEER-Verlust wurde eine verringerte Expression der Tight und Adherens Junction Proteine ZO-1, claudin-5, und VE-cadherin mittels qPCR festgestellt. qPCR und siRNA Knockdown Experimente deuteten darauf hin, dass dies möglicherweise, aber nicht ausschließlich, auf den Transkriptionsfaktor Snail1 zurückzuführen war. Zusätzlich zu den beobachteten Effekten auf die zelluläre Transkription von Tight Junction Genen, zeigten Immunfluoreszenzfärbungen eine verringerte Expression von Occludin an den Zell-Zell-Verbindungen, was auf eine post-translationale Modulation schließen lässt. Zusammen deuten die Ergebnisse dieser Infektionsstudien auf eine mögliche Kombination aus trans- und parazellulärer bakterieller Transmigration der mBCSFB hin. Zuletzt wurden in dieser Arbeit noch die Immunaktivierung von BECs nach N. meningitidis Infektion in den neuen BEC-LMC Kokulturmodellen untersucht. Hierbei wurde eine erhöhte Expression von Zytokinen, insbesondere Interleukin-8, beobachtet. 
Insgesamt konnten in dieser Arbeit neue, fortschrittlicher in vitro Modelle der mBCSFB entwickelt werden, welche die humane Physiologie besser widerspiegeln und daher für Infektionsstudien mit Meningitis-verursachenden Erregern wie N. meningitidis von besonderem Nutzen sind.
KW  - Bakterielle Hirnhautentzündung
KW  - Blut-Liquor-Schranke
KW  - Induzierte pluripotente Stammzelle
KW  - Neisseria meningitidis
KW  - In-vitro-Kultur
KW  - Brain endothelial cells
KW  - Leptomeningeal cells
KW  - Hirnendothelzellen
KW  - Leptomeningealzellen
Y1  - 2024
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-346216
ER  - 
TY  - THES
A1  - Malkmus, Christoph
T1  - Establishment of a 3D \(in\) \(vitro\) skin culture system for the obligatory human parasite \(Onchocerca\) \(volvulus\)
T1  - Etablierung eines 3D-\(in\)-\(vitro\)-Hautkultursystems für den obligat humanen Parasiten \(Onchocerca\) \(volvulus\)
N2  - Onchocerciasis, the world's second-leading infectious cause of blindness in humans
–prevalent in Sub-Saharan Africa – is caused by Onchocerca volvulus (O. volvulus), an
obligatory human parasitic filarial worm. Commonly known as river blindness,
onchocerciasis is being targeted for elimination through ivermectin-based mass
drug administration programs. However, ivermectin does not kill adult parasites,
which can live and reproduce for more than 15 years within the human host. These
impediments heighten the need for a deeper understanding of parasite biology and
parasite-human host interactions, coupled with research into the development of
new tools – macrofilaricidal drugs, diagnostics, and vaccines. Humans are the only
definitive host for O. volvulus. Hence, no small-animal models exist for propagating
the full life cycle of O. volvulus, so the adult parasites must be obtained surgically
from subcutaneous nodules. A two-dimensional (2D) culture system allows that
O. volvulus larvae develop from the vector-derived infective stage larvae (L3) in vitro
to the early pre-adult L5 stages. As problematic, the in vitro development of
O. volvulus to adult worms has so far proved infeasible. We hypothesized that an
increased biological complexity of a three-dimensional (3D) culture system will
support the development of O. volvulus larvae in vitro. Thus, we aimed to translate
crucial factors of the in vivo environment of the developing worms into a culture
system based on human skin. The proposed tissue model should contain 1. skinspecific
extracellular matrix, 2. skin-specific cells, and 3. enable a direct contact of
larvae and tissue components. For the achievement, a novel adipose tissue model
was developed and integrated to a multilayered skin tissue comprised of epidermis,
dermis and subcutis. Challenges of the direct culture within a 3D tissue model
hindered the application of the three-layered skin tissue. However, the indirect coculture
of larvae and skin models supported the growth of fourth stage (L4) larvae in
vitro. The direct culture of L4 and adipose tissue strongly improved the larvae
survival. Furthermore, the results revealed important cues that might represent the
initial encapsulation of the developing worm within nodular tissue. These results
demonstrate that tissue engineered 3D tissues represent an appropriate in vitro
environment for the maintenance and examination of O. volvulus larvae.
