TY  - THES
A1  - Massih, Bita
T1  - Human stem cell-based models to analyze the pathophysiology of motor neuron diseases
T1  - Humane Stammzell-basierte Modelle zur Analyse der Pathophysiologie von Motoneuronerkrankungen
N2  - Motor neuron diseases (MNDs) encompass a variety of clinically and genetically heterogeneous disorders, which lead to the degeneration of motor neurons (MNs) and impaired motor functions. MNs coordinate and control movement by transmitting their signal to a target muscle cell. The synaptic endings of the MN axon and the contact site of the muscle cell thereby form the presynaptic and postsynaptic structures of the neuromuscular junction (NMJ). In MNDs, synaptic dysfunction and synapse elimination precede MN loss suggesting that the NMJ is an early target in the pathophysiological cascade leading to MN death. In this study, we established new experimental strategies to analyze human MNDs by patient derived induced pluripotent stem cells (iPSCs) and investigated pathophysiological mechanisms in two different MNDs.
To study human MNDs, specialized cell culture systems that enable the connection of MNs to their target muscle cells are required to allow the formation of NMJs. In the first part of this study, we established and validated a human neuromuscular co-culture system consisting of iPSC derived MNs and 3D skeletal muscle tissue derived from myoblasts. We generated 3D muscle tissue by culturing primary myoblasts in a defined extracellular matrix in self-microfabricated silicone dishes that support the 3D tissue formation. Subsequently, iPSCs from healthy donors and iPSCs from patients with the progressive MND Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) were differentiated into MNs and used for 3D neuromuscular co-cultures. Using a combination of immunohistochemistry, calcium imaging, and pharmacological stimulations, we characterized and confirmed the functionality of the 3D muscle tissue and the 3D neuromuscular co-cultures. Finally, we applied this system as an in vitro model to study the pathophysiology of ALS and found a decrease in neuromuscular coupling, muscle contraction, and axonal outgrowth in co-cultures with MNs harboring ALS-linked superoxide dismutase 1 (SOD1) mutation. In summary, this co-culture system presents a human model for MNDs that can recapitulate aspects of ALS pathophysiology.
In the second part of this study, we identified an impaired unconventional protein secretion (UPS) of Sod1 as pathological mechanisms in Pleckstrin homology domain-containing family G member 5 (Plekhg5)-associated MND. Sod1 is a leaderless cytosolic protein which is secreted in an autophagy-dependent manner. We found that Plekhg5 depletion in primary MNs and NSC34 cells leads to an impaired secretion of wildtype Sod1, indicating that Plekhg5 drives the UPS of Sod1 in vitro. By interfering with different steps during the biogenesis of autophagosomes, we could show that Plekhg5-regulated Sod1 secretion is determined by autophagy. To analyze our findings in a clinically more relevant model we utilized human iPSC MNs from healthy donors and ALS patients with SOD1 mutations. We observed reduced SOD1 secretion in ALS MNs which coincides with reduced protein expression of PLEKHG5 compared to healthy and isogenic control MNs. To confirm this correlation, we depleted PLEKHG5 in control MNs and found reduced extracellular SOD1 levels, implying that SOD1 secretion depends on PLEKHG5. In summary, we found that Plekh5 regulates the UPS of Sod1 in mouse and human MNs and that Sod1 secretion occurs in an autophagy dependent manner. Our data shows an unreported mechanistic link between two MND-associated proteins.
N2  - Motoneuronerkrankungen (MNE) umfassen eine Vielzahl klinisch und genetisch heterogener Erkrankungen, die zur Degeneration von Motoneuronen (MN) und zu beeinträchtigten motorischen Funktionen führen. MN koordinieren und steuern Muskelbewegungen, indem sie ihr Signal an eine Zielmuskelzelle übertragen. Die synaptischen Endungen des MN-Axons und die Kontaktstelle der Muskelzelle bilden dabei die präsynaptischen und postsynaptischen Strukturen der neuromuskulären Endplatte (NME). Bei MNE zeichnen sich synaptische Dysfunktion und Synapseneliminierung bereits vor dem Verlust von MN ab, was darauf hindeutet, dass die NME ein frühes Ziel in der pathophysiologischen Kaskade ist, die zum MN-Tod führt. In dieser Studie haben wir neue experimentelle Strategien zur Analyse humaner MNE mithilfe von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSZ) entwickelt und pathophysiologische Mechanismen bei zwei verschiedenen MNE untersucht.
Um humane MNE zu untersuchen sind Zellkultursysteme erforderlich, die die Verbindung von MN mit ihren Zielmuskelzellen ermöglichen, um NME zu bilden. Im ersten Teil dieser Studie haben wir ein humanes neuromuskuläres Co-Kultursystem etabliert und validiert, das aus iPSZ abgeleiteten MN und 3D Skelettmuskelgewebe aus Myoblasten besteht. Wir haben 3D Muskelgewebe erzeugt, indem wir primäre Myoblasten in einer definierten extrazellulären Matrix in selbst gefertigten Silikonschalen kultivierten, die die 3D-Gewebebildung unterstützen. Anschließend wurden iPSZ von gesunden Spendern und iPSZ von Patienten mit der MNE Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) in MN differenziert und für neuromuskuläre 3D Co-Kulturen verwendet. Mithilfe von immunhistochemischen Untersuchungen, Calcium-Imaging und pharmakologischen Stimulationen konnten wir die Funktionalität des 3D Muskelgewebes und neuromuskulären 3D Co-Kulturen charakterisieren und validieren. Anschließend wurde das System als in vitro Modell zur Untersuchung der Pathophysiologie von ALS verwendet. ALS Co-Kulturen mit MN, die eine Superoxid Dismutase 1 (SOD1)-Genmutation aufwiesen, zeigten eine Abnahme der neuromuskulären Verbindung, der Muskelkontraktion und des axonalen Wachstums. Zusammenfassend stellt dieses Co-Kultursystem ein humanes Modell für die Untersuchung von MNE dar, das Aspekte der ALS-Physiologie rekapitulieren kann.