N2  - Onchozerkose, die weltweit zweithäufigste infektionsbedingte Ursache für
Erblindung von Menschen, wird durch Onchocerca volvulus (O. volvulus) verursacht,
ein parasitärer Fadenwurm. Die allgemein als Flussblindheit bekannte
Onchozerkose wird mit dem Medikament Ivermectin bekämpft, das jedoch nicht die
adulten Parasiten tötet, die im Menschen mehr als 15 Jahre lang leben und sich
vermehren. Ein tieferes Verständnis der Biologie des Parasiten und dessen
Interaktionen im menschlichen Wirt ist für die Erforschung und Entwicklung neuer
Instrumente – makrofilarizide Medikamente, Diagnostika und Impfstoffe –
erforderlich. Da der Mensch der einzige Endwirt für O. volvulus ist, gibt es keine
Tiermodelle für dessen Vermehrung. Zu Forschungszwecken werden adulte Würmer
daher chirurgisch aus subkutanen Knoten erkrankter Individuen gewonnen. Ein
zweidimensionales (2D) Kultursystem ermöglicht die Entwicklung von aus dem
Vektor isolierten infektiösen O. volvulus-Larven (L3) bis zu einem frühen präadulten
Stadium. Als problematisch erwies sich bisher die in vitro Entwicklung von O. volvulus
bis zum adulten Wurm. Unsere Hypothese ist, dass eine erhöhte biologische
Komplexität des Kultursystems die Entwicklung von O. volvulus-Larven in vitro
unterstützt. Daher wurden entscheidende Faktoren der in vivo-Umgebung
entwickelnder Larven – die menschliche Haut – auf ein dreidimensionales (3D)
Kultursystem übertragen. Dieses Kultursystem sollte 1. Haut-spezifische
extrazelluläre Matrix enthalten, 2. hautspezifische Zellen und 3. einen direkten
Kontakt zwischen Larven und Gewebekomponenten ermöglichen. Dafür wurde ein
neuartiges Fettgewebemodell entwickelt, das in ein mehrschichtiges Hautgewebe
integriert wurde – bestehend aus Epidermis, Dermis und subkutanem Fettgewebe.
Die Anwendung des dreischichtigen Hautgewebes als direktes Kultursystem wurde
durch technische Herausforderungen verhindert. Jedoch unterstützte die indirekte
Ko-Kultur von Hautmodellen das Wachstum der Larven (L4) in vitro. Die direkte
Kultur mit dem Fettgewebemodell verbesserte die Viabilität der Larven signifikant.
Darüber hinaus konnten Anzeichen für eine beginnende Verkapselung der Larven
durch humane Zellen und Matrix gezeigt werden kann. Die Ergebnisse
demonstrieren, dass humane Gewebemodelle eine angemessene in vitro-Umgebung
für die Kultur und die Erforschung von O. volvulus darstellen.
KW  - Tissue Engineering
KW  - Humanparasitologie
KW  - In-vitro-Kultur
KW  - Onchozerkose
KW  - Multilayered skin tissue model
KW  - Onchocerca volvulus
KW  - Skin Tissue Engineering
KW  - Parasitology
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-317171
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TY  - THES
A1  - Leikeim, Anna
T1  - Vascularization Strategies for Full-Thickness Skin Equivalents to Model Melanoma Progression
T1  - Vaskularisierungsstrategien für Vollhautäquivalente zur Modellierung der Melanom-Progression
N2  - Malignant melanoma (MM) is the most dangerous type of skin cancer with rising incidences worldwide. Melanoma skin models can help to elucidate its causes and formation or to develop new treatment strategies. However, most of the current skin models lack a vasculature, limiting their functionality and applicability. MM relies on the vascular system for its own supply and for its dissemination to distant body sites via lymphatic and blood vessels. Thus, to accurately study MM progression, a functional vasculature is indispensable. To date, there are no vascularized skin models to study melanoma metastasis in vitro, which is why such studies still rely on animal experimentation. 
In the present thesis, two different approaches for the vascularization of skin models are employed with the aim to establish a vascularized 3D in vitro full-thickness skin equivalent (FTSE) that can serve as a test system for the investigation of the progression of MM. 
Initially, endothelial cells were incorporated in the dermal part of FTSEs. The optimal seeding density, a spheroid conformation of the cells and the cell culture medium were tested. A high cell density resulted in the formation of lumen-forming shapes distributed in the dermal part of the model. These capillary-like structures were proven to be of endothelial origin by staining for the endothelial cell marker CD31. The established vascularized FTSE (vFTSE) was characterized histologically after 4 weeks of culture, revealing an architecture similar to human skin in vivo with a stratified epidermis, separated from the dermal equivalent by a basement membrane indicated by collagen type IV. However, this random capillary-like network is not functional as it cannot be perfused. 
Therefore, the second vascularization approach focused on the generation of a perfusable tissue construct. A channel was molded within a collagen hydrogel and seeded with endothelial cells to mimic a central, perfusable vessel. The generation and the perfusion culture of the collagen hydrogel was enabled by the use of two custom-made, 3D printed bioreactors. Histological assessment of the hydrogels revealed the lining of the channel with a monolayer of endothelial cells, expressing the cell specific marker CD31. 
For the investigation of MM progression in vitro, a 3D melanoma skin equivalent was established. Melanoma cells were incorporated in the epidermal part of FTSEs, representing the native microenvironment of the tumor. Melanoma nests grew at the dermo-epidermal junction within the well stratified epidermis and were characterized by the expression of common melanoma markers. First experiments were conducted showing the feasibility of combining the melanoma model with the vFTSE, resulting in skin models with tumors at the dermo-epidermal junction and lumen-like structures in the dermis. 
Taken together, the models presented in this thesis provide further steps towards the establishment of a vascularized, perfusable melanoma model to study melanoma progression and metastasis.
N2  - Das maligne Melanom (MM) ist die gefährlichste Form von Hautkrebs mit weltweit steigender Inzidenz. Melanom-Hautmodelle können helfen, seine Ursachen und Entstehung aufzuklären oder neue Behandlungsstrategien zu entwickeln. Den meisten bisherigen Hautmodellen fehlt jedoch ein Gefäßsystem, was ihre Funktionalität und Anwendbarkeit einschränkt. Das MM ist auf das Gefäßsystem angewiesen, sowohl für die eigene Versorgung als auch für die Ausbreitung über Lymph- und Blutgefäße zu entfernten Körperstellen. Um die Entwicklung des MM genau zu studieren, ist daher eine funktionelles Gefäßsystem unabdingbar. Bislang gibt es keine vaskularisierten Hautmodelle, um die Melanommetastasierung in vitro zu untersuchen, weshalb solche Studien immer noch auf Tierversuche angewiesen sind. 
In der vorliegenden Arbeit werden zwei unterschiedliche Ansätze zur Vaskularisierung von Hautmodellen mit dem Ziel verfolgt, ein vaskularisiertes 3D in vitro Vollhautmodell (full-thickness skin equivalent, FTSE) zu etablieren, das als Testsystem zur Untersuchung der Entwicklung des MM dienen kann. 
Einerseits wurden Endothelzellen in den dermalen Teil von FTSEs integriert. Die optimale Aussaatdichte, eine sphäroidale Konformation der Zellen und das Zellkulturmedium wurden getestet. Eine hohe Zelldichte führte zur Bildung von lumenbildenden Formen, die im dermalen Teil des Modells verteilt waren. Diese kapillarähnlichen Strukturen wurden durch Färbung für den Endothelzellmarker CD31 als endothelialen Ursprungs nachgewiesen. Das etablierte vaskularisierte FTSE (vFTSE) wurde nach 4 Wochen Kultur histologisch charakterisiert und zeigte eine der menschlichen Haut in vivo ähnliche Architektur mit einer geschichteten Epidermis, die vom dermalen Äquivalent durch eine Basalmembran, gezeigt durch Kollagen Typ IV, getrennt ist. Dieses zufällige kapillarartige Netzwerk ist jedoch nicht funktional, da es nicht durchblutet werden kann. 
Daher konzentrierte sich der zweite Vaskularisierungsansatz auf die Erzeugung eines perfundierbaren Gewebekonstrukts. Ein Kanal wurde in einem Kollagenhydrogel geformt und mit Endothelzellen besiedelt, um ein zentrales, perfundierbares Gefäß zu imitieren. Die Erzeugung und die Perfusionskultur des Kollagenhydrogels wurde durch die Verwendung von zwei speziell angefertigten, 3D-gedruckten Bioreaktoren ermöglicht. Die histologische Beurteilung der Hydrogele zeigte die Auskleidung des Kanals mit einer Einzelschicht von Endothelzellen, die den zellspezifischen Marker CD31 exprimieren. 
Für die Untersuchung der MM-Progression in vitro wurde ein 3D-Melanom-Hautäquivalent hergestellt. Melanomzellen wurden in den epidermalen Teil von FTSEs integriert, was die native Mikroumgebung des Tumors darstellt. Die Melanomnester wuchsen an der dermo-epidermalen Grenzfläche innerhalb der gut stratifizierten Epidermis und wurden durch die Expression gängiger Melanommarker charakterisiert. Zusätzlich konnte die Kombination des Melanom-Modells mit dem vFTSE gezeigt werden, was zu Hautmodellen mit Tumoren an der dermo-epidermalen Grenzfläche und lumenartigen Strukturen in der Dermis führte. 
Alles in allem bieten die in dieser Arbeit vorgestellten Modelle weitere Schritte hin zur Entwicklung eines vaskularisierten, perfundierbaren Melanommodell zur Erforschung der Melanomprogression und Metastasierung.
KW  - Tissue Engineering
KW  - In-vitro-Kultur
KW  - Melanom
KW  - skin model
KW  - vascularization
KW  - in vitro-Testsystem
KW  - perfused hydrogel
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-272956
ER  -