Im zweiten Teil dieser Studie konnten wir eine Beeinträchtigung der unkonventionellen Proteinsekretion (UPS) von Sod1 als pathologischen Mechanismus bei Pleckstrin homology domain-containing family G member 5 (Plekhg5)-assoziiertem MNE identifizieren.
Sod1 ist ein cytosolisches Protein ohne Signalsequenz für konventionelle Sekretion. Stattdessen wird die UPS über sekretorische Autophagie-Mechanismen reguliert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Plekhg5-Depletion in primären MN und NSC34-Zellen zu einer beeinträchtigten Sekretion von Wildtyp-Sod1 führt, was darauf hinweist, dass die UPS von Sod1 Plekgh5 abhängig ist. Indem verschiedene Schritte während der Biogenese von Autophagosomen gestört wurden, konnten wir nachweisen, dass die Plekhg5-regulierte Sod1-Sekretion Autophagie abhängig ist. Um unsere Ergebnisse in einem klinisch relevanteren Modell zu analysieren, wurden humane iPSZ-MN von gesunden Spendern und ALS-Patienten mit SOD1-Mutationen untersucht. Hier fand sich, dass die Sekretion von mutiertem SOD1 in ALS-MN im Vergleich zu gesunden und isogenen Kontrollen verringert ist. Dabei konnten wir zeigen, dass eine verringerte SOD1 Sekretion in ALS-MNs mit einer verringerten Expression von PLEKHG5 einhergeht. Um diese Korrelation zu bestätigen, wurden Kontroll-MN nach PLEKHG5-Depletion untersucht und eine verminderte SOD1-Sekretion dokumentiert, was auf eine PLEKHG5 Abhängigkeit hindeutet. Zusammenfassend konnten wir zeigen, dass Plekh5 die UPS von Sod1 in Maus MN und humanen MN reguliert und dass die Sod1-Sekretion Autophagie abhängig erfolgt. Unsere Daten belegen eine bislang noch nicht gezeigte mechanistische Verknüpfung zwischen zwei MNE-assoziierten Proteinen.
KW  - Tissue Engineering
KW  - NMJ (neuromuscular junction)
KW  - MND
KW  - SOD1
KW  - ALS
KW  - PLEKHG5
KW  - Co-culture
KW  - 3D muscle
KW  - Motoneuron
KW  - Stammzellen
KW  - Neuromuskuläre Endplatte
KW  - Induzierte pluripotente Stammzelle
KW  - Motoneuron-Krankheit
KW  - Myatrophische Lateralsklerose
KW  - Zellkultur
KW  - Motorische Endplatte
KW  - Induced pluripotent stem cells
KW  - Motor neuron disease
KW  - Amyotrophic lateral sclerosis
KW  - Cell culture
Y1  - 2024
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-346374
PB  - Frontiers in Cell and Developmental Biology
ER  - 
TY  - THES
A1  - Wagner, Toni
T1  - Activity and Crosstalk of STAT3 and BMP Signalling Pathways in Pluripotency Control of Mouse and Medaka Stem Cells
T1  - Aktivität und Verschaltung von STAT3 und BMP Signalwegen in der Pluripotenzkontrolle von Maus und Medaka Stammzellen
N2  - - 77/83 allerdings inaktiv in Kulturen und Embryonen von Medaka. Dieser Unterschied wird durch Daten aus humanen ES-Zellkulturen unterstützt. Letztere sind ebenfalls komplett STAT3 unabhängig. Die BMP-Smad Kaskade wiederum ist in Medaka-Stammzellen aktiv, Antidifferenzierungsgene wie id2, die durch BMP direkt kontrolliert werden, sind dementsprechend exprimiert. Diese Daten stimmen wiederum mit dem Maussystem überein, während humane ES-Zellen diesbezüglich bislang nicht untersucht wurden. Die Interaktion zwischen verschiedenen Signalwegen ist ein bisher noch nicht gut verstandenes Gebiet. Die Integration verschiedener Signale ist aber speziell für Stammzellen, die ihr Differenzierungsschicksal von winzigen Abweichungen in der Signalmixtur abhängig machen, von entscheidender Bedeutung. Im zweiten Teil der hier vorgelegten Arbeit konnte eine Interaktion zwischen dem BMP-Rezeptor 1a und STAT3 nachgewiesen werden. Diese Interaktion ist offenbar Teil eines variablen Komplexes. Zum ersten Mal war es auch möglich, funktionale Konsequenzen für STAT3 nach Stimulierung des BMP-Rezeptors 1a zu dokumentieren. Nach Belegung des BMP-Rezeptors 1a mit dem mutierten BMP2-A34D wird STAT3 trotz Aktivierung durch Phosphorylierung an Tyrosin 705 im Zytoplasma von Maus Stammzellen festgehalten. Zusammengenommen konnte hier gezeigt werden, dass eine Interaktion zwischen den bislang als isoliert betrachteten Signalwegen BMP-Smad und STAT3 besteht. Des Weiteren wurde das Medaka-Stammzellkultursystem benutzt, um zu zeigen, dass STAT3 für die Pluripotenz von Stammzellen nur im Maussystem eine Rolle spielt, wohingegen BMPZielgene wie id2 in bislang allen getesteten ES-Zellkultursystemen aktiv sind.
KW  - Stammzellen
KW  - Pluripotency
KW  - ES-Cells
KW  - STAT3
KW  - BMP
KW  - Medaka
Y1  - 2007
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-26495
ER  